Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Isolamento, caracterização e baseada em MicroRNA modificação genética de células-tronco humanas folículo Dental

Published: November 16, 2018 doi: 10.3791/58089
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 3, 1,2, 3
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty at Rostock University, 3Department of Operative Dentistry and Periodontology, Rostock University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo descreve a transiente engenharia genética de células-tronco dentárias extraídas do folículo dental humano. A estratégia de modificação não-virais aplicada pode tornar-se uma base para a melhoria dos produtos terapêuticos células-tronco.

Abstract

Até à data, vários tipos de células-tronco em diferentes estádios de desenvolvimento estão no foco para o tratamento de doenças degenerativas. Ainda, certos aspectos, tais como morte celular maciça inicial e baixos efeitos terapêuticos, prejudicada sua ampla tradução clínica. Engenharia genética de células-tronco antes da transplantação surgiu como um método promissor para otimizar os efeitos terapêuticos de células estaminais. No entanto, sistemas de entrega segura e eficiente do gene ainda estão faltando. Portanto, o desenvolvimento de métodos adequados pode fornecer uma abordagem para resolver desafios atuais de terapias baseadas em células-tronco.

O presente protocolo descreve o extração e caracterização de células-tronco humanas folículo dental (hDFSCs) bem como suas modificações genéticas não-virais. O folículo dental pós-natal revelou-se como uma fonte promissora e facilmente acessível para a colheita de células estaminais adultas multipotentes possuindo potencial de alta proliferação. O procedimento de isolamento descrito apresenta um método simples e confiável para colher hDFSCs de dentes do siso. Este protocolo inclui também métodos para definir as características de células-tronco de células isoladas. Para a engenharia genética de hDFSCs, uma estratégia otimizada do transfection baseada em lipídios catiônicos é apresentada permitindo introdução de microRNA altamente eficiente sem causar efeitos citotóxicos. MicroRNAs são candidatos adequados para manipulação de célula transitória, como estes pequenos reguladores translacionais controlam o destino e comportamento de células-tronco sem o perigo de integração estável do genoma. Assim, este protocolo representa um procedimento seguro e eficiente para a engenharia de hDFSCs que pode se tornar importante para otimizar sua eficácia terapêutica.

Introduction

O folículo dental humano é um frouxo ectomesenchymally-derivado do tecido conjuntivo em torno do desenvolvimento dente1,2. Ao lado de sua função de coordenação osteoclastogenesis e osteogênese para o processo de erupção do dente, este tecido abriga células estaminais e progenitoras especialmente para o desenvolvimento do periodonto,4,3,5. Portanto, o folículo dental é considerado como uma fonte alternativa para colher células-tronco adultas humanas6,7.

Vários estudos demonstraram que as células-tronco humanas folículo dental (hDFSCs) são capazes de diferenciar em linhagem periodontal, incluindo osteoblastos, fibroblastos do ligamento e cementoblastos8,9,10 . Além disso, essas células foram mostradas para coincidir com todas as características de células estromais mesenquimais (MSCs) incluindo a capacidade de auto renovadora, aderência plástica, expressão de marcadores de superfície específicas (por exemplo,, CD73, CD90, CD105), bem como osteogênico, adipogenic e chondrogenic diferenciação potencial11,12,13. Outros estudos também revelaram um potencial de diferenciação neural de hDFSCs2,14,15,16,17,18.

Devido a suas propriedades promissoras e fácil acesso, o hDFSCs tornou-se recentemente relevante para a engenharia de tecido19,20,21. Os primeiros estudos concentraram-se sobre o potencial de DFSCs de regeneração óssea, periodontal e raízes de dente19,22,23,24,25,26, 27,28,29,30. Desde o conhecimento da funcionalidade de neurogênica de hDFSCs, sua aplicação como potencial tratamento para doenças neurodegenerativas tem sido investigados31,32,33. HDFSCs também ganharam importância com respeito à regeneração de outros tecidos (por exemplo, o epitélio corneano)34,35. O potencial terapêutico de hDFSC não se baseia apenas em seu potencial de diferenciação directa, mas também na sua atividade parácrina. Recentemente, hDFSCs têm sido mostrados para secretar uma variedade de fatores bioativos, tais como metaloproteinases de matriz (MMPs), fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento fibroblástico básico (bFGF) e crescimento hepatócito fator (HGF), que desempenham um papel crucial para a angiogênese, imunomodulação, remodelação da matriz extracelular e processos reparativa36.

No entanto, ampla tradução clínica da terapia de células-tronco ainda é prejudicada por vários desafios, como a morte maciça inicial celular e células-tronco baixo benéfico efeitos37,38. Engenharia genética fornece uma estratégia promissora para enfrentar esses desafios e, portanto, pode aumentar consideravelmente a eficácia terapêutica de células-tronco38,39,40. Para manipulação de célula transitória, microRNAs (miRs) são candidatos adequados, como estes pequenos reguladores translacionais controlam o destino e comportamento de células-tronco sem o perigo de genoma estável integração41,42, 43. até à data, vários miRs benéficos foram identificados promovendo a proliferação de células-tronco, sobrevivência, orientação, atividade parácrina bem como a sua diferenciação em várias linhagens44. Por exemplo, miR-133a engenharia MSCs mostrou uma maior sobrevivência e enxertia em corações de rato enfartado, resultando em uma melhor função cardíaca quando comparado a não modificado MSCs45. Da mesma forma, miR-146 superexpressão MSCs foram mostrados a secretar quantidades mais elevadas de VEGF, que por sua vez, levou a uma maior eficiência terapêutica no tecido isquêmico46.

