Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Opretholdelse af biologiske kulturer og måling af Gen-ekspression i Aphis nerii: et ikke-model System for plante-insekt interaktioner

Published: August 31, 2018 doi: 10.3791/58044
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biological Sciences Department, Vanderbilt University

Summary

Bladlus Aphis nerii koloniserer på stærkt forsvaret planter i dogbane familie (Apocyanaceae) og giver mange muligheder for at studere plante-insekt interaktioner. Her præsenterer vi en række protokoller for vedligeholdelse af anlægget og bladlus kulturer, og den generation og analyse af molekylære og - omic data for A. nerii.

Abstract

Bladlus er fremragende eksperimentelle modeller for en bred vifte af biologiske spørgsmål lige fra udviklingen i symbioser og udvikling af polyphenisms til spørgsmål omkring insekts interaktioner med deres værtsplanter. Genomisk ressourcer er tilgængelige for flere arter, bladlus, og med fremskridt inden for den næste generation sequencing, transkriptom undersøgelser udvides til ikke-model organismer, som mangler genomer. Derudover kan bladlus kulturer indsamlet fra feltet og opdrættes i laboratoriet til brug i kropsligt og molekylær eksperimenter for at bygge bro over kløften mellem økologiske og genetiske undersøgelser. Sidst, mange bladlus kan opretholdes i laboratoriet på deres foretrukne værtsplanter i evig, parthenogenic livscyklus muliggør sammenligninger af ukønnet reproduktion genotyper. Aphis nerii, milkweed-oleander bladlus, giver en sådan model for at studere insekt interaktioner med giftige planter ved hjælp af både kropsligt og molekylær eksperimenter. Metoder til produktion og vedligeholdelse af anlægget og bladlus kulturer i drivhus og laboratorium, DNA og RNA ekstraktioner, microsatellite analyse, de novo transkriptom forsamling og kommentering, transkriptom differential udtrykket analyse og qPCR verifikation af varierende udtrykte gener er skitseret og drøftet her.

Introduction

Bladlus er små, hemimetabolous insekter, at koloniser på forskellige planter familier i hele verden. De er karakteristiske for flere funktioner, de fleste især deres komplekse livscyklus involverer cykliske partenogenese og diskrete polyphenisms og deres obligat ernæringsmæssige symbioser med bakteriel eller gær endosymbionts, der leverer næringsstoffer mangler fra deres kost af plante sap1. Mens de fleste bladlus er vært plante specialister, nogle generalist arter er vigtig afgrøde skadedyr, påføre betydelig økonomisk skade på afgrøder, enten direkte eller via de patogener og virus vektor de2. Offentliggørelsen af de første bladlus genom i 2010, ært bladlus Acyrthosiphon pisum3, markerede en vigtig milepæl i studiet af bladlus biologi fordi det fastsatte behandle spørgsmål om insekt de genomiske ressourcer tilpasninger til de planteædende livsstil, herunder dem, der kan føre til en bedre kontrol strategier4. Siden dengang, har yderligere genomiske ressourcer akkumuleret med offentliggørelsen af en kommenteret genom for sojabønner bladlus Aphis glycines5og offentligt tilgængelige samlede genom ressourcer til en anden tre-bladlus arter (Myzus cerasi (black cherry bladlus), Myzus persicae (fersken-kartoffel bladlus), Rhopalosiphum padi (Hæg-havre bladlus)6. Værdifulde de novo transkriptom ressourcer er tilgængelige samt for en række andre arter, bladlus (e.g.,Aphis gossypii (bomuld bladlus)7, Sitobion avenae (Kornbladlusen)8, Cinara pinitabulaeformis (fyrretræ bladlus)9, Aphis nerii (milkweed-oleander bladlus)10).

Bladlus har også gjort varigt bidrag til vores forståelse af plante-insekt interaktioner og økologi af livet på planter11. Et område, hvor bladlus har gjort særligt vigtigt bidrag er i vores forståelse af plante værtssammenspil kemiske økologi. Planteædende insekter udtrykke forskellige tilpasninger fordel for at overvinde plante forsvar, og nogle endda ved selvsupplering plante forsvar for deres egen12,13,14. For eksempel, er milkweed-oleander bladlus, Aphis nerii, en lys gul, invasive bladlus findes i tempererede og tropiske regioner over hele verden, der koloniserer om planter i familien milkweed (Apocynaceae). Planter i familien Apocynaceae har udviklet forskellige kemiske forsvar, herunder mælkeagtig latex og hjerteglykosider kendt som cardenolides, der binder kation carrier Na, K-ATPase og er effektivt afskrækkende til generalist planteædere15, 16. milkweed specialister udtrykke forskellige former for modstand mod cardenolides, og nogle selektivt eller passivt akkumulere eller ændre cardenolides i deres væv, som et middel til at afskrække underbud eller for andre fordele17. A. nerii menes at udskille cardenolides på denne måde, selv om de mekanismer og funktionelle fordele forbliver uklart10,18.

