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Genetics

分離の特性と人間の歯小嚢細胞のマイクロ Rna を用いた遺伝子組み換え

Published: November 16, 2018 doi: 10.3791/58089
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 3, 1,2, 3
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty at Rostock University, 3Department of Operative Dentistry and Periodontology, Rostock University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

このプロトコルでは、人間の歯小嚢から抽出された歯の幹細胞の一時的な遺伝子工学について説明します。適用の非ウイルス性変更戦略は治療幹細胞製品の改善のための基礎になることがあります。

Abstract

日には、発達段階別にいくつかのタイプの幹細胞は、変性疾患の治療のための焦点。まだ、初期大規模な細胞死と治療効果は低いなどの特定の側面は、広範な臨床翻訳障害。移植前に幹細胞の遺伝子工学は、治療の幹細胞の効果を最適化する有望な方法として浮上しました。しかし、安全で効率的な遺伝子送達システムはまだ欠けています。したがって、適切な手法の開発には、幹細胞ベースの治療の現在の課題を解決するアプローチがあります。

この議定書では、彼らの非ウイルス性遺伝子組み換えだけでなく、抽出と人間の歯小嚢の幹細胞 (hDFSCs) の性質について説明します。産後の歯小嚢は、高拡散潜在性を有する多能性幹細胞を収穫するための有望で、簡単にアクセスできるソースとして発表しました。記載されている分離の手順は、埋伏智歯の歯から hDFSCs を収穫する、シンプルで信頼性の高い方法を示します。またこのプロトコルには、単離細胞の幹細胞の特性を定義するメソッドが装備されています。HDFSCs の遺伝子工学、最適化されたカチオン性脂質ベースのトランスフェクション戦略に細胞毒性を引き起こすことがなく有効にする非常に効率的なマイクロ Rna の導入を示します。マイクロ Rna は、これらの小さな並進レギュレータは運命と安定したゲノム統合の危険なしで茎セルの動作を制御、一時的なセルの操作に適した候補です。したがって、このプロトコルは、その治療の有効性を最適化するために重要となる hDFSCs の工学の安全で効率的な手順を表します。

Introduction

人間の歯小嚢は、発展途上の歯1,2を取り巻く緩やかな ectomesenchymally から派生した結合組織です。破骨細胞形成と骨延長法歯の噴火プロセスの調整するため、その機能の横には、この組織は、特に歯周組織3,4、5の開発のための茎および祖先のセルを隠し持っています。したがって、歯小嚢は成体幹細胞6,7を収穫するための代替ソースとしてと見なされます。

いくつかの研究人間の歯小嚢の幹細胞 (hDFSCs) の骨芽細胞、歯根膜線維芽細胞と酵素8,9,10を含む歯周の系統に分化の実証.さらに、これらの細胞は自己複製能力、プラスチックの付着、特定の表面マーカーの発現を含む間葉系間質細胞 (MSCs) のすべての特性に合わせて示されていた (例えば, CD73, CD90, CD105) 同様、骨、脂肪細胞と軟骨細胞分化ポテンシャル11,12,13。他の研究はまた、hDFSCs2,14,15,16,17,18の神経の微分の潜在性を明らかにしました。

それらの有望なプロパティとの容易なアクセスのために hDFSCs なった最近ティッシュ工学19,20,21に関連します。最初の研究は、骨、歯周組織を再生する DFSCs の可能性に集中しているし、歯の根19,22,23,24,25,26、 27,28,29,30。HDFSCs の神経因性の機能の知識、神経変性疾患の潜在的な治療として応用以来調査31,32,33。HDFSCs に関しての重要性は益々 も、他の組織 (例えば、角膜上皮)34,35の再生。HDFSC の治療の可能性は、傍分泌活動にも直接微分の潜在性にのみ基づいていません。最近では、hDFSCs は、豊富なマトリックスメタロプロテアーゼ (Mmp)、インスリン様成長因子 (IGF)、血管内皮増殖因子 (VEGF)、塩基性繊維芽細胞成長因子 (bFGF) と肝細胞の成長などの生理活性因子を分泌する示されています。因子 (HGF)、血管新生、抗炎症、細胞外マトリックスを改造、修復プロセス36の重要な役割を果たしています。

しかし、幹細胞療法の広範な臨床翻訳はまだ大規模な初期細胞死や低有益な幹細胞効果37,38など、いくつかの課題が損なわれます。遺伝子工学はこれらの課題に対処するための有望な戦略を提供し、したがって、幹細胞38,39,40の治療効果を大きく向上できます。一時的なセルの操作マイクロ Rna (miRs) は、適切な候補者は、これらの小さな並進レギュレータ運命と安定したゲノム統合41,42,のハザードの幹細胞の挙動を制御43. までに、いくつかの有益な miRs は幹細胞の増殖、生存、ホーミング、パラクリン活動としていくつか系統44に分化を促進識別されています。例えば、ミール 133a 改善心機未変更の MSCs45と比較した場合、梗塞ラット心における生存率の増加と生着を示した MSCs を設計されています。同様に、ミール 146a 過剰 MSCs 虚血組織46で治療効率につながった VEGF の多量を分泌することが示されました。