Este manuscrito apresenta um protocolo detalhado para a extração seletiva e engenharia genética de hDFSCs. Para este fim, descrevemos a digestão enzimática e colheita dos folículos dentários humanas, bem como o posterior isolamento do hDFSCs. Para caracterizar células isoladas, instruções importantes para a verificação das propriedades MSC foram incluídas em conformidade com as diretrizes da sociedade internacional para terapia celular13. Além disso, nós fornecemos uma descrição detalhada para a geração de hDFSCs miR-modificado pela aplicação de uma estratégia de transfeccao baseada em lipídios catiônicos e a avaliação da eficiência do transfection e citotoxicidade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

HDFSCs são isolados os folículos dentários dos dentes do siso extraídos fornecidos pelo departamento de Cirurgia Buco Maxilo facial plástica do centro médico da Universidade de Rostock. Obteve-se consentimento informado e autorização por escrito de todos os pacientes. Este estudo foi autorizado pelo Comitê de ética local da Universidade de Rostock (permissão No. A 2017-0158).

1. isolamento de hDFSCs

Nota: Para evitar a contaminação bacteriana, o dente do siso não deve ser eclodiu antes de extração

  1. Preparação das soluções necessárias
    1. Preparar o tampão fosfato salino (PBS) / solução de penicilina-estreptomicina-glutamina (P-S-G): misturar 495 mL de PBS com 5 mL de solução de P-S-G. Loja alíquotas de 50 mL a 4 ° C.
    2. Preparar o meio de cultura de hDFSC: misturar 445 mL de meio basal com 5 mL de agente antibiótico e 50 mL de soro fetal bovino (FBS). Loja a 4 ° C.
    3. Preparar o tipo de colagenase armazeno solução (30 mg/mL): diluir 300 mg de tipo de colagenase em 10 mL de meio basal suplementado com 1% de agente antibiótico. Misture vigorosamente a solução. Filtre a solução através de um filtro de 0,2 µm. Loja alíquotas de 500 µ l de colagenase tipo I solução estoque a-20 ° C.
    4. Preparar a solução Dispase II (40mg/mL): diluir 40 mg de Dispase II em 10 mL de meio basal suplementado com 1% de agente antibiótico. Misture vigorosamente a solução. Filtre a solução através de um filtro de 0,2 µm. Loja alíquotas de 500 µ l de solução-mãe Dispase II a-20 ° C.
  2. Procedimento cirúrgico
    1. Injetar uma quantidade suficiente (máximo: 2 mL) de solução de anestésico local.
    2. Criar e aumentar um retalho mucoperiosteal três lados. Não é necessário criar um retalho lingual.
    3. Protege o aspecto lingual com um elevador periosteal.
    4. Delicadamente moinho bucal e distal osso com uma rebarba redonda de metal duro.
    5. Solte o tecido do folículo com um elevador periosteal. Remova cuidadosamente o dente completo (germe) e folículo puxando a coroa (e folículo) com posterior fórceps (terceiro-molar).
    6. Debride e irrigar o soquete abundantemente com solução de NaCl.
    7. Substitua o retalho mucoperiosteal com suturas de vicryl (ver Tabela de materiais).
    8. Remover o folículo do dente da cavidade oral e colocá-los em uma alíquota de 50 mL de solução de PBS/P-S-G.
      Nota: A amostra pode ser armazenada a 4 ° C até o processamento adicional.
  3. Digestão enzimática do folículo dente
    1. Pré-aquecer o meio de cultura de hDFSC e solução de PBS/P-S-G, à temperatura ambiente (RT).
    2. Descongele uma alíquota de cada tipo de colagenase eu e soluções estoque de Dispase II. Prepare uma solução de digestão de 3 mg/mL tipo colagenase eu e 4 mg/mL Dispase II adicionando 500 µ l de cada colagenase tipo I e a solução de 4 mL de basal médio contendo 1% antibiótico agente Dispase II.
    3. Coloque o folículo extraído em uma placa de Petri estéril e adicionar 10 mL de solução de PBS/P-S-G para lavar o tecido extraído. Repita este passo de lavar duas vezes.
    4. Picar o folículo extraído em pedaços de cerca de 1 x 1 mm com um bisturi estéril dentro da placa de Petri contendo 10 mL de solução de PBS/P-S-G.
    5. Tecido de transferência picada e solução de PBS/P-S-G a partir de Petri em um tubo de centrifuga conico de 50 mL. Lave a placa de Petri com 10 mL de solução de PBS/P-S-G e transferir a solução para o mesmo tubo.
    6. Centrifugar o tubo de centrifuga conico por 10 min a 353 x g em RT e descartar o sobrenadante.
    7. Adicione 5 mL de solução de digestão no tecido granulado. Misture suavemente a solução e o tecido. Incube a mistura a 37 ° C e 5% CO2 por 2 h em uma incubadora de agitação.
    8. Centrífuga digerido suspensão de célula/tecido 353 x g durante 10 minutos no RT. descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento Obtido em 6 mL de meio de cultura de hDFSC.
    9. Suspensão de células de sementes em um 25 cm2 frasco de cultura de células e incubar as células em 37 ° C, 5% de CO2 e de 20% O2.
      Nota: Se o tecido não é completamente digerido, transferi o tecido restante para o frasco de cultura celular também.
    10. Mude meio cuidadosamente 24 h após a semeadura da célula. Depois mude o médio a cada três dias até a confluência.
      Nota: HDFSCs devem ser plástico aderente 24 h após a semeadura da célula e podem ser separadas de células não-aderentes e os componentes sanguíneos, simplesmente alterando o meio.
  4. Colheita de células
    1. Pre-aquecer o meio de cultura de hDFSC, a solução de PBS/P-S-G e a solução de ácido (EDTA) tripsina/ácido etilenodiaminotetracético para RT
    2. Descartar o sobrenadante do frasco de cultura e lavar confluentes com 5 mL de solução de PBS/P-S-G.
    3. Adicionar 1 mL de solução de tripsina/EDTA para o frasco de cultura e incubar durante 3 min a 37 ° C. Interrompa o processo de digestão, adicionar 3 mL de meio de cultura de hDFSC para o frasco de cultura.
    4. Suspensão de células de transferência em um tubo de centrifuga conico de 15 mL e centrifugar a suspensão por 10 min a 353 x g em RT. descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em uma quantidade apropriada de meio de cultura de hDFSC.
    5. Contar as células: misture suavemente 10 µ l de suspensão de células com 10 µ l de solução de azul de Tripan. Aplicar 10 µ l em uma câmara de contagem e calcular a quantidade de células hDFSC.