Givet de genomiske ressourcer ved hånden, giver A. nerii en fremragende eksperimentelle model til studier af de molekylære og genetiske mekanismer involveret i kemo-økologiske samspillet mellem giftige værtsplanter og deres specialist planteædere. Det er værd at bemærke, at mens nogle af de tidligste undersøgelser af A. nerii fokuseret på binding af cardenolides19, siden dengang, undersøgelser af A. nerii har givet indsigt i en bred vifte af evolutionære og økologiske spørgsmål, herunder den genetiske struktur af invasive insekter20 og samspillet mellem bottom-up og top-down regulering på Planteæder tæthed21. A. nerii er således en god kandidat som en eksperimentel model for et særligt brede sæt af undersøgelser af insekt-plante interaktion. Kritisk for enhver undersøgelse med A. nerii succes er den forsigtige kultur af bladlus populationer, som omfatter kultur af planter som bladlus er afhængige af, samt en effektiv generation af høj kvalitet - omic data. Vores mål er at guide læseren gennem både. Skitseret nedenfor er metoder til produktion og vedligeholdelse af anlægget og bladlus kulturer i drivhus og laboratorium, DNA og RNA ekstraktioner, microsatellite analyse, de novo transkriptom forsamling og kommentering, transkriptom differential udtryk analyse og qPCR verifikation af varierende udtrykte gener. Mens disse metoder er skrevet for A. nerii, generelle dyrkning, udvinding, og analysemetoder, der kan udvides til en bred vifte af bladlus arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. plant kulturer

  1. Købe frø fra enhver kommerciel leverandør eller indsamle fra modne planter i feltet.
    Bemærk: Denne protokol er velegnet til de fleste kommercielt tilgængelige milkweed arter (fx Asclepias incarnata, A. syriaca, A. Silkeplante, Gomphocarpus Blærespiræa). Nogle frø skal muligvis være kolde-stratificeret, og instruktioner fra frøleverandør bør kontrolleres.
  2. Plante frø i et fint germinating jord (60-70% fine sphagnum, perlite, vermiculite, kalksten).
    1. Udfylde en standard sætteplante bakke med spiring mix jord; at sikre, at jorden når toppen af brøndene. I hver brønd, gøre en fordybning til at skabe et hul i jorden omkring en 3 cm dybe.
    2. Placere en frø i hvert hul og vand meget godt med en vandkande sådan, at jorden dækker frø og er mættet.
    3. Dyrke frø i et drivhus (Se vilkårene nedenfor, 1.5). Vand regelmæssigt, dagligt til hver-andre-dag; nok til at opretholde jordfugtighed til en moderat niveau.
  3. Når planter har dyrket deres første sæt fuld blade, re pot stiklinger i en almindelig pottemuld mix (50-60% sphagnum, bark og kalksten) (fig. 1A).
    1. Brug 4-tommer runde Potter, der passer med en tæt forsegling med cup bure. Fyld med almindelig pottemuld op til ca. 5 cm under kanten.
    2. Oprette et hul i jorden dybt nok til at nå bunden af puljen.
    3. Med hånden, forsigtigt scoop modne sætteplante fra sin godt og placere det dybt inde i hullet i puljen, 4 tommer. Dække sætteplante med jorden. Vand meget godt.
    4. Dyrke planter i drivhuset og vandet jævnligt, dagligt til hver anden dag; nok til at opretholde moderate jordfugtighed.
  4. Drivhus betingelser.
    1. Indstille drivhus termostater at opretholde dagtimerne temperaturer mellem 18-28 ° C og natten temperaturer mellem 16-22 ° C ved hjælp af producentens anvisninger.
    2. I vintermånederne, når dagene er kortere, supplere dagslys med 600 W højtryks natrium pærer (12 h, 8 am-8 pm).
  5. Kontrollere uønskede skadedyr (fx, thrips, bladlus) med en Blandtegning økologisk sæbeopløsning, men, bruge disse produkter med forsigtighed.
    1. Gøre sæbeopløsning ifølge producentens anbefaling og anvendelse ved hjælp af en sprayflaske.
    2. Lad sæbe på planterne for 4-24 h. forsigtigt skylle planterne med vand for at fjerne sæbe 4 – 24 h efter ansøgning og skyl dem med vand en anden gang før brug med laboratoriet bladlus kulturer.
  6. Kultur befolkningens gennemsnitlige bladlus på planter, der er vokset mindst 3-4 sæt af fuld blade og er mindst 10 cm høj (figur 1B).

2. bladlus kulturer

  1. Starter laboratorium bladlus befolkninger fra en eksisterende lab isoclonal befolkning eller starter fra felt-indsamlet bladlus følge anvisningerne nedenfor.
    1. Når du starter et laboratorium befolkning fra en eksisterende lab isoclonal befolkning, overføre bladlus som beskrevet i 2.3.1–2.3.3.
  2. Hvornår starter den nye isoclonal, felt-indsamlet bladlus befolkninger og placere en enkelt, reproducing, voksne bladlus på en egnet vært plante som nævnt i trin 1,6.
    Bemærk: Befolkninger kan startes fra vingede (alate) eller unwinged (apterous) voksne.
    1. Manuelt inspicere planter fra drivhuset for uønskede skadedyr før brug med laboratoriet bladlus. Fastfryse alle planter med uønskede bladlus. Hvis det ønskes, skal du bruge en ethanol sugekolbe fjerne thrips eller andre skadedyr.
      Bemærk: Sørg for at skylle planter, der er blevet behandlet med sæbe før brug som beskrevet i trin 1.5.2.
    2. Sikkert overføre en enkelt voksen bladlus ved hjælp af et paintbrush eller munden pipette lavet med 3/16" ID x 1/4" OD plastslanger, en 1.000 µL pipette spids og en 2,00 µL pipette spids (fig. 2A).
    3. Sikkert dække planterne med bladlus med en kop bur lavet med en plastik kop med toppen afskåret, dækket med en finmasket og sikret med tape (figur 2B).
    4. Placer bladlus angrebne planter i en bakke og holde i et kontrolleret miljø kammer (16 L: 8 d, 22 ° C, 70% fugtighed).
  3. For at opretholde de bestand populationer, overføre bladlus til friske, nye planter ugentligt (2.2.1–2.2.3).
    1. Overføre sikkert 1 – 3 2nd eller 3rd instar nymfer og 1 voksen-alderen bladlus ved hjælp af en mund pipette (tal 2A, 3).
      Bemærk: Bestande bevares bedst ved at overføre unwinged individer.
    2. Sikkert dække bladlus angrebne planter med en kop bur lavet med en plastik kop med toppen afskåret, dækket med en finmasket og sikret med tape.
    3. Placer planter i en bakke og holde bladlus i en miljømæssig kammer (16 L: 8 d, 22 ° C, 70% fugtighed).
    4. Alternativt, hvis ønsket og hvis anlægget vært er af ordentlig kvalitet, bruge en ethanol sugekolbe for at reducere populationer forlader gengivelse af kun én voksen og to til tre 2. eller 3. instar nymfer.
  4. For at oprette samme alder befolkninger til brug i eksperimenter, placere op til 5 voksne (helst unwinged) fra stock befolkningen ind på et nyt anlæg til værten.
    1. Fjern voksne 24 timer senere.
    2. Omkring 5-7 dage senere, placere når F1 afkom har modnet til voksenalderen, op til 5 unwinged F1 voksne på et nyt anlæg til værten. Fjern voksne 24 timer senere.
    3. Når F2 befolkning har modnet til voksenalderen, er denne befolkning klar til at blive brugt i forsøg.
      Bemærk: Denne proces sikrer, at den eksperimentelle befolkning er omtrent samme alder og er født i nogenlunde samme alder mødre.
  5. Bekræfte de genotypiske forskelle mellem felt-fanget isoclonal linjerne ved hjælp af microsatellite genotypebestemmelse (beskrevet nedenfor, afsnit 3 & 4).

3. DNA-ekstraktion

  1. Forberedelse
    1. Brug steril teknik til at forberede 1 L lysisbuffer (0,1 M NaCl, 0,2 M saccharose, 0,1 M Tris (pH 9.1), 0,05 M EDTA, 0,05% SDS).
    2. Varm den varme blok eller vand bad til 65 ° C.
  2. Væv homogenisering og lysis
    1. Placer bladlus i bunden af et sterilt, 1,5 mL microcentrifuge rør.
    2. Placere den sterile pistil i røret med bladlus og fordybe i bunden af røret i flydende kvælstof.
      Bemærk: Optimale væv opløsning opnås når bladlus er placeret mellem pistil og side af røret.
    3. Slibe bladlus med pistil til i første omgang lyse celler.
    4. Bruge 200 µL (opdelt i 2 x 100 µL alikvoter) af lysisbuffer for en enkelt voksen bladlus. Tilføj den første delprøve for at male og resuspend den knuste bladlus, indtil prøven er synligt opløst, så brug den anden alikvot til vaske pistil.
    5. Inkuber de knuste bladlus i lysisbuffer ved 65 ° C i vand bad eller varme blok i 30 min.
  3. DNA nedbør
    1. Mens glasset er varmt, tilføje 14 µL af 8 M KOAc. Vend røret til mix. Gemme prøven på is i 30 min.
      Bemærk: Protokollen kan blive standset her, og prøver kan opbevares ved-20 ° C op til 24 timer.
    2. Der centrifugeres ved 13.000 x g i 15 min. ved stuetemperatur. Overføre supernatanten til nye 1,5 mL rør med pipette. Være omhyggelig med ikke at fjerne nogen af de pelleted debris.
    3. For at forbedre DNA pellet visualisering, tilføje 2 µL glykogen (20 µg/mL) til supernatanten. Hvis stikprøvestørrelsen er store nok, skal du udelade dette trin.
    4. Tilføje 200 µL koldt 100% Molekylær-grade ethanol til supernatanten. Invertere rør for at blande og inkuberes ved stuetemperatur i mindst 15 min.
      Bemærk: Protokollen kan blive standset her, og prøver kan opbevares ved-20 ° C op til 24 timer.
    5. Der centrifugeres ved 13.000 x g i 15 min. ved stuetemperatur. Fjerne ethanol af pipettering.
  4. DNA vask og eluering
    1. Tilføje 200 µL koldt 70% Molekylær-grade ethanol. Derefter svippe tube resuspend og vaske pelleten.
    2. Der centrifugeres ved 13.000 x g i 5 min. Mens visualisere pellet, forsigtigt fjerne ethanol af pipettering og tilføje 200 µL koldt 100% Molekylær-grade ethanol.
    3. Der centrifugeres ved 13.000 x g i 5 min. Mens visualisere pellet, forsigtigt fjerne ethanol af pipettering.
      Bemærk: Gentag 100-70-100 ethanol vask hvis det er nødvendigt.
    4. Luft tørre pellets til 5 – 10 min med tube æglæggende vandret åben på en silkepapir.
    5. Resuspenderes DNA i 80 µL af lave TE (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA).
    6. Kvantificere den resuspenderede DNA ved hjælp af et spektrofotometer.
    7. Opbevares ved 4 ° C.

4. Microsatellite PCR og sekventering for bladlus genotypebestemmelse

  1. Bestil de passende F og R primere for microsatellite sekventering (tabel 120).
    Bemærk: Reverse primer sekvenser bør ændres med 5'-6-FAM eller 5'-5-HEX fluorescerende etiketter til multipleksede prøver til microsatellite sekvensering.
  2. Udføre PCR med enkelt bladlus DNA-prøver (beskrevet i punkt 3) og fluorescently mærket microsatellite primere.
    1. Bland PCR reaktioner efter producentens protokol (0,2 µM F/R primer, 2,5 mM MgCl2, 50-200 ng DNA skabelon).
    2. Brug følgende indstillinger for thermocycler: indledende denaturering på 94 ° C i 4 min, 35 cyklusser af 94 ° C til 30 s, 58 ° C til 35 s, 72 ° C i 45 s, og et afsluttende brudforlængelse skridt ved 72 ° C i 10 min.
  3. Kombinere PCR prøver med forskellige fluorescerende tags til at reducere antallet af prøver sekventeret og sekvens microsatellite prøver på genotypebestemmelse anlæg.
  4. Analysere .fsa rå eksempelfilerne bruger microsatellite analyse software.

5. RNA udvinding

  1. Indsamle bladlus prøver for RNA udvinding i 1,5 mL RNase / DNase-fri rør og umiddelbar fryse i flydende kvælstof.
    Bemærk: Hvis nedenstående trin ikke er udført umiddelbart, prøverne kan opbevares ved-80 ° C.
  2. Væv homogenisering
    1. Med den sterile pistil i røret med bladlus, fryse i flydende kvælstof i 10-15 sekunder, indtil prøven stop sydende. Knuse bladlus godt med pistil, som beskrevet i trin 3.2.
      Bemærk: Optimale væv opløsning opnås når bladlus er placeret mellem pistil og side af røret.
    2. I stinkskab, tilføje 800 µL guanidinium kaliumthiocyanat-phenol-chloroform udvinding reagens til prøven (1-5 voksne bladlus). Homogeniseres prøver med pistil og bortskaffe pistil.
  3. Faseadskillelse
    Bemærk: Alle trin skal udføres i et stinkskab.
    1. Inkuber de homogeniserede prøver for 5 min ved stuetemperatur. Tilføje 160 µL chloroform til prøven. Ryst kraftigt i hånden for 15 s.
    2. Der inkuberes i 2-3 min. ved stuetemperatur. Der centrifugeres i 15 min. ved 12.000 x g ved 4 ° C.
      Bemærk: Efter centrifugering, blandingen adskiller i 3 lag: en lavere, rød phenol-chloroform, en interfase og en farveløs øverste vandig fase. RNA er fortsat udelukkende i den vandige fase. Omfanget af den vandige bliver ~ 480 µL.
  4. RNA nedbør
    1. I et stinkskab, skal du overføre den vandige fase til en frisk, RNase-fri slange. Lave ikke forstyrre den mellemliggende fase.
    2. Bundfald RNA ved at tilføje 400 µL af isopropanol og inkuberes prøve ved-20 ° C i 10 min.
      Bemærk: Protokollen kan blive standset her, og prøver kan opbevares ved-20 ° C op til 24 timer.
    3. Centrifugeres prøve i 10 min på 12.000 x g ved 4 ° C.
  5. RNA vask og eluering
    1. Fjern supernatanten; Watch for RNA pellet.
    2. Skyl RNA toerstoffet med 1 mL af 75% ethanol i DEPC-behandlet vand. Mix af langsomme vortexing. Der centrifugeres i 5 min på 7.500 x g ved 4 ° C.
    3. Gentag trin 5.5.1–5.5.2 for at hjælpe med at fjerne phenol forurenende stoffer.
    4. Fjern supernatanten og luft tørre pellet i 5-10 min. med tube æglæggende vandret åben på en steril bænk. Lad ikke RNA pellet tørre fuldstændigt.
    5. Opløse RNA pellet i 30 µL af RNase-fri eller DEPC-behandlet vand. Forsigtigt pipetteres op og ned for at blande. Der inkuberes ved 55-60 ° C i 10-15 min.

6. RNAseq De Novo transkriptom forsamling, Kommentering og differentieret udtryk analyse

  1. Analysere RNA prøve koncentration og kvalitet ved hjælp af en chip-baserede kapillær elektroforese system.
    Bemærk: En chip-baserede kapillær elektroforese system er metoden bedre valg end analysere med et spektrofotometer, fordi det giver en mere præcis og følsom foranstaltning af RNA koncentration og kvalitet.
    1. Hvis prøverne er af passende kvalitet (≥ 250 ng samlede, RIN (RNA integritet antallet) ≥ 5), udføre RNA sekvensering.
      Bemærk: Vigtigere, fordi denne sequencing data vil blive brugt til begge udtryk profilering og de novo transkriptom forsamling, mere læse dybde vil resultere i en højere kvalitet transkriptom. For en rimelig omfattende samling ved hjælp af Illumina sekventering teknologi, 100 – 200 millioner 100 bp, ville parrede ende læser være en anbefalede udgangspunkt. Samlede mRNA bibliotek forberedelse og RNA sekventering blev udført af en sekventering facilitet.
  2. Kontrollere kvaliteten af læsninger ved hjælp af hurtigt QC22.
  3. Kombiner alle prøve læsninger og samle transkriptom de novo ved hjælp af Trinity23,24 (Trimmomatic kvalitet filtrering aktiveret).
  4. Forfine forsamlingen
    1. Brug Transdecoder25 til at identificere åbne læserammer (ORFs), der er et minimum af 100 aminosyrer i længden.
    2. Udføre homologi søger efter de oversatte ORFs mod Pfam26 og UniProt27 databaser ved hjælp af BLASTP28 og HMMER29, henholdsvis.
    3. Fjernes bakteriel udskrifter (enhver oversat sekvens hvis bedste BLAST ramte var at et bakterielt gen med en smule score på over 300 og en minimum aminosyre sekvens identitet på 50%).
    4. Skjule en komplet, oversatte ORFs, der er på mindst 99% identiske på aminosyre niveau ved hjælp af CD-HIT30.
    5. Skjule de resterende, ufuldstændige ORFs, der er mindst 95% identiske på nukleotid niveau ved hjælp af CD-HIT30.
    6. Tildel de resterende nukleotidsekvenser med unikke, artsspecifikke identifikatorer (fx APHNE 0001).
  5. Vurdere fuldstændigheden af de raffinerede forsamling, ved hjælp af BUSCO (http://busco.ezlab.org/) og leddyr gen datasæt31.
  6. Transkriptom anmærkning
    1. Først, anmærke det raffinerede transkriptom ved hjælp af HMMER mod Pfam database26,29.
    2. Andet, anmærke transkriptom ved hjælp af BLASTP mod UniProt database27,28.
    3. For det tredje, anmærke transkriptom ved hjælp af BLASTP mod de kodning sekvenser af valgte insekter med offentliggjorte, kommenteret genomer.
    4. Sidst, anmærke transkriptom ved hjælp af BLASTP mod ært bladlus protein database kun.
    5. Brug Trinotate til at generere GO anmærkninger fra UniProt tiltrædelser.
    6. Brug Trinotate til at organisere alle anmærkning resultaterne i en SQLite database og generere en anmærkning rapport.
  7. Differential udtryk analyse
    Bemærk: Ved hjælp af den raffinerede transkriptom som reference, justere og kvantificere hvert bibliotek separat.
    1. Brug Trimmomatic til kvalitet-filter og trim oprindelige læse filer32.
      Bemærk: Hvis udfører dette trin efter en Trinity forsamling, kan man i stedet bruge Trimmomatic output fra dette skridt.
    2. Udføre lokale tilpasninger for hver prøve ved hjælp af Bowtie233.
    3. Uddrag Læs tæller fra hver prøve individuelt ved hjælp af SAMtools34.
    4. Beregne det differentierede udtryk mellem prøver af interesse ved hjælp af DESeq2 med standardparametre og en parametrisk passer35.

7. qPCR verifikation af varierende udtrykte gener

Bemærk: Hvis brugerne er interesserede i varierende udtrykte gener fra deres RNAseq eksperimenter, følgende protokol kan bruges til at kontrollere mønstre af differential udtryk.

  1. Generere RNA prøver, som beskrevet ovenfor (trin 5).
  2. Kvantificere RNA ekstraktioner bruger et spektrofotometer til at kontrollere kvaliteten og opnå koncentrationen.
  3. Syntetisere cDNA prøver ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit som pr fabrikantens anbefaling.
  4. Bestemme primer effektivitetsgevinsterne for gener af interesse at sikre nøjagtig dobbelt PCR-amplifikation.
    1. Baseret på oprindelige RNA koncentrationer, udføre serielle fortyndinger (101) at opnå 3 cDNA koncentrationer.
    2. Ved hjælp af en kvantitativ PCR master mix, mix tredobbelt qPCR reaktioner efter producentens protokol bruger tre primer koncentrationer (f.eks. 100 nM, 200 nM, 300 nM) med tre seriefremstillede fortyndet cDNA koncentrationer (f.eks. 0,1 ng/µL, 10 NG/µL, 100 ng/µL).
    3. For hvert mål gen, beregne hældningen (m) af den linje, der er oprettet ved hjælp af Ct gennemsnitsværdier for hver prøve som de afhængige variabler og log (cDNA koncentration) som de uafhængige variabler (tre punkter samlede).
    4. Bruge følgende ligning for at beregne primer effektivitet (E) hvor m er den hældning, der beregnes i 7.4.3:
      E = 10^(-1/m)
      Bemærk: Primer effektivitetsgevinster mellem 90-110% er velegnet til analyser. Denne proces sikrer lige forstærkning af alle gener medtages i beregningerne.
  5. Brug metoden ΔΔCt med en husholdning gen for at kvantificere den differentiale udtryk for gener af interesse36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Plant kulturer: Frø vil tage ca. to til fire uger, afhængig af sæsonen, for at vokse stort nok til at være re potteplanter (fig. 1A). Re potteplanter frøplanter vil tage endnu to til fire uger at vokse til en optimal størrelse for bladlus kulturer (figur 1B).

Bladlus kulturer: Voksen A. nerii er kendetegnet ved nogle mørkelagt cauda og kan være unwinged (apterous, fig. 3A, B) eller bevingede (alate, figur 3C, D). Udvikle wing puder bliver synlige, når nymfer når den tredje instar (figur 3E, F). Stock kulturer bevares bedst ved at overføre en til tre midten instar og én voksen-alderen unwinged bladlus; Dette sikrer en sund, blandet befolkning. Befolkninger der skal bruges til forsøg bør være kulturperler ved hjælp af unwinged bladlus, som beskrevet ovenfor (2.4). En A. nerii voksen kan producere 3-10 afkom pr. dag, afhængig af vært plante og bladlus10år.

DNA og RNA ekstraktioner: Enkelt, voksen A. nerii vil give ca 100 – 200 ng/µL DNA (80 µL eluering; Figur 4 A) og 150-300 ng/µL RNA (30 µL eluering; Figur 4 B). repræsentant microsatellite toppe er vist i figur 5. Repræsentative relative udtryk for en kandidat gen på tre betingelser (kontrol, behandling 1, behandling 2) er beregnet i tabel 2 og vist i figur 6.

Figure 1
Figur 1 : Repræsentant planter til bladlus kulturer. (A) stiklinger kan være re potteplanter, efter de har udviklet deres første fulde sæt af løvblade. (B) planter kan bruges til bladlus kulturer, når de har udviklet 3-4 sæt af løvblade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Eksempler på værktøjer, der anvendes til dyrkning af bladlus. (A) munden pipetter kan oprettes ved hjælp af ID 3/16" x 1/4" OD plastslanger, en 1.000 µL pipette spids og en 200 µL pipette tip. (B, C) Bruge cup bure (klar plast kopper med toppen afskåret og sikret med finmasket) til sikkert passe over toppen af 4 i. puljer anvendes til bladlus kulturer. Dette giver mulighed for masser af lys og ventilation til at skabe et gunstigt miljø for bladlus og plante, og holder bladlus indeholdt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Repræsentant voksen og nymfe Aphis nerii. (A, B) Apterous (unwinged) voksen A. nerii er identificeret af mørkelagt cauda på deres bagerste ende. (C, D) Alate (vingede) voksne er identificeret af fuldt udviklede vinger og formørket cauda på deres posterior. (E, F) Udvikle A. nerii nymfer gå gennem fire instar stadier og udvikle wing puder tydeligt under den tredje instar fase. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Repræsentant geler. (A) DNA ekstraktioner (1 kb stigen). Syv A. nerii DNA ekstraktioner er visualiseret i baner 3-9. Negativ kontrol er i lane 10. (B) RNA ekstraktioner. 11 A. nerii RNA ekstraktioner er visualiseret i baner 3-13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Repræsentant microsatellite toppe. 6-FAM-mærkede toppe er visualiseret i blå. LIZ-500 stigen er vist i orange. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : qPCR verifikation af et varierende udtrykte gen. Repræsentative mRNA relativ mængde (RQ) udtryk (beregnet ved hjælp af metoden ΔΔCt, tabel 2) vist for en kandidat gen af interesse på tre betingelser: kontrol, behandling 1, behandling 2. Grafen viser nedsat udtryk for kandidat gen under behandlinger 1 og 2 i forhold til kontrol (tabel 2). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Primer navn Retning Rækkefølge (5' - 3')
Ago24_F frem TTTTCCCGGCACACCGAGT
Ago24_R omvendt GCCAAACTTTACACCCCGC
Siden 53_F frem TGACGAACGTGGTTAGTCGT
Siden 53_R omvendt GGCATAACGTCCTAGTCACA
Siden 59_F frem GCGAGTGGTATTCGCTTAGT
Siden 59_R omvendt GTTACCCTCGACGATTGCGT
Siden 66_F frem TCGGTTTGGCAACGTCGGGC
Siden 66_R omvendt GACTAGGGAGATGCCGGCGA
Siden 69_F frem CGACTCAGCCCCGAGATTT
Siden 69_R omvendt ATACAAGCAAACATAGACGGAA
Siden 84_F frem GACAGTGGTGAGGTTTCAA
Siden 84_R omvendt ACTGGCGTTACCTTGTCTA
Siden 89_F frem GAACAGTGCTCGCAGTCTAT
Siden 89_R omvendt GACAGCGTAAACATCGCGGT
Siden 126_F frem GGTACATTCGTGTCGATTT
Siden 126_R omvendt TAAACGAAAAAACCACGTAC

Tabel 1: Microsatellite primer sekvenser bruges til genotype Aphis nerii 20 .

Target Stikprøve CT middelværdi CT Std. Dev ΔCt AVG. ΔCt ΔΔCt RQ=2^(-ΔΔCt) RQ SEM
ef1a 1.1 22.59 0
ef1a 1.2 20.31 0
ef1a 1.3 20.36 0.226
ef1a 1.4 20.27 0,036
ef1a 1.5 20.55 0,003
ef1a 1,6 20.52 0.245
ef1a 2.1 20.49 0.082
ef1a 2.2 19.86 0.033
ef1a 2.3 20.19 0.037
ef1a 2.4 19.67 0.058
ef1a 2.5 20.25 0.188
ef1a 2.6 18.16 0.089
ef1a 3.1 20,93 0.157
ef1a 3.2 20.22 0,003
ef1a 3.3 20.44 0.039
ef1a 3.4 20.91 0.559
ef1a 3.5 20.63 0.017
ef1a 3.6 20.3 0.135
gen af interesse 1.1 24,6 0.173 2,01 0 1
gen af interesse 1.2 24.25 0.019 3,94 2.975 0 1 0
gen af interesse 1.3 24,79 0,04 4.43 0 1
gen af interesse 1.4 25.23 0,285 4.96 4.695 0 1 0
gen af interesse 1.5 24,6 0.103 4.05 0 1
gen af interesse 1,6 25.08 0.033 4.56 4.305 0 1 0
gen af interesse 2.1 27.52 0,155 7,03 5.019033762 0.03084042
gen af interesse 2.2 27.23 0.061 7.37 7.2 3.428355679 0.092888533 0.031024057
gen af interesse 2.3 27.18 0.058 6,99 2.56158174 0.169389724
gen af interesse 2.4 27.45 0 7,78 7.385 2.820764967 0.141535419 0.013927153
gen af interesse 2.5 27.44 0,032 7.19 3.138956897 0.113521944
gen af interesse 2.6 28 0 9.84 8.515 5.284272079 0.025661119 0.043930413
gen af interesse 3.1 27.23 0.143 6.3 4.292437371 0.051032588
gen af interesse 3.2 27.05 0.088 6.83 6.565 2.891234282 0.134788164 0.041877788
gen af interesse 3.3 27.45 0.109 7,01 2.578145722 0.167456035
gen af interesse 3.4 27.58 0.019 6,67 6,84 1.709038085 0.305863936 0.069203951
gen af interesse 3.5 27,06 0.067 6.43 2.384498984 0.191511246
gen af interesse 3.6 27.36 0 7.06 6.745 2.513723938 0.175103043 0.008204101

Tabel 2: beregninger for qPCR ΔΔC t verifikation af kandidat gen. Kandidat genekspression beregnes i forhold til ef1a (figur 6). Prøver 1.1-1.6 repræsenterer seks biologiske replikater under kontrol behandling; prøver 2.1-2.6 repræsenterer seks biologiske replikater under behandling 1; prøver 3.1-3.6 repræsenterer seks biologiske replikater under behandling 2. Ct Std. Dev. beregnes ud fra tre tekniske replikater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det har længe været anerkendt, at aposematic A. nerii kan give indsigt i de mønstre og mekanismer af resistens over for planten forsvar og især kemisk binding18,37. En række af genomisk ressourcer er for nylig opstået i A. nerii10, tilbyder nye muligheder for økologisk og funktionelle genomisk undersøgelser, der bruger A. nerii som model. Vi redegøre for grundlæggende protokoller i bladlus og plant kultur og molekylær/genomisk teknikker, med den antagelse, at fremtidige arbejde på denne art sandsynligvis vil inddrage undersøgelser, der udnytter genomisk og funktionelle økologiske metoder. Mange uafklarede spørgsmål forblive om mekanismer og betydningen af cardenolide afgiftning og binding i A. nerii. Teknikker såsom RNAi for udtryk knockdown eller gen redigering tilgange vil vise sig værdifulde i denne henseende.

En af udfordringerne i dyrkning bladlus er i deres uhyre kapacitet til reproduktion og spredning. Disse træk, som direkte vedrører hvorfor de er alvorlige afgrøde skadedyr, betyder, at bladlus kulturer kræver næsten daglige opmærksomhed, som godt som extreme care hvis isogene linjer er kræves til eksperimenter. Teknikkerne, der er beskrevet ovenfor, herunder dem til at generere data til analyse af genekspression, mens ligner almindelige protokoller for bladlus opdræt og molekylær analyse, give en specifik trinvis vejledning til at generere tilstrækkelig biologisk materiale til A. nerii for et mangfoldigt sæt af molekylære og økologiske applikationer.

Med henblik herpå, hvis funktionelle eller økologiske genomisk undersøgelser er på horisonten for A. nerii, skal disse være kombineret med levende kulturer at fuldt ud udnytte de eksperimentelle muligheder, de tilbyder. Insekt planteædere live i komplekse samfund på deres værtsplanter, og både intraspecific interaktioner38,39 samt artskrydsede interaktioner40 forme det ultimative svar af A. nerii til deres værtsplanter . Værtsplanter, A. nerii specialiserer sig på, udgør et varieret sæt af planter, som udtrykker divergerende livshistorie strategier15,21, hvilket understreger betydningen af kobling rent genomisk eller fysiologiske tilgange med eksperimentelle manipulationer, der tegner sig for naturligt forekommende variation i A. nerii Fællesskaberne. De metoder, der er skitseret her udgangspunktet for en funktionel og økologiske genomisk perspektiv på A. nerii og dens samspil med giftige værtsplanter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Michelle Moon (Vanderbilt University) for assistance med fotografering. Vanderbilt University givet støtte til PA og SSLB understøttes af DGE-1445197.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sun Gro Fafard Germination Mix Hummert International 10-0952-2
Sun Gro Fafard 3B/ Metro Mix Hummert International 10-0951-2
2" x 4" Round Standard Pot Anderson Pots 1503
DreamTaq DNA Polymerase ThermoFisher Scientific EP0701
Trizol ThermoFisher Scientific 15596026
SuperScript® III First-Strand Synthesis kit ThermoFisher Scientific 18080051
Power SYBR Green PCR Master Mix ThermoFisher Scientific 4367659

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brisson, J. A., Stern, D. L. The pea aphid, Acyrthosiphon pisum.: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies. BioEssays. 28, 747-755 (2006).
  2. Dixon, A. F. G. Aphid Ecology: An Optimization Approach. , Springer. Netherlands. (1985).
  3. Consortium, T. I. A. G. Genome Sequence of the Pea Aphid Acyrthosiphon pisum. PLoS Biology. , 1000313 (2010).
  4. Srinivasan, D. G., Brisson, J. A. Aphids: A Model for Polyphenism and Epigenetics. Genetics Research International. 2012, 1-12 (2012).
  5. Wenger, J. A., et al. Whole genome sequence of the soybean aphid, Aphis glycines. Insect Biochememistry and Molecular Biology. , 1-10 (2017).
  6. Aphidbase. Genouest.org. , Available from: bipaa.genouest.org/is/aphidbase/ (2018).
  7. Li, Z. -Q., et al. Ecological adaption analysis of the cotton aphid (Aphis gossypii) in different phenotypes by transcriptome comparison. PLoS ONE. 8, 83180 (2013).
  8. Wang, D., Liu, Q., Jones, H. D., Bruce, T., Xia, L. Comparative transcriptomic analyses revealed divergences of two agriculturally important aphid species. BMC Genomics. 15 (1), 1023-1024 (2014).
  9. Wu, S., et al. De novo characterization of the pine aphid Cinara pinitabulaeformis Zhang et Zhang transcriptome and analysis of genes relevant to pesticides. PLoS ONE. 12, 0178496-0178517 (2017).
  10. Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C., Gerardo, N. M., Abbot, P. Transcriptional profile and differential fitness in a specialist milkweed insect across host plants varying in toxicity. Molecular Ecology. , (2017).
  11. Dixon, A. F. G. Insect Herbivore-Host Dynamics. , Cambridge University Press. Cambridge. (2005).
  12. Goggin, F. L. Plant-aphid interactions: molecular and ecological perspectives. Current Opinion in Plant Biology. 10, 399-408 (2007).
  13. Will, T., Furch, A., Zimmermann, M. R. How phloem-feeding insects face the challenge of phloem-located defenses. Frontiers in Plant Science. 4, 1-12 (2013).
  14. Webster, B. The role of olfaction in aphid host location. Physiological Entomology. 37, 10-18 (2012).
  15. Agrawal, A. A., Petschenka, G., Bingham, R. A., Weber, M. G., Rasmann, S. Toxic cardenolides: chemical ecology and coevolution of specialized plant-herbivore interactions. New Phytologist. 194, 28-45 (2012).
  16. Dobler, S., Petschenka, G., Pankoke, H. Coping with toxic plant compounds- the insect's perspective on iridoid glycosides and cardenolides. Phytochemistry. 72, 1593-1604 (2011).
  17. Opitz, S. E. W., Müller, C. Plant chemistry and insect sequestration. Chemoecology. 19, 117-154 (2009).
  18. Birnbaum, S. S. L., Abbot, P. Insect adaptations toward plant toxins in milkweed-herbivores systems - a review. Entomologia Experimentalis et Applicata. 58, 579-610 (2018).
  19. Rothschild, M., von Euw, J., Reichstein, T. Cardiac glycosides in the oleander aphid, Aphis nerii. Journal of Insect Physiology. 16, 1141-1145 (1970).
  20. Harrison, J. S., Mondor, E. B. Evidence for an invasive aphid 'superclone': extremely low genetic diversity in oleander aphid (Aphis nerii) populations in the southern United States. PLoS ONE. 6, 17524 (2011).
  21. Mooney, K. A., Halitschke, R., Kessler, A., Agrawal, A. A. Evolutionary trade-offs in plants mediate the strength of trophic cascades. Science. 327, 1642-1644 (2010).
  22. Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. Bioinformatics. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2010).
  23. Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).
  24. Haas, B. J., et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis. Nature Protocols. 8, 1494-1512 (2013).
  25. Transdecoder. , Available from: http://transdecoder.sf.net (2018).
  26. Finn, R. D., et al. The Pfam protein families database: towards a more sustainable future. Nucleic Acids Research. 44, Database Issue 279-285 (2016).
  27. The UniProt Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Research. 45, 158-169 (2017).
  28. Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 1 (36), 5-9 (2008).
  29. Hmmer.org. , Available from: http://hmmer.org (2018).
  30. Fu, L., Niu, B., Zhu, Z., Wu, S., Li, W. CD-HIT: accelerated for clustering the next generation sequencing data. Bioinformatics. 28 (23), 3150-3152 (2012).
  31. Simão, F. A., Waterhouse, R. M., Ioannidis, P., Kriventseva, E. V., Zdobnov, E. M. BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs. Bioinformatics. 31, 3210-3212 (2015).
  32. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
  33. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9, 357-359 (2012).
  34. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
  35. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15, 31 (2014).
  36. Rieu, I., Powers, S. J. Real-time quantitative RT-PCR: design, calculations, and statistics. Plant Cell. 21, 1031-1033 (2009).
  37. Malcolm, S. B. Chemical defence in chewing and sucking insect herbivores: plant-derived cardenolides in the monarch butterfly and oleander aphid. Chemoecology. 1, 12-21 (1990).
  38. Agrawal, A. A., Underwood, N., Stinchcombe, J. R. Intraspecific variation in the strength of density dependence in aphid populations. Ecological Entomology. 29, 521-526 (2004).
  39. Zehnder, C. B., Hunter, M. D. A comparison of maternal effects and current environment on vital rates of Aphis nerii, the milkweed-oleander aphid. Ecological Entomology. 32, 172-180 (2007).
  40. Hartbauer, M. Collective defense of Aphis nerii and Uroleucon hypochoeridis (Homoptera, Aphididae) against natural enemies. PLoS ONE. 5, 10417 (2010).

Tags

Genetik spørgsmålet 138 bladlus drivhus milkweed microsatellite RNAseq qPCR plante-insekt interaktion
Opretholdelse af biologiske kulturer og måling af Gen-ekspression i <em>Aphis nerii</em>: et ikke-model System for plante-insekt interaktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C.,… More

Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C., Abbot, P. Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions. J. Vis. Exp. (138), e58044, doi:10.3791/58044 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter