Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

عزل وتوصيف والمستندة إلى MicroRNA التحوير الوراثي للخلايا الجذعية البشرية جريب طب الأسنان

Published: November 16, 2018 doi: 10.3791/58089
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 3, 1,2, 3
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty at Rostock University, 3Department of Operative Dentistry and Periodontology, Rostock University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

ويصف هذا البروتوكول الهندسة الوراثية عابر لطب الأسنان من الخلايا الجذعية المستخرجة من المسام الأسنان البشرية. الاستراتيجية التطبيقية التعديل غير الفيروسية التي قد تصبح أساسا لتحسين منتجات الخلايا الجذعية العلاجية.

Abstract

وحتى الآن، العديد من أنواع الخلايا الجذعية في مراحل إنمائية مختلفة في التركيز على علاج الأمراض التنكسية. حتى الآن، جوانب معينة، مثل موت الخلية الأولى واسعة النطاق والآثار العلاجية منخفضة، ضعف الترجمة السريرية واسعة النطاق. الهندسة الوراثية للخلايا الجذعية قبل زرع برزت كوسيلة واعدة لتحسين الآثار العلاجية من الخلايا الجذعية. ومع ذلك، تزال تفتقر إلى نظم إيصال الجينات آمنة وفعالة. ولذلك، تطوير أساليب مناسبة قد توفر نهجاً لحل التحديات الراهنة في العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية.

يصف هذا البروتوكول استخراج وتوصيف الخلايا الجذعية البشرية جريب طب الأسنان (هدفسكس) كذلك على التحوير الوراثي غير الفيروسية. كشف النقاب عن المسام الأسنان بعد الولادة كمصدر واعدة ويمكن الوصول إليها بسهولة لحصاد الخلايا الجذعية البالغة multipotent تمتلك إمكانات عالية الانتشار. ويعرض إجراءات العزل وصف طريقة بسيطة وموثوق بها لحصاد هدفسكس من تأثير ضرس العقل. ويضم هذا البروتوكول أيضا أساليب لتحديد خصائص الخلايا الجذعية الخلايا المعزولة. للهندسة الوراثية من هدفسكس، يرد استراتيجية أمثل تعداء الأيوني على أساس المادة الدهنية مواتية ميكرورنا ذات كفاءة عالية مقدمة دون أن تسبب الآثار السامة للخلايا. ميكرورناس هي المرشحين المناسبين للتلاعب بالخلية عابرة، هذه الجهات المنظمة متعدية الجنسيات الصغيرة التحكم في مصير وسلوك الخلايا الجذعية دون خطر التكامل الجينوم مستقرة. وهكذا، يمثل هذا البروتوكول إجراء آمنة وتتسم بالكفاءة لهندسة هدفسكس التي يمكن أن تصبح مهمة لتحسين فعاليتها العلاجية.

Introduction

جريب الأسنان البشرية فضفاضة المستمدة من اكتوميسينتشيمالي نسيج الضام المحيطة بالأسنان النامية1،2. إلى جانب وظيفتها تنسيق أوستيوكلاستوجينيسيس وتكون العظم لعملية اندلاع الأسنان، يأوي هذا النسيج الخلايا الجذعية، والسلف لا سيما لوضع دواعم3،،من45. ولذلك، يعتبر المسام الأسنان كمصدر بديل لحصاد الخلايا الجذعية البشرية6،7.

وأظهرت دراسات عدة أن الخلايا الجذعية البشرية جريب طب الأسنان (هدفسكس) قادرون على التفريق في نسب اللثة بما في ذلك خلايا الاوستيوبلاستس، الرباط الليفية وسيمينتوبلاستس8،،من910 . وعلاوة على ذلك، عرضت هذه الخلايا تطابق خصائص كافة الخلايا اللحمية الوسيطة (MSCs) بما في ذلك القدرات الذاتية تجديد، التقيد البلاستيك، والتعبير عن علامات سطح معين (مثل، CD73، CD90، CD105) كذلك، أوستيوجينيك، أديبوجينيك وتشوندروجينيك التمايز المحتملة11،،من1213. وكشفت دراسات أخرى أيضا إمكانية تفريق العصبية هدفسكس2،،من1415،16،،من1718.

نظراً لخصائص واعدة وسهولة الوصول، أصبح هدفسكس ذات الصلة مؤخرا للأنسجة الهندسة19،،من2021. الدراسات الأولى التي ركزت على إمكانات دفسكس لتجديد العظام واللثة وجذور الأسنان19،،من2223،24،،من2526، ،من 2728،،من2930. معرفة قدرة هدفسكس العصبية، تطبيقها كعلاج محتمل لأمراض الأعصاب منذ التحقيق31،،من3233. هدفسكس اكتسبت أيضا أهمية فيما يتعلق بتجديد أخرى34،الأنسجة (ظهارة القرنيةمثلاً )35. إمكانات العلاج هدفسك لا يقوم فقط على إمكاناتهم التمايز المباشر بل أيضا على نشاطهم باراكريني. مؤخرا، أظهرت أن تفرز ثروة عوامل النشطة بيولوجيا، مثل مصفوفة ميتالوبروتيناسيس (يتولى) وعامل نمو الأوعية الدموية غشائي (VEGF)، وعامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية (بفجف) ويشبه الأنسولين عامل النمو (IGF) النمو تتمثل هدفسكس عامل (هجف)، التي تقوم بدور حاسم للأوعية والمرباة وإعادة عرض مصفوفة الخلوية إضافية وعمليات الترميمي36.

ومع ذلك، تأثر الترجمة السريرية واسعة النطاق للعلاج بالخلايا الجذعية لا تزال العديد من التحديات، مثل موت الخلايا الأولية الضخمة وانخفاض الخلايا الجذعية مفيدة آثار37،38. الهندسة الوراثية يوفر استراتيجية واعدة للتصدي لهذه التحديات وذلك يمكن أن يعزز الفعالية العلاجية للخلايا الجذعية البالغة38،،من3940. للتلاعب بالخلية عابرة، ميكرورناس (ميرس) مرشحين مناسبين، كما هذه الجهات المنظمة متعدية الجنسيات الصغيرة التحكم في مصير وسلوك الخلايا الجذعية دون الخطر من الجينوم مستقرة التكامل41،42، 43-وحتى الآن، حددت عدة ميرس مفيدة تعزيز انتشار الخلايا الجذعية والبقاء على قيد الحياة، وصاروخ موجه، نشاط paracrine، فضلا عن على التمايز إلى عدة الأنساب44. على سبيل المثال، المهندسة مير-133a MSCs أظهرت زيادة البقاء على قيد الحياة وانجرافتمينت في قلوب الفئران إينفاركتيد أدى تحسين وظيفة القلب عند مقارنة بغير معدلة MSCs45. وبالمثل، عرضت مير-146a overexpressing MSCs لإفراز كميات أعلى من VEGF الذي أدى بدوره إلى تعزيز كفاءة علاجية في الأنسجة الدماغية46.

ويعرض هذه المخطوطة بروتوكول مفصل لاستخراج انتقائية والهندسة الوراثية من هدفسكس. ولهذا الغرض، وصفت لنا هضم الحصاد والانزيميه تجاويف الأسنان البشرية وكذلك عزل هدفسكس اللاحقة. لوصف الخلايا المعزولة، وتعليمات هامة لتحقق خصائص ماجستير قد أدرجت وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها "الجمعية الدولية" "العلاج الخلوي"13. وبالإضافة إلى ذلك، نحن نقدم وصفاً مفصلاً للجيل من تعديل مير هدفسكس بتطبيق استراتيجية الأيوني تعداء على أساس المادة الدهنية وتقييم كفاءة تعداء وسيتوتوكسيسيتي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

هدفسكس يتم عزل من المسام الأسنان لاستخراج الحكمة الأسنان المقدمة من الإدارة عن طريق الفم والوجه والفكين جراحة التجميل في المركز الطبي في جامعة روستوك. تم الحصول على الموافقة عن علم وموافقة كتابية من جميع المرضى. إذن هذه الدراسة لجنة الأخلاقيات المحلية التابعة لجامعة روستوك (إذن برقم 2017-0158).

1-عزل هدفسكس

ملاحظة: لمنع التلوث البكتيري، ضرس العقل ينبغي أن لا تكون اندلعت قبل استخراج

  1. إعداد الحلول المطلوبة
    1. تحضير المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS)/البنسلين والستربتوميسين-الجلوتامين (P-S-G) الحل: مزيج مل 495 من برنامج تلفزيوني مع 5 مل من محلول P-S-G. تخزين مختبرين من 50 مل عند 4 درجة مئوية.
    2. إعداد متوسطة الثقافة هدفسك: مزيج مل 445 من متوسطة القاعدية مع 5 مل من عامل المضادات الحيوية و 50 مل من المصل البقري الجنين (FBS). مخزن في 4 درجات مئوية.
    3. إعداد نوع كولاجيناز أنا الأسهم الحل (30 ملغ/مل): تمييع 300 ملغ نوع كولاجيناز في 10 مل متوسطة القاعدية وتستكمل مع عامل مضاد حيوي 1%. مزيج من قوة الحل. تصفية الحل باستخدام عامل تصفية 0.2 ميكرون. مخزن مختبرين من 500 ميليلتر من كولاجيناز النوع الأول من الحل الأسهم عند-20 درجة مئوية.
    4. إعداد الحل "الثاني ديسباسي" الأسهم (40 مغ/مل): تمييع 40 مغ من "ديسباسي الثاني" في 10 مل متوسطة القاعدية وتستكمل مع عامل مضاد حيوي 1%. مزيج من قوة الحل. تصفية الحل باستخدام عامل تصفية 0.2 ميكرون. تخزين مختبرين من 500 ميليلتر للحل "الثاني ديسباسي" الأسهم في-20 درجة مئوية.
  2. إجراء العمليات الجراحية
    1. ضخ كمية كافية (الحد الأقصى: 2 مل) من مخدر موضعي.
    2. إنشاء ورفع رفرف ثلاثي موكوبيريوستيل. رفع رفرف لغات غير مطلوب.
    3. حماية الجانب المتعلق باللغات بمصعد بيريوستيل.
    4. مطحنة بلطف العظام الشدقى والقاصي مع جولة لدغ معادن الصلبة.
    5. قم بفك أنسجة المسام بمصعد بيريوستيل. بعناية إزالة الأسنان كاملة (الجرثومية) والمسام بسحب التاج (والمسام) مع الخلفي (الثالثة-المولى) الملقط.
    6. ديبريدي وري مأخذ التوصيل جيدا مع محلول كلوريد الصوديوم.
    7. استبدال رفرف موكوبيريوستيل بخيوط فيكريل (انظر الجدول للمواد).
    8. إزالة المسام الأسنان من تجويف الفم ووضعها في قاسمة من 50 مل من محلول برنامج تلفزيوني/P-S-G.
      ملاحظة: ويمكن تخزين العينة في 4 درجات مئوية حتى مزيد من المعالجة.
  3. الهضم الأنزيمي للمسام الأسنان
    1. هدفسك الحارة قبل الثقافة المتوسطة وحل برنامج تلفزيوني/P-S-G إلى درجة حرارة الغرفة (RT).
    2. ذوبان الجليد قاسمة واحد لكل نوع من أنواع كولاجيناز الأول و "الثاني ديسباسي" الأسهم الحلول. تعد حلاً هضم من 3 ملغ/مل نوع كولاجيناز أنا و 4 مغ/مل ديسباسي الثاني بإضافة 500 ميليلتر من كل كولاجيناز النوع الأول و "الثاني ديسباسي" حل الأسهم إلى 4 مل من القاعدية المتوسطة التي تحتوي على 1% المضادات الحيوية عامل.
    3. مكان جريب المستخرجة في طبق بتري معقم وإضافة 10 مل من محلول برنامج تلفزيوني/P-S-G لغسل الأنسجة المستخرجة. كرر هذه الخطوة الغسيل مرتين.
    4. فرم المسام المستخرجة إلى قطعة من حوالي 1 مم × 1 مم مع مشرط معقم داخل طبق بتري يحتوي على 10 مل من محلول برنامج تلفزيوني/P-S-G.
    5. نقل الأنسجة مفروم وحل برنامج تلفزيوني/P-S-G من طبق بيتري في أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي. أغسل صحن بيتري مع 10 مل من محلول برنامج تلفزيوني/P-S-G ونقل الحل في الأنبوب نفسه.
    6. الطرد المركزي الأنبوبة المخروطية أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 353 س ز على RT وتجاهل المادة طافية.
    7. إضافة 5 مل من محلول الهضم للأنسجة الأعلاف. المزيج بلطف الحل والأنسجة. احتضان المخلوط في 37 درجة مئوية و 5% CO2 ل 2 ح في حاضنة تهتز.
    8. أجهزة الطرد المركزي يهضم تعليق خلية/الأنسجة في 353 x ز لمدة 10 دقائق في الرايت تجاهل المادة طافية وإعادة تعليق بيليه التي تم الحصول عليها في 6 مل من هدفسك الثقافة المتوسطة.
    9. تعليق خلية البذور في 25 سم2 خلية قارورة الثقافة واحتضان خلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2% 20 س2.
      ملاحظة: إذا لم يتم هضمها الأنسجة تماما، نقل الأنسجة المتبقية إلى قارورة ثقافة الخليوي أيضا.
    10. تغيير المتوسطة بعناية ح 24 بعد البذر الخلية. بعد ذلك تغيير المتوسطة كل ثلاثة أيام حتى كونفلوينسي.
      ملاحظة: هدفسكس ينبغي أن البلاستيك-تمسكا 24 ساعة بعد البذر الخلية ولا يمكن فصلها عن الخلايا غير ملتصقة ومكونات الدم بمجرد تغيير في المتوسط.
  4. حصاد الخلية
    1. قبل الحارة هدفسك الثقافة المتوسطة، حل برنامج تلفزيوني/P-S-G وحل حمض (يدتا) التربسين/الإيثيلين إلى الرايت
    2. تجاهل المادة طافية من قارورة الثقافة ويغسل خلايا المتلاقية مع 5 مل من محلول برنامج تلفزيوني/P-S-G.
    3. أضف 1 مل من محلول التربسين/أدتا إلى قارورة الثقافة واحتضان لمدة 3 دقائق في 37 درجة مئوية. إيقاف عملية الهضم عن طريق إضافة 3 مل من هدفسك الثقافة المتوسطة إلى قارورة الثقافة.
    4. نقل تعليق خلية في أنبوب الطرد مركزي مخروطية 15 مل والطرد المركزي من تعليق لمدة 10 دقيقة في 353 x ز في الرايت تجاهل المادة طافية وإعادة تعليق بيليه بمبلغ مناسب لمتوسط الثقافة هدفسك.
    5. حساب عدد الخلايا: مزيج 10 ميليلتر من تعليق خلية بلطف مع 10 ميليلتر لحل تريبان الأزرق. تطبيق 10 ميليلتر في غرفة الفرز وحساب مقدار خلية هدفسك.

2-وصف هدفسكس

  1. إيمونوفينوتيبينج
    1. إعداد الخلايا لتحليل تدفق سيتوميتريك
      1. إعداد الحلول المطلوبة
        1. إعداد برنامج تلفزيوني/يدتا (2 مم): مزيج مل 996 من برنامج تلفزيوني مع 4 مل يدتا (0.5 م).
        2. إعداد المخزن المؤقت المصبوغة: مزيج مل 995 من برنامج تلفزيوني/يدتا (2 مم) مع 5 غ من جيش صرب البوسنة. تصفية الحل باستخدام وحدة تصفية 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
        3. إعداد حل الأسهم بارافورمالدهيد (PFA) (4%): تمييع ز 4 منهاج عمل بيجين في 100 مل من برنامج تلفزيوني والحرارة الحل إلى 80 درجة مئوية. مزيج الحل وضبط قيمة pH إلى 7.3. قاسمة الحصول على حل منهاج عمل بيجين في مخزن في-20 درجة مئوية ومبلغ كل منها (1.5 مل) حتى الاستخدام.
          تنبيه: نظراً لمنهاج عمل بيجين الأبخرة السامة، إعداد الحل منهاج عمل بيجين في غطاء دخان التهوية.
      2. بعد خلية الحصاد (1.4)، نقل عينات 14 من 5 × 104 خلايا إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنابيب. الطرد المركزي من التعليق في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
        ملاحظة: أداء العمل التالية في غرفة مظللة بدلاً من ذلك. الحفاظ على الخلايا والمواد الكاشفة على الجليد ما لم ينص على خلاف ذلك.
      3. تعليق إعادة الخلايا بكميات معينة من المخزن المؤقت المصبوغة (4 درجة مئوية) وإضافة FcR حجب كاشف (4 درجة مئوية) كما هو مبين في الجدول 1.
      4. إضافة الأضداد التالية على الجانب الداخلي من العينة الخاصة بكل منها كما هو مبين في الجدول 1: اللوفيكوسيانين (APC) الماوس المضادة الإنسان CD29؛ آسيا والمحيط الهادئ الماوس IgG1 κ ايستب التحكم؛ بيريدينين--الكلوروفيل البروتين (بيركب)-Cyanine5.5 الماوس المضادة الإنسان CD44؛ الماوس Cyanine5.5 بيركب IgG2b κ ايستب التحكم؛ V500 الماوس المضادة الإنسان CD45؛ ماوس V500 IgG1 κ ايستب التحكم؛ ماوس فيكوريثرين (PE) المضادة الإنسان CD73؛ PE الماوس IgG1 κ ايستب التحكم؛ بيركب-Cyanine5.5 الماوس المضادة الإنسان CD90؛ الماوس Cyanine5.5 بيركب IgG1 κ ايستب التحكم؛ ماوس CD105 المضادة الإنسان: أليكسا فلور (AF) 488؛ فأرة التحكم IgG1 السلبية: AF488؛ PE Cyanine7 الماوس المضادة الإنسان CD117؛ ماوس PE-Cyanine7 IgG1، κ ايستب التحكم. بعد أن تم إضافة الأجسام المضادة لكل عينة، تدور أسفل الأجسام المضادة وتخلط برفق. تبني الحلول لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
      5. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني (4 درجة مئوية) والطرد المركزي العينات من 300 غرام x لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
      6. تعليق إعادة الخلايا في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني (4 درجة مئوية) وإضافة 33 ميليلتر من منهاج عمل بيجين (4 في المائة). مزيج من الحلول وتخزينها على الجليد أو عند 4 درجة مئوية حتى تحليل تدفق سيتوميتريك.
    2. قياس التدفق سيتوميتريك للخلايا
      ملاحظة: أداء العمل التالية في غرفة مظللة بدلاً من ذلك. تبقى الخلايا على الجليد حتى القياس.
      1. للنظر في التعبير عن المستضدات السطحية، نقل العينات في أنابيب مناسبة لتدفق سيتوميتريك القياسات.
      2. قياس أحداث4 على الأقل 2 x 10 باستخدام سيتوميتير تدفق. تحليل كما هو مبين في الشكل 2.
  2. إمكانية التفريق مولتيبوتينت من هدفسكس
    1. استخدام المتاحة تجارياً "البشرية Mesenchymal الخلايا الجذعية الوظيفية تحديد مجموعة" للتأكد من أديبوجينيك، أوستيوجينيك، وإمكانات المفاضلة تشوندروجينيك من هدفسكس. تطبيق حمار الماعز المضادة AF488 جسم الثانوية لتلطيخ من الأحماض الدهنية ملزمة البروتين 4 (FABP4) وأجريكان فضلا عن حمار الماوس المضادة AF488 جسم الثانوية لتلطيخ من أوستيوكالسين. لتلطيخ نويات، استخدام الوسيلة المتصاعدة مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI).
      ملاحظة: إعداد عينات دون جسم الأولية كعناصر سلبية لتحاليل مجهرية.
    2. تحليل التعبير عن البروتينات بالليزر الفحص المجهري [كنفوكل]. إعدادات الفحص المجهري: الهدف 40 x مع الغمر النفط؛ الإثارة الليزر 488 نانومتر (بالنسبة AF488) و 405 نانومتر (ل DAPI).

3-تعداء هدفسكس

  1. وبعد الحصاد (1.4) الخلية، البذور هدفسكس على لوحة ثقافة 24-جيدا خلية 24 ساعة قبل تعداء.
    ملاحظة: ابتداء من كثافة الخلية حوالي 4 × 104 خلايا كل بئر. الخلايا ينبغي التوصل إلى التقاء ~ 80% في يوم تعداء.
    ملاحظة: البذور عينة خلية إضافية واحدة كمراقبة لتحليل تدفق سيتوميتريك.
  2. إعداد مجمعات تعداء
    ملاحظة: لمنع التلوث الناجم عن رنسيس، تنظيف مساحة العمل مباشرة قبل إعداد مجمعات تعداء استخدام رناسي إزالة التلوث الحل. استخدام مواد خالية من رناسي والحلول فقط.
    ملاحظة: أداء العمل التالية في غرفة مظللة بدلاً من ذلك.
    1. إعداد حل الأسهم مير (50 ميكرومتر): إعادة تعليق مير السلائف المسمى Cy3 (نمول 5) في المياه خالية من نوكلاس 100 ميليلتر. قاسمة الحصول على الحل مير الأسهم في كل منها مبالغ (5 ميليلتر) ومخزن في الظلام في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    2. تمييع pmol 40 من مير (0.8 ميليلتر من الحل الأسهم مير 50 ميكرومتر) في 66.7 ميليلتر من المصل انخفاض المتوسط. مزيج الحل بلطف
    3. تمييع 0.67 ميليلتر من الكاشف الأيوني تعداء على أساس المادة الدهنية في 66.7 ميليلتر من المصل انخفاض المتوسط. مزيج الحل بلطف واحتضان لمدة 5 دقائق في الرايت
    4. بعد الحضانة، إضافة الكاشف تعداء المخفف مسبقاً إلى مير قبل المخفف. مزيج الحل بلطف واحتضان لمدة 15 دقيقة في الرايت
  3. إضافة مجمعات تعداء استعداد dropwise مباشرة إلى متوسط الثقافة في الخلايا. المزيج بلطف هزاز لوحة الثقافة خلية 24-جيدا ذهابا وإيابا.
  4. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2و 20% س2 ل 24 ساعة.

4-تحليل تعداء

ملاحظة: أداء العمل التالية في غرفة مظللة بدلاً من ذلك.

  1. خلية الحصاد بعد تعداء
    ملاحظة: جمع كافة الحلول الخلية من عينة واحدة في أنبوب الطرد المركزي المخروطية 15 مل نفس.
    1. 24 ساعة بعد تعداء، جمع المادة طافية العينات في أنابيب الطرد المركزي الخاصة بكل منها.
    2. تغسل الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني ونقل برنامج تلفزيوني في أنبوب الطرد المركزي الخاصة بكل منها وإضافة 500 ميليلتر التربسين/يدتا (RT) إلى الخلايا. احتضان حلول 3 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. وقف تريبسينيزيشن بإضافة 1 مل من الثقافة المتوسطة (RT) إلى الخلايا ونقل الحل في أنبوب الطرد المركزي الخاصة بكل منها. خلايا أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: من هذا الوقت، تبقى الخلايا والمواد الكاشفة على الجليد ما لم ينص على خلاف ذلك.
  2. إعداد الخلايا لتحليل تدفق سيتوميتريك
    1. تجاهل المادة طافية. إعادة تعليق الخلايا في 100 ميليلتر المصبوغة المخزن المؤقت (4 درجة مئوية) ونقل الخلية حل لأنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
    2. إضافة 0.5 ميليلتر لصبغ رد الفعل أمين للعينات من أجل التمييز بين الخلايا الحية والميتة. مزيج الحل بلطف واحتضان لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
    3. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني (4 درجة مئوية) إلى الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
    4. تعليق إعادة الخلايا في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني (4 درجة مئوية) وإضافة 33 ميليلتر من منهاج عمل بيجين (4 في المائة). مزيج من الحلول وتخزينها على الجليد أو عند 4 درجة مئوية حتى تحليل تدفق سيتوميتريك.
  3. قياس التدفق سيتوميتريك للخلايا
    ملاحظة: أداء العمل التالية في غرفة مظللة بدلاً من ذلك. تبقى الخلايا على الجليد حتى القياس.
    1. نقل العينات إلى أنابيب مناسبة لتدفق سيتوميتريك القياسات.
    2. دراسة جدوى الخلية وكفاءة امتصاص مير cytometer تدفق استخدام. قياس على الأقل 2 x 104 الأحداث. استخدام استراتيجية النابضة هو مبين في الشكل 4.
      ملاحظة: استخدام خلايا أونترانسفيكتيد كمراقبة سلبية على ترتيب النابضة للخلايا Cy3 الإيجابية وعلى حساب موت الخلية الناجمة عن تعداء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نقدم هنا، تعليمة عزلة مفصلة لحصاد هدفسكس من الأنسجة البشرية جريب طب الأسنان. نظراً لسهولة الوصول للمسام الأسنان أثناء الجراحة الروتينية، أنها مصدرا واعداً لاستخراج الخلايا الجذعية البالغة.

هدفسكس معزولة وأظهرت جميع الخصائص الموصوفة لتعريف MSCs13. في الواقع، كانت خلايا بلاستيكية ملتصقة تحت وصف ظروف الثقافة وعرضها مورفولوجيا تشبه تنتجها الخلايا الليفية (الشكل 1). وكشف تحليل تدفق سيتوميتريك أن هدفسكس أعرب فريق من بعض المستضدات السطحية، بما في ذلك CD29، CD44، CD73، CD90، و CD105، بينما كانت CD45 و CD117 غائبة (الشكل 2). وعلاوة على ذلك، أديبوجينيك، أوستيوجينيك، وإمكانيات التمايز تشوندروجينيك الخلايا تحت محددة في المختبر الثقافة الظروف ما أكده إيمونوستينينج الأحماض الدهنية ملزمة البروتين 4 (FABP4)، أوستيوكالسين، وأجريكان (الشكل 3).

تمكين استراتيجية وصف تعداء الأيوني على أساس المادة الدهنية كفاءة التعديل الوراثي عابرة من هدفسكس مع مير امتصاص ~ 100 في المائة من خلايا قابلة للحياة 24 ساعة بعد انتهاء تعداء (الشكل 4 باء). وعلاوة على ذلك، أظهرت transfected (الشكل 4A) وأونترانسفيكتيد (الشكل 4) عينات كميات مماثلة من الخلايا الميتة التي تثبت ظروف تجهيز خلية لطيف.

Figure 1
رقم 1: الضوء الممثل صورة مجهر هدفسكس. إظهار الخلايا مورفولوجيا تنتجها الخلايا الليفية مثل ظروف الثقافة القياسية.

Figure 2
رقم 2: تدفق الممثل سيتوميتريك إيمونوفينوتيبينج من هدفسكس- تحليل سيتوميتريك تدفق الخلايا بعد تلطيخ لعلامات سطح خلية محددة (أزرق). واستخدمت المقابلة ايستب الضوابط كعناصر سلبية (رمادي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: الممثل التحقق من أديبوجينيك، أوستيوجينيك وإمكانيات التمايز تشوندروجينيك هدفسكس. بعد التمايز، حددت adipocytes وأوستيوسيتيس وتشوندروسيتيس إيمونوستاينينج بروتين الأحماض الدهنية (A) 4 (FABP4) (الأخضر) و osteocalcin (ب) (أخضر) (ج) أجريكان (أخضر). كانت الملون الأنوية مع DAPI (أزرق). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: الممثل النابضة استراتيجية لتحليل تعداء. التمثيل التخطيطي النابضة الاستراتيجية المستخدمة للتقدير الكمي سيتوتوكسيسيتي (A) (الأزرق: الخلايا الميتة) و (ب) كفاءة امتصاص مير المسمى Cy3 (أحمر: Cy3+ الخلايا) تعداء بعد 24 ساعة. خلايا أونترانسفيكتيد (ج،د) استخدمت كعنصر التحكم.

أجهزة ماكينتوش FcR الأجسام المضادة [ميليلتر] ضوابط ايستب [ميليلتر]
عينة المخزن المؤقت حظر CD29 CD44 CD45 CD73 CD90 CD105 CD117 آسيا والمحيط الهادئ Cy5.5 بيركب V500 PE Cy5.5 بيركب AF488 PE Cy7
[ميليلتر] كاشف [ميليلتر] آسيا والمحيط الهادئ Cy5.5 بيركب V500 PE Cy5.5 بيركب AF488 PE Cy7 IgG1 IgG2b IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1
1 30 10 10
2 37.5 10 2.5
3 37.5 10 2.5
4 30 10 10
5 35 10 5
6 35 10 5
7 37.5 10 2.5
8 30 10 10
9 30 10 10
10 37.5 10 2.5
11 30 10 10
12 40 10 10
13 30 10 5
14 37.5 10 2.5

الجدول 1: بيبيتينج تخطيط إيمونوفينوتيبينج هدفسكس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخلايا الجذعية البالغة حاليا في التركيز لمعالجة العديد من الأمراض التنكسية. على وجه الخصوص، العظام نخاع (بي أم)-المستمدة من الخلايا الجذعية، بما في ذلك الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) و MSCs، قيد التحقيق السريرية مكثف47. ومع ذلك، حصاد BM هو إجراء جائر تسبب الألم في موقع التبرع وقد تؤدي إلى الأحداث الضائرة48. في الآونة الأخيرة، برز أنسجة الأسنان بعد الولادة كالرواية والوصول إليها بسهولة من مصدر للخلايا الجذعية. سيظهر لتلبية جميع MSC خصائص هذه الخلايا الجذعية طب الأسنان وأظهرت قدرة الانتشار أعلى كالخلايا الجذعية المشتقة من BM49. هنا، قدمنا بروتوكول مفصل لاستخراج وتوصيف والهندسة من هدفسكس.

وقد وضعت الإجراء وصف بمعزل عن غيرها في المسام الأسنان البشرية أثرت الحكمة الأسنان، هذا النسيج عادة المستخرجة، والتخلص من النفايات الطبية19. ومع ذلك، يمكن أن تستخدم الأنسجة الأسنان الأخرى، بما في ذلك لب الأسنان50،51واربطه اللثة52، سينظف الأسنان المتساقطة53، والجذر الحليمة قمي54، لاستخراج الجذعية طب الأسنان الخلايا.

الهندسة الوراثية للخلايا الجذعية عن طريق إدراج ميرس استراتيجية مبتكرة للتغلب على بعض الصعوبات في العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية، مثل الخلايا الجذعية منخفضة بقاء43،55،،من5657. وقدم هذا البروتوكول تعليمات حاسمة لكفاءة إدخال مير الاصطناعية في هدفسكس باستخدام كاشف تعداء الموجبة متاحة تجارياً على أساس المادة الدهنية. تطبيق تركيبات الاسمافرون الموجبة للتسليم المواد الكاشفة العلاجية، مثل المخدرات، والأحماض النووية، تم التحقيق في تجارب سريرية عديدة،من5859. ومع ذلك، الدهنية الموجبة يحتمل السامة للخلايا بطريقة تعتمد على الجرعة بأضرار مثل، إلى سلامة غشاء الخلية أو التعديلات في الجينات التعبير59،،من6061 . ولذلك، يجب إيلاء اهتمام خاص للتأثيرات السمية على الخلايا الناجمة عن تعداء.

جدير بالذكر أن يكون قد تم تحسين الظروف المشار إليها تعداء مير بوساطة التحوير الوراثي من هدفسكس فيما يتعلق بالكفاءة وسيتوتوكسيسيتي. ومع ذلك، أظهرت دراسات أخرى التطبيق الناجح لهذا الكاشف تعداء لتسليم إضافية الأحماض النووية، بما في ذلك الحمض النووي بلازميد، مرناً و siRNA، في خلية مختلفة أنواع62،63، 64 , 65 , 66 , 67 , 68-وكشفت نتائج هذه الدراسات أن شروط التسليم المثالي تفاوتاً كبيرا، وقد تحدد لكل نوع من الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل "البرنامج فورون المركز الطبي الجامعي روستوك" (889018) ومؤسسة رطبة (2016-11). وبالإضافة إلى ذلك، بعد الظهر، والثالثة التي يدعمها الفدرالية (كبار الشخصيات + 00240).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488 Bio-Rad MCA1557A488 Clone SN6, monoclonal
Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488 Bio-Rad MCA928A488 monoclonal
APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody BD Biosciences 559883 Clone MAR4, monoclonal
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 555751 Clone MOPC-21, monoclonal
PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody BD Biosciences 550257 Clone AD2, monoclonal
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 555749 Clone MOPC-21, monoclonal
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody BD Biosciences 339217 Clone 104D2, monoclonal
PE-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 557872 Clone MOPC-21, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody BD Biosciences 560531 Clone G44-26, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 558304 Clone 27-35, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90 Antibody BD Biosciences 561557 Clone 5E10, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 55095 Clone MOPC-21, monoclonal
V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody BD Biosciences 560777 Clone HI30, monoclonal
V500 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 560787 Clone X40, monoclonal
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec 130-059-901
UltraPure EDTA Thermo Fisher Scientific 15575-020 0.5M, pH 8.0
Steritop Merck Millipore SCGPT05RE 0.22 µm, radio-sterilized, polyethersulfone
BSA Sigma-Aldrich A7906
PFA Merck Millipore 1040051000
Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit R&D Systems SC006
RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution Thermo Fisher Scientific AM9780
Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 Thermo Fisher Scientific AM17120 5 nmol
Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 Thermo Fisher Scientific AM17110 5 nmol
Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11055 polyclonal
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21202 polyclonal
Mounting medium; Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057-20ML histology mounting medium
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope Zeiss
BD FACS LSRII flow cytometer BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2 BD Biosciences
ZEN2011 software Zeiss
Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%) Biochrom L2143 in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+
Amine reactive dye; LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
PBS (1x) Thermo Fisher Scientific 10010023 pH: 7.4; w/o: Ca and Mg
P-S-G (100x) Thermo Fisher Scientific 10378016
Basal medium; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 Thermo Fisher Scientific 11039021
Antibiotic, ZellShield Biochrom W 13-0050
FBS Thermo Fisher Scientific 10500064
Collagenase type I Thermo Fisher Scientific 17100017
Dispase II Thermo Fisher Scientific 17105041
Filter, Sterifix syringe filter 0.2 µm Braun 4099206
50 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62,547,254
15 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62,554,502
Cell culture flask 75 cm2 Sarstedt 833,910,002
Cell culture flask, 25 cm2 Sarstedt 833,911,002
Freezing medium, Biofreeze Biochrom F 2270
Cryotubes Thermo Fisher Scientific 377267 1.8 mL
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154 0.4 %
Counting chamber Paul Marienfeld
Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001% Mibe
NaCl solution Braun 0.9 %
Vicryl satures, Vicryl rapide Ethicon 3 - 0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: Applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839-851 (2015).
  2. Lima, R. L., et al. Human dental follicle cells express embryonic, mesenchymal and neural stem cells markers. Archives of oral biology. 73, 121-128 (2017).
  3. Wise, G. E. Cellular and molecular basis of tooth eruption. Orthodontics & craniofacial research. 12 (2), 67-73 (2009).
  4. Baykul, T., Saglam, A. A., Aydin, U., Başak, K. Incidence of cystic changes in radiographically normal impacted lower third molar follicles. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 99 (5), 542-545 (2005).
  5. Wise, G. E., Frazier-Bowers, S., D'Souza, R. N. Cellular, molecular, and genetic determinants of tooth eruption. Critical reviews in oral biology and medicine : an official publication of the American Association of Oral Biologists. 13 (4), 323-334 (2002).
  6. Ten Cate, A. R. The development of the periodontium: A largely ectomesenchymally derived unit. Periodontology 2000. 13 (1), 9-19 (1997).
  7. Park, B. -W., et al. In vitro and in vivo osteogenesis of human mesenchymal stem cells derived from skin, bone marrow and dental follicle tissues. Differentiation; research in biological diversity. 83 (5), 249-259 (2012).
  8. Sowmya, S., et al. Periodontal Specific Differentiation of Dental Follicle Stem Cells into Osteoblast, Fibroblast, and Cementoblast. Tissue engineering. Part C, Methods. 21 (10), 1044-1058 (2015).
  9. Kémoun, P., et al. Human dental follicle cells acquire cementoblast features under stimulation by BMP-2/-7 and enamel matrix derivatives (EMD) in vitro. Cell and tissue research. 329 (2), 283-294 (2007).
  10. Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
  11. Hieke, C., et al. Human dental stem cells suppress PMN activity after infection with the periodontopathogens Prevotella intermedia and Tannerella forsythia. Scientific reports. 6, 39096 (2016).
  12. Kumar, A., et al. Molecular spectrum of secretome regulates the relative hepatogenic potential of mesenchymal stem cells from bone marrow and dental tissue. Scientific reports. 7 (1), 15015 (2017).
  13. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  14. Ullah, I., et al. In vitro comparative analysis of human dental stem cells from a single donor and its neuronal differentiation potential evaluated by electrophysiology. Life sciences. 154, 39-51 (2016).
  15. Völlner, F., Ernst, W., Driemel, O., Morsczeck, C. A two-step strategy for neuronal differentiation in vitro of human dental follicle cells. Differentiation; research in biological diversity. 77 (5), 433-441 (2009).
  16. Morsczeck, C., et al. Comparison of human dental follicle cells (DFCs) and stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) after neural differentiation in vitro. Clinical oral investigations. 14 (4), 433-440 (2010).
  17. Kadar, K., et al. Differentiation potential of stem cells from human dental origin - promise for tissue engineering. Journal of physiology and pharmacology: An official journal of the Polish Physiological Society. 60, Suppl 7. 167-175 (2009).
  18. Heng, B. C., et al. Decellularized Matrix Derived from Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells Enhances the Neurogenic Potential of Dental Follicle Stem Cells. Journal of endodontics. 43 (3), 409-416 (2017).
  19. Honda, M. J., Imaizumi, M., Tsuchiya, S., Morsczeck, C. Dental follicle stem cells and tissue engineering. Journal of Oral Science. 52 (4), 541-552 (2010).
  20. Liu, J., et al. Concise reviews: Characteristics and potential applications of human dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Stem cells. 33 (3), Dayton, Ohio. 627-638 (2015).
  21. Morsczeck, C., Reichert, T. E. Dental stem cells in tooth regeneration and repair in the future. Expert opinion on biological therapy. 18 (2), 187-196 (2018).
  22. Rezai-Rad, M., et al. Evaluation of bone regeneration potential of dental follicle stem cells for treatment of craniofacial defects. Cytotherapy. 17 (11), 1572-1581 (2015).
  23. Handa, K., et al. Progenitor Cells From Dental Follicle Are Able to Form Cementum Matrix In Vivo. Connective Tissue Research. (2-3), 406-408 (2009).
  24. Tsuchiya, S., Ohshima, S., Yamakoshi, Y., Simmer, J. P., Honda, M. J. Osteogenic Differentiation Capacity of Porcine Dental Follicle Progenitor Cells. Connective Tissue Research. 51 (3), 197-207 (2010).
  25. Honda, M. J., et al. Stem cells isolated from human dental follicles have osteogenic potential. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 111 (6), 700-708 (2011).
  26. Guo, W., et al. Dental follicle cells and treated dentin matrix scaffold for tissue engineering the tooth root. Biomaterials. 33 (5), 1291-1302 (2012).
  27. Yang, B., et al. Tooth root regeneration using dental follicle cell sheets in combination with a dentin matrix - based scaffold. Biomaterials. 33 (8), 2449-2461 (2012).
  28. Bai, Y., et al. Cementum- and periodontal ligament-like tissue formation by dental follicle cell sheets co-cultured with Hertwig's epithelial root sheath cells. Bone. 48 (6), 1417-1426 (2011).
  29. Guo, S., et al. Comparative study of human dental follicle cell sheets and periodontal ligament cell sheets for periodontal tissue regeneration. Cell transplantation. 22 (6), 1061-1073 (2013).
  30. Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC biotechnology. 15, 114 (2015).
  31. Li, X., et al. A therapeutic strategy for spinal cord defect: Human dental follicle cells combined with aligned PCL/PLGA electrospun material. BioMed research international. , 197183 (2015).
  32. Yang, C., Li, X., Sun, L., Guo, W., Tian, W. Potential of human dental stem cells in repairing the complete transection of rat spinal cord. Journal of neural engineering. 14 (2), 26005 (2017).
  33. Kanao, S., et al. Capacity of Human Dental Follicle Cells to Differentiate into Neural Cells In Vitro. Stem Cells International. 2017, 8371326 (2017).
  34. Sung, I. -Y., et al. Cardiomyogenic Differentiation of Human Dental Follicle-derived Stem Cells by Suberoylanilide Hydroxamic Acid and Their In Vivo Homing Property. International journal of medical sciences. 13 (11), 841-852 (2016).
  35. Botelho, J., Cavacas, M. A., Machado, V., Mendes, J. J. Dental stem cells: Recent progresses in tissue engineering and regenerative medicine. Annals of medicine. 49 (8), 644-651 (2017).
  36. Dou, L., et al. Secretome profiles of immortalized dental follicle cells using iTRAQ-based proteomic analysis. Scientific reports. 7 (1), 7300 (2017).
  37. Lee, S., Choi, E., Cha, M. -J., Hwang, K. -C. Cell adhesion and long-term survival of transplanted mesenchymal stem cells: A prerequisite for cell therapy. Oxidative medicine and cellular longevity. 2015, 632902 (2015).
  38. Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Recent Progress in Stem Cell Modification for Cardiac Regeneration. Stem Cells International. 2018 (2), 1-22 (2018).
  39. Nowakowski, A., Walczak, P., Janowski, M., Lukomska, B. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells for Regenerative Medicine. Stem cells and development. 24 (19), 2219-2242 (2015).
  40. Nowakowski, A., Walczak, P., Lukomska, B., Janowski, M. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells to Induce Their Migration and Survival. Stem Cells International. 2016, 4956063 (2016).
  41. Gulluoglu, S., Tuysuz, E. C., Bayrak, O. F. miRNA Regulation in Dental Stem Cells: From Development to Terminal Differentiation. Dental Stem Cells. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. #350;ahin, F., Doğan, A., Demirci, S. , Springer International Publishing. (2016).
  42. Hammond, S. M. An overview of microRNAs. Advanced drug delivery reviews. 87, 3-14 (2015).
  43. Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular research. 93 (4), 614-622 (2012).
  44. Clark, E. A., Kalomoiris, S., Nolta, J. A., Fierro, F. A. Concise Review: MicroRNA Function in Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. Stem cells. 32 (5), 1074-1082 (2014).
  45. Dakhlallah, D., et al. MicroRNA-133a engineered mesenchymal stem cells augment cardiac function and cell survival in the infarct heart. Journal of cardiovascular pharmacology. 65 (3), 241-251 (2015).
  46. Seo, H. -H., et al. Exogenous miRNA-146a Enhances the Therapeutic Efficacy of Human Mesenchymal Stem Cells by Increasing Vascular Endothelial Growth Factor Secretion in the Ischemia/Reperfusion-Injured Heart. Journal of vascular research. 54 (2), 100-108 (2017).
  47. Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell stem cell. 17 (1), 11-22 (2015).
  48. Siddiq, S., et al. Bone marrow harvest versus peripheral stem cell collection for haemopoietic stem cell donation in healthy donors. The Cochrane database of systematic reviews. (1), CD006406 (2009).
  49. Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B. Dental-Related Stem Cells and Their Potential in Regenerative Medicine. Regenerative Medicine and Tissue Engineering. Andrades, J. A. , InTech. (2013).
  50. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  51. Honda, M. J., et al. Side population cells expressing ABCG2 in human adult dental pulp tissue. International endodontic journal. 40 (12), 949-958 (2007).
  52. Seo, B. -M., et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. The Lancet. 364 (9429), 149-155 (2004).
  53. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  54. Sonoyama, W., et al. Characterization of the apical papilla and its residing stem cells from human immature permanent teeth: a pilot study. Journal of endodontics. 34 (2), 166-171 (2008).
  55. Nollet, E., Hoymans, V. Y., van Craenenbroeck, A. H., Vrints, C. J., van Craenenbroeck, E. M. Improving stem cell therapy in cardiovascular diseases: the potential role of microRNA. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 311 (1), H207-H218 (2016).
  56. Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761 (2016).
  57. Schade, A., et al. Magnetic Nanoparticle Based Nonviral MicroRNA Delivery into Freshly Isolated CD105(+) hMSCs. Stem cells international. 2014, 197154 (2014).
  58. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
  59. Xue, H. Y., Liu, S., Wong, H. L. Nanotoxicity: a key obstacle to clinical translation of siRNA-based nanomedicine. Nanomedicine. 9 (2), London, England. 295-312 (2014).
  60. Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological & pharmaceutical bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
  61. Omidi, Y., Barar, J., Akhtar, S. Toxicogenomics of cationic lipid-based vectors for gene therapy: impact of microarray technology. Current drug delivery. 2 (4), 429-441 (2005).
  62. Hausburg, F., et al. Defining optimized properties of modified mRNA to enhance virus- and DNA- independent protein expression in adult stem cells and fibroblasts. Cellular physiology and biochemistry: International journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 35 (4), 1360-1371 (2015).
  63. Cardarelli, F., et al. The intracellular trafficking mechanism of Lipofectamine-based transfection reagents and its implication for gene delivery. Scientific reports. 6, 25879 (2016).
  64. Kirschman, J. L., et al. Characterizing exogenous mRNA delivery, trafficking, cytoplasmic release and RNA-protein correlations at the level of single cells. Nucleic acids research. 45 (12), e113 (2017).
  65. Li, L., Nie, Y., Ye, D., Cai, G. An easy protocol for on-chip transfection of COS-7 cells with a cationic lipid-based reagent. Lab on a chip. 9 (15), 2230-2233 (2009).
  66. Chang, K., Marran, K., Valentine, A., Hannon, G. J. RNAi in cultured mammalian cells using synthetic siRNAs. Cold Spring Harbor protocols. 2012 (9), 957-961 (2012).
  67. Sakurai, K., Chomchan, P., Rossi, J. J. Silencing of gene expression in cultured cells using small interfering RNAs. Current protocols in cell biology. , Chapter 27, Unit 27.1.1-28 (2010).
  68. Hoelters, J., et al. Nonviral genetic modification mediates effective transgene expression and functional RNA interference in human mesenchymal stem cells. The journal of gene medicine. 7 (6), 718-728 (2005).

Tags

علم الوراثة، 141 قضية، الخلايا الجذعية، الخلايا الجذعية جريب طب الأسنان، والخلايا الجذعية الوسيطة، التعديل غير الفيروسية، والهندسة الوراثية، تعداء عابرة، microRNA
عزل وتوصيف والمستندة إلى MicroRNA التحوير الوراثي للخلايا الجذعية البشرية جريب طب الأسنان
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Müller, P., Ekat, K.,… More

Müller, P., Ekat, K., Brosemann, A., Köntges, A., David, R., Lang, H. Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells. J. Vis. Exp. (141), e58089, doi:10.3791/58089 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter