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Genetics

अलगाव, लक्षण वर्णन और मानव दंत कूप स्टेम सेल के MicroRNA आधारित आनुवंशिक संशोधन

Published: November 16, 2018 doi: 10.3791/58089
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 3, 1,2, 3
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty at Rostock University, 3Department of Operative Dentistry and Periodontology, Rostock University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल चिकित्सकीय स्टेम मानव दंत कूप से निकाले कोशिकाओं के क्षणिक आनुवंशिक इंजीनियरिंग का वर्णन । लागू गैर वायरल संशोधन रणनीति चिकित्सकीय स्टेम सेल उत्पादों के सुधार के लिए एक आधार बन सकता है ।

Abstract

तिथि करने के लिए, विभिंन विकासात्मक चरणों में कई स्टेम सेल प्रकार अपक्षयी रोगों के उपचार के लिए ध्यान में हैं । फिर भी, कुछ पहलुओं, जैसे प्रारंभिक बड़े पैमाने पर कोशिका मृत्यु और कम उपचारात्मक प्रभाव, उनके व्यापक नैदानिक अनुवाद बिगड़ा । प्रत्यारोपण करने से पहले स्टेम कोशिकाओं के आनुवंशिक इंजीनियरिंग चिकित्सकीय स्टेम सेल प्रभाव का अनुकूलन करने के लिए एक आशाजनक विधि के रूप में उभरा । हालांकि, सुरक्षित और कुशल जीन डिलिवरी सिस्टम अभी भी कमी है । इसलिए, उपयुक्त विधियों का विकास स्टेम सेल आधारित उपचारों में वर्तमान चुनौतियों का समाधान करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान कर सकता है ।

वर्तमान प्रोटोकॉल निष्कर्षण और मानव दंत कूप स्टेम सेल (hDFSCs) के रूप में अच्छी तरह के रूप में उनके गैर वायरल आनुवंशिक संशोधन के लक्षण वर्णन । जन्मोत्तर दंत कूप उच्च प्रसार क्षमता रखने वयस्क multipotent स्टेम सेल कटाई के लिए एक होनहार और आसानी से सुलभ स्रोत के रूप में अनावरण किया । वर्णित अलगाव प्रक्रिया प्रभावित ज्ञान दांत से hDFSCs फसल के लिए एक सरल और विश्वसनीय तरीका प्रस्तुत करता है । इसके अलावा इस प्रोटोकॉल के लिए अलग कोशिकाओं के स्टेम सेल विशेषताओं को परिभाषित करने के तरीके शामिल हैं । hDFSCs के आनुवंशिक इंजीनियरिंग के लिए, एक अनुकूलित cationic लिपिड आधारित अभिकर्मक रणनीति साइटोटोक्सिक प्रभाव के कारण के बिना अत्यधिक कुशल microRNA परिचय को सक्षम करने के लिए प्रस्तुत किया है । MicroRNAs परिवर्तनीय सेल हेरफेर के लिए उपयुक्त उंमीदवार हैं, के रूप में इन छोटे शोधों नियामकों स्थिर जीनोम एकीकरण के खतरे के बिना भाग्य और स्टेम सेल के व्यवहार को नियंत्रित करते हैं । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल hDFSCs कि उनके चिकित्सीय प्रभावकारिता के अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है इंजीनियरिंग के लिए एक सुरक्षित और कुशल प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है ।

Introduction

मानव दंत कूप एक ढीला ectomesenchymally है संयोजी विकासशील दांत1,2आसपास के ऊतक व्युत्पंन । अपने कार्य के बगल में दांत विस्फोट प्रक्रिया के लिए osteoclastogenesis और आस्टियोजेनेसिस समंवय करने के लिए, इस ऊतक periodontium3,4,5के विकास के लिए विशेष रूप से स्टेम और जनक कोशिकाओं बंदरगाहों । इसलिए, दंत कूप मानव वयस्क स्टेम सेल6,7फसल के लिए एक वैकल्पिक स्रोत के रूप में माना जाता है ।

कई अध्ययनों से प्रदर्शन किया है कि मानव दंत कूप स्टेम सेल (hDFSCs) osteoblasts, बंध fibroblasts और cementoblasts8,9,10 सहित periodontal वंश में अंतर करने में सक्षम हैं . इसके अलावा, इन कोशिकाओं को आत्म-नवीकरण क्षमता, प्लास्टिक पालन, विशिष्ट सतह मार्करों की अभिव्यक्ति (जैसे, CD73, CD90, CD105) के रूप में अच्छी तरह से osteogenic सहित mesenchymal stromal कोशिकाओं (MSCs) के सभी विशेषताओं से मेल करने के लिए दिखाया गया है, adipogenic र chondrogenic विभेद संभावित११,१२,१३। अंय अध्ययनों से भी पता चला hDFSCs2,14,15,16,17,18के तंत्रिका विभेद की क्षमता ।

उनके होनहार गुणों और आसान पहुंच के कारण, hDFSCs हाल ही में ऊतक इंजीनियरिंग19,20,21के लिए प्रासंगिक बन गया । पहला अध्ययन DFSCs की क्षमता पर केंद्रित करने के लिए अस्थि, periodontal और दांत जड़ों19,22,23,24,25,26, पुनर्जंम 27,28,29,30. hDFSCs की तंत्रिकाजन्य क्षमता के ज्ञान के बाद से, neurodegenerative रोगों के लिए संभावित उपचार के रूप में उनके आवेदन31,३२,३३की जांच की गई है । HDFSCs भी अंय ऊतकों (जैसे, corneal उपकला)३४,३५के उत्थान के लिए संमान के साथ महत्व प्राप्त किया है । hDFSC की चिकित्सीय क्षमता न केवल उनके प्रत्यक्ष विभेदक क्षमता पर आधारित है बल्कि उनकी paracrine गतिविधि पर भी निर्भर करती है । हाल ही में, hDFSCs इस तरह के मैट्रिक्स metalloproteinases (MMPs), इंसुलिन जैसे विकास कारक (IGF), संवहनी endothelial वृद्धि कारक (वीईजीएफ़), बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF) और hepatocyte वृद्धि के रूप में सक्रिय कारकों, के एक धन स्रावित करने के लिए दिखाया गया है फैक्टर (एचजीएफ), जो angiogenesis के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, चुहियों, अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स remodeling और प्रतिकारक प्रक्रियाओं३६।

हालांकि, स्टेम सेल थेरेपी के व्यापक नैदानिक अनुवाद अभी भी कई चुनौतियों से ख़राब है, जैसे बड़े पैमाने पर प्रारंभिक सेल मौत और कम लाभकारी स्टेम सेल प्रभाव३७,३८। आनुवंशिक इंजीनियरिंग इन चुनौतियों का पता करने के लिए एक आशाजनक रणनीति प्रदान करता है और इसलिए बहुत स्टेम कोशिकाओं३८,३९,४०की चिकित्सीय प्रभावकारिता को बढ़ा सकते हैं । क्षणिक कोशिका हेरफेर के लिए, microRNAs (miRs) उपयुक्त उंमीदवार हैं, के रूप में इन छोटे शोधों नियामकों स्थिर जीनोम एकीकरण के जोखिम के बिना स्टेम सेल के भाग्य और व्यवहार को नियंत्रित४१,४२, ४३. तिथि करने के लिए, कई लाभकारी miRs स्टेम सेल प्रसार को बढ़ावा देने की पहचान की गई है, अस्तित्व, होमिंग, paracrine गतिविधि के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कई प्रजातियों में उनके भेदभाव४४. उदाहरण के लिए, मीर-133a इंजीनियर MSCs एक वृद्धि की उत्तरजीविता दिखाया और infarcted चूहा दिल में engraftment एक बेहतर हृदय समारोह में जिसके परिणामस्वरूप जब unmodified MSCs४५की तुलना में । इसी तरह, मीर-146a व्यक्त MSCs वीईजीएफ़ के उच्च मात्रा में जो बारी में कोरोनरी ऊतक४६में एक बढ़ाया चिकित्सकीय दक्षता के नेतृत्व में स्रावित करने के लिए दिखाया गया.

इस पांडुलिपि चयनात्मक निष्कर्षण और hDFSCs के आनुवंशिक इंजीनियरिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है । इस प्रयोजन के लिए, हम मानव दंत कूप के संचयन और एंजाइमी पाचन के साथ ही hDFSCs के बाद के अलगाव का वर्णन किया । आदेश में अलग कोशिकाओं की विशेषता के लिए, एमएससी संपत्तियों के सत्यापन के लिए महत्वपूर्ण निर्देश के अनुसार सेलुलर चिकित्सा13के लिए इंटरनेशनल सोसायटी के दिशा निर्देशों के साथ शामिल किया गया है । इसके अलावा, हम एक cationic लिपिड आधारित अभिकर्मक रणनीति और अभिकर्मक दक्षता और cytotoxicity के मूल्यांकन लागू करने के द्वारा मीर संशोधित hDFSCs की पीढ़ी के लिए एक विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं ।

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Protocol

HDFSCs रॉस्टॉक विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र के मौखिक और मैक्सिलोफैशियल प्लास्टिक सर्जरी विभाग द्वारा उपलब्ध कराए गए ज्ञान दांत के दंत कूप से अलग कर रहे हैं । सभी रोगियों से सूचित सहमति एवं लिखित स्वीकृति प्राप्त की गई । यह अध्ययन रॉस्टॉक विश्वविद्यालय की स्थानीय एथिक्स कमेटी (अनुमति सं. ए 2017-0158) द्वारा प्राधिकृत किया गया था ।

1. hDFSCs का अलगाव

नोट: जीवाणु संदूषण को रोकने के लिए, ज्ञान दांत निष्कर्षण से पहले नहीं उभर होना चाहिए

  1. आवश्यक समाधान की तैयारी
    1. तैयार फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब)/Penicillin-Streptomycin-Glutamine (पी-एस-जी) समाधान: पी-एस-जी समाधान के 5 मिलीलीटर के साथ पंजाब के ४९५ मिलीलीटर का मिश्रण । 4 डिग्री सेल्सियस पर ५० मिलीलीटर की दुकान aliquots ।
    2. hDFSC कल्चर मीडियम तैयार करें: एंटीबायोटिक एजेंट के 5 मिलीलीटर और भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के ५० मिलीलीटर के साथ बेसल मध्यम के ४४५ मिलीलीटर को मिलाएं । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    3. तैयार Collagenase प्रकार मैं शेयर समाधान (30 मिलीग्राम/एमएल): पतला ३०० मिलीग्राम Collagenase प्रकार मैं बेसल मध्यम के 10 मिलीलीटर में 1% एंटीबायोटिक एजेंट के साथ पूरक । जोरदार घोल मिक्स करा. ०.२ µm फ़िल्टर का उपयोग करके समाधान फ़िल्टर करें । स्टोर aliquots के ५०० µ l के Collagenase प्रकार मैं स्टॉक समाधान पर-20 ° c.
    4. तैयार Dispase द्वितीय स्टॉक समाधान (४० मिलीग्राम/एमएल): पतला ४० Dispase द्वितीय के एमजी बेसल मध्यम के 10 मिलीलीटर में 1% एंटीबायोटिक एजेंट के साथ पूरक । जोरदार घोल मिक्स करा. ०.२ µm फ़िल्टर का उपयोग करके समाधान फ़िल्टर करें । Dispase II स्टॉक समाधान के ५०० µ l का संग्रह aliquots-20 ° c.
  2. सर्जिकल प्रक्रिया
    1. स्थानीय संवेदनाहारी के एक पर्याप्त राशि (अधिकतम: 2 मिलीलीटर) सुई ।
    2. बनाएं और एक तीन तरफा mucoperiosteal प्रालंब बढ़ा । एक बहुभाषी प्रालंब स्थापना की आवश्यकता नहीं है ।
    3. एक periosteal लिफ्ट के साथ बहुभाषी पहलू की रक्षा करना ।
    4. धीरे एक दौर मुश्किल धातु गड़गड़ाहट के साथ मिल buccal और बाहर की हड्डी ।
    5. एक periosteal लिफ्ट के साथ कूप के ऊतकों को ढीला । ध्यान से पूरा दांत (रोगाणु) और बाहर मुकुट खींचकर कूप (और कूप) पीछे (तीसरे दाढ़) संदंश के साथ हटा दें ।
    6. स्त्री और NaCl समाधान के साथ अच्छी तरह से सॉकेट सिंचाई ।
    7. vicryl टांके के साथ mucoperiosteal प्रालंब बदलें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    8. मौखिक गुहा से दांत कूप निकालें और उंहें पंजाब के ५० मिलीलीटर की एक aliquot में जगह/पी-एस-जी समाधान ।
      नोट: नमूना 4 डिग्री सेल्सियस पर आगे प्रसंस्करण तक संग्रहित किया जा सकता है ।
  3. एंजाइमी दांत कूप के पाचन
    1. प्री-वार्म hDFSC कल्चर मीडियम और पंजाब/पी-एस-जी के कमरे के तापमान (आरटी) के समाधान ।
    2. गल येक Collagenase प्रकार I और Dispase II शेयर सॉल्यूशन का एक aliquot । 3 मिलीग्राम/एमएल Collagenase प्रकार मैं और 4 मिलीग्राम/एमएल Dispase द्वितीय के ५०० µ एल जोड़कर एक पाचन समाधान तैयार करें प्रत्येक Collagenase प्रकार मैं और Dispase द्वितीय स्टॉक समाधान 1% एंटीबायोटिक एजेंट युक्त बेसल मध्यम के 4 मिलीलीटर के लिए ।
    3. एक बाँझ पेट्री डिश में निकाले कूप प्लेस और पंजाब के 10 मिलीलीटर/पी-एस जी समाधान निकाले ऊतक धोने के लिए । इस धुलाई चरण को दो बार दोहराएं ।
    4. पेट्री डिश के भीतर एक बाँझ स्केलपेल के साथ के बारे में 1 मिमी x 1 मिमी के टुकड़े करने के लिए निकाले कूप कीमा/पी-एस-जी समाधान ।
    5. स्थानांतरण कीमा बनाया हुआ ऊतक और पंजाबियों/पी-एस-जी समाधान पेट्री डिश से एक ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में । पेट्री डिश को पंजाब के 10 मिलीलीटर/पी-एस-जी सॉल्यूशन से धोएं और समाधान को उसी ट्यूब में ट्रांसफर कर दें ।
    6. 10 मिनट के लिए आरटी पर ३५३ x जी में शंकु केंद्रापसारक ट्यूब केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
    7. गोली ऊतक के लिए पाचन समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें । धीरे समाधान और ऊतक मिश्रण । ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% 2 एक मिलाते हुए मशीन में एच के लिए सह2 पर मिश्रण गर्मी ।
    8. आर टी डाइजेस्ट में 10 मिनट के लिए ३५३ x g पर पचा सेल/supernatant त्यागें और hDFSC संस्कृति माध्यम के 6 मिलीलीटर में प्राप्त गोली पुनः निलंबित ।
    9. बीज सेल में एक 25 सेमी2 सेल संस्कृति कुप्पी और ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2 और 20% हे2पर गर्मी कोशिकाओं में निलंबन ।
      नोट: यदि ऊतक पूरी तरह से पचा नहीं है, शेष ऊतक सेल संस्कृति कुप्पी के रूप में अच्छी तरह से हस्तांतरण ।
    10. सेल सीडिंग के बाद मध्यम ध्यान से 24 एच बदलें । बाद में परिवर्तन मध्यम हर तीन दिन तक प्रवाह ।
      नोट: HDFSCs कोशिका बोने के बाद प्लास्टिक-अनुयाई 24 एच होना चाहिए और केवल माध्यम बदलकर गैर-अनुयाई कोशिकाओं और रक्त घटकों से अलग किया जा सकता है ।
  4. सेल हार्वेस्टिंग
    1. प्री-वार्म hDFSC कल्चर मीडियम, पंजाब/पी-एस-जी सॉल्यूशन और Trypsin/Ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) सॉल्यूशन फॉर आरटी.
    2. supernatant से संस्कृति कुप्पी और धो धाराप्रवाह कोशिकाओं के 5 मिलीलीटर के साथ छोड़ो/पी-एस-जी समाधान ।
    3. संस्कृति कुप्पी और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए मशीन के लिए Trypsin/EDTA समाधान की 1 मिलीलीटर जोड़ें । संस्कृति कुप्पी के hDFSC संस्कृति माध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़कर पाचन प्रक्रिया को रोकें ।
    4. स्थानांतरण सेल सस्पेंशन में एक 15 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब और 10 मिनट के लिए निलंबन केंद्रापसारक पर ३५३ x g पर छोड़ supernatant और फिर से hDFSC संस्कृति माध्यम की एक उचित मात्रा में गोली निलंबित ।
    5. कोशिकाओं गिनती: धीरे Trypan नीले समाधान के 10 µ एल के साथ सेल निलंबन के 10 µ एल मिश्रण । एक गिनती चैंबर में 10 µ एल लागू करें और hDFSC सेल राशि की गणना.

2. hDFSCs का लक्षण वर्णन

  1. Immunophenotyping
    1. प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए कक्षों की तैयारी
      1. आवश्यक समाधान की तैयारी
        1. EDTA (2 मिमी): EDTA (०.५ मीटर) की 4 मिलीलीटर के साथ पंजाब के ९९६ मिलीलीटर मिश्रण तैयार करें ।
        2. धुंधला बफर तैयार: BSA के 5 ग्राम के साथ EDTA (2 मिमी) के ९९५ मिलीलीटर मिश्रण । एक ०.२२ µm फ़िल्टर इकाई का उपयोग कर समाधान फ़िल्टर और 4 ° c पर स्टोर जब तक उपयोग ।
        3. तैयार paraformaldehyde (पीएफए) शेयर समाधान (4%): पंजाब के १०० मिलीलीटर में 4 ग्राम पीएफए पतला और ८० डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान गर्मी । समाधान मिश्रण और ७.३ करने के लिए पीएच मान समायोजित करें । Aliquot संबंधित मात्रा में पीएफए समाधान प्राप्त (१.५ मिलीलीटर) और स्टोर पर-20 डिग्री सेल्सियस उपयोग तक ।
          चेतावनी: क्योंकि पीएफए धुएं विषाक्त कर रहे हैं, एक हवादार धुएं हुड में पीएफए समाधान तैयार करते हैं ।
      2. सेल संचयन (१.४) के बाद, 5 x 104 कोशिकाओं के 14 नमूनों को १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में स्थानांतरित करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० x g पर निलंबन केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें ।
        नोट: एक जगह छायांकित कमरे में निंनलिखित काम करते हैं । बर्फ पर कोशिकाओं और रिएजेंटों रखें जब तक अंयथा कहा ।
      3. धुंधला बफ़र (4 डिग्री सेल्सियस) की कुछ मात्रा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित और तालिका 1में संकेत के रूप में FcR ब्लॉकिंग एजेंट (4 डिग्री सेल्सियस) जोड़ें ।
      4. तालिका 1में संकेत के रूप में संबंधित नमूने के भीतर की ओर निंनलिखित एंटीबॉडी जोड़ें: Allophycocyanin (APC) माउस विरोधी मानव CD29; APC माउस IgG1 κ isotype नियंत्रण; Peridinin-क्लोरोफिल प्रोटीन (PerCP)-cyanine 5.5 माउस एंटी ह्यूमन CD44; PerCP-cyanine 5.5 माउस IgG2b κ isotype नियंत्रण; V500 चूहा विरोधी मानव CD45; V500 माउस IgG1 κ isotype नियंत्रण; Phycoerythrin (पीई) माउस विरोधी मानव CD73; पे माउस IgG1 κ isotype control; PerCP-cyanine 5.5 माउस एंटी ह्यूमन CD90; PerCP-cyanine 5.5 माउस IgG1 κ isotype नियंत्रण; माउस विरोधी मानव CD105: Alexa Fluor (वायुसेना) 488; माउस IgG1 नकारात्मक नियंत्रण: AF488; पे-Cyanine7 माउस एंटी-ह्यूमन CD117; पे-Cyanine7 माउस IgG1, κ isotype कंट्रोल. एंटीबॉडी के बाद प्रत्येक नमूने के लिए जोड़ा गया है, एंटीबॉडी नीचे स्पिन और धीरे मिश्रण. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए समाधान की मशीन ।
      5. पंजाब (4 डिग्री सेल्सियस) के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० x g पर नमूने के लिए । supernatant को त्यागें ।
      6. पंजाब (4 डिग्री सेल्सियस) के १०० µ एल में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड और पीएफए (4%) के ३३ µ l को जोड़ें । मिश्रण समाधान और बर्फ पर दुकान या 4 ° c पर जब तक प्रवाह cytometric विश्लेषण ।
    2. कोशिकाओं का प्रवाह cytometric माप
      नोट: एक जगह छायांकित कमरे में निंनलिखित काम करते हैं । माप तक बर्फ पर कोशिकाओं रखें ।
      1. सतह एंटीजन की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए, प्रवाह cytometric माप के लिए उपयुक्त ट्यूबों में स्थानांतरण नमूने ।
      2. एक प्रवाह cytometer का उपयोग कर कम से 2 x 104 घटनाओं को मापने । चित्र 2में दर्शाए अनुसार विश्लेषण करें ।
  2. hDFSCs की Multipotent विभेदक क्षमता
    1. hDFSCs की adipogenic, osteogenic और chondrogenic विभेदक क्षमता की पुष्टि करने के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानव Mesenchymal स्टेम सेल कार्यात्मक पहचान किट का प्रयोग करें । फैटी एसिड बाध्यकारी प्रोटीन के दाग के लिए गधा विरोधी बकरी AF488 माध्यमिक एंटीबॉडी 4 (FABP4) और aggrecan के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गधा विरोधी माउस AF488 एंटीबॉडी के धुंधला के लिए माध्यमिक osteocalcin लागू करें । नाभिक के दाग के लिए, 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) के साथ बढ़ते मध्यम का उपयोग करें ।
      नोट: सूक्ष्म विश्लेषण के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्राथमिक एंटीबॉडी बिना नमूनों को तैयार.
    2. लेजर स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा प्रोटीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण । माइक्रोस्कोप सेटिंग्स: तेल विसर्जन के साथ 40x उद्देश्य; उत्तेजना लेजर ४८८ एनएम (AF488 के लिए) और ४०५ एनएम (DAPI के लिए) ।

3. अभिकर्मक का hDFSCs

  1. सेल हार्वेस्टिंग (१.४) के बाद, अभिकर्मक करने से पहले 24-well सेल कल्चर प्लेट 24 एच पर सीड hDFSCs ।
    नोट: सेल घनत्व शुरू लगभग 4 x 10 अच्छी तरह से प्रति4 कोशिकाओं है । कोशिकाओं अभिकर्मक के दिन पर ~ ८०% संगम तक पहुंच जाना चाहिए ।
    नोट: बीज एक अतिरिक्त सेल नमूना प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए नियंत्रण के रूप में ।
  2. अभिकर्मक परिसरों की तैयारी
    नोट: RNases से संक्रमण को रोकने के लिए, RNase दूषण समाधान का उपयोग कर अभिकर्मक परिसरों की तैयारी से पहले कार्यक्षेत्र को साफ करें । केवल RNase-मुक्त सामग्री और समाधानों का उपयोग करें ।
    नोट: एक जगह छायांकित कमरे में निंनलिखित काम करते हैं ।
    1. मीर स्टॉक समाधान तैयार करें (५० µ m): पुनः निलंबित Cy3-बला के प्रणेता मीर (5 nmol) में १०० µ l nuclease-मुक्त पानी. Aliquot संबंधित मात्रा में मीर स्टॉक समाधान प्राप्त (5 µ एल) और दुकान पर अंधेरे में-20 ° c उपयोग तक ।
    2. ४० pmol मीर का पतला (०.८ µ एल के ५० µ एम मीर स्टॉक समाधान) में कम सीरम मध्यम के ६६.७ µ l. घोल को धीरे से मिलाएं
    3. कम सीरम मध्यम के ६६.७ µ l में cationic लिपिड-आधारित अभिकर्मक रिएजेंट के ०.६७ µ एल पतला । मिश्रण धीरे समाधान और आरटी पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
    4. मशीन के बाद, पूर्व पतला मीर के लिए पूर्व पतला अभिकर्मक एजेंट जोड़ें । मिश्रण धीरे समाधान और आरटी पर 15 मिनट के लिए मशीन ।
  3. तैयार अभिकर्मक परिसरों को सीधे dropwise के कल्चरल मीडियम से जोड़ें । 24-अच्छी तरह से सेल संस्कृति थाली आगे और पीछे कमाल द्वारा धीरे से मिलाएं ।
  4. ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% CO2, और 20% O2 में 24 घंटे के लिए कोशिकाओं की मशीन ।

4. अभिकर्मक का विश्लेषण

नोट: एक जगह छायांकित कमरे में निंनलिखित काम करते हैं ।

  1. अभिकर्मक के बाद सेल हार्वेस्टिंग
    नोट: एक ही 15 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में एक नमूना के सभी सेल समाधान ले लीजिए ।
    1. 24 अभिकर्मक के बाद एच, संबंधित केंद्रापसारक ट्यूबों में नमूनों की supernatant इकट्ठा ।
    2. पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ धो कोशिकाओं, संबंधित केंद्रापसारक ट्यूब में पंजाबियों हस्तांतरण और कोशिकाओं को ५०० µ l Trypsin/EDTA (आरटी) जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए समाधान की मशीन ।
    3. संस्कृति मध्यम (आरटी) की कोशिकाओं को 1 मिलीलीटर जोड़कर trypsinization रोकें और संबंधित केंद्रापसारक ट्यूब में समाधान हस्तांतरण । 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक ।
      नोट: इस समय से, बर्फ पर कोशिकाओं और रिएजेंटों रखें जब तक अंयथा कहा ।
  2. प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए कक्षों की तैयारी
    1. supernatant को त्यागें । १०० µ एल धुंधला बफर (4 डिग्री सेल्सियस) और एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के लिए स्थानांतरण सेल समाधान में पुन: निलंबित कोशिकाओं ।
    2. नमूने के लिए अमीन प्रतिक्रियाशील डाई के ०.५ µ एल जोड़ें आदेश में रहते हैं और मृत कोशिकाओं के बीच भेद करने के लिए. धीरे समाधान मिश्रण और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
    3. पंजाब के 1 मिलीलीटर (4 डिग्री सेल्सियस) कोशिकाओं को जोड़ने और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें ।
    4. पंजाब (4 डिग्री सेल्सियस) के १०० µ एल में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड और पीएफए (4%) के ३३ µ l को जोड़ें । मिश्रण समाधान और बर्फ पर दुकान या 4 ° c पर जब तक प्रवाह cytometric विश्लेषण ।
  3. कोशिकाओं का प्रवाह cytometric माप
    नोट: एक जगह छायांकित कमरे में निंनलिखित काम करते हैं । माप तक बर्फ पर कोशिकाओं रखें ।
    1. प्रवाह cytometric माप के लिए उपयुक्त ट्यूबों में स्थानांतरण नमूने ।
    2. कोशिका व्यवहार्यता की जांच करें और मीर तेज एक प्रवाह cytometer का उपयोग कर दक्षता । 2 x 104 घटनाओं को मापने । चित्रा 4में दर्शाई गई गेटिंग कार्यनीति का उपयोग करें.
      नोट: नकारात्मक नियंत्रण के रूप में untransfected कोशिकाओं का प्रयोग करें Cy3 सकारात्मक कोशिकाओं के लिए गेटिंग की व्यवस्था करने के लिए और सेल अभिकर्मक की वजह से मौत की गणना ।

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Representative Results

यहां, हम मानव दंत कूप ऊतक से hDFSCs फसल के लिए एक विस्तृत अलगाव अनुदेश पेश करते हैं । नियमित सर्जरी के दौरान दंत कूप के आसान पहुंच के कारण, यह वयस्क स्टेम कोशिकाओं के निष्कर्षण के लिए एक आशाजनक स्रोत है ।

अलग hDFSCs सभी विशेषताओं13MSCs की परिभाषा के लिए वर्णित दिखाया । वास्तव में, कोशिकाओं प्लास्टिक-अनुयाई थे वर्णित संस्कृति शर्तों के तहत और एक fibroblast की तरह आकृति विज्ञान (चित्रा 1) प्रदर्शित किया । प्रवाह cytometric विश्लेषण से पता चला कि hDFSCs कुछ सतह एंटीजन का एक पैनल व्यक्त किया, जिसमें CD29, CD44, CD73, CD90 और CD105, जबकि CD45 और CD117 अनुपस्थित थे (चित्रा 2) । इसके अलावा, adipogenic, osteogenic और chondrogenic भेदभाव के तहत कोशिकाओं की क्षमता इन विट्रो संस्कृति शर्तों में फैटी एसिड बाध्यकारी प्रोटीन की immunostaining द्वारा पुष्टि की गई 4 (FABP4), osteocalcin और aggrecan (चित्रा 3) ।

वर्णित cationic लिपिड आधारित अभिकर्मक रणनीति एक मीर के साथ hDFSCs के कुशल क्षणिक आनुवंशिक संशोधन सक्षम-24 व्यवहार्य कोशिकाओं के ~ १००% में ले-अभिकर्मक (चित्रा 4B) । इसके अलावा, transfected (चित्रा 4a) और untransfected (आंकड़ा 4c) नमूने कोमल कोशिका प्रसंस्करण की स्थिति साबित मृत कोशिकाओं के तुलनीय मात्रा में दिखाया ।