この原稿は、選択的な抽出と hDFSCs の遺伝子工学のための詳しいプロトコルを提示します。このため、人間の歯科小胞の収穫と酵素の消化だけでなく、hDFSCs の後続の分離について述べる。隔離されたセルを特徴付けるために MSC プロパティの検証のための重要な手順は、国際細胞治療13学会のガイドラインに従って含まれています。また、カチオン性脂質ベースのトランスフェクション戦略とトランスフェクション効率性と細胞毒性の評価を適用することによってミール変更 hDFSCs の世代の詳細な説明を提供します。

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Protocol

HDFSCs は、ロストック大学医療センター歯科口腔外科学講座によって提供される抽出の知恵の歯の歯科小胞から分離されています。インフォームド コンセントと書面による承認は、すべての患者から得られました。この研究は、(許可番号 2017年-0158) ロストック大学の倫理委員会で承認されました。

1. hDFSCs の単離

注:親知らずは、細菌汚染を防ぐためには、抽出前にない噴出する必要があります。

  1. 必要な溶液の調製
    1. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の準備/ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン (P S G) ソリューション: 495 mL の PBS の P S G 溶液 5 mL を混ぜて。4 ° C で 50 mL の因数を格納します。
    2. HDFSC 培養液の準備: 445 mL 基本培地の 5 ml の抗菌剤、ウシ胎児血清 (FBS) の 50 mL を混ぜます。4 ° C でのストア
    3. コラゲナーゼ型を準備私貯蔵液 (30 mg/mL): 基礎培地 10 mL では 1% 抗菌剤を添加したコラゲナーゼ型の 300 mg を希釈します。積極的にソリューションをミックスします。0.2 μ m フィルターを使用して、ソリューションをフィルター処理します。コラゲナーゼを 500 μ l 添加のストア因数-20 ° C で保存溶液を型します。
    4. 当期 II 原液 (40 mg/mL) の準備: 1% 抗菌剤を添加した基礎培地 10 mL に Dispase II の 40 mg を希釈します。積極的にソリューションをミックスします。0.2 μ m フィルターを使用して、ソリューションをフィルター処理します。-20 ° C で当期 II 原液を 500 μ l 添加の因数を格納します。
  2. 手術の手順
    1. 十分な量を注入 (最大: 2 mL) 局所麻酔薬の。
    2. 作成し、三つどもえの骨膜を発生させます。舌のフラップを上げる必要はありません。
    3. 骨膜エレベーターのある舌の側面を保護します。
    4. 優しくラウンド ハード金属バリで頬側から遠位骨を加工します。
    5. 骨膜エレベーターと卵胞の組織を緩めます。後部 (第三大臼歯) 鉗子で完全な歯 (生殖) とリュウズを引いて包 (と包) を慎重に取り外します。
    6. 創傷清拭し、NaCl 水溶液中で完全にソケットに水を引きます。
    7. Vicryl の縫合 (材料の表を参照) で、骨膜を置き換えます。
    8. 口腔内から歯卵胞を外し、PBS/P ・ S ・ G 溶液 50 mL の因数にそれらを置きます。
      注:サンプルは、さらに処理まで 4 ° C で保存できます。
  3. 歯卵胞の酵素の消化力
    1. あらかじめ暖かい hDFSC 培と部屋の温度 (RT) PBS/P ・ S ・ G ソリューション。
    2. 私と当期 II 原液コラゲナーゼの種類ごとの 1 つの因数分解しなさい。私は、4 mg/mL 当期 II 500 μ L 各コラゲナーゼのタイプ I および当期 II を 4 mL の基底の中の含まれている 1% 抗菌剤の原液を追加して 3 mg/mL 型コラゲナーゼの消化力ソリューションを準備します。
    3. 滅菌シャーレに抽出された卵胞を配置し、摘出された組織を洗浄する PBS/P ・ S ・ G 溶液 10 mL を追加します。この洗浄工程を 2 回繰り返します。
    4. 約 1 mm × 1 mm PBS/P ・ S ・ G 溶液 10 mL を含むペトリ皿内滅菌メスの部分を抽出した卵胞をミンチします。
    5. 50 mL の円錐形遠心チューブにシャーレからみじん切りにした組織と PBS/P ・ S ・ G ソリューションを転送します。PBS/P ・ S ・ G 溶液 10 mL をシャーレを洗うし、同じチューブにソリューションを転送します。
    6. RT で 353 x gで 10 分間の円錐形遠心管を遠心し、上澄みを廃棄します。
    7. 消化液 5 mL を小球形にされた組織に追加します。ソリューションと組織を優しく混ぜます。揺れのインキュベーターで 2 h の CO2を 37 ° C および 5% の混合物を孵化させなさい。
    8. 遠心分離機は破棄した上清で 10 分の 353 x gの細胞・組織を懸濁液を消化し、再 hDFSC 培養液 6 mL で得られたペレットを中断します。
    9. 25 cm2種細胞懸濁液は、細胞培養用フラスコと 37 ° C、5% CO2と 20% O2セルを孵化させなさい。
      注:組織が完全に消化されていない場合は、細胞培養用フラスコ同様に残りの組織を転送します。
    10. 変更中慎重に 24 h 細胞播種後。その後媒体の confluency まで 3 日を変更します。
      注:HDFSCs 細胞播種後プラスチック付着 24 h をする必要があり、媒体を変更するだけで非付着性のセルおよび血液成分から分離することができます。
  4. セルを収穫
    1. あらかじめ暖かい hDFSC 培、PBS/P ・ S ・ G ソリューションと右にトリプシン/エチレンジアミン edta 溶液
    2. 培養用フラスコから上澄みを廃棄し、PBS/P ・ S ・ G 溶液 5 mL に合流するセルを洗浄します。
    3. 培養用フラスコに/トリプシン EDTA 溶液の 1 mL を追加し、37 ° C で 3 分間インキュベートHDFSC 培養液 3 mL を培養用フラスコに追加することによって消化力プロセスを停止します。
    4. 15 mL コニカル遠心チューブに細胞懸濁液を移すと破棄した上清で 353 x gで 10 分間の懸濁液を遠心分離し、再 hDFSC 培地の適切な量の餌を中断します。
    5. セルをカウント: の細胞懸濁液の 10 μ L を混ぜて軽くトリパン ブルー溶液 10 μ L。カウント室に 10 μ L を適用し、hDFSC 細胞量を計算します。

2. hDFSCs のキャラクタリゼーション

  1. 診療
    1. 細胞のフローサイトメトリーによる解析のための準備
      1. 必要な溶液の調製
        1. PBS/EDTA (2 mM) の準備: 996 mL の PBS の EDTA (0.5 M) の 4 つの mL を混ぜて。
        2. 染色バッファーを準備: PBS/EDTA (2 mM) の 995 mL を混ぜて BSA の 5 g。0.22 μ m のフィルター ユニットを使用して、ソリューションをフィルターし、使用まで 4 ° C で保存します。
        3. パラホルムアルデヒド (PFA) 原液 (4%) を準備: 4 g PFA 100 mL の PBS を希釈し、80 ° C への解決策を熱ソリューションをミックスし、7.3 に pH 値を調整します。因数は、使用までそれぞれ金額 (1.5 mL)、-20 ° C で店で PFA ソリューションを得られます。
          注意: PFA 煙は有毒なので、換気の発煙のフード PFA ソリューションを準備します。
      2. セル (1.4) を収穫後 1.5 mL 遠心チューブに 5 x 10 の4セルの 14 サンプルを転送します。4 ° C で 10 分間 300 x gで懸濁液を遠心分離します。上清を捨てます。
        注:むしろ影付きルームで次の作業を実行します。特に明記しない限り、細胞と氷に試薬を維持します。
      3. 再染色バッファー (4 ° C) の特定の量で細胞を中断し、FcR 試薬 (4 ° C) を表 1に示すようにブロックを追加します。
      4. 表 1に示されるように、それぞれのサンプルの内側に次の抗体を追加: アロフィコシアニン (APC) マウス抗ひと (cd29);APC マウス IgG1 κ アイソタイプ コントロールペリジニン クロロフィル蛋白質 (PerCP)-Cyanine5.5 マウス抗ひと CD44;PerCP Cyanine5.5 マウス IgG2b κ アイソタイプ コントロールV500 マウス抗ヒト CD45;V500 マウス IgG1 κ アイソタイプ コントロールフィコエ リスリン (PE) マウス抗ひと CD73;PE マウス IgG1 κ アイソタイプ コントロールPerCP Cyanine5.5 マウス抗ひと CD90;PerCP Cyanine5.5 マウス IgG1 κ アイソタイプ コントロールマウス抗ひと CD105: Alexa Fluor (AF) 488;マウス IgG1 負の制御: AF488;PE Cyanine7 マウス抗ひと CD117;PE Cyanine7 マウス IgG1、κ アイソタイプ コントロール。抗体は、各サンプルに追加されている後の抗体スピンダウン、軽く混ぜます。4 ° C で 10 分間ソリューションを孵化させなさい
      5. 1 mL の PBS (4 ° C) を追加し、遠心分離機の 4 ° C で 10 分間 300 x g でサンプル上清を捨てます。
      6. 100 μ L の PBS (4 ° C) で細胞を再停止し、PFA (4%) の 33 μ L を追加します。ソリューションをミックスし、フローサイトメトリーによる解析まで 4 ° C の氷の上を格納します。
    2. 細胞のフローサイトメトリーによる測定
      注:むしろ影付きルームで次の作業を実行します。測定まで氷の上の細胞を保ちます。
      1. 表面抗原の発現を検討するには、流れフローサイト メーターによる測定に適したチューブにサンプルを転送します。
      2. 流れの cytometer を使用して少なくとも 2 × 104イベントを測定します。図 2に示すように分析します。
  2. HDFSCs の多能性の微分の潜在性
    1. 市販ヒト間葉系幹細胞機能同定キットを使用して、脂肪細胞、骨、hDFSCs の軟骨分化を確認します。脂肪酸結合タンパク質 4 (FABP4) の汚損のためのロバの反やぎ AF488 二次抗体を適用、アグリカン ロバ抗マウス AF488 二次抗体オステオカルシンの汚損のためだけでなく。核の染色, 4', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) でメディアをマウントを使用します。
      注:ネガティブ コントロールとして検の一次抗体なしサンプルを準備します。
    2. 共焦点レーザー顕微鏡による蛋白質の表現を分析します。顕微鏡設定: 40 x 目的は油浸;(AF488) のための励起レーザー 488 nm、405 nm (DAPI) ため。

3. hDFSCs のトランスフェクション

  1. セル (1.4) を収穫後 24 ウェルの細胞培養プレート トランスフェクション前に 24 h の hDFSCs をシードします。
    注:ウェルあたり約 4 × 10 の4の細胞は、細胞密度を開始します。電池が当日 transfection の ~ 80% の合流点に達する必要があります。
    注: は、フローサイトメトリーによる解析のコントロールとして追加のセルの 1 つのサンプルをシードします。
  2. トランスフェクション錯体の合成
    注:RNases からの汚染を防ぐためには、直接 RNase 除染液を用いたトランスフェクションの複合体の準備する前にワークスペースをクリーンします。RNase フリーの材料とソリューションのみを使用します。
    注:むしろ影付きルームで次の作業を実行します。
    1. ミール ストック溶液 (50 μ M) を調製: 再 Cy3 標識前駆体ミール (5 nmol) 100 μ L ヌクレアーゼ フリー水を中断します。因数は、使用までミールそれぞれ量 (5 μ L) の原液と-20 ° C で暗闇の中でストアを取得しました。
    2. ミール (50 μ M ミール原液の 0.8 μ L) 減らされた血清中の 66.7 μ L での 40 pmol を希釈します。軽く混ぜ
    3. 66.7 μ 減少血清中のカチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬の 0.67 μ L を希釈します。軽く混ぜ、室温 5 分間インキュベート
    4. インキュベーション後、希釈のトランスフェクション試薬を希釈ミールに追加します。軽く混ぜ、室温に 15 分間インキュベート
  3. 細胞培養培地に直接滴下準備トランスフェクション錯体を追加します。24 ウェルの細胞培養プレートを前後に揺動で優しく混ぜます。
  4. 37 ° C、5% CO2、および 20% O2 24 時間で細胞を孵化させなさい。

4. 遺伝子の解析

注:むしろ影付きルームで次の作業を実行します。

  1. 細胞トランスフェクション後採取
    注:同じ 15 mL 円錐形遠心分離機管の 1 つのサンプルのすべての携帯ソリューションを収集します。
    1. トランスフェクション後、24 h は、それぞれ遠心チューブ内のサンプルの上澄みを収集します。
    2. 1 ml の PBS のセルを洗浄、それぞれ遠心管に PBS を転送、500 μ L を追加/トリプシン EDTA (RT) のセルにします。37 ° C で 3 分間ソリューションを孵化させなさい
    3. 培 (RT) の 1 つの mL を追加してセルとそれぞれ遠心管に転送ソリューションに trypsinization を停止します。4 ° C で 10 分間 300 × gで遠心分離細胞
      注:この時間から特に明記しない限りセルと試薬氷の上を維持します。
  2. 細胞のフローサイトメトリーによる解析のための準備
    1. 上清を捨てます。再細胞染色バッファー (4 ° C) と 1.5 mL 遠心チューブに転送細胞液 100 μ L を中断します。
    2. ライブとデッドの細胞を区別するためにアミン反応性染料の 0.5 μ L をサンプルに追加します。優しくソリューションをミックスし、4 ° C で 10 分間インキュベート
    3. 300 x gで 4 ° C で 10 分間遠心し、細胞 1 mL の PBS (4 ° C) を追加します。上清を捨てます。
    4. 100 μ L の PBS (4 ° C) で細胞を再停止し、PFA (4%) の 33 μ L を追加します。ソリューションをミックスし、フローサイトメトリーによる解析まで 4 ° C の氷の上を格納します。
  3. 細胞のフローサイトメトリーによる測定
    注:むしろ影付きルームで次の作業を実行します。測定まで氷の上の細胞を保ちます。
    1. 流れフローサイト メーターによる測定に適したチューブにサンプルを転送します。
    2. 細胞生存率及びフローサイト ミール吸収効率を調べる。少なくとも 2 × 104イベントを測定します。図 4で示すゲートの戦略を使用します。
      注:Cy3 陽性細胞のゲーティングを手配し、トランスフェクションによって細胞死を計算します、融合細胞をネガティブ コントロールとして使用します。

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Representative Results

人間の歯小嚢の組織から hDFSCs を収穫する詳細な分離命令を紹介します。ルーチン手術中に歯小嚢への簡単アクセス、ため成体幹細胞の抽出のための有望なソースです。

孤立した hDFSCs は、MSCs13の定義に記述されているすべての特性を示した。実際には、細胞がプラスチック付着下培養条件を説明し、線維芽細胞のような形状 (図 1) が表示されます。フローサイトメトリーによる解析では、CD45 と CD117 は欠席 (図 2) (cd29)、CD44、CD73、CD90 CD105 を含むある特定の表面抗原のパネルを hDFSCs に表現を明らかにしました。また、脂肪細胞、骨および特定の in vitro における細胞の軟骨分化培養条件 (FABP4) 脂肪酸結合蛋白質 4 の染色、オステオカルシン、アグリカン (図 3) が確認されました。

説明カチオン性脂質ベースのトランスフェクション戦略には、ミール吸収性の生菌 24 h 後トランスフェクション (図 4 b) の ~ 100% の hDFSCs の効率的な一時的な遺伝的変更が有効になります。また、transfected (図 4 a) と融合 (図 4) サンプルは、穏やかな細胞処理条件を証明する死んだ細胞の対等な量を示した。

Figure 1
図 1: 代表的な光 hDFSCs の顕微鏡画像。細胞は標準培養条件下での線維芽細胞様形態を示します。

Figure 2
図 2: hDFSCs の代表的なフロー フローサイトメトリーによる診療します。特定の細胞表面マーカー (青) の染色後の細胞のフローサイトメトリーによる解析。対応するアイソタイプ コントロールは、ネガティブ コントロール (グレー) として使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: 脂肪細胞、骨軟骨分化ポテンシャル hDFSCs の代表的な検証します。分化した脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞は、免疫染色 (A) 脂肪酸結合蛋白質 4 の (FABP4) (緑)、(B) オステオカルシン (緑) (緑) (C) アグリカンによって識別されました。核染色 DAPI で (青)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: 代表的な遺伝子の解析のための戦略をゲートします。(A) 細胞毒性の定量化に使用される戦略をゲートの模式図 (青: 死んだ細胞)、Cy3 標識ミール吸収効率 (B) (赤: Cy3+細胞) 24 h 後トランスフェクション。融合細胞 (C,D) は、コントロールとして使用されました。

MAC FcR 抗体 [μ] アイソタイプ コントロール [μ]
サンプル バッファー ブロック (CD29) CD44 CD45 CD73 CD90 CD105 CD117 APC PerCP Cy5.5 V500 PE PerCP Cy5.5 AF488 PE Cy7
[μ] 試薬 [μ] APC PerCP Cy5.5 V500 PE PerCP Cy5.5 AF488 PE Cy7 IgG1 IgG2b IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1
1 30 10 10
2 37.5 10 2.5
3 37.5 10 2.5
4 30 10 10
5 35 10 5
6 35 10 5
7 37.5 10 2.5
8 30 10 10
9 30 10 10
10 37.5 10 2.5
11 30 10 10
12 40 10 10
13 30 10 5
14 37.5 10 2.5

表 1: ピペッティング hDFSCs の診療のためのレイアウトです。

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Discussion

成体幹細胞は現在いくつかの変性疾患の治療のための焦点に。特に、骨髄 (BM)-由来幹細胞、造血幹細胞 (造血) を含む、MSCs では、集中的な臨床調査47。しかし、BM 収穫寄付のサイトで痛みを引き起こす侵襲で、48有害事象につながる可能性があります。最近、産後の歯科組織は小説および幹細胞に簡単にアクセスできるソースとして浮上しています。これらの歯の幹細胞はすべて MSC 特性に合わせて表示され、骨髄由来幹細胞49として高い増殖能力を示した。ここでは、抽出、評価、hDFSCs エンジニア リングのための詳しいプロトコルを提案します。

説明の隔離プロシージャは埋伏智歯の歯の歯科小胞人間にこの組織がよく抽出、19医療廃棄物として処分しました。それにもかかわらず、歯科パルプ50,51、歯根52、剥離の落葉性歯53, ルート頂乳頭54など他の歯の組織は歯科幹の抽出に活用できます。セルです。

MiRs を挿入することによって幹細胞の遺伝子工学は、低細胞生存43,55,56,57などの幹細胞を用いた治療の困難を克服するために新たな戦略です。このプロトコルは、市販のカチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いた hDFSCs 合成ミールの効率的な導入の重要な手順を発表しました。多数の臨床試験58,59治療試薬、薬や核酸などの配信のためカチオン性リポソーム製剤の応用について調べた。カチオン性リポソームが、用量依存的で潜在的に細胞毒性遺伝子式59,60,61に細胞膜や変更の整合性への例えば,損傷を引き起こすことによって.したがって、特に注意はトランスフェクションによって細胞への毒性を支払われる必要があります。

特に、指定されたトランスフェクション条件は、効率性と細胞毒性に関して hDFSCs のミールを介した遺伝子組み換えの最適化されています。それにもかかわらず、他の研究を示した別のセル型62,63,に追加核酸、プラスミド DNA を含む mRNA や siRNA、配信するためこのトランスフェクション試薬の成功のアプリケーション64,65,66,67,68. これらの研究の結果は、理想的な配信条件が大幅に変化し、セル タイプごとに定義する必要があることを明らかにしました。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この作品は、ロストック大学医療センター (889018) および湿気がある基礎 (2016-11) の FORUN プログラムによって支えられました。さらに、午後、ジャネットボンドブリル BMBF (VIP + 00240) によってサポートされています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488 Bio-Rad MCA1557A488 Clone SN6, monoclonal
Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488 Bio-Rad MCA928A488 monoclonal
APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody BD Biosciences 559883 Clone MAR4, monoclonal
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 555751 Clone MOPC-21, monoclonal
PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody BD Biosciences 550257 Clone AD2, monoclonal
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 555749 Clone MOPC-21, monoclonal
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody BD Biosciences 339217 Clone 104D2, monoclonal
PE-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 557872 Clone MOPC-21, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody BD Biosciences 560531 Clone G44-26, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 558304 Clone 27-35, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90 Antibody BD Biosciences 561557 Clone 5E10, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 55095 Clone MOPC-21, monoclonal
V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody BD Biosciences 560777 Clone HI30, monoclonal
V500 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 560787 Clone X40, monoclonal
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec 130-059-901
UltraPure EDTA Thermo Fisher Scientific 15575-020 0.5M, pH 8.0
Steritop Merck Millipore SCGPT05RE 0.22 µm, radio-sterilized, polyethersulfone
BSA Sigma-Aldrich A7906
PFA Merck Millipore 1040051000
Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit R&D Systems SC006
RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution Thermo Fisher Scientific AM9780
Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 Thermo Fisher Scientific AM17120 5 nmol
Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 Thermo Fisher Scientific AM17110 5 nmol
Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11055 polyclonal
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21202 polyclonal
Mounting medium; Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057-20ML histology mounting medium
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope Zeiss
BD FACS LSRII flow cytometer BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2 BD Biosciences
ZEN2011 software Zeiss
Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%) Biochrom L2143 in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+
Amine reactive dye; LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
PBS (1x) Thermo Fisher Scientific 10010023 pH: 7.4; w/o: Ca and Mg
P-S-G (100x) Thermo Fisher Scientific 10378016
Basal medium; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 Thermo Fisher Scientific 11039021
Antibiotic, ZellShield Biochrom W 13-0050
FBS Thermo Fisher Scientific 10500064
Collagenase type I Thermo Fisher Scientific 17100017
Dispase II Thermo Fisher Scientific 17105041
Filter, Sterifix syringe filter 0.2 µm Braun 4099206
50 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62,547,254
15 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62,554,502
Cell culture flask 75 cm2 Sarstedt 833,910,002
Cell culture flask, 25 cm2 Sarstedt 833,911,002
Freezing medium, Biofreeze Biochrom F 2270
Cryotubes Thermo Fisher Scientific 377267 1.8 mL
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154 0.4 %
Counting chamber Paul Marienfeld
Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001% Mibe
NaCl solution Braun 0.9 %
Vicryl satures, Vicryl rapide Ethicon 3 - 0

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References

  1. Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: Applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839-851 (2015).
  2. Lima, R. L., et al. Human dental follicle cells express embryonic, mesenchymal and neural stem cells markers. Archives of oral biology. 73, 121-128 (2017).
  3. Wise, G. E. Cellular and molecular basis of tooth eruption. Orthodontics & craniofacial research. 12 (2), 67-73 (2009).
  4. Baykul, T., Saglam, A. A., Aydin, U., Başak, K. Incidence of cystic changes in radiographically normal impacted lower third molar follicles. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 99 (5), 542-545 (2005).
  5. Wise, G. E., Frazier-Bowers, S., D'Souza, R. N. Cellular, molecular, and genetic determinants of tooth eruption. Critical reviews in oral biology and medicine : an official publication of the American Association of Oral Biologists. 13 (4), 323-334 (2002).
  6. Ten Cate, A. R. The development of the periodontium: A largely ectomesenchymally derived unit. Periodontology 2000. 13 (1), 9-19 (1997).
  7. Park, B. -W., et al. In vitro and in vivo osteogenesis of human mesenchymal stem cells derived from skin, bone marrow and dental follicle tissues. Differentiation; research in biological diversity. 83 (5), 249-259 (2012).
  8. Sowmya, S., et al. Periodontal Specific Differentiation of Dental Follicle Stem Cells into Osteoblast, Fibroblast, and Cementoblast. Tissue engineering. Part C, Methods. 21 (10), 1044-1058 (2015).
  9. Kémoun, P., et al. Human dental follicle cells acquire cementoblast features under stimulation by BMP-2/-7 and enamel matrix derivatives (EMD) in vitro. Cell and tissue research. 329 (2), 283-294 (2007).
  10. Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
  11. Hieke, C., et al. Human dental stem cells suppress PMN activity after infection with the periodontopathogens Prevotella intermedia and Tannerella forsythia. Scientific reports. 6, 39096 (2016).
  12. Kumar, A., et al. Molecular spectrum of secretome regulates the relative hepatogenic potential of mesenchymal stem cells from bone marrow and dental tissue. Scientific reports. 7 (1), 15015 (2017).
  13. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  14. Ullah, I., et al. In vitro comparative analysis of human dental stem cells from a single donor and its neuronal differentiation potential evaluated by electrophysiology. Life sciences. 154, 39-51 (2016).
  15. Völlner, F., Ernst, W., Driemel, O., Morsczeck, C. A two-step strategy for neuronal differentiation in vitro of human dental follicle cells. Differentiation; research in biological diversity. 77 (5), 433-441 (2009).
  16. Morsczeck, C., et al. Comparison of human dental follicle cells (DFCs) and stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) after neural differentiation in vitro. Clinical oral investigations. 14 (4), 433-440 (2010).
  17. Kadar, K., et al. Differentiation potential of stem cells from human dental origin - promise for tissue engineering. Journal of physiology and pharmacology: An official journal of the Polish Physiological Society. 60, Suppl 7. 167-175 (2009).
  18. Heng, B. C., et al. Decellularized Matrix Derived from Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells Enhances the Neurogenic Potential of Dental Follicle Stem Cells. Journal of endodontics. 43 (3), 409-416 (2017).
  19. Honda, M. J., Imaizumi, M., Tsuchiya, S., Morsczeck, C. Dental follicle stem cells and tissue engineering. Journal of Oral Science. 52 (4), 541-552 (2010).
  20. Liu, J., et al. Concise reviews: Characteristics and potential applications of human dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Stem cells. 33 (3), Dayton, Ohio. 627-638 (2015).
  21. Morsczeck, C., Reichert, T. E. Dental stem cells in tooth regeneration and repair in the future. Expert opinion on biological therapy. 18 (2), 187-196 (2018).
  22. Rezai-Rad, M., et al. Evaluation of bone regeneration potential of dental follicle stem cells for treatment of craniofacial defects. Cytotherapy. 17 (11), 1572-1581 (2015).
  23. Handa, K., et al. Progenitor Cells From Dental Follicle Are Able to Form Cementum Matrix In Vivo. Connective Tissue Research. (2-3), 406-408 (2009).
  24. Tsuchiya, S., Ohshima, S., Yamakoshi, Y., Simmer, J. P., Honda, M. J. Osteogenic Differentiation Capacity of Porcine Dental Follicle Progenitor Cells. Connective Tissue Research. 51 (3), 197-207 (2010).
  25. Honda, M. J., et al. Stem cells isolated from human dental follicles have osteogenic potential. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 111 (6), 700-708 (2011).
  26. Guo, W., et al. Dental follicle cells and treated dentin matrix scaffold for tissue engineering the tooth root. Biomaterials. 33 (5), 1291-1302 (2012).
  27. Yang, B., et al. Tooth root regeneration using dental follicle cell sheets in combination with a dentin matrix - based scaffold. Biomaterials. 33 (8), 2449-2461 (2012).
  28. Bai, Y., et al. Cementum- and periodontal ligament-like tissue formation by dental follicle cell sheets co-cultured with Hertwig's epithelial root sheath cells. Bone. 48 (6), 1417-1426 (2011).
  29. Guo, S., et al. Comparative study of human dental follicle cell sheets and periodontal ligament cell sheets for periodontal tissue regeneration. Cell transplantation. 22 (6), 1061-1073 (2013).
  30. Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC biotechnology. 15, 114 (2015).
  31. Li, X., et al. A therapeutic strategy for spinal cord defect: Human dental follicle cells combined with aligned PCL/PLGA electrospun material. BioMed research international. , 197183 (2015).
  32. Yang, C., Li, X., Sun, L., Guo, W., Tian, W. Potential of human dental stem cells in repairing the complete transection of rat spinal cord. Journal of neural engineering. 14 (2), 26005 (2017).
  33. Kanao, S., et al. Capacity of Human Dental Follicle Cells to Differentiate into Neural Cells In Vitro. Stem Cells International. 2017, 8371326 (2017).
  34. Sung, I. -Y., et al. Cardiomyogenic Differentiation of Human Dental Follicle-derived Stem Cells by Suberoylanilide Hydroxamic Acid and Their In Vivo Homing Property. International journal of medical sciences. 13 (11), 841-852 (2016).
  35. Botelho, J., Cavacas, M. A., Machado, V., Mendes, J. J. Dental stem cells: Recent progresses in tissue engineering and regenerative medicine. Annals of medicine. 49 (8), 644-651 (2017).
  36. Dou, L., et al. Secretome profiles of immortalized dental follicle cells using iTRAQ-based proteomic analysis. Scientific reports. 7 (1), 7300 (2017).
  37. Lee, S., Choi, E., Cha, M. -J., Hwang, K. -C. Cell adhesion and long-term survival of transplanted mesenchymal stem cells: A prerequisite for cell therapy. Oxidative medicine and cellular longevity. 2015, 632902 (2015).
  38. Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Recent Progress in Stem Cell Modification for Cardiac Regeneration. Stem Cells International. 2018 (2), 1-22 (2018).
  39. Nowakowski, A., Walczak, P., Janowski, M., Lukomska, B. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells for Regenerative Medicine. Stem cells and development. 24 (19), 2219-2242 (2015).
  40. Nowakowski, A., Walczak, P., Lukomska, B., Janowski, M. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells to Induce Their Migration and Survival. Stem Cells International. 2016, 4956063 (2016).
  41. Gulluoglu, S., Tuysuz, E. C., Bayrak, O. F. miRNA Regulation in Dental Stem Cells: From Development to Terminal Differentiation. Dental Stem Cells. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. #350;ahin, F., Doğan, A., Demirci, S. , Springer International Publishing. (2016).
  42. Hammond, S. M. An overview of microRNAs. Advanced drug delivery reviews. 87, 3-14 (2015).
  43. Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular research. 93 (4), 614-622 (2012).
  44. Clark, E. A., Kalomoiris, S., Nolta, J. A., Fierro, F. A. Concise Review: MicroRNA Function in Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. Stem cells. 32 (5), 1074-1082 (2014).
  45. Dakhlallah, D., et al. MicroRNA-133a engineered mesenchymal stem cells augment cardiac function and cell survival in the infarct heart. Journal of cardiovascular pharmacology. 65 (3), 241-251 (2015).
  46. Seo, H. -H., et al. Exogenous miRNA-146a Enhances the Therapeutic Efficacy of Human Mesenchymal Stem Cells by Increasing Vascular Endothelial Growth Factor Secretion in the Ischemia/Reperfusion-Injured Heart. Journal of vascular research. 54 (2), 100-108 (2017).
  47. Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell stem cell. 17 (1), 11-22 (2015).
  48. Siddiq, S., et al. Bone marrow harvest versus peripheral stem cell collection for haemopoietic stem cell donation in healthy donors. The Cochrane database of systematic reviews. (1), CD006406 (2009).
  49. Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B. Dental-Related Stem Cells and Their Potential in Regenerative Medicine. Regenerative Medicine and Tissue Engineering. Andrades, J. A. , InTech. (2013).
  50. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  51. Honda, M. J., et al. Side population cells expressing ABCG2 in human adult dental pulp tissue. International endodontic journal. 40 (12), 949-958 (2007).
  52. Seo, B. -M., et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. The Lancet. 364 (9429), 149-155 (2004).
  53. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  54. Sonoyama, W., et al. Characterization of the apical papilla and its residing stem cells from human immature permanent teeth: a pilot study. Journal of endodontics. 34 (2), 166-171 (2008).
  55. Nollet, E., Hoymans, V. Y., van Craenenbroeck, A. H., Vrints, C. J., van Craenenbroeck, E. M. Improving stem cell therapy in cardiovascular diseases: the potential role of microRNA. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 311 (1), H207-H218 (2016).
  56. Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761 (2016).
  57. Schade, A., et al. Magnetic Nanoparticle Based Nonviral MicroRNA Delivery into Freshly Isolated CD105(+) hMSCs. Stem cells international. 2014, 197154 (2014).
  58. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
  59. Xue, H. Y., Liu, S., Wong, H. L. Nanotoxicity: a key obstacle to clinical translation of siRNA-based nanomedicine. Nanomedicine. 9 (2), London, England. 295-312 (2014).
  60. Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological & pharmaceutical bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
  61. Omidi, Y., Barar, J., Akhtar, S. Toxicogenomics of cationic lipid-based vectors for gene therapy: impact of microarray technology. Current drug delivery. 2 (4), 429-441 (2005).
  62. Hausburg, F., et al. Defining optimized properties of modified mRNA to enhance virus- and DNA- independent protein expression in adult stem cells and fibroblasts. Cellular physiology and biochemistry: International journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 35 (4), 1360-1371 (2015).
  63. Cardarelli, F., et al. The intracellular trafficking mechanism of Lipofectamine-based transfection reagents and its implication for gene delivery. Scientific reports. 6, 25879 (2016).
  64. Kirschman, J. L., et al. Characterizing exogenous mRNA delivery, trafficking, cytoplasmic release and RNA-protein correlations at the level of single cells. Nucleic acids research. 45 (12), e113 (2017).
  65. Li, L., Nie, Y., Ye, D., Cai, G. An easy protocol for on-chip transfection of COS-7 cells with a cationic lipid-based reagent. Lab on a chip. 9 (15), 2230-2233 (2009).
  66. Chang, K., Marran, K., Valentine, A., Hannon, G. J. RNAi in cultured mammalian cells using synthetic siRNAs. Cold Spring Harbor protocols. 2012 (9), 957-961 (2012).
  67. Sakurai, K., Chomchan, P., Rossi, J. J. Silencing of gene expression in cultured cells using small interfering RNAs. Current protocols in cell biology. , Chapter 27, Unit 27.1.1-28 (2010).
  68. Hoelters, J., et al. Nonviral genetic modification mediates effective transgene expression and functional RNA interference in human mesenchymal stem cells. The journal of gene medicine. 7 (6), 718-728 (2005).

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分離の特性と人間の歯小嚢細胞のマイクロ Rna を用いた遺伝子組み換え
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Müller, P., Ekat, K., Brosemann, A., Köntges, A., David, R., Lang, H. Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells. J. Vis. Exp. (141), e58089, doi:10.3791/58089 (2018).

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