2. caracterização do hDFSCs

  1. Immunophenotyping
    1. Preparação de células para análise de fluxo cytometric
      1. Preparação das soluções necessárias
        1. PBS/EDTA (2 mM) de preparar: misturar 996 mL de PBS com 4 mL de EDTA (0,5 M).
        2. Preparar o buffer de coloração: misture 995 mL de PBS/EDTA (2 mM) com 5 g de BSA. Filtrar a solução usando uma unidade de filtro de 0,22 µm e armazenar a 4 ° C até o uso.
        3. Preparar a solução de paraformaldeído (PFA) (4%): diluir PFA 4G em 100 mL de PBS e aquecer a solução a 80 ° C. Misturar a solução e ajustar o valor de pH de 7,3. Alíquota obtido solução PFA em montantes respectivos (1,5 mL) e loja a-20 ° C até o uso.
          Cuidado: Porque PFA fumos são tóxicos, prepare a solução PFA em uma coifa ventilada.
      2. Após a célula da colheita (1.4), transferi 14 amostras de 5 x 104 células para tubos de microcentrifuga de 1,5 mL. Centrifugar as suspensões a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
        Nota: Execute o seguinte trabalho em uma sala bastante sombreada. Manter as células e os reagentes no gelo, salvo indicação em contrário.
      3. Ressuspender as células em determinadas quantidades de buffer de coloração (4 ° C) e adicionar FcR bloqueando o reagente (4 ° C), conforme indicado na tabela 1.
      4. Adicionar os seguintes anticorpos para o lado interno da respectiva amostra, conforme indicado na tabela 1: Allophycocyanin (APC) do mouse anti-humano CD29; Rato APC controle de isotipo IgG1 κ; Proteína peridinin-clorofila (PerCP)-Cyanine5.5 do mouse anti-humano CD44; PerCP-Cyanine5.5 rato controle de isotipo IgG2b κ; V500 rato anti-humano CD45; V500 rato controle de isotipo IgG1 κ; Ficoeritrina (PE) do mouse anti-humano CD73; Rato de PE controle de isotipo IgG1 κ; PerCP-Cyanine5.5 do mouse anti-humano CD90; PerCP-Cyanine5.5 rato controle de isotipo IgG1 κ; mouse anti-humano CD105: Alexa Fluor (AF) 488; controle negativo de IgG1 de mouse: AF488; PE-Cyanine7 do mouse anti-humano CD117; PE-Cyanine7 rato IgG1, controle do isotipo κ. Depois de anticorpos foram adicionados para cada amostra, spin para baixo de anticorpos e misture delicadamente. Incubar as soluções durante 10 minutos a 4 ° C.
      5. Adicionar 1 mL de PBS (4 ° C) e centrifugar as amostras a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
      6. Ressuspender as células em 100 µ l de PBS (4 ° C) e adicione µ l 33 de PFA (4%). Misturar as soluções e armazenar no gelo ou a 4 ° C até análise de fluxo cytometric.
    2. Medição de fluxo cytometric de células
      Nota: Execute o seguinte trabalho em uma sala bastante sombreada. Manter as células no gelo até a medição.
      1. Para examinar a expressão de antígenos de superfície, transferir as amostras para tubos adequados para medições de fluxo cytometric.
      2. Medir pelo menos 2 x 104 eventos usando um citômetro de fluxo. Analise como está representada na Figura 2.
  2. Potencial de diferenciação multipotentes de hDFSCs
    1. Use um comercialmente disponível humana Mesenchymal Stem Cell funcional identificação Kit para confirmar adipogenic, osteogênico e potencial de diferenciação chondrogenic de hDFSCs. Aplicar o anticorpo secundário de burro de anti-cabra AF488 para coloração de ácido graxo proteína 4 (FABP4) e aggrecan bem como anticorpo secundário de burro anti-rato AF488 para coloração de osteocalcina. Para a coloração de núcleos, use o meio de montagem com 4' 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI).
      Nota: Prepare amostras sem anticorpo primário como controles negativos para análises microscópicas.
    2. Analise a expressão de proteínas por laser, microscopia confocal. Configurações de microscopia: 40 x objetivo com a imersão de óleo; excitação do laser 488 nm (para AF488) e 405 nm (DAPI).

3. a transfeccao de hDFSCs

  1. Após a célula da colheita (1.4), as sementes hDFSCs sobre uma placa de cultura de células 24-poço 24 h antes do transfection.
    Nota: Começando a densidade celular é de aproximadamente 4 x 104 células por poço. Células devem alcançar confluência de ~ 80% no dia do transfection.
    Nota: As sementes uma amostra de células adicionais como controle para análise de fluxo cytometric.
  2. Preparação de complexos de transfeccao
    Nota: Para evitar a contaminação de RNases, limpe o espaço de trabalho diretamente antes de preparação dos complexos de transfeccao usando solução de descontaminação de RNase. Use somente material livre de RNase e soluções.
    Nota: Execute o seguinte trabalho em uma sala bastante sombreada.
    1. Preparar a solução-mãe de miR (50 µM): re-suspender miR com rótulo Cy3 precursor (5 nmol) na água de nuclease livre 100 µ l. Solução-mãe de alíquota miR obtidos em loja no escuro a-20 º C até o uso e respectivos montantes (5 µ l).
    2. Dilua a 40 pmol de miR (0,8 µ l de solução-mãe miR 50 µM) em 66,7 µ l de meio de soro reduzida. Misture a solução suavemente
    3. Dilua 0.67 µ l de reagente de Transfeccao de baseada em lipídios catiônicos em 66,7 µ l de meio de soro reduzida. Misture a solução suavemente e incubar durante 5 min à RT
    4. Após a incubação, adicione o reagente de transfeccao pré-diluído para a miR pre-diluída. Misture a solução suavemente e incube por 15 min no RT
  3. Adicione gota a gota os complexos de transfeccao preparado diretamente para o meio de cultura de células. Misture delicadamente agite-a placa de cultura de células de 24-bem e para trás.
  4. Incube as celulas em 37 ° C, 5% de CO2e 20% O2 por 24 h.

4. análise do Transfection

Nota: Execute o seguinte trabalho em uma sala bastante sombreada.

  1. Célula da colheita depois de transfeccao
    Nota: Recolha todas as soluções de célula de uma amostra no tubo de centrifuga conico de 15 mL mesmo.
    1. 24 h após a transfeccao, recolher o sobrenadante de amostras em tubos de centrífuga respectivos.
    2. Lavar as células com 1 mL de PBS, PBS de transferência para o tubo de centrifugação respectivos e adicione 500 µ l tripsina/EDTA (RT) para as células. Incubar as soluções para 3 min a 37 ° C.
    3. Pare tripsinização, adicionando 1 mL de meio de cultura (RT) para as células e a transferência da solução no tubo de centrífuga respectivos. Células de centrifugação a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
      Nota: A partir deste momento, manter células e reagentes no gelo, salvo indicação em contrário.
  2. Preparação de células para análise de fluxo cytometric
    1. Desprezar o sobrenadante. Ressuspender as células em 100 µ l de tampão de coloração (4 ° C) e transferência celular solução para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
    2. Adicione 0,5 µ l de corante reativo de amina para as amostras a fim de distinguir entre células vivas e mortas. Delicadamente, misturar a solução e incubar durante 10 minutos a 4 ° C.
    3. Adicionar 1 mL de PBS (4 ° C) para as células e centrifugar x g por 10 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
    4. Ressuspender as células em 100 µ l de PBS (4 ° C) e adicione µ l 33 de PFA (4%). Misturar as soluções e armazenar no gelo ou a 4 ° C até análise de fluxo cytometric.
  3. Medição de fluxo cytometric de células
    Nota: Execute o seguinte trabalho em uma sala bastante sombreada. Manter as células no gelo até a medição.
    1. Transferi as amostras para tubos adequados para medições de fluxo cytometric.
    2. Examine a viabilidade celular e eficiência de absorção de miR usando um citômetro de fluxo. Medir pelo menos 2 x 104 eventos. Use a estratégia associada representada na Figura 4.
      Nota: Use células untransfected como controlo negativo para organizar o gating para células positivas Cy3 e calcular a morte celular causada por transfecção.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Aqui, apresentamos uma instrução detalhada de isolamento para colher hDFSCs do tecido do folículo dental humana. Devido ao fácil acesso do folículo dental durante cirurgia de rotina, é uma fonte promissora para a extração de células-tronco adultas.

O hDFSCs isoladas mostrou todas as características descritas para a definição do MSCs13. Na verdade, as células foram plástico aderente sob descreveu as condições de cultura e exibido uma fibroblasto como morfologia (Figura 1). Análises de fluxo cytometric revelaram que hDFSCs expressa um painel de determinados antígenos de superfície, incluindo CD29, CD44, CD73, CD90 e CD105, enquanto CD45 e CD117 estavam ausentes (Figura 2). Além disso, o adipogenic, osteogênico e chondrogenic potencial de diferenciação das células sob específicos in vitro cultura condições foi confirmada por imunocoloração de ácido graxo proteína 4 (FABP4), osteocalcina e aggrecan (Figura 3).

A estratégia descrita do transfection baseada em lipídios catiônicos habilitado eficiente modificação genética transiente de hDFSCs com um miR-captação em ~ 100% de células viáveis 24h pós do transfection (Figura 4B). Além disso, transfectadas (Figura 4A) e untransfected (Figura 4) amostras mostraram quantidades comparáveis de células mortas provando condições de processamento de célula suave.

Figure 1
Figura 1: luz representante imagens de microscópio de hDFSCs. As células apresentam uma morfologia de fibroblasto, como em condições de cultura padrão.

Figure 2
Figura 2: representante fluxo cytometric immunophenotyping de hDFSCs. Análise de fluxo cytometric das células após coloração por marcadores de superfície celular específicos (azul). Controles de isotipo correspondentes foram usados como controles negativos (cinza). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: verificação de representante da adipogenic, osteogênico e potencial de diferenciação chondrogenic de hDFSCs. Após a diferenciação, adipócitos, osteócitos e condrócitos foram identificados por imunocoloração de (A) ácido graxo proteína 4 (FABP4) (verde), (B) osteocalcina (verde) e (C) aggrecan (verde). Núcleos estavam manchados com DAPI (azuis). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: representante gating estratégia para análise do transfection. Representação esquemática da estratégia utilizada para a quantificação de citotoxicidade (A) de retenção (azul: células mortas) e (B) eficiência de absorção de miR Cy3-rotulado (vermelho: Cy3+ células) pós-transfeccao 24 h. Células untransfected (C,D) foram utilizadas como controle.

MACS FcR Anticorpos µ [l] ISOTYPE controles µ [l]
Amostra buffer de bloqueio CD29 CD44 CD45 CD73 CD90 CD105 CD117 APC PerCP-Cy5.5 V500 PE PerCP-Cy5.5 AF488 PE-Cy7
µ [l] reagente µ [l] APC PerCP-Cy5.5 V500 PE PerCP-Cy5.5 AF488 PE-Cy7 IgG1 IgG2b IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1
1 30 10 10
2 37.5 10 2.5
3 37.5 10 2.5
4 30 10 10
5 35 10 5
6 35 10 5
7 37.5 10 2.5
8 30 10 10
9 30 10 10
10 37.5 10 2.5
11 30 10 10
12 40 10 10
13 30 10 5
14 37.5 10 2.5

Tabela 1: Pipetagem layout para immunophenotyping de hDFSCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Células-tronco adultas estão atualmente em foco para o tratamento de diversas doenças degenerativas. Em particular, a medula (BM) óssea-derivadas de células-tronco, incluindo as células-tronco hematopoiéticas (linfócitos) e MSCs, estão sob investigação clínica intensiva47. No entanto, BM colheita é um procedimento invasivo, causando dor no local da doação e pode levar a efeitos adversos48. Recentemente, o tecido dental pós-Natal tem emergido como um romance e facilmente acessível fonte de células-tronco. Essas células-tronco dentais foram mostradas para conhecer todas as características do MSC e mostrou maior capacidade de proliferação como células-tronco derivadas de BM49. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a extração, caracterização e engenharia de hDFSCs.

O procedimento de isolamento descrito foi desenvolvido na humanos folículos dentários dos dentes do siso, como este tecido é comumente extraído e eliminado como resíduos médicos19. No entanto, outros tecidos dentários, incluindo a polpa dental50,51, ligamento periodontal52, dentes decíduos esfoliada53e papila apical de raiz54, podem ser utilizados para a extração do tronco dental células.

Engenharia genética de células-tronco, inserindo miRs é uma estratégia nova para superar certas dificuldades em terapias baseadas em células-tronco, tais como células-tronco baixa sobrevivência43,55,56,57. Este protocolo apresentou instruções cruciais para a introdução eficiente de miR sintético no hDFSCs usando um reagente de Transfeccao de baseada em lipídios catiônicos comercialmente disponível. A aplicação de formulações lipossomas catiônicas para a entrega dos reagentes terapêuticas, tais como drogas e ácidos nucleicos, foi investigada em numerosos estudos clínicos58,59. No entanto, os lipossomas catiônicos são potencialmente citotóxicos de forma dose-dependente, causando danos, por exemplo,, a integridade da membrana celular ou alterações no gene expressão59,60,61 . Portanto, deve ser dada especial atenção a efeitos tóxicos sobre as células induzidas por transfecção.

Nomeadamente, condições de transfeccao indicado foram otimizadas para modificação genética mediada por miR de hDFSCs em matéria de eficiência e citotoxicidade. No entanto, outros estudos demonstraram a aplicação bem sucedida deste reagente de Transfeccao para a entrega de adicionais ácidos nucleicos, incluindo o Plasmídeo, mRNA e siRNA, em células de diferentes tipos de62,63, 64 , 65 , 66 , 67 , 68. os resultados destes estudos revelaram que as condições de entrega ideal variaram significativamente e devem ser definidos para cada tipo de célula.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo programa Forum de Rostock University Medical Centre (889018) e a Fundação úmida (2016-11). Além disso, P.M. e R.D. são suportados pelo BMBF (VIP + 00240).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488 Bio-Rad MCA1557A488 Clone SN6, monoclonal
Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488 Bio-Rad MCA928A488 monoclonal
APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody BD Biosciences 559883 Clone MAR4, monoclonal
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 555751 Clone MOPC-21, monoclonal
PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody BD Biosciences 550257 Clone AD2, monoclonal
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 555749 Clone MOPC-21, monoclonal
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody BD Biosciences 339217 Clone 104D2, monoclonal
PE-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 557872 Clone MOPC-21, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody BD Biosciences 560531 Clone G44-26, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 558304 Clone 27-35, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90 Antibody BD Biosciences 561557 Clone 5E10, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 55095 Clone MOPC-21, monoclonal
V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody BD Biosciences 560777 Clone HI30, monoclonal
V500 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 560787 Clone X40, monoclonal
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec 130-059-901
UltraPure EDTA Thermo Fisher Scientific 15575-020 0.5M, pH 8.0
Steritop Merck Millipore SCGPT05RE 0.22 µm, radio-sterilized, polyethersulfone
BSA Sigma-Aldrich A7906
PFA Merck Millipore 1040051000
Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit R&D Systems SC006
RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution Thermo Fisher Scientific AM9780
Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 Thermo Fisher Scientific AM17120 5 nmol
Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 Thermo Fisher Scientific AM17110 5 nmol
Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11055 polyclonal
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21202 polyclonal
Mounting medium; Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057-20ML histology mounting medium
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope Zeiss
BD FACS LSRII flow cytometer BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2 BD Biosciences
ZEN2011 software Zeiss
Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%) Biochrom L2143 in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+
Amine reactive dye; LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
PBS (1x) Thermo Fisher Scientific 10010023 pH: 7.4; w/o: Ca and Mg
P-S-G (100x) Thermo Fisher Scientific 10378016
Basal medium; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 Thermo Fisher Scientific 11039021
Antibiotic, ZellShield Biochrom W 13-0050
FBS Thermo Fisher Scientific 10500064
Collagenase type I Thermo Fisher Scientific 17100017
Dispase II Thermo Fisher Scientific 17105041
Filter, Sterifix syringe filter 0.2 µm Braun 4099206
50 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62,547,254
15 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62,554,502
Cell culture flask 75 cm2 Sarstedt 833,910,002
Cell culture flask, 25 cm2 Sarstedt 833,911,002
Freezing medium, Biofreeze Biochrom F 2270
Cryotubes Thermo Fisher Scientific 377267 1.8 mL
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154 0.4 %
Counting chamber Paul Marienfeld
Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001% Mibe
NaCl solution Braun 0.9 %
Vicryl satures, Vicryl rapide Ethicon 3 - 0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: Applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839-851 (2015).
  2. Lima, R. L., et al. Human dental follicle cells express embryonic, mesenchymal and neural stem cells markers. Archives of oral biology. 73, 121-128 (2017).
  3. Wise, G. E. Cellular and molecular basis of tooth eruption. Orthodontics & craniofacial research. 12 (2), 67-73 (2009).
  4. Baykul, T., Saglam, A. A., Aydin, U., Başak, K. Incidence of cystic changes in radiographically normal impacted lower third molar follicles. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 99 (5), 542-545 (2005).
  5. Wise, G. E., Frazier-Bowers, S., D'Souza, R. N. Cellular, molecular, and genetic determinants of tooth eruption. Critical reviews in oral biology and medicine : an official publication of the American Association of Oral Biologists. 13 (4), 323-334 (2002).
  6. Ten Cate, A. R. The development of the periodontium: A largely ectomesenchymally derived unit. Periodontology 2000. 13 (1), 9-19 (1997).
  7. Park, B. -W., et al. In vitro and in vivo osteogenesis of human mesenchymal stem cells derived from skin, bone marrow and dental follicle tissues. Differentiation; research in biological diversity. 83 (5), 249-259 (2012).
  8. Sowmya, S., et al. Periodontal Specific Differentiation of Dental Follicle Stem Cells into Osteoblast, Fibroblast, and Cementoblast. Tissue engineering. Part C, Methods. 21 (10), 1044-1058 (2015).
  9. Kémoun, P., et al. Human dental follicle cells acquire cementoblast features under stimulation by BMP-2/-7 and enamel matrix derivatives (EMD) in vitro. Cell and tissue research. 329 (2), 283-294 (2007).
  10. Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
  11. Hieke, C., et al. Human dental stem cells suppress PMN activity after infection with the periodontopathogens Prevotella intermedia and Tannerella forsythia. Scientific reports. 6, 39096 (2016).
  12. Kumar, A., et al. Molecular spectrum of secretome regulates the relative hepatogenic potential of mesenchymal stem cells from bone marrow and dental tissue. Scientific reports. 7 (1), 15015 (2017).
  13. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  14. Ullah, I., et al. In vitro comparative analysis of human dental stem cells from a single donor and its neuronal differentiation potential evaluated by electrophysiology. Life sciences. 154, 39-51 (2016).
  15. Völlner, F., Ernst, W., Driemel, O., Morsczeck, C. A two-step strategy for neuronal differentiation in vitro of human dental follicle cells. Differentiation; research in biological diversity. 77 (5), 433-441 (2009).
  16. Morsczeck, C., et al. Comparison of human dental follicle cells (DFCs) and stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) after neural differentiation in vitro. Clinical oral investigations. 14 (4), 433-440 (2010).
  17. Kadar, K., et al. Differentiation potential of stem cells from human dental origin - promise for tissue engineering. Journal of physiology and pharmacology: An official journal of the Polish Physiological Society. 60, Suppl 7. 167-175 (2009).
  18. Heng, B. C., et al. Decellularized Matrix Derived from Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells Enhances the Neurogenic Potential of Dental Follicle Stem Cells. Journal of endodontics. 43 (3), 409-416 (2017).
  19. Honda, M. J., Imaizumi, M., Tsuchiya, S., Morsczeck, C. Dental follicle stem cells and tissue engineering. Journal of Oral Science. 52 (4), 541-552 (2010).
  20. Liu, J., et al. Concise reviews: Characteristics and potential applications of human dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Stem cells. 33 (3), Dayton, Ohio. 627-638 (2015).
  21. Morsczeck, C., Reichert, T. E. Dental stem cells in tooth regeneration and repair in the future. Expert opinion on biological therapy. 18 (2), 187-196 (2018).
  22. Rezai-Rad, M., et al. Evaluation of bone regeneration potential of dental follicle stem cells for treatment of craniofacial defects. Cytotherapy. 17 (11), 1572-1581 (2015).
  23. Handa, K., et al. Progenitor Cells From Dental Follicle Are Able to Form Cementum Matrix In Vivo. Connective Tissue Research. (2-3), 406-408 (2009).
  24. Tsuchiya, S., Ohshima, S., Yamakoshi, Y., Simmer, J. P., Honda, M. J. Osteogenic Differentiation Capacity of Porcine Dental Follicle Progenitor Cells. Connective Tissue Research. 51 (3), 197-207 (2010).
  25. Honda, M. J., et al. Stem cells isolated from human dental follicles have osteogenic potential. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 111 (6), 700-708 (2011).
  26. Guo, W., et al. Dental follicle cells and treated dentin matrix scaffold for tissue engineering the tooth root. Biomaterials. 33 (5), 1291-1302 (2012).
  27. Yang, B., et al. Tooth root regeneration using dental follicle cell sheets in combination with a dentin matrix - based scaffold. Biomaterials. 33 (8), 2449-2461 (2012).
  28. Bai, Y., et al. Cementum- and periodontal ligament-like tissue formation by dental follicle cell sheets co-cultured with Hertwig's epithelial root sheath cells. Bone. 48 (6), 1417-1426 (2011).
  29. Guo, S., et al. Comparative study of human dental follicle cell sheets and periodontal ligament cell sheets for periodontal tissue regeneration. Cell transplantation. 22 (6), 1061-1073 (2013).
  30. Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC biotechnology. 15, 114 (2015).
  31. Li, X., et al. A therapeutic strategy for spinal cord defect: Human dental follicle cells combined with aligned PCL/PLGA electrospun material. BioMed research international. , 197183 (2015).
  32. Yang, C., Li, X., Sun, L., Guo, W., Tian, W. Potential of human dental stem cells in repairing the complete transection of rat spinal cord. Journal of neural engineering. 14 (2), 26005 (2017).
  33. Kanao, S., et al. Capacity of Human Dental Follicle Cells to Differentiate into Neural Cells In Vitro. Stem Cells International. 2017, 8371326 (2017).
  34. Sung, I. -Y., et al. Cardiomyogenic Differentiation of Human Dental Follicle-derived Stem Cells by Suberoylanilide Hydroxamic Acid and Their In Vivo Homing Property. International journal of medical sciences. 13 (11), 841-852 (2016).
  35. Botelho, J., Cavacas, M. A., Machado, V., Mendes, J. J. Dental stem cells: Recent progresses in tissue engineering and regenerative medicine. Annals of medicine. 49 (8), 644-651 (2017).
  36. Dou, L., et al. Secretome profiles of immortalized dental follicle cells using iTRAQ-based proteomic analysis. Scientific reports. 7 (1), 7300 (2017).
  37. Lee, S., Choi, E., Cha, M. -J., Hwang, K. -C. Cell adhesion and long-term survival of transplanted mesenchymal stem cells: A prerequisite for cell therapy. Oxidative medicine and cellular longevity. 2015, 632902 (2015).
  38. Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Recent Progress in Stem Cell Modification for Cardiac Regeneration. Stem Cells International. 2018 (2), 1-22 (2018).
  39. Nowakowski, A., Walczak, P., Janowski, M., Lukomska, B. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells for Regenerative Medicine. Stem cells and development. 24 (19), 2219-2242 (2015).
  40. Nowakowski, A., Walczak, P., Lukomska, B., Janowski, M. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells to Induce Their Migration and Survival. Stem Cells International. 2016, 4956063 (2016).
  41. Gulluoglu, S., Tuysuz, E. C., Bayrak, O. F. miRNA Regulation in Dental Stem Cells: From Development to Terminal Differentiation. Dental Stem Cells. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. #350;ahin, F., Doğan, A., Demirci, S. , Springer International Publishing. (2016).
  42. Hammond, S. M. An overview of microRNAs. Advanced drug delivery reviews. 87, 3-14 (2015).
  43. Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular research. 93 (4), 614-622 (2012).
  44. Clark, E. A., Kalomoiris, S., Nolta, J. A., Fierro, F. A. Concise Review: MicroRNA Function in Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. Stem cells. 32 (5), 1074-1082 (2014).
  45. Dakhlallah, D., et al. MicroRNA-133a engineered mesenchymal stem cells augment cardiac function and cell survival in the infarct heart. Journal of cardiovascular pharmacology. 65 (3), 241-251 (2015).
  46. Seo, H. -H., et al. Exogenous miRNA-146a Enhances the Therapeutic Efficacy of Human Mesenchymal Stem Cells by Increasing Vascular Endothelial Growth Factor Secretion in the Ischemia/Reperfusion-Injured Heart. Journal of vascular research. 54 (2), 100-108 (2017).
  47. Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell stem cell. 17 (1), 11-22 (2015).
  48. Siddiq, S., et al. Bone marrow harvest versus peripheral stem cell collection for haemopoietic stem cell donation in healthy donors. The Cochrane database of systematic reviews. (1), CD006406 (2009).
  49. Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B. Dental-Related Stem Cells and Their Potential in Regenerative Medicine. Regenerative Medicine and Tissue Engineering. Andrades, J. A. , InTech. (2013).
  50. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  51. Honda, M. J., et al. Side population cells expressing ABCG2 in human adult dental pulp tissue. International endodontic journal. 40 (12), 949-958 (2007).
  52. Seo, B. -M., et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. The Lancet. 364 (9429), 149-155 (2004).
  53. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  54. Sonoyama, W., et al. Characterization of the apical papilla and its residing stem cells from human immature permanent teeth: a pilot study. Journal of endodontics. 34 (2), 166-171 (2008).
  55. Nollet, E., Hoymans, V. Y., van Craenenbroeck, A. H., Vrints, C. J., van Craenenbroeck, E. M. Improving stem cell therapy in cardiovascular diseases: the potential role of microRNA. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 311 (1), H207-H218 (2016).
  56. Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761 (2016).
  57. Schade, A., et al. Magnetic Nanoparticle Based Nonviral MicroRNA Delivery into Freshly Isolated CD105(+) hMSCs. Stem cells international. 2014, 197154 (2014).
  58. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
  59. Xue, H. Y., Liu, S., Wong, H. L. Nanotoxicity: a key obstacle to clinical translation of siRNA-based nanomedicine. Nanomedicine. 9 (2), London, England. 295-312 (2014).
  60. Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological & pharmaceutical bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
  61. Omidi, Y., Barar, J., Akhtar, S. Toxicogenomics of cationic lipid-based vectors for gene therapy: impact of microarray technology. Current drug delivery. 2 (4), 429-441 (2005).
  62. Hausburg, F., et al. Defining optimized properties of modified mRNA to enhance virus- and DNA- independent protein expression in adult stem cells and fibroblasts. Cellular physiology and biochemistry: International journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 35 (4), 1360-1371 (2015).
  63. Cardarelli, F., et al. The intracellular trafficking mechanism of Lipofectamine-based transfection reagents and its implication for gene delivery. Scientific reports. 6, 25879 (2016).
  64. Kirschman, J. L., et al. Characterizing exogenous mRNA delivery, trafficking, cytoplasmic release and RNA-protein correlations at the level of single cells. Nucleic acids research. 45 (12), e113 (2017).
  65. Li, L., Nie, Y., Ye, D., Cai, G. An easy protocol for on-chip transfection of COS-7 cells with a cationic lipid-based reagent. Lab on a chip. 9 (15), 2230-2233 (2009).
  66. Chang, K., Marran, K., Valentine, A., Hannon, G. J. RNAi in cultured mammalian cells using synthetic siRNAs. Cold Spring Harbor protocols. 2012 (9), 957-961 (2012).
  67. Sakurai, K., Chomchan, P., Rossi, J. J. Silencing of gene expression in cultured cells using small interfering RNAs. Current protocols in cell biology. , Chapter 27, Unit 27.1.1-28 (2010).
  68. Hoelters, J., et al. Nonviral genetic modification mediates effective transgene expression and functional RNA interference in human mesenchymal stem cells. The journal of gene medicine. 7 (6), 718-728 (2005).

Tags

Genética edição 141 células-tronco células-tronco do folículo dental células-tronco mesenquimais modificação não-virais engenharia genética transfecção transiente microRNA
Isolamento, caracterização e baseada em MicroRNA modificação genética de células-tronco humanas folículo Dental
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Müller, P., Ekat, K.,… More

Müller, P., Ekat, K., Brosemann, A., Köntges, A., David, R., Lang, H. Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells. J. Vis. Exp. (141), e58089, doi:10.3791/58089 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter