Summary
여기, 우리가 순진한 CD4 + T 세포, 순진한 CD4 + T 세포, THGM의 차별화의 격리를 포함 하 여에서 murine granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T 도우미 (THGM) 세포를 분화 하는 프로토콜을 제시 하 고 차별화 된 THGM 셀의 분석. 이 메서드는 규칙의 연구 및 THGM 세포의 기능에 적용할 수 있습니다.
Abstract
Granulocyte 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF)-T 도우미 (THGM) 셀 생산은 주로 인터페론 (IFN) γ 또는 인터 루 킨 (IL)-17 생산 하지 않고 GM-CSF를 분 비 하 고 발견 된다 새로 확인된 된 T 도우미 셀 하위 집합 면역 neuroinflammation에 필수적인 역할을 재생 합니다. Splenocytes의 단일 세포 현 탁 액에서 순진한 CD4 + T 세포 및 THGM 순진한 CD4 + T 세포에서 세포 생성의 격리 하는 방법 T 세포 중재 면역과 면역 질환의 연구에 유용한 기술 될 것 이다. 여기는 일리노이-7에 의해 추진 THGM 셀으로 마우스 순진한 CD4 + T 세포를 구분 하는 방법에 설명 합니다. 분화의 결과 세포내 cytokine cytometry, 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)와 함께 얼룩을 포함 하 여 다른 기술을 사용 하 여 cytokines 식의 분석에 의해 평가 되었다 고 효소 연결 된 immunosorbent 분석 (ELISA) 프로토콜을 사용 하는 THGM 차별화 설명 여기, 세포의 약 55 %IFNα 또는 IL-17의 최소한의 표현으로 GM-CSF를 표현. GM-CSF THGM 세포의 주된 표현 추가 GM-CSF, IFNα, 및 mRNA와 단백질 수준에서 IL-17의 발현의 분석에 의해 확인 되었다. 따라서,이 메서드는 순진한 CD4 + T 세포 T로 차별화 하는 데 사용할 수 있습니다HGM에서 생체 외에서세포는 THGM 세포 생물학의 연구에 도움이 될 것입니다.
Introduction
CD4 + T 도우미 (TH) 세포는 미생물 병원 체에 대 한 호스트 방어, 암 감시, 그리고 면역1,2,3중요 한 역할을가지고 면역 시스템의 필수적인 구성 요소입니다. T 세포 수용 체 (TCR) 활성화, 순진한 CD4 + T 세포는 TH1, TH2로 분화 될 수 있다, TH 17, 또는 규제 T (Treg) 세포 다른 cytokine milieus2,4, 의 영향 5. 최근, 주로 GM-CSF 생산, TH 세포의 새로운 하위 집합 확인 되었고 THGM6라는. THGM 세포의 분화는 신호 변환기의 활성화 및 전사 5 (STAT5)의 활성을 통해 일리노이-7에 의해 구동 됩니다. 다른 TH의 낮은 표현 하면서 GM-CSF의 큰 금액을 표현 하는 이러한 세포-세포 IFNγ 및 IL-176등 서명 cytokines. GM-CSF는 CD4 + T 세포 중재 neuroinflammation7,8의 개발에 중요 한 역할을 발견 했다. IFNγ-또는 IL-17-표현 autoreactive T 세포에 비해, GM-CSF 표현 T 세포는 이전 질병 발병과 높은 질병 심각도 야생-타입에 전송된 (WT) 마우스. 또한, Csf2-/-T 세포 하지 못했습니다 실험적인 자기 면역 뇌 (EAE) 유도 adoptively WT 받는 사람에 게 전송 후 IFNγ 또는 IL-17A 부족 한 T 세포 EAE7을 중재 하는 기능을 유지 하는 반면. 또한, 중화 항 체를 사용 하 여 GM-CSF의 봉쇄 ameliorated EAE 질병 심각도8. 또한, 마우스에서 T 세포에 STAT5의 결핍 EAE 개발6저하 THGM 세대에서 그리고, 따라서, 생쥐의 저항에서 결과. 이러한 연구 결과 면역 neuroinflammatory 질병에서 GM-CSF 표현 TH 세포의 중요성을 밑줄. 따라서, GM-CSF 표현 TH 순진한 CD4 + T 세포에서 세포를 분화 하는 방법을 구축 면역 neuroinflammation 및 T 세포 중재 면역 응답의 pathogenesis의 연구에서 중요 한 것입니다. 그러나, 프로토콜을 효율적으로 THGM 세포에서에서 생성 murine 순진한 CD4 + 설립 되지 않았습니다.
여기 우리 순진한 CD4 + T 세포에서 murine THGM 셀을 구분 하는 방법 제시. 이 프로토콜에서 마우스 비장 추출, 단일 세포 현 탁 액, CD4 긍정적인 선택, 정렬 (FACS), 형광 활성화 된 세포 및 TH 세포의 준비를 포함 하 여 모든 절차에 설명 감 별 법 및 분석입니다. 차별화 된 T 보조 세포 mRNA 수준에서 cytokine 식을 결정 하려면 양적 실시간 PCR에 의해 단일 세포 수준에서 cytokine 식을 결정 하려면 cytometry 결합 얼룩이 지는 세포내 cytokine에 의해 분석 되 고 단백질 수준에서 cytokine 식 평가 하 일 라 여. 이 메서드는 THGM EAE, GM-CSF, 병 인에 중요 한 역할 등 다양 한 조건 하에서 세포 생물학의 연구에 적용할 수 있습니다.
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Protocol
이 프로토콜에서 사용 하는 모든 마우스 C57BL/6 유전 배경에 되었고 싱가포르 국립 대학에서 특정 병원 체 자유로운 조건에서 보관. 모든 실험 기관 동물 관리 및 사용의 싱가포르의 국가 대학 위원회에 의해 승인 하는 프로토콜을 사용 하 여 수행 했다.
1. 시 약 및 재료 준비
- 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 포함 하는 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)과 1 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 500 mL를 준비 합니다.
참고: 최적의 결과 대 한 전체 절차를 통해 얼음에 버퍼를 유지 합니다. - 완전 한 RPMI 미디어 포함 된 RPMI 1640, 10 %FBS, 및 1% 페니실린 스 50 mL를 준비 합니다. 50 µ M THGM 세포 분화에 대 한 β-mercaptoethanol을 포함 하는 완전 한 RPMI 미디어를 사용 합니다. 증기 두건에서 β-mercaptoethanol을 추가 합니다.
- 안티-CD3e 집중 재고 3 μ g/mL PBS에 희석 하 여 안티-CD3e 항 체 혼합물의 7.5 mL를 준비 합니다. 각 항 체 혼합물의 추가 150 μ에 의해 코트 48-잘 접시 고 하룻밤 또는 적어도 1 시간 동안 37 ° C에서 4 ° C에서 접시를 품 어.
- 한 쌍의가 위와 집게를 소독 하 고 70% 에탄올 해 사이에서 그들을 유지.
2입니다. Murine Splenocytes의 준비
- (6-8 주 이전)의 마우스를 안락사 제도 승인 CO2 질 또는 자 궁 경부 전위를 사용 하 여. 70% 에탄올으로 마우스를 살포 하 고 그 뒤에 폴리스 티 렌 블록에 마운트. 생물 안전 캐비닛 다음 단계를 진행 하는 마우스를 전송 합니다.
- 집게의 쌍을 사용 하 여 피부를 개최 하 고 약 4 cm,가 위를 사용 하 여 왼쪽에 흉 곽 아래 피부를 잘라. 비장을 노출 하 고 메 마른 집게를 사용 하 여 비장 추출 복 주머니를 엽니다.
- 50 mL 튜브에 70 μ m 셀 스 트레이너를 놓고 미리 버퍼의 2 mL와 함께 그것을 젖은. 셀 스 트레이너 (한 셀 스 트레이너에 대 한 2-3 spleens)에 spleens를 놓고 5 mL 주사기 플런저의 끝을 사용 하 여 macerate.
- 모든 셀 튜브에 플러시됩니다 때까지 스 트레이너 및 여러 번 셀 절연 버퍼의 1-2 mL와 함께 튜브를 헹 굴. 셀 스 트레이너를 삭제 하 고 350 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 세포를 원심 폐기는 상쾌한.
- 감기 (4 ° C) 암모늄-염화-칼륨 (ACK) lysing 버퍼 (150 m m NH4Cl, 10 m m KHCO3, 0.1 m m 나2EDTA, pH 7.2-7.4)의 5 mL와 함께 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 부드럽게 중화 ACK를 완전 한 RPMI 미디어의 2 분 추가 10 ml 그들을 혼합합니다 버퍼 및 즉시 350 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 세포를 원심 원심 분리 후에 상쾌한 폐기.
3. 격리의 CD4 + T 세포 세포 분리 열과 마그네틱 CD4 Microbeads를 사용 하 여
- 셀 절연 버퍼의 5 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 세포 현 탁 액 모든 파편을 제거 하는 새로운 15 mL 튜브에 사전 분리 필터 (30 μ m)를 사용 하 여 필터링 합니다.
- 세포 현 탁 액의 10 μ 고 버퍼의 90 μ를 추가 하 여 10 배 희석을 만들. 10 μ 희석된 세포 현 탁 액의 고 trypan 블루 셀 카운팅을 위한 10 μ 함께 섞는다. 실행 가능한 세포의 수익률을 확인 하려면 hemocytometer 셀을 계산 합니다.
- 350 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심 및 삭제는 상쾌한.
- 107 셀 당 90 μ 버퍼의 셀을 resuspend. 마그네틱 CD4 microbeads 107 셀 당 10 μ를 추가 합니다. 4 ° c.에서 15 분에 대 한 셀을 품 어 최적의 결과 대 한 혼합 셀 서 스 펜 션 5 분에 부드럽게 부 화 하는 동안.
- 셀은 잠복기 동안 마그네틱 스탠드에 분리 열을 배치 합니다. 미리 열 버퍼의 2 mL을 젖은.
- 셀/구슬 외피의 끝에, 버퍼의 5 mL로 세포 세척 및 4 ° c.에서 5 분 동안 350 x g 에서 원심 폐기는 상쾌한.
- Resuspend 버퍼의 1 mL에 셀, 셀 분리 열에는 샘플을 로드 하 고 통과 하자. 15 mL 원심 분리기 튜브를 사용 하 여 CD4 세포 분수를 수집. 그것은 건조 하기 전에 저수지를 씻어 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 2 x 세척 단계를 반복 합니다.
- 마그네틱 스탠드에서 셀 분리 열을 제거 하 고 새로운 15ml 원심 관에 배치. 셀 분리 열 셀 절연 버퍼의 2 개 mL를 추가 하 고 열에서 셀을 단단히 플런저를 적용.
- CD4 + 세포를 4 ° C에서 5 분 동안 350 x g 에서 분수 원심 폐기는 상쾌한.
4. 정화 순 CD4 + T 세포 (CD4+CD25-CD44loCD62L안녕) 형광 활성화 된 세포 분류와 THGM 차별화 하 여
- 버퍼의 500 µ L에서 얻은 CD4 + 세포 pellet을 resuspend. 형광 활용 된 항 체 혼합물 CD4-PerCp를 포함 하는 셀 믹스 (2.8 µ g/mL), CD44 APC (2.4 µ g/mL), CD25-PE (2 µ g/mL), 및 CD62L FITC (10 µ g/mL) (표 1). 빛에서 그들을 보호 하면서 20-30 분 동안 얼음에 셀을 품 어.
참고: 항 체의 농도 이전 실험실에 최적화 했다. 나열 된 항 체의 수는 1-2 마우스에서 셀입니다. - 부 화 후 버퍼의 5 mL로 세포 세척 하 고 350 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 세포를 원심
- 삭제는 상쾌한 고 resuspend 버퍼의 500 µ L에 셀. 다시 나일론 메쉬를 사용 하 여 셀을 필터링 합니다.
- 셀 정렬 FACS 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 버퍼의 500 µ L 컬렉션 FACS 튜브 precoat
- 얻기는 CD4+CD25-CD44loCD62L안녕하세요 인구 (순진한 CD4의+ T 세포) FACS 정렬. CD4에 게이트+CD25- 첫 번째, 및 다음 선택 CD44loCD62L안녕하세요 셀이이 인구에서.
- 순진한 CD4 수집+ T 새로운 15 mL 원심 분리기 관으로 분수를 셀. 350 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심 및 삭제는 상쾌한.
- 50 µ M β-mercaptoethanol을 포함 하는 완전 한 RPMI 미디어에 106 셀/mL의 농도에서 순진한 CD4 + T 세포 resuspend
- 안티-CD3e 항 체를 precoating 48-잘 접시에 대 한 사용 발음 일리노이-7 각 잘에서 씨 0.25 백만 (250 µ L) 셀 (2 ng/mL), 안티-CD28 (1 µ g/mL), 및 안티-IFNγ (10 µ g/mL) (표 1).
참고: 사이토카인 및 항 체의 농도 이전 THGM 세포 분화에 대 한 실험실에 최적화 했다. - 3 일 동안 5% CO2 와 37 ° C에서 세포를 품 어. 매체는 인큐베이션 기간 동안 변경 하지 마십시오.
5. 마우스 THGM 셀의 분석 생체 외에서 생성
- 현미경을 사용 하 여, 세포 분화 3 d 분화 후 확인 합니다. 세포를 수확 하 고 4 ° c.에서 5 분 동안 350 x g 에서 원심 2 세포를 씻어 완전 한 RPMI 미디어와 x.
참고: 차별화 된 셀은 순진한 CD4 + T 세포 보다 크기가 큽니다. - 완전 한 RPMI 미디어의 1 mL에 셀 resuspend 세포 현 탁 액의 10 μ 고 trypan는 hemocytometer와 휴대폰 번호를 확인 하려면 파란색의 10 μ 함께 잘 섞는다. Restimulation 및 분석에 대 한 세 가지 묘약으로 차별화 된 셀을 나눕니다.
참고: 세포내 cytokine 얼룩과 ELISA 분석 실험 필요 이들 백만 셀, 그리고 정량 분석 ≥ 1 백만 세포가 필요 합니다. -
세포내 cytokine 얼룩에 대 한 restimulate phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA) 셀 (100 ng/mL)와 단백질 수송 억제제 (1 µ L/mL) 4-6 h 존재 ionomycin (1 μ g/mL).
- 세포를 수확 하 고 안티-CD4 항 체로 그들을 얼룩 (PerCP 활용 된 0.2 mg/mL, 1: 100 희석; 또는 FITC 활용, 0.5 mg/mL, 1: 100 희석) 30 분.
- 20-60 분에 대 한 고정 버퍼의 200 μ와 셀을 수정 합니다. 고정 후 씻어 셀 2 x permeabilization 버퍼의 1 mL.
- GM-CSF (PE 활용, 0.2 mg/mL, 1: 100 희석)에 대 한 항 체와 세포내 얼룩 IL-17A (FITC 활용, 0.5 mg/mL, 1: 100 희석; 수행 APC-conjugated, 0.2 mg/mL, 1: 100 희석), 일리노이-4 (APC 활용, 0.2 mg/mL, 1: 100 희석), 및 IFNγ (APC 활용, 0.2 mg/mL, 1: 100 희석; PE-conjugated, 0.2 mg/mL, 1: 100 희석) 어둠 속에서 30 분.
- 차별화 된 세포 cytokine 유전자 발현의 정량 분석을 위해 (1.3 단계에서 설명한 대로 접시 precoating) 플레이트-바인딩 안티-CD3e (3 μ g/mL)와 셀을 활성화 합니다. 자극 후 3 h는 정량에 대 한 cDNA를 준비 하는 페 놀 RNA 추출 시 약을 사용 하 여 전체 RNA를 분리 하는 세포를 수확. 프라이 머와는 정량에 사용 하는 프로그램 표 2 와 3, 각각 나열 됩니다.
- 차별화 된 세포 cytokine 단백질 분 비의 분석을 위해 24 h (1.3 단계에서 설명한 대로 접시 precoating) 플레이트-바인딩 안티-CD3e (3 μ g/mL)와 셀 restimulate. 그들의 농도 결정 하는 IL-17 및 GM-CSF ELISA 표면에 뜨는 세포 배양 수확.
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Representative Results
2 8 주 오래 된 남성 C57BL/6 쥐에서 고립 된 naive CD4 + T 세포 세 부분으로 분할 되었다. 세포의 한 부분 설명 하는 프로토콜에 따라 THGM 세포로 분화 했다. 다른 부분 THGM의 차별화에서 IL-4 봉쇄의 영향을 테스트 안티-일리노이-4 항 체 (10 µ g/mL)의 THGM 조건 하에서 경작 되었다. 마지막 부분 (3 µ g/mL 안티-CD3e, 1 µ g/mL 안티-CD28, 10 ng/mL TGFβ, 30 ng/mL 일리노이-6, 10 µ g/mL 안티-IFNγ, 및 안티-일리노이-4 10 µ g/mL) TH17 차별화 조건 하에서 경작 되었다. 차별화의 3 일 후 세포 수확 되었고 세포내 cytokine 얼룩, 정량, 그리고 ELISA cytokine 식 분석을 restimulated. 세포내 cytokine 얼룩 및 FACS 분석 결과를 보여주는 THGM 차별화 조건 하에서 경작 하는 세포의 약 55% 셀 (그림 1A), GM-CSF 표현 했다 반면 세포의 약 2% TH에서 분화 17 조건 GM-CSF를 표현. 또한, 8.17% IL 17 생산 하는 세포 생성 TH17 분화 상태에 비해, THGM 차별화 조건만 결과 IL 17 표현 하는 세포의 약 1%. 테스트 2 분화 조건에서 셀의 극히 일부에 표현 IFNγ (< 1%). 또한, 몇 일 4 표현 하는 T 세포 (< 1%) THGM 또는 TH17 문화 (그림 1B)에서 볼 수 있었다. 이러한 결과 설명된 THGM 세포 분화 조건을 사용 하 여, 우리는 성공적으로 생성 된 T 보조 세포 주로 GM-CSF를 표현 했다.
THGM 세포의 성공적인 차별화 더 qPCRs에서 결과 의해 확인 되었다 하 고 ELISA GM-CSF 및 IL-17 차별화 된 세포의 RNA와 단백질 수준에서의 식을 검토 하는 분석 실험. 생성 된 THGM 셀 Csf2 의 상당히 높은 표현 했지만 Il17 의 훨씬 더 낮은 식 비해 TH17 세포 (그림 2A). 그림 2B에서 같이, GM-CSF 단백질 문화 supernatants THGM과 TH17 세포에서에서 발견 되었다. 그럼에도 불구 하 고, 표면에 뜨는 THGM 문화에서 GM-CSF 농도 대 한 했다 TH17에에서 그의 삼 배 셀. 또한, IL-17 (그림 2B), IFNγ, 및 IL-4의 단백질 표면에 뜨는 THGM 세포 배양에서 감지 되지 않았습니다. RORγt TH17의 마스터 녹음 방송 요인으로 확인 된 이후 STAT3 및 STAT5 셀 각각 TH17 THGM 세포의 개발에 큰 중요성을가지고 표시 되었습니다, 우리는 그들의 mRNA를 검사 THGM과 TH17 세포에서 식. 그것은 THGM 셀 Rorc 의 상당히 낮은 표현과 TH17 보다 높은 Stat5 표현 했다 발견 했다 세포 (그림 3). 흥미롭게도, THGM 셀 했다 약간 낮은 (하지만 중요 하지) 식의 Stat3 유전자에 비해 TH17 세포. 이러한 결과 표시는 비록 THGM과 TH17 차별화 transcriptional 다른 요인에 의해 규율 됩니다, 그들은 몇 가지 일반적인 기능을 공유할 수 있습니다.
그림 1: THGM 세포 주로 급행 GM-CSF. THGM과 TH17 세포 분화 후 3 일 수확 했다. (A) 5 h의 셀은 PMA와 단백질 수송 억제제 존재 ionomycin restimulated 했다. GM-CSF, 일리노이-17, IFNγ의 식 세포내 cytokine cytometry 다음 얼룩에 의해 분석 되었다. TH17 또는 THGM 셀 (B)는 IL-4, IFNγ 식을 분석 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 표현의 일-17, IFNγ, 및 TH17 THGM 셀에서 GM-CSF. THGM과 TH17 세포 수확 고 플레이트-바인딩 안티-CD3e와 감 별 법 후에 3 일 restimulated. (A) 세포 cDNA 준비, 자극 후 3 h에 대 한 RNA를 분리를 수확 했다. Ifng, Il-17, 및 Csf2 식 정량 실시간 PCR (정량)에 의해 결정 되었다. (B) 표면에 뜨는 문화 THGM 셀, GM-CSF의 농도 결정 하는 자극 후 24 h에서 수확 했다 또는 ELISA에 의해 IL-17 TH17 세포. (* * p < 0.01, * * * p < 0.001.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Rorc, Stat3, 및 Stat5 유전자 발현 TH17 THGM 셀에. 차별화 된 THGM과 TH17 세포 수확 했다 그리고 3 h. 위해 플레이트-바인딩 안티-CD3e와 restimulated 총 RNA 격리 된 cDNA를 준비 하. Rorc, Stat3및 Stat5 식 정량에 의해 결정 되었다. (* p < 0.05, * * p < 0.01; NS = 중요.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 이름 | 사진 농도 | 작업 농도 | 희석 | 볼륨 500에서 μ 버퍼 얼룩 |
| CD4-PerCp | 0.2 mg/mL | 2.8 μ g/mL | 1:71 | 7 Μ |
| CD44-APC | 0.2 mg/mL | 2.4 μ g/mL | 1:83 | 6 Μ |
| CD25-PE | 0.2 mg/mL | 2 μ g/mL | 1: 100 | 5 Μ |
| CD62L FITC | 0.5 mg/mL | 10 μ g/mL | 1:50 | 10 Μ |
| GM-CSF-PE | 0.2 mg/mL | 2 μ g/mL | 1: 100 | |
| IL-17A-FITC | 0.5 mg/mL | 5 μ g/mL | 1: 100 | |
| IL-17A-APC | 0.2 mg/mL | 2 μ g/mL | 1: 100 | |
| IFNΓ APC | 0.2 mg/mL | 2 μ g/mL | 1: 100 | |
| IFNΓ PE | 0.2 mg/mL | 2 μ g/mL | 1: 100 | |
| IL-4-APC | 0.2 mg/mL | 2 μ g/mL | 1: 100 | |
| CD4 FITC | 0.5 mg/mL | 5 μ g/mL | 1: 100 | |
| 일리노이-7 | 20 μ g/mL | 2 ng/mL | 1:10000 | |
| 안티 CD28 | 0.5 mg/mL | 1 μ g/mL | 1: 500 | |
| 안티-IFNγ | 1 mg/mL | 10 μ g/mL | 1: 100 |
표 1: cytokines 그리고 항 체를 사용합니다.
| 뇌관 | 시퀀스 | |
| Ifng 앞으로 | 5'-TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAA-3' | |
| Ifng 역 | 5'-TGGCTCTGCAGGATTTTCATG-3' | |
| Il-17 앞으로 | 5'-CTCCAGAAGGCCCTCAGACTAC-3' | |
| Il-17 역 | 5'-AGCTTTCCCTCCGCATTGACACAG-3' | |
| Csf2 앞으로 | 5'-TTTACTTTTCCTGGGCATTG-3' | |
| Csf2 역 | 5'-TAGCTGGCTGTCATGTTCAA-3' | |
| Rorc 앞으로 | 5'-TTTGGAACTGGCTTTCCATC-3' | |
| Rorc 역 | 5'-AAGATCTGCAGCTTTTCCACA-3' | |
| Stat3 앞으로 | 5'-TGGCCCTTTGGAATGAAGGGTACA-3' | |
| Stat3 역 | 5'-CACTGATGTCCTTTTCCACCCAAGT-3' | |
| Stat5 앞으로 | 5'-TGCCCGGCTGGAACTACACCTT-3' | |
| Stat5 역 | 5'-ATGCCCCCGATTTCCGAGTCAC-3' | |
표 2: 정량 Pcr 위한 뇌관입니다.
| 단계 | 임시입니다. (° C) | 시간 | 반복 | |
| 1 | 95 | 2 분 | ||
| 2 | 95 | 3 s | ||
| 3 | 60 | 30 s | 단계 2, 3, 39 번 | 판 읽기 |
| 4 | 65-95 | 5 s | 단계 4, 30 번, + 0.5 ° C는 각 반복 | 판 읽기 |
표 3: PCR 유전자 발현을 평가 프로그램.
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Discussion
여기 우리는 생체 외에서 THGM 차별화의 마우스 순진한 CD4 + 세포, 메서드를 확인 하기 위해 차별화 된 세포의 분석에 의해 뒤에서 프로토콜을 설명 합니다. 노트, 비장 및 림프절 순진한 CD4 + T 세포 정화와 THGM 차별화에 대 한 사용할 수 있습니다. 세포내 cytokine 얼룩 cytometry 셀의 약 55% 보여주었다 결합에 의해 결정 하는 cytokine 식 THGM 상태 (그림 1A)에서 GM-CSF 표현 세포가를 유도 했다. TH17 차별화 조건 셀에 비해, THGM 상태 하에서 분화 하는 셀에 포함 된 IL 17 표현 인구;의 배경 수준 그러나, il17 유전자 발현의 정량 (그림 2A)에 의해 감지 되지 않습니다.
흥미롭게도, IFNγ 중화 항 체의 추가도 불구 하 고 우리는 TH17에 THGM 셀 Ifng mRNA 발현의 낮은 수준 감지 하 고 THGM 세포의 1% 미만 이었다 IFNγ 표현 셀 키를 누릅니다. (그림 1 - 2). 이 사용 될 수 있었다 IFNγ 중화 항 체의 부족 금액 THGM 상태에서 또는 IL-12의 양을 추적을 제공 하는 (그것은 거의 100% 순수 순진한 CD4 + T 세포를 얻을 수 없습니다) 타고 난 면역 세포의 가능한 오염에 대 한 가능한 TH1 세포 생성. 그것은 또한 우리가 사용 하는 THGM 상태 Ifng의 전사를 완전히 차단 수 없음을 가능. 우리는 미래에이 문제를 해결 것입니다. 그럼에도 불구 하 고, IFNγ 단백질은 검색 되지 문화 supernatants 또는 TH17 THGM에에서 일 라.
여기에 제시 된 프로토콜에서 우리만 THGM 차별화와 일리노이-7 IFNγ 차단 항 체 사용. 이 조건 하에서 차별화의 3 일 후 세포의 50% 이상을 표현 GM-CSF, 하지만 하지 IL-17, 일리노이-4, 또는 IFNγ (그림 1). 또한, Rorc표현, 유전자는 RORγt는 중요 Th17 차별화9TH에 비해 THGM 셀에 어 17 세포 (그림 3) 인코딩합니다. 이 프로토콜은, 그러므로, 다른 보고10이전 보다 GM-CSF 표현 T 세포의 생성에 대 한 보다 효율적인 방법. 우리의 결과 또한, naïve T 세포와 일리노이-7 신호 순도 뿐만 아니라 IFNγ 표현 T 세포 분화의 예방은 키 THGM 세대에 대 한 시연.
설명 된 프로토콜을 사용 하 여 생성 된 GM-CSF 셀의 주된 표현 THGM의 성공적인 차별화를 보여주었다. 우리는 cytokines의 품질 지적 하 고 항 체 또는 다른 회사에서 같은 회사에서 다른 배치의 동일 하지 않을 수 있습니다. 따라서, 최적의 상태를 알아내기 위하여 cytokines 그리고 항 체 T 조 수 세포 분화에 사용의 수를 테스트 해야 하는 것이 좋습니다.
요약 하자면,이 프로토콜을 사용 하 여 생성 된 THGM 셀 익스프레스 IL-17의 최소한의 수준 일리노이-4, 또는 IFNγ. 우리는이 프로토콜 GM-CSF 표현 T 생성에서 잘 작동 확신HGM에 체 외세포. 이 방법을 사용할 수 있습니다 더 실험적인 자기 면역 뇌 (EAE)를 포함 하 여 면역 neuroinflammation 등 다양 한 조건에서 THGM 세포의 생물학을 공부 하 생쥐와 인간 다 발성 경화 증, GM-CSF 재생 한 11병 인 중요 한 역할입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 싱가포르 국립 대학교 건강 시스템 (T1-2014 년 10 월-12 및 T1-2015 년 9 월-10)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| FBS Heat Inactivated | Capricorn | FBS-HI-12A | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | Diluted to 1x PBS in sterile water |
| EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10x ACK buffer | Biolegend | 420301 | diluted in sterile water |
| Cell strainer | SPL Life Sciences | 93070 | |
| CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T | |
| Centrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
| Sony SY3200 cell sorter | Sony | Sony SY3200 cell sorter | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 210261 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| FACS tube | Corning | 352054 | |
| 24 well cell culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0041-82 | |
| PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) | eBioscience | 12-0251-82 | |
| anti-human/mouse CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
| anti-mouse CD62L FITC | eBioscience | 11-0621-85 | |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | 640010 | |
| Hyclone Trypan Blue Solution | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
| microscope | Nikon | Nikon Elipse TS100 | |
| Purified anti-mouse CD3e antibody | Biolegend | 100314 | |
| Purified hamster anti-mouse CD28 | BD Biosciences | 553295 | |
| Purified Rat anti-mouse IFNγ | eBioscience | 16-7312-85 | |
| Purified anti-mouse IL-4 Antibody | Biolegend | 504102 | |
| Recombinant Mouse IL-7 Protein | R&D system | 407-ML | |
| recombinant human TGF-beta | R&D system | 240-B-010 | |
| PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| GolgiPlug protein transport inhibitor | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
| Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| anti-mouse GM-CSF PE | eBioscience | 12-7331-82 | |
| FITC anti-mouse IL-17A | Biolegend | 506908 | |
| APC anti-mouse IFN-gamma | Biolegend | 505810 | |
| GO Taq qPCR master mix | Promega | A6002 | |
| mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! | invitrogen | 88-7334-88 | |
| Mouse IL-17A Uncouted ELISA | invitrogen | 88-7371-22 |
References
- Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
- Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).
- Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
- Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).
- Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
- El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
- Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
- Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).
