Summary
Qui, presentiamo un protocollo per differenziare murino granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing linfociti T helper (THGM) da cellule T CD4 + ingenuo, incluso l'isolamento delle cellule T CD4 + Naive, differenziazione di THGM, e analisi delle cellule di THGM differenziate. Questo metodo può essere applicato agli studi del regolamento e la funzione delle cellule di THGM.
Abstract
Il fattore di stimolazione del granulocyte-macrofago-colonia (GM-CSF)-la produzione di cellule T helper (THGM) è un sottoinsieme di cellule helper T recentemente identificato che principalmente secerne GM-CSF senza produrre l'interferone (IFN) γ o interleuchina (IL) -17 e si trova a svolgono un ruolo essenziale nella neuroinfiammazione autoimmuni. Un metodo di isolamento di cellule T CD4 + ingenuo da una cella singola sospensione degli splenocytes e generazione di cellule THGM da cellule T CD4 + ingenuo sarebbe una tecnica utile nello studio dell'immunità mediata da cellule T e malattie autoimmuni. Qui descriviamo un metodo che differenzia le cellule di T di CD4 + ingenuo di topo in cellule di THGM promosse da IL-7. L'esito della differenziazione è stata valutata tramite l'analisi dell'espressione di citochine utilizzando diverse tecniche, tra cui intracellulare cytokine colorazione combinato con citometria a flusso, una reazione a catena quantitativa in tempo reale della polimerasi (PCR), e analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA). Utilizzando il protocollo di differenziazione THGM come descritto qui, circa il 55% delle cellule espresso GM-CSF con una minima espressione di IL2 o IL-17. L'espressione predominante di GM-CSF dalle cellule di THGM è stato ulteriormente confermato dall'analisi dell'espressione di GM-CSF, IL2 e IL-17 a livelli di mRNA e di proteina. Pertanto, questo metodo può essere utilizzato per differenziare le cellule CD4 + T naive a THGM cellule in vitro, che saranno utili nello studio della biologia delle cellule di THGM.
Introduction
Linfociti CD4 + T helper (TH) sono componenti essenziali del sistema immunitario, avendo un ruolo cruciale nella difesa ospite contro gli agenti patogeni microbici, nella sorveglianza del cancro e nell'autoimmunità1,2,3. Al momento dell'attivazione del ricevitore (TCR) di cellule T, cellule T CD4 + ingenuo possono essere differenziate in TH1, TH2, TH 17, o regolamentazione T (Treg) cellule sotto l'influenza di citochine differenti ambienti2,4, 5. recentemente, un nuovo subset di cellule TH , che produce principalmente GM-CSF, è stato identificato e denominato THGM6. La differenziazione delle cellule di THGM è guidata da IL-7 attraverso l'attivazione di un trasduttore di segnale e attivatore di trascrizione 5 (STAT5). Queste cellule esprimono una grande quantità di GM-CSF pur avendo una bassa espressione di altri TH-cell firma citochine quali IFNγ e IL-176. GM-CSF è stato trovato per svolgere un ruolo critico nello sviluppo di CD4 + T cellulo-mediata neuroinflammation7,8. Rispetto al IFNγ o IL-17-esprimendo le cellule T autoreattive, GM-CSF-esprimendo T cellule trasferito al selvaggio-tipo topi (WT) ha causati un inizio più iniziale di malattia e la maggiore severità di malattia. Inoltre, le cellule di T di QCS2- / - non riuscito ad indurre encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) dopo essere stato trasferito passivamente ai destinatari WT, mentre le cellule di T che mancano IFNγ o IL-17A mantenuto la capacità di mediare EAE7. Inoltre, un blocco di GM-CSF utilizzando anticorpi neutralizzanti ha migliorato EAE malattia gravità8. Inoltre, una carenza di STAT5 in cellule di T in topi ha provocato in una generazione di THGM diminuita e, quindi, in una resistenza dei topi a EAE sviluppo6. Questi risultati sottolineano l'importanza delle cellule di T di GM-CSF-esprimendoH nella malattia autoimmune neuroinfiammatorie. Quindi, stabilire un metodo per differenziare le cellule di T di GM-CSF-esprimendoH da cellule T CD4 + ingenuo sarebbe importante nello studio della patogenesi autoimmune neuroinflammation e immunitaria mediata da cellule T. Tuttavia, un protocollo che efficientemente genera cellule THGM da murino ingenuo che CD4 + non è stata stabilita.
Qui presentiamo un metodo che differenzia cellule murine THGM da cellule T CD4 + ingenuo. Questo protocollo descrive l'intera procedura, compreso l'estrazione della milza dal mouse, la preparazione di una sospensione unicellulare, la selezione positiva CD4, la cella di fluorescenza-attivato ordinano (FACS) e la cellula di TH differenziazione e analisi. Il differenziato cellule T helper vengono analizzate da intracellulare cytokine colorazione combinato con citometria a flusso per determinare l'espressione di citochine a livello di singola cellula, mediante una PCR quantitativa in tempo reale per determinare l'espressione di citochine a livello di mRNA, e da ELISA per valutare l'espressione di citochine a livello di proteina. Questo metodo può essere applicato agli studi di biologia cellulare THGM in varie condizioni, come ad esempio EAE, dove GM-CSF svolge un ruolo importante nella patogenesi.
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Protocol
Tutti i topi usati in questo protocollo sono stati il background genetico C57BL/6 e alloggiati in condizioni da organismi patogeni specifiche presso la National University of Singapore. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando protocolli approvati dal comitato di uso della Università nazionale di Singapore e istituzionali Animal Care.
1. reagenti e preparazione del materiale
- Preparare 500 mL di tampone fosfato salino (PBS) contenente 2% siero bovino fetale (FBS) e 1 millimetro di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA).
Nota: Mantenere il buffer sul ghiaccio durante l'intera procedura per ottenere risultati ottimali. - Preparare 50 mL di completo supporto RPMI contenente RPMI 1640, 10% FBS e 1% di penicillina-streptomicina. Utilizzare supporti RPMI completi contenente 50 µM β-mercaptoetanolo per la differenziazione delle cellule di THGM. Aggiungere il β-mercaptoetanolo in una cappa aspirante.
- Preparare 7,5 mL di una miscela di anticorpi anti-CD3e diluendo stock anti-CD3e concentrato a 3 μg/mL in PBS. Cappotto 48 pozzetti aggiungendo 150 µ l della miscela dell'anticorpo ad ogni pozzetto e incubare la piastra a 37 ° C per almeno 1 h, o a 4 ° C durante la notte.
- Sterilizzare un paio di forbici e pinze e tenerli in etanolo al 70% tra le dissezioni.
2. preparazione degli Splenocytes murini
- Eutanasia del mouse (di 6 – 8 settimane vecchie) utilizzando un istituzionalmente approvato CO2 asfissia o dislocazione cervicale. Spruzzare il mouse con etanolo al 70% e montarlo su un blocco di polistirolo sulla sua schiena. Trasferire il mouse a una sicurezza microbiologica per procedere con i passaggi seguenti.
- Tenere la pelle usando un paio di pinze e tagliare la pelle sotto la gabbia toracica sul lato sinistro per circa 4 cm, utilizzando un paio di forbici. Aprire il sac peritoneale per esporre la milza e utilizzare pinze sterili per estrarre la milza.
- Collocare un filtro cella 70 μm su un tubo da 50 mL e pre-bagnare con 2 mL di tampone. Posizionare le milze sul filtro cella (2 – 3 milze per filtro di una cella) e macerare li usando l'estremità di un pistone della siringa 5 mL.
- Risciacquare il filtro e il tubo parecchie volte con 1 – 2 mL di buffer di isolamento cella fino a quando tutte le celle vengono scaricate nel tubo. Eliminare il filtro cella e centrifugare le cellule a 350 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare con 5 mL di freddo (4 ° C) ammonio-cloruro-potassio (ACK) Lisi buffer (150mm NH4Cl, 10mm KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA; pH 7,2-7,4) e mescolare delicatamente per 2 minuti aggiungere 10 mL di multimediale RPMI completo per neutralizzare l'ACK buffer e centrifugare immediatamente le cellule a 350 x g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante dopo la centrifugazione.
3. isolamento di CD4 + T Cells utilizzando microsfere magnetiche CD4 e una colonna di separazione cellulare
- Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di buffer di isolamento delle cellule. Filtrare la sospensione cellulare utilizzando un filtro di pre-separazione (30 μm) in una nuova provetta da 15mL per rimuovere eventuali detriti.
- Prendere 10 μL della sospensione cellulare e fare una diluizione di 10 x aggiungendo 90 μL di tampone. Prendere 10 μL della sospensione delle cellule diluito e mescolare con 10 μL di trypan blu per il conteggio delle cellule. Contare le celle in un emocitometro per determinare il rendimento di cellule vitali.
- Centrifugare le cellule a 350 x g per 5 min a 4 ° C e scartare il surnatante.
- Risospendere le cellule in 90 μL di tampone per 107 cellule. Aggiungere 10 μL di microperle magnetiche CD4 per 107 cellule. Incubare le cellule per 15 min a 4 ° C. Per risultati ottimali, miscelare la sospensione cellulare delicatamente ogni 5 minuti durante l'incubazione.
- Mentre sono incubando le cellule, è possibile posizionare una colonna di separazione sul supporto magnetico. Pre-bagnato la colonna con 2 mL di tampone.
- Alla fine dell'incubazione delle cellule/tallone, lavare le cellule con 5 mL di tampone e li Centrifugare a 350 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
- Risospendere le cellule in 1 mL di tampone, caricare il campione nella colonna di separazione cellulare e lasciarlo fluire attraverso. Utilizzare una provetta per centrifuga 15 mL per raccogliere la frazione di cellule CD4. Aggiungere 1 mL di tampone per lavare il serbatoio prima che sia asciutto. Ripetere la fase di lavaggio 2 x.
- Rimuovere la colonna di separazione delle cellule dal supporto magnetico e posizionarlo su una nuova provetta da centrifuga da 15 mL. Aggiungere 2 mL di buffer di isolamento delle cellule nella colonna di separazione cellulare e applicare lo stantuffo saldamente per forzare le celle dalla colonna.
- Centrifugare la frazione a 350 x g per 5 min a 4 ° C per ottenere cellule CD4 +. Scartare il surnatante.
4. purificazione delle cellule T CD4 + Naive (CD4+CD25–CD44loCD62LCiao) di differenziazione di ordinamento delle cellule e THGM fluorescenza-attivato
- Risospendere il pellet di cellule CD4 + ottenuto in 500 µ l di tampone. Mescolare le cellule con una miscela di anticorpi coniugati fluorescenti contenenti CD4-PerCp (2,8 µ g/mL), CD44-APC (2,4 µ g/mL), CD25-PE (2 µ g/mL) e CD62L-FITC (10 µ g/mL) (tabella 1). Incubare le cellule in ghiaccio per 20 – 30 minuti, mentre li protegge dalla luce.
Nota: Le concentrazioni degli anticorpi sono state ottimizzate in precedenza in laboratorio. Il numero di anticorpi elencati è per celle da 1 – 2 topi. - Dopo l'incubazione, lavare le cellule con 5 mL di tampone e centrifugare le cellule a 350 x g per 5 min a 4 ° C.
- Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 500 µ l di tampone. Filtrare le celle utilizzando una rete di nylon.
- Trasferire la sospensione cellulare in una provetta di FACS per l'ordinamento delle cellule. Precoat i tubi di raccolta FACS con 500 µ l di tampone.
- Ottenere un CD4+CD25–CD44loCD62LCiao popolazione (di ingenuo CD4+ T cellule) ordinando FACS. Cancello il CD4+CD25– prime e quindi selezionare CD44loCD62LCiao cellule da questa popolazione.
- Raccogliere l'ingenuo CD4+ T cell frazioni in una nuova provetta da centrifuga 15 mL. Centrifugare le cellule a 350 x g per 5 min a 4 ° C e scartare il surnatante.
- Risospendere le cellule di T di CD4 + ingenuo ad una concentrazione di 106 cellule/mL in completo supporto RPMI contenente 50 µM β-mercaptoetanolo.
- Aspirare gli anticorpi di anti-CD3e utilizzati per spre-spalmatura in lastra 48 pozzetti. Le cellule di seme 0,25 milioni (250 µ l) in ciascun pozzetto con IL-7 (2 ng/mL), anti-CD28 (1 µ g/mL) e anti-IFNγ (10 µ g/mL) (tabella 1).
Nota: Le concentrazioni di citochine e gli anticorpi sono state ottimizzate in precedenza in laboratorio per una differenziazione delle cellule di THGM. - Incubare le cellule a 37 ° C con 5% CO2 per 3 giorni. Non modificare il mezzo durante l'incubazione.
5. analisi delle cellule di GM del Mouse THgenerato In Vitro
- Utilizzando un microscopio, controllare la differenziazione cellulare 3 d dopo la differenziazione. Raccogliere le cellule e loro Centrifugare a 350 x g per 5 min a 4 ° C. Lavare le cellule 2 x con completo supporto di RPMI.
Nota: Le cellule differenziate sono più ampie rispetto alle cellule di T di CD4 + ingenuo. - Risospendere le cellule in 1 mL di multimediale completo RPMI. Prendere 10 µ l di sospensione cellulare e mescolare bene con 10 μL di trypan blu per determinare il numero di cellulare con un emocitometro. Dividere le cellule differenziate in tre pozioni per una restimolazione e analisi.
Nota: Intracellulari di cytokine colorazione e saggi ELISA richiedono ≥0.5 milione cellule e analisi qPCR richiedono ≥ 1 milione cellule. -
Per la colorazione intracellulare cytokine, stimolare le cellule con forbolo miristato 12 13-acetato (PMA) (100 ng/mL) e ionomicina (1 μg/mL) in presenza di un inibitore del trasporto di proteine (1 µ l/mL) per 4-6 h.
- Raccogliere le cellule e li macchia con l'anticorpo anti-CD4 (PerCP-coniugato, 0,2 mg/mL, diluizione 1: 100; o coniugato FITC, 0,5 mg/mL, diluizione 1: 100) per 30 min.
- Fissare le cellule con 200 μL di tampone di fissazione per 20 – 60 min. Dopo la fissazione, lavare le cellule 2 x con 1 mL di tampone di permeabilizzazione.
- Eseguire la colorazione intracellulare con gli anticorpi contro il GM-CSF (PE-coniugato, 0,2 mg/mL, diluizione 1: 100), IL-17A (FITC-coniugato, 0,5 mg/mL, diluizione 1: 100; APC-conjugated, 0,2 mg/mL, diluizione 1: 100), IL-4 (APC-coniugato, 0,2 mg/mL, diluizione 1: 100) e IFNγ (APC-coniugato, 0,2 mg/mL, diluizione 1: 100; PE-conjugated, 0,2 mg/mL, diluizione 1: 100) per 30 min al buio.
- Per un'analisi qPCR dell'espressione genica citochina da cellule differenziate, attivare le cellule con piastra-associazione anti-CD3e (3 μg/mL) (precoating la piastra come descritto al punto 1.3). A 3 h dopo la stimolazione, raccogliere le cellule per isolare RNA totale usando un reagente di estrazione del fenolo RNA per prepararsi la qPCR di cDNA. I primer e il programma utilizzato per la qPCR sono riportati nelle tabelle 2 e 3, rispettivamente.
- Per l'analisi della secrezione della proteina citochina da cellule differenziate, stimolare le cellule con piastra-associazione anti-CD3e (3 μg/mL) per 24 h (precoating la piastra come descritto al punto 1.3). Raccogliere il surnatante per IL-17 e GM-CSF ELISA per determinare le loro concentrazioni di coltura cellulare.
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Representative Results
Cellule T CD4 + Naive isolate da due 8-settimana-vecchio maschio C57BL/6 topi sono stati divisi in tre porzioni. Una porzione delle cellule è stata differenziata in cellule di THGM seguendo il protocollo descritto. Un'altra porzione è stata coltivata in una condizione di THGM in presenza dell'anticorpo anti-IL-4 (10 µ g/mL) per testare l'influenza di un blocco di IL-4 nella differenziazione delle THGM. L'ultima parte è stata coltivata in una condizione di differenziazione 17 TH(3 µ g/mL anti-CD3e, 1 µ g/mL anti-CD28, 10 ng/mL TGFβ, 30 ng/mL IL-6, 10 µ g/mL anti-IFNγ e 10 µ g/mL anti-IL-4). Dopo 3 giorni di differenziazione, le cellule sono state raccolte e restimolate per analizzare l'espressione di citochine intracellulari di cytokine colorazione, qPCR e ELISA. Risultati dalla macchiatura intracellulari di cytokine e analisi al FACS ha dimostrato che circa il 55% delle cellule coltivate sotto la condizione di differenziazione THGM erano GM-CSF-esprimendo le cellule (Figura 1A), mentre solo circa il 2% delle cellule differenziato sotto TH17 condizione espressa di GM-CSF. Inoltre, rispetto alla condizione di differenziazione 17 THche generato 8.17% cellule producono IL-17, la condizione di differenziazione THGM solo portato a circa l'1% delle cellule che esprimono IL-17. Sotto le condizioni di due differenziazione testate, solo una piccola frazione delle cellule espresso IFNγ (< 1%). Inoltre, alcune cellule di T che esprimono IL-4 (< 1%) sono stati veduti nella cultura 17 GMHT o TH(Figura 1B). Questi risultati hanno mostrato che utilizzando la condizione di differenziazione di cellule THGM descritta, aver generato i linfociti T helper che esprimono principalmente GM-CSF.
La differenziazione di successo delle cellule di THGM è stato ulteriormente confermata dai risultati di qPCRs e dosaggi ELISA per esaminare l'espressione di GM-CSF e IL-17 a livelli di RNA e di proteine in cellule differenziate. Le cellule di THGM generate avevano un'espressione significativamente più alta di QCS2 ma un'espressione molto più bassa di Il17 rispetto a TH17 cellule (Figura 2A). Come illustrato nella Figura 2B, proteina di GM-CSF è stata rilevata nel sovranatante da sia GMHT e TH17 cellule. Tuttavia, la concentrazione di GM-CSF nel surnatante della cultura THGM era circa triplo di quello in TH17 cellule. Inoltre, proteine di IL-17 (Figura 2B), IFNγ e IL-4 erano inosservabili in coltura delle cellule di THGM surnatante. Poiché RORγt è stato identificato come il fattore di trascrizione master di TH17 cellule, mentre STAT3 e STAT5 hanno dimostrate di avere una grande importanza nello sviluppo di TH17 e cellule THGM, rispettivamente, abbiamo esaminato i loro mRNA espressione nelle cellule THGM e TH17. È stato trovato che le cellule di THGM avevano un'espressione significativamente più bassa del Rorc e un' più alta espressione di Stat5 rispetto a TH17 cellule (Figura 3). Interessante, le cellule di THGM avevano un'espressione leggermente inferiore (ma non significativa) di Stat3 genica rispetto a TH17 cellule. Questi risultati hanno indicato che anche se il GMHT e TH17 differenziazione sono regolati da diversi fattori trascrizionali, potrebbero condividere alcune caratteristiche comuni.
Figura 1: Le cellule THGM principalmente espressa GM-CSF. GM di THe TH17 cellule sono state raccolte il giorno 3 dopo la differenziazione. (A) per 5 ore, le cellule sono state restimolate con PMA e ionomicina in presenza di un inibitore della proteina di trasporto. L'espressione di GM-CSF, IL-17 e IFNγ è stato analizzato da intracellulari di cytokine colorazione seguita da citometria a flusso. (B) l'IL-4 e IFNγ espressione di TH17 o cellule THGM è stato analizzato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Espressione di IL-17, IFNγ e GM-CSF in TH17 e cellule THGM. GM di THe TH17 cellule sono state raccolte e restimolate con piastra-associazione anti-CD3e, 3 giorni dopo la differenziazione. (A) le cellule sono state raccolte per isolare RNA per la preparazione di cDNA, 3 h dopo la stimolazione. Le espressioni di Ifng, Il-17e QCS2 sono state determinate mediante una PCR quantitativa in tempo reale (qPCR). (B) il surnatante della cultura è stato raccolto a 24 h dopo la stimolazione, per determinare la concentrazione di GM-CSF in cellule di THGM, o cellule di IL-17 in TH17, da ELISA. (* * p < 0.01, * * * p < 0,001.) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rorc, Stat3 e Stat5 espressione genica in cellule di THGM e TH17. Sono state raccolte differenziate GM di THe TH17 cellule e restimolato con piastra-associazione anti-CD3e per 3 h. RNA totale è stato isolato per preparare cDNA. Le espressioni Rorc, Stat3e Stat5 sono state determinate mediante qPCR. (* p < 0,05, * * p < 0.01; NS = non significativo.) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Nome | Concentrazione d'archivio | concentrazione di lavoro | Diluizione | volume in 500 μL di tampone di colorazione |
| CD4-PerCp | 0,2 mg/mL | 2,8 μg/mL | 1: 71 | 7 ΜL |
| CD44-APC | 0,2 mg/mL | 2.4 μg/mL | 1:83 | 6 ΜL |
| CD25-PE | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | 5 ΜL |
| CD62L-FITC | 0,5 mg/mL | 10 μg/mL | 01:50 | 10 ΜL |
| GM-CSF-PE | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-17A-FITC | 0,5 mg/mL | 5 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-17A-APC | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| IFNΓ-APC | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| IFNΓ-PE | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-4-APC | 0,2 mg/mL | 2 μg/mL | 1: 100 | |
| CD4-FITC | 0,5 mg/mL | 5 μg/mL | 1: 100 | |
| IL-7 | 20 μg/mL | 2 ng/mL | 1: 10000 | |
| Anti-CD28 | 0,5 mg/mL | 1 μg/mL | 1: 500 | |
| Anti-IFNγ | 1 mg/mL | 10 μg/mL | 1: 100 |
Tabella 1: Utilizzati anticorpi e citochine.
| Primer | Sequenza | |
| IFNg Avanti | 5'-TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAA-3' | |
| IFNg Invertire | 5'-TGGCTCTGCAGGATTTTCATG-3' | |
| Il-17 Avanti | 5'-CTCCAGAAGGCCCTCAGACTAC-3' | |
| Il-17 Invertire | 5'-AGCTTTCCCTCCGCATTGACACAG-3' | |
| QCS2 Avanti | 5'-TTTACTTTTCCTGGGCATTG-3' | |
| QCS2 Invertire | 5'-TAGCTGGCTGTCATGTTCAA-3' | |
| RORC Avanti | 5'-TTTGGAACTGGCTTTCCATC-3' | |
| RORC Invertire | 5'-AAGATCTGCAGCTTTTCCACA-3' | |
| STAT3 Avanti | 5'-TGGCCCTTTGGAATGAAGGGTACA-3' | |
| STAT3 Invertire | 5'-CACTGATGTCCTTTTCCACCCAAGT-3' | |
| STAT5 Avanti | 5'-TGCCCGGCTGGAACTACACCTT-3' | |
| STAT5 Invertire | 5'-ATGCCCCCGATTTCCGAGTCAC-3' | |
Tabella 2: Primer per qPCR.
| passo | Temp. (° C) | tempo | Ripetere | |
| 1 | 95 | 2 min | ||
| 2 | 95 | 1 di 1 | ||
| 3 | 60 | 30 s | Passo 2 e 3, 39 volte | leggere la piastra |
| 4 | 65 – 95 | 5 s | Passo 4, 30 volte, + 0,5 ° C ogni ripetere | leggere la piastra |
Tabella 3: Programma di PCR per valutare l'espressione genica.
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Discussion
Qui abbiamo descritto un protocollo di una differenziazione in vitro THGM da ingenuo CD4 + cellule di topo, seguita da un'analisi delle cellule differenziate per convalidare il metodo. Della nota, linfonodi e milza può essere utilizzati per ingenuo purificazione di cellule T CD4 + e THGM differenziazione. L'espressione di citochine determinato macchiando intracellulari di cytokine combinato con citometria a flusso ha mostrato che circa il 55% delle cellule sono state indotte a diventare GM-CSF-esprimendo le cellule sotto la condizione di THGM (Figura 1A). Rispetto alle cellule sotto la condizione di differenziazione 17 TH, le cellule che differenziano sotto la condizione di THGM hanno contenuto un livello di sfondo di una popolazione che esprimono IL-17; Tuttavia, l'espressione genica il17 è rilevabile dalla qPCR (Figura 2A).
È interessante notare che, nonostante l'aggiunta di un anticorpo neutralizzante IFNγ, abbiamo rilevato un basso livello di espressione di mRNA di Ifng TH17 sia le cellule di THGM, e meno dell'1% delle cellule THGM erano IFNγ-esprimendo le cellule. (Figure 1 - 2). Questo potrebbe essere dovuto alla quantità insufficiente di IFNγ anticorpo neutralizzante anti-utilizzato nella condizione di THGM, o a una possibile contaminazione delle cellule dell'immunità innata (è quasi impossibile ottenere cellule T CD4 + di 100% puro ingenuo) che ha fornito una quantità in tracce di IL-12 per la possibile generazione di 1 cellula di TH. È anche possibile che la condizione di THGM che abbiamo usato non era in grado di spegnere completamente la trascrizione di Ifng. Si affronterà questo problema in futuro. Tuttavia, IFNγ proteina non è stata rilevata nei surnatanti cultura di GMHT o TH17 da ELISA.
Nel protocollo presentato qui, abbiamo usato solo un anticorpo bloccante IFNγ insieme IL-7 per la differenziazione di THGM. Dopo 3 giorni di differenziazione in questa condizione, più del 50% delle cellule espresso GM-CSF, ma non IL-17, IL-4, o IFNγ (Figura 1). Inoltre, l'espressione del Rorc, il gene che codifica RORγt, che è fondamentale per la differenziazione Th179, era significativamente più basso nelle cellule THGM rispetto a quello in TH17 cellule (Figura 3). Questo protocollo è, pertanto, un metodo più efficiente per la generazione di cellule T di GM-CSF-espressione di un altro precedentemente segnalato10. I nostri risultati hanno dimostrato anche che, oltre alla purezza delle cellule T naive e segnalazione di IL-7, la prevenzione della differenziazione delle cellule T che esprimono IFNγ è una chiave per la generazione di THGM.
L'espressione predominante delle cellule del GM-CSF sono stati generati utilizzando il protocollo descritto ha dimostrato la differenziazione riuscita di THGM. Vorremmo sottolineare che la qualità delle citochine e anticorpi da aziende diverse o anche di lotti diversi dalla stessa società non possono essere lo stesso. È pertanto consigliabile che il numero di citochine e gli anticorpi usati nella differenziazione delle cellule di assistente T deve essere testato al fine di trovare la condizione ottima.
In sintesi, le cellule di THGM che sono state generate usando questo protocollo esprimono un livello minimo di IL-17, IL-4, o IFNγ. Siamo fiduciosi che questo protocollo funziona bene nella generazione di GM-CSF-esprimendo THGM cellule in vitro. Questo metodo può essere utilizzato per approfondire ulteriormente la biologia delle cellule di THGM in vari termini quali neuroinflammation autoimmuni, tra cui encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) in topi e sclerosi multipla umana, dove GM-CSF svolge un ruolo importante nella patogenesi11.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto da borse di studio dal National University salute sistema di Singapore (T1-2014 ott-12 e T1-2015 set-10).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| FBS Heat Inactivated | Capricorn | FBS-HI-12A | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | Diluted to 1x PBS in sterile water |
| EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10x ACK buffer | Biolegend | 420301 | diluted in sterile water |
| Cell strainer | SPL Life Sciences | 93070 | |
| CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T | |
| Centrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
| Sony SY3200 cell sorter | Sony | Sony SY3200 cell sorter | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 210261 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| FACS tube | Corning | 352054 | |
| 24 well cell culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0041-82 | |
| PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) | eBioscience | 12-0251-82 | |
| anti-human/mouse CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
| anti-mouse CD62L FITC | eBioscience | 11-0621-85 | |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | 640010 | |
| Hyclone Trypan Blue Solution | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
| microscope | Nikon | Nikon Elipse TS100 | |
| Purified anti-mouse CD3e antibody | Biolegend | 100314 | |
| Purified hamster anti-mouse CD28 | BD Biosciences | 553295 | |
| Purified Rat anti-mouse IFNγ | eBioscience | 16-7312-85 | |
| Purified anti-mouse IL-4 Antibody | Biolegend | 504102 | |
| Recombinant Mouse IL-7 Protein | R&D system | 407-ML | |
| recombinant human TGF-beta | R&D system | 240-B-010 | |
| PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| GolgiPlug protein transport inhibitor | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
| Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| anti-mouse GM-CSF PE | eBioscience | 12-7331-82 | |
| FITC anti-mouse IL-17A | Biolegend | 506908 | |
| APC anti-mouse IFN-gamma | Biolegend | 505810 | |
| GO Taq qPCR master mix | Promega | A6002 | |
| mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! | invitrogen | 88-7334-88 | |
| Mouse IL-17A Uncouted ELISA | invitrogen | 88-7371-22 |
References
- Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
- Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).
- Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K.
- Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).
- Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
- El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
- Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
- Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).