Figure 1
चित्रा 1: hDFSCs के प्रतिनिधि प्रकाश माइक्रोस्कोप तस्वीर । कक्ष मानक culture शर्तों के अंतर्गत एक fibroblast-समान आकृति विज्ञान दिखाते हैं ।

Figure 2
चित्र 2: प्रतिनिधि प्रवाह cytometric immunophenotyping of hDFSCs. विशिष्ट सेल सतह मार्करों (नीला) के लिए धुंधला होने के बाद कोशिकाओं का प्रवाह cytometric विश्लेषण । इसी isotype नियंत्रण नकारात्मक नियंत्रण (ग्रे) के रूप में इस्तेमाल किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: adipogenic के प्रतिनिधि सत्यापन, osteogenic और chondrogenic hDFSCs की विभेदक क्षमता । विभेद के बाद, adipocytes, osteocytes और chondrocytes की immunostaining द्वारा पहचान की गई (A) फैटी एसिड बाइंडिंग प्रोटीन 4 (FABP4) (हरा), (B) osteocalcin (हरा) और (C) aggrecan (हरा) । नाभिक DAPI (नीला) से सना हुआ था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: अभिकर्मक के विश्लेषण के लिए प्रतिनिधि गेटिंग रणनीति । गेटिंग रणनीति के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (ए) cytotoxicity (नीला: मृत कोशिकाओं) और (ख) Cy3 के ठहराव के लिए इस्तेमाल किया-लेबल मीर के ऊपर ले लो दक्षता (लाल: Cy3+ कोशिकाओं) 24 एच पोस्ट-अभिकर्मक । Untransfected कोशिकाओं (सी,डी) नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया ।

एमएसीएस FcR एंटीबॉडी [µ एल] Isotype नियंत्रण [µ l]
नमूना बफ़र अवरुद्ध CD29 CD44 CD45 CD73 CD90 CD105 CD117 Apc PerCP-cy 5.5 V500 पीई PerCP-cy 5.5 AF488 पे-Cy7
[µ l] रिएजेंट [µ l] Apc PerCP-cy 5.5 V500 पीई PerCP-cy 5.5 AF488 पे-Cy7 IgG1 IgG2b IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1
1 30 10 10
2 ३७.५ 10 २.५
3 ३७.५ 10 २.५
4 30 10 10
5 ३५ 10 5
6 ३५ 10 5
7 ३७.५ 10 २.५
8 30 10 10
9 30 10 10
10 ३७.५ 10 २.५
11 30 10 10
12 ४० 10 10
13 30 10 5
14 ३७.५ 10 २.५

तालिका 1: hDFSCs के immunophenotyping के लिए Pipetting लेआउट ।

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Discussion

वयस्क स्टेम सेल वर्तमान में ध्यान में कई अपक्षयी रोगों के उपचार के लिए कर रहे हैं । विशेष रूप से, अस्थि मज्जा (बी. एम.)-व्युत्पन्न स्टेम सेल, सहित टेम स्टेम सेल (HSCs) और MSCs, गहन नैदानिक जांच४७के तहत कर रहे हैं. हालांकि, बीएम हार्वेस्टिंग एक इनवेसिव दान के स्थल पर दर्द के कारण प्रक्रिया है और प्रतिकूल घटनाओं४८के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । हाल ही में, जन्मोत्तर दंत ऊतक एक उपंयास और स्टेम सेल के लिए आसानी से सुलभ स्रोत के रूप में उभरा है । इन दंत स्टेम कोशिकाओं को सभी एमएससी विशेषताओं को पूरा करने के लिए दिखाया गया था और बीएम के रूप में उच्च प्रसार क्षमता-व्युत्पंन स्टेम सेल४९दिखाया । यहां, हम निष्कर्षण, लक्षण वर्णन और hDFSCs के इंजीनियरिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया ।

वर्णित अलगाव प्रक्रिया मानव प्रभावित ज्ञान दांत के दंत कूप पर विकसित किया गया है, के रूप में इस ऊतक आमतौर पर निकाला जाता है और के रूप में चिकित्सा अपशिष्ट19का निपटारा । फिर भी, दंत लुगदी५०,५१, periodontal बंधन५२, छूटना पर्णपाती दांत५३, और रूट शिखर papilla५४सहित अंय दंत ऊतक, दंत स्टेम की निकासी के लिए उपयोग किया जा सकता है कक्षों.

miRs डालने के द्वारा स्टेम सेल के आनुवंशिक इंजीनियरिंग एक उपंयास के लिए स्टेम कोशिका आधारित चिकित्सा में कुछ कठिनाइयों को दूर करने के लिए, जैसे कि कम स्टेम सेल अस्तित्व४३,५५,५६,५७के रूप में रणनीति है । इस प्रोटोकॉल hDFSCs में सिंथेटिक मीर के कुशल परिचय के लिए महत्वपूर्ण निर्देश प्रस्तुत एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध cationic लिपिड आधारित अभिकर्मक एजेंट का उपयोग कर । चिकित्सीय रिएजेंटों के वितरण के लिए cationic liposomal योगों के आवेदन, जैसे दवाओं और न्यूक्लिक एसिड, कई नैदानिक परीक्षणों में जांच की गई है५८,५९. हालांकि, cationic liposomes संभावित रूप से एक खुराक पर निर्भर तरीके से साइटोटोक्सिक हैं जैसे, कोशिका झिल्ली या जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन की अखंडता को नुकसान५९,६०,६१ . इसलिए, विशेष रूप से ध्यान अभिकर्मक द्वारा प्रेरित कोशिकाओं पर विषाक्त प्रभाव के लिए भुगतान किया जाना चाहिए ।

विशेष रूप से, संकेत अभिकर्मक शर्तों मीर के लिए अनुकूलित किया गया है, दक्षता और cytotoxicity के संबंध में hDFSCs की मध्यस्थता आनुवंशिक संशोधन. फिर भी, अंय अध्ययनों से अलग सेल प्रकार६२,६३ में प्लाज्मिड डीएनए, mRNA और सिरना सहित अतिरिक्त न्यूक्लिक एसिड, के वितरण के लिए इस अभिकर्मक एजेंट के सफल आवेदन का प्रदर्शन किया, ६४ , ६५ , ६६ , ६७ , ६८. इन अध्ययनों के परिणाम से पता चला है कि आदर्श प्रसव की स्थिति काफी अलग है और प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए परिभाषित किया जाना है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को रॉस्टॉक यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर (८८९०१८) और सीलन फाउंडेशन (2016-11) के FORUN प्रोग्राम ने सपोर्ट किया था । इसके अलावा, P.M. और R.D. BMBF (वीआईपी + ००२४०) द्वारा समर्थित हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488 Bio-Rad MCA1557A488 Clone SN6, monoclonal
Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488 Bio-Rad MCA928A488 monoclonal
APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody BD Biosciences 559883 Clone MAR4, monoclonal
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 555751 Clone MOPC-21, monoclonal
PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody BD Biosciences 550257 Clone AD2, monoclonal
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 555749 Clone MOPC-21, monoclonal
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody BD Biosciences 339217 Clone 104D2, monoclonal
PE-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 557872 Clone MOPC-21, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody BD Biosciences 560531 Clone G44-26, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 558304 Clone 27-35, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90 Antibody BD Biosciences 561557 Clone 5E10, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 55095 Clone MOPC-21, monoclonal
V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody BD Biosciences 560777 Clone HI30, monoclonal
V500 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 560787 Clone X40, monoclonal
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec 130-059-901
UltraPure EDTA Thermo Fisher Scientific 15575-020 0.5M, pH 8.0
Steritop Merck Millipore SCGPT05RE 0.22 µm, radio-sterilized, polyethersulfone
BSA Sigma-Aldrich A7906
PFA Merck Millipore 1040051000
Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit R&D Systems SC006
RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution Thermo Fisher Scientific AM9780
Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 Thermo Fisher Scientific AM17120 5 nmol
Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 Thermo Fisher Scientific AM17110 5 nmol
Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11055 polyclonal
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21202 polyclonal
Mounting medium; Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057-20ML histology mounting medium
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope Zeiss
BD FACS LSRII flow cytometer BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2 BD Biosciences
ZEN2011 software Zeiss
Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%) Biochrom L2143 in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+
Amine reactive dye; LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
PBS (1x) Thermo Fisher Scientific 10010023 pH: 7.4; w/o: Ca and Mg
P-S-G (100x) Thermo Fisher Scientific 10378016
Basal medium; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 Thermo Fisher Scientific 11039021
Antibiotic, ZellShield Biochrom W 13-0050
FBS Thermo Fisher Scientific 10500064
Collagenase type I Thermo Fisher Scientific 17100017
Dispase II Thermo Fisher Scientific 17105041
Filter, Sterifix syringe filter 0.2 µm Braun 4099206
50 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62,547,254
15 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62,554,502
Cell culture flask 75 cm2 Sarstedt 833,910,002
Cell culture flask, 25 cm2 Sarstedt 833,911,002
Freezing medium, Biofreeze Biochrom F 2270
Cryotubes Thermo Fisher Scientific 377267 1.8 mL
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154 0.4 %
Counting chamber Paul Marienfeld
Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001% Mibe
NaCl solution Braun 0.9 %
Vicryl satures, Vicryl rapide Ethicon 3 - 0

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आनुवंशिकी अंक १४१ स्टेम सेल दंत कूप स्टेम सेल mesenchymal स्टेम सेल गैर वायरल संशोधन जेनेटिक इंजीनियरिंग क्षणिक अभिकर्मक microRNA
अलगाव, लक्षण वर्णन और मानव दंत कूप स्टेम सेल के MicroRNA आधारित आनुवंशिक संशोधन
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Müller, P., Ekat, K., Brosemann, A., Köntges, A., David, R., Lang, H. Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells. J. Vis. Exp. (141), e58089, doi:10.3791/58089 (2018).

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