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JoVE Journal Genetics
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Genetics

Isolement, caractérisation et axée sur les micro-ARN de la Modification génétique des cellules souches humaines follicule dentaire

Published: November 16, 2018 doi: 10.3791/58089
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 3, 1,2, 3
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty at Rostock University, 3Department of Operative Dentistry and Periodontology, Rostock University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Ce protocole décrit le génie génétique transitoire dentaire des cellules souches extraites du follicule dentaire humaine. La stratégie appliquée modification non viraux peut-être devenir une base pour l’amélioration des produits thérapeutiques des cellules souches.

Abstract

A ce jour, plusieurs types de cellules souches à différents stades de développement sont dans la mise au point pour le traitement des maladies dégénératives. Pourtant, certains aspects, tels que la mort cellulaire massive initiale et faible d’effets thérapeutique, avec facultés affaiblies à leur traduction clinique large. Génie génétique des cellules souches avant la greffe a émergé comme une méthode prometteuse pour optimiser les effets thérapeutiques des cellules souches. Cependant, les systèmes de prestation sûre et efficace de gène manquent encore. Par conséquent, le développement de méthodes appropriées peut fournir une approche pour résoudre les défis actuels dans les thérapies à base de cellules souches.

Le présent protocole décrit l’extraction et la caractérisation des cellules souches de follicule dentaire humaine (hDFSCs) ainsi que leur modification génétique non viraux. Le follicule dentaire postnatal dévoilé comme une source prometteuse et facilement accessible pour la récolte des cellules souches multipotentes adultes possédant le potentiel élevé de prolifération. La technique d’isolation décrit présente une méthode simple et fiable pour récolter des hDFSCs de dents de sagesse. Ce protocole comprend également des méthodes pour définir les caractéristiques des cellules souches de cellules isolées. Génie biomoléculaire de hDFSCs, une stratégie optimisée transfection de base de lipides cationiques est présentée habilitante introduction microARN hautement efficace sans causer d’effets cytotoxiques. MicroARN sont des candidats appropriés pour la manipulation de cellules transitoires, comme ces petits régulateurs translationnelles contrôlent le devenir et le comportement des cellules souches sans danger d’intégration génome stable. Par conséquent, ce protocole représente une procédure sûre et efficace pour l’ingénierie des hDFSCs qui peut devenir important pour optimiser leur efficacité thérapeutique.

Introduction

Le follicule dentaire humain est un tissu conjonctif lâche dérivé ectomesenchymally entourant la dent en développement1,2. À côté de sa fonction de coordonner osteoclastogenesis et ostéogenèse pour le processus d’éruption de dent, ce tissu contenant des cellules souches et progénitrices en particulier pour le développement du parodonte3,4,5. Par conséquent, le follicule dentaire est considéré comme une source alternative de récolter les cellules souches humaines adultes6,7.

Plusieurs études ont démontré que les cellules souches humaines follicule dentaire (hDFSCs) sont capables de différencier dans la lignée parodontale incluant des ostéoblastes, les fibroblastes du ligament et les cémentoblastes8,9,10 . En outre, ces cellules ont été montrés pour correspondre à toutes les caractéristiques des cellules stromales mésenchymateuses (CSM), y compris capacité autorenouvellement, adhérence plastique, expression des marqueurs de surface spécifiques (par exemple, CD73, CD90, CD105) aussi bien qu’ostéogénique, adipocytaire et chondrogéniques différenciation potentiels11,12,13. D’autres études ont également révèlent un potentiel de différenciation neurale de hDFSCs2,14,15,16,17,18.

En raison de leurs propriétés prometteuses et un accès facile, hDFSCs est devenu récemment pertinentes pour tissus techniques19,20,21. Les premières études se concentrent sur le potentiel de DFSCs de régénération osseuse, parodontale et dent racines19,22,23,24,25,26, 27,28,29,30. La connaissance de la capacité neurogène de hDFSCs, leur application comme traitement potentiel pour les maladies neurodégénératives depuis enquête31,32,,33. HDFSCs ont également gagné en importance à la régénération des autres tissus (p. ex., l’épithélium cornéen)34,35. Le potentiel thérapeutique des hDFSC ne repose pas seulement sur leur potentiel de différenciation direct mais aussi sur leur activité paracrine. Récemment, il a été démontrés que hDFSCs sécrètent une multitude de facteurs bioactifs tels que les métalloprotéinases matricielles (MMP), facteur de croissance analogue à l’insuline (IGF), facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) et croissance hépatocyte facteur (HGF), qui jouent un rôle crucial dans l’angiogenèse, immunomodulation, remodelage de la matrice extra-cellulaire et processus réparateur36.

Cependant, large traduction clinique de thérapie de cellules souches est encore affaiblie par plusieurs défis, comme la mort massive de cellules initiales et bas les cellules souches bénéfiques effets37,38. Le génie génétique prévoit une stratégie prometteuse pour relever ces défis et donc peut améliorer grandement l’efficacité thérapeutique de cellules souches38,39,40. Pour la manipulation de cellules transitoires, microARN (miRs) sont des candidats, comme ces petits régulateurs translationnelles contrôlent le devenir et le comportement des cellules souches sans le danger du génome stable intégration41,,42, 43. a ce jour, plusieurs miRs bénéfiques ont été identifiés en favorisant la prolifération des cellules souches, survie, homing, activité paracrine ainsi que leur différenciation en plusieurs lignées44. Par exemple, miR-133 a machiné MSCs ont montré une augmentation de la survie et la prise de greffe dans les coeurs de rats infarci résultant en une amélioration de la fonction cardiaque par rapport aux non modifiées MSCs45. De même, miR-146 a MSCs sur-exprimant apparaissaient à sécréter des quantités plus élevées de VEGF qui a conduit à un renforcement de l’efficacité thérapeutique dans les tissus ischémiques46.

Ce manuscrit présente un protocole détaillé pour l’extraction sélective et l’ingénierie génétique des hDFSCs. À cette fin, nous avons décrit la digestion enzymatique et récolte des follicules dentaires humains, ainsi que l’isolation ultérieure de hDFSCs. Afin de caractériser les cellules isolées, des instructions importantes pour la vérification des propriétés MSC ont été incluses conformément aux directives de la société internationale de thérapie cellulaire13. En outre, nous fournissons une description détaillée pour la génération de hDFSCs miR-modifiée en appliquant une stratégie axée sur les lipides cationiques de la transfection et l’évaluation de l’efficacité de transfection et cytotoxicité.

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Protocol

HDFSCs sont isolées des follicules dentaires des dents de sagesse extraites fournies par le ministère d’orale et maxillo-faciale chirurgie plastique du centre médical de l’Université de Rostock. Consentement et autorisation écrite a été obtenue chez tous les patients. Cette étude a été autorisée par le Comité local d’éthique de l’Université de Rostock (autorisation No. A 2017-0158).

1. isolement de hDFSCs

Remarque : Pour éviter la contamination bactérienne, dents de sagesse ne devrait pas être éclatés avant extraction

  1. Préparation de solutions requises
    1. Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) / solution de pénicilline-streptomycine-Glutamine (P-S-G) : mélanger 495 mL de PBS avec 5 mL de solution de P-S-G. Stocker les aliquotes de 50 mL à 4 ° C.
    2. Préparer le milieu de culture hDFSC : mélanger 445 mL du milieu basal avec 5 mL d’agent antibiotique et 50 mL de sérum fœtal (SVF). Conserver à 4 ° C.
    3. Type de collagénase de préparer je stock solution (30 mg/mL) : diluer 300 mg de type collagénase I dans 10 mL de milieu de base additionné de 1 % agent antibiotique. Mélanger vigoureusement la solution. Filtrer la solution à l’aide d’un filtre de 0,2 µm. Magasin aliquotes de 500 µL de collagénase de type I solution stock à-20 ° C.
    4. Préparer la solution mère a II (40 mg/mL) : diluer 40 mg de II a dans 10 mL de milieu de base additionné de 1 % agent antibiotique. Mélanger vigoureusement la solution. Filtrer la solution à l’aide d’un filtre de 0,2 µm. Stocker les aliquotes de 500 µL de solution-mère a II à-20 ° C.
  2. Intervention chirurgicale
    1. Injecter une quantité suffisante (maximum : 2 mL) d’anesthésique local.
    2. Créer et élever un lambeau de mucoperiosteal à trois lobes. Soulevant un rabat lingual n’est pas nécessaire.
    3. Protéger l’aspect multilingue avec un ascenseur périoste.
    4. Doucement mill osseuse vestibulaire et distale avec un rond burr métal dur.
    5. Desserrer le tissu du follicule avec un ascenseur périoste. Retirez soigneusement les dents (le germe) et follicule en tirant la Couronne (et follicule) avec postérieures forceps (tiers-molaire).
    6. Débrider et irriguer la prise soigneusement avec une solution NaCl.
    7. Remplacez le rabat mucoperiosteal par sutures vicryl (voir Table des matières).
    8. Retirez le follicule de la dent de la cavité buccale et rangez-les dans une partie aliquote de 50 mL de solution de PBS/P-S-G.
      Remarque : L’échantillon peut être stocké à 4 ° C jusqu'à ce que la poursuite de la procédure.
  3. Digestion enzymatique du follicule dentaire
    1. Milieu de culture hDFSC Préchauffez et PBS/P-S-G de la solution à température ambiante (RT).
    2. Décongeler une aliquote de chaque type de collagénase I et a II solutions stocks. Préparer une solution de digestion de collagénase de type 3 mg/mL I et 4 mg/mL a II en ajoutant 500 µL de chaque collagénase de type I et solution-mère à 4 mL de basale moyenne contenant 1 % agent antibiotique a II.
    3. Placez le follicule extrait dans une boîte de Petri stérile et ajouter 10 mL de solution de PBS/P-S-G pour laver les tissus extraits. Répétez cette étape de laver deux fois.
    4. Émincer le follicule extrait en morceaux d’environ 1 mm x 1 mm avec un scalpel stérile dans la boîte de Pétri contenant 10 mL de solution de PBS/P-S-G.
    5. Transfert en tissu haché et solution de PBS/P-S-G de la boîte de Pétri dans un tube à centrifuger conique 50 mL. Laver le plat de Pétri avec 10 mL de solution de PBS/P-S-G et transvaser la solution dans le même tube.
    6. Centrifuger le tube à centrifuger conique pendant 10 min à 353 x g à RT et éliminer le surnageant.
    7. Ajouter 5 mL de solution de digestion du même tissu. Mélanger délicatement la solution et le tissu. Incuber à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 2 h dans un incubateur à agitation mélange.
    8. Centrifugeuse digéré la suspension cellulaire/tissulaire à 353 x g pendant 10 min à RT. jeter le surnageant et Resuspendre le culot obtenu en 6 mL de milieu de culture hDFSC.
    9. Suspension de cellules de graines dans un 25 cm2 flacon de culture de cellules et incuber les cellules à 37 ° C, 5 % de CO2 et 20 % O2.
      Remarque : Si le tissu n’est pas complètement digéré, transférer le tissu restant à ainsi le flacon de culture cellulaire.
    10. Changer support soigneusement 24h après l’ensemencement de la cellule. Changez ensuite le milieu tous les trois jours jusqu'à la confluence.
      Remarque : HDFSCs doivent être plastique-adhérent 24 h après l’ensemencement de la cellule et se distingues des cellules non adhérentes et des composants sanguins en changeant simplement le milieu.
  4. Récolte des cellules
    1. Préchauffer le milieu de culture hDFSC, solution de PBS/P-S-G et la trypsine/éthylènediaminetétraacétique solution d’acide (EDTA) RT.
    2. Jeter le surnageant du flacon de culture et laver les cellules confluentes avec 5 mL de solution de PBS/P-S-G.
    3. Ajouter 1 mL de solution de trypsine/EDTA dans le flacon de culture et incuber pendant 3 min à 37 ° C. Arrêter le processus de digestion en ajoutant 3 mL de milieu de culture de hDFSC dans le flacon de culture.
    4. Transfert dans un tube à centrifuger conique 15 mL de suspension cellulaire et centrifuger la suspension pendant 10 min à 353 x g à RT. jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans une quantité appropriée de milieu de culture hDFSC.
    5. Compter les cellules : mélanger doucement 10 µL de suspension cellulaire à 10 µL de solution de bleu de Trypan. Appliquer 10 µL dans une chambre de comptage et de calculer la quantité de cellules hDFSC.

2. caractérisation des hDFSCs

  1. Immunophénotypage
    1. Préparation des cellules pour cytométrie
      1. Préparation de solutions requises
        1. Préparer les PBS/EDTA (2 mM) : mélanger 996 mL de PBS avec 4 mL d’EDTA (0,5 M).
        2. Préparer la coloration tampon : mélangez 995 mL de PBS/EDTA (2 mM) avec 5 g de BSA. Filtrer la solution à l’aide d’un filtre de 0,22 µm et conserver à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
        3. Préparer la solution mère de paraformaldéhyde (PFA) (4 %) : diluer 4 g PFA dans 100 mL de PBS et chauffer la solution à 80 ° C. Mélanger la solution et ajuster le pH de 7,3. Aliquote obtenu solution PFA en proportions respectives (1,5 mL) et de conserver à-20 ° C jusqu'à son utilisation.
          ATTENTION : Parce que PFA vapeurs sont toxiques, préparez la solution de PFA sous une hotte ventilée.
      2. Après la récolte (1.4), transférer 14 échantillons de 5 x 104 cellules dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL. Centrifuger les suspensions à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
        Remarque : Réaliser les travaux suivants dans une pièce plutôt ombragée. Garder les cellules et réactifs sur glace sauf indication contraire.
      3. Remettre en suspension des cellules dans certains montants de coloration tampon (4 ° C) et ajouter FcR blocage réactif (4 ° C) comme indiqué dans le tableau 1.
      4. Ajouter les anticorps suivants sur la face interne de l’échantillon respectif comme il est indiqué dans le tableau 1: anti-l’homme souris Allophycocyanin (APC) CD29 ; Souris APC contrôle des isotypes IgG1 κ ; Péridinine-chlorophylle, protéines (PerCP)-Cyanine5.5 anti-homme de souris CD44 ; PerCP-Cyanine5.5 souris le contrôle IgG2b κ isotype ; V500 anti-homme de souris CD45 ; V500 souris contrôle des isotypes IgG1 κ ; Phycoérythrine (PE) souris anti-humain CD73 ; Souris de PE contrôle des isotypes IgG1 κ ; PerCP-Cyanine5.5 anti-homme de souris CD90 ; PerCP-Cyanine5.5 souris contrôle des isotypes IgG1 κ ; la souris anti-humain CD105 : Alexa Fluor (AF) 488 ; contrôle négatif IgG1 de souris : AF488 ; PE-Cyanine7 anti-homme de souris CD117 ; PE-Cyanine7 souris IgG1, contrôle d’isotype κ. Après que les anticorps ont été ajoutés à chaque échantillon, tournez en bas des anticorps et mélanger doucement. Incuber les solutions pendant 10 min à 4 ° C.
      5. Ajouter 1 mL de PBS (4 ° C) et centrifuger les échantillons à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
      6. Remettre en suspension les cellules dans 100 µL de PBS (4 ° C) et ajouter 33 µL de l’IFP (4 %). Mélanger les solutions et les conserver sur la glace ou à 4 ° C jusqu'à l’analyse en cytométrie en flux.
    2. Mesure de débit par cytométrie en flux des cellules
      Remarque : Réaliser les travaux suivants dans une pièce plutôt ombragée. Garder les cellules sur la glace jusqu'à la mesure.
      1. Afin d’étudier l’expression des antigènes de surface, transférer les échantillons dans des tubes adaptés aux mesures de cytométrie en flux.
      2. Mesurer au moins 2 x 104 événements à l’aide d’un cytomètre en flux. Analyser tel que représenté dans la Figure 2.
  2. Potentiel de différenciation multipotentes de hDFSCs
    1. Utilisez un disponible dans le commerce humaine Mesenchymal Stem Cell fonctionnelle Identification Kit pour confirmer adipocytaire, ostéogénique et potentiel de différenciation chondrogéniques de hDFSCs. Appliquer l’anticorps secondaire de AF488 anti-chèvre âne pour la coloration de la protéine acide gras 4 (FABP4) et AGGRECANE ainsi que de l’âne d’AF488 secondaires anticorps anti-souris pour la coloration de l’ostéocalcine. Pour la coloration des noyaux, utiliser le milieu de montage avec 4', 6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI).
      Remarque : Préparer les échantillons sans anticorps primaire comme témoins négatifs d’analyses microscopiques.
    2. Analyser l’expression des protéines par microscopie confocale à balayage laser. Paramètres de microscopie : objectif 40 x avec immersion dans l’huile ; excitation laser 488 nm (pour AF488) et 405 nm (pour DAPI).

3. la transfection de hDFSCs

  1. Après la récolte (1.4), graines hDFSCs sur une plaque de culture cellulaire de 24 puits 24h avant la transfection.
    Remarque : À partir de la densité cellulaire est environ 4 x 104 cellules par puits. Cellules devraient atteindre environ 80 % confluence le jour de la transfection.
    Remarque : Une cellule supplémentaire échantillon comme contrôle pour analyse en cytométrie en flux.
  2. Préparation de transfection complexes
    Remarque : Pour empêcher la contamination par les RNases, nettoyer l’espace de travail directement avant la préparation de transfection complexes à l’aide de la solution de décontamination de RNase. Utilisez seulement le matériau sans RNase et solutions.
    Remarque : Réaliser les travaux suivants dans une pièce plutôt ombragée.
    1. Préparer la solution mère de miR (50 µM) : remettre en suspension miR précurseur marqué Cy3 (5 nmol) dans de l’eau exempte de nucléase 100 µL. Solution mère de l’aliquote miR obtenus en magasin à-20 ° C jusqu'à son utilisation dans l’obscurité et les montants respectifs (5 µL).
    2. Diluer 40 pmol de miR (0,8 µL de la solution mère de miR de 50 µM) à 66,7 µL de milieu de sérum réduit. Mélanger la solution doucement
    3. Diluer 0,67 µL de réactif de transfection de base de lipides cationiques à 66,7 µL de milieu de sérum réduit. Mélanger la solution doucement et laisser incuber 5 min à température ambiante.
    4. Après l’incubation, ajouter le réactif de transfection préalablement dilué au préalable diluée SEM. Mélanger la solution doucement et incuber pendant 15 min à température ambiante.
  3. Ajouter goutte à goutte les complexes de transfection préparés directement au milieu de culture sur cellules. Mélanger doucement en balançant la plaque de culture cellulaire de 24 puits en arrière.
  4. Incuber les cellules à 37 ° C, 5 % de CO2et 20 % O2 pendant 24 h.

4. analyse de la Transfection

Remarque : Réaliser les travaux suivants dans une pièce plutôt ombragée.

  1. Récolte après la transfection de cellules
    Remarque : Collecter toutes les solutions de la cellule d’un échantillon dans le tube à centrifuger conique 15 mL même.
    1. 24h après la transfection, recueillir le liquide surnageant des échantillons dans des tubes à centrifuger respectifs.
    2. Laver les cellules avec 1 mL de PBS, PBS de transfert dans le tube à centrifuger respectifs et ajouter 500 µL trypsine/EDTA (RT) aux cellules. Incuber les solutions pendant 3 min à 37 ° C.
    3. Arrêter la trypsinisation en ajoutant 1 mL de milieu de culture (RT) aux cellules et transvaser la solution dans le tube à centrifuger respectifs. Cellules de centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C.
      Remarque : Dès cette époque, garder les cellules et réactifs sur glace sauf indication contraire.
  2. Préparation des cellules pour cytométrie
    1. Jeter le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans 100 µL de tampon de marquage (4 ° C) et transférer cellule solution dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
    2. Ajouter 0,5 µL de colorant réactif amine aux échantillons afin de distinguer entre des cellules vivantes et mortes. Doucement, mélanger la solution et incuber pendant 10 min à 4 ° C.
    3. Ajouter 1 mL de PBS (4 ° C) dans les cellules et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
    4. Remettre en suspension les cellules dans 100 µL de PBS (4 ° C) et ajouter 33 µL de l’IFP (4 %). Mélanger les solutions et les conserver sur la glace ou à 4 ° C jusqu'à l’analyse en cytométrie en flux.
  3. Mesure de débit par cytométrie en flux des cellules
    Remarque : Réaliser les travaux suivants dans une pièce plutôt ombragée. Garder les cellules sur la glace jusqu'à la mesure.
    1. Transférer les échantillons dans des tubes adaptés aux mesures de cytométrie en flux.
    2. Examiner la viabilité cellulaire et l’efficacité d’absorption de miR à l’aide d’un cytomètre en flux. Mesurer au moins 2 x 104 événements. Utiliser la stratégie de blocage représentée à la Figure 4.
      Remarque : Utiliser les cellules celllulaire comme contrôle négatif pour organiser le processus de blocage pour les cellules positives Cy3 et de calculer la mort cellulaire provoquée par transfection.

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Representative Results

Nous présentons ici, une instruction détaillée d’isolement à la récolte des hDFSCs du tissu humain follicule dentaire. En raison de l’accès facile du follicule dentaire pendant la chirurgie de routine, il est une source prometteuse pour l’extraction des cellules souches adultes.

Le hDFSCs isolées ont montré toutes les caractéristiques décrites pour la définition de MSCs13. En fait, les cellules étaient adhérentes plastique moins décrit les conditions de culture et affiché une morphologie fibroblastique (Figure 1). Analyses de cytométrie en flux a révélé que hDFSCs exprimée un panel de certains antigènes de surface, y compris CD29, CD44, CD73, CD90 et CD105, tandis que CD45 et CD117 étaient absents (Figure 2). En outre, l’adipocytaire, ostéogénique et chondrogéniques potentiel de différenciation des cellules in vitro particulier la culture des conditions a été confirmée par immunomarquage de protéine acide gras 4 (FABP4), ostéocalcine et AGGRECANE (Figure 3).

La stratégie décrit la transfection base de lipides cationiques activé la modification génétique transitoire efficace de hDFSCs avec une miR-absorption à ~ 100 % de la transfection après 24h cellules viables (Figure 4 b). En outre, transfectées (Figure 4 a) et celllulaire échantillons (Figure 4) a montré des quantités comparables de cellules mortes prouvant les paramètres de transformation cellulaire doux.

Figure 1
Figure 1 : lumière représentant photo microscope de hDFSCs. Les cellules présentent une morphologie des fibroblastes dans des conditions de culture standard.

Figure 2
Figure 2 : immunophénotypage par cytométrie en flux flux représentatif de hDFSCs. Cytométrie de cellules après coloration pour marqueurs de surface cellulaire spécifique (bleu). Contrôles d’isotype correspondants étaient utilisés comme témoins négatifs (gris). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : vérification représentative des adipocytaire, ostéogénique et potentiel de différenciation chondrogéniques de hDFSCs. Après différenciation, les ostéocytes, les chondrocytes et les adipocytes ont été identifiés par immunomarquage de protéine acide gras (A) 4 (FABP4) (vert), (B) ostéocalcine (vert) et (C) AGGRECANE (vert). Les noyaux ont été colorés au DAPI (bleus). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : représentant gating stratégie pour l’analyse de la transfection. Représentation schématique du processus de blocage stratégie utilisée pour la quantification de la cytotoxicité (A) (bleu : les cellules mortes) et (B), efficacité d’absorption de Cy3 marqué miR (rouge : Cy3+ cellules) transfection après 24h. Les cellules celllulaire (C,D) ont été utilisées comme contrôle.

MACS FcR Anticorps [µL] Isotype contrôles [µL]
Échantillon mémoire tampon blocage CD29 CD44 CD45 CD73 CD90 CD105 CD117 APC PerCP-Cy5.5 V500 PE PerCP-Cy5.5 AF488 PE-Cy7
[µl] réactif [µl] APC PerCP-Cy5.5 V500 PE PerCP-Cy5.5 AF488 PE-Cy7 IgG1 IgG2b IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1
1 30 10 10
2 37,5 10 2.5
3 37,5 10 2.5
4 30 10 10
5 35 10 5
6 35 10 5
7 37,5 10 2.5
8 30 10 10
9 30 10 10
10 37,5 10 2.5
11 30 10 10
12 40 10 10
13 30 10 5
14 37,5 10 2.5

Tableau 1 : Pipetage mise en page pour l’immunophénotypage des hDFSCs.

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Discussion

Les cellules souches adultes sont actuellement en discussion pour le traitement de plusieurs maladies dégénératives. En particulier, OS a moelle (BM)-dérivées de cellules souches, y compris les cellules souches hématopoïétiques (CSH) et MSCs, sont sous investigation clinique intensive47. Cependant, récolte de BM est une procédure invasive provoquant une douleur sur le site de don et peut conduire à des effets indésirables,48. Récemment, le tissu dentaire postnatal a émergé comme un roman et une source facilement accessible pour les cellules souches. Ces cellules souches dentaires ont montré pour répondre à toutes les caractéristiques MSC et plus grande capacité de prolifération de cellules souches dérivées BM49. Ici, nous avons présenté un protocole détaillé pour l’extraction, la caractérisation et le génie de hDFSCs.

La technique d’isolation décrit a été développée sur des follicules dentaires humains des dents de sagesse, que ce tissu est généralement extraite et éliminé comme déchets médicaux19. Néanmoins, autres tissus dentaires, y compris la pulpe dentaire50,51, ligament alvéolo-dentaire52, exfoliée dents caduques53et racine papille apicale54, peuvent être utilisés pour l’extraction de souches dentaires cellules.

Génie génétique des cellules souches en insérant des miRs est une stratégie novatrice pour surmonter certaines difficultés dans les thérapies à base de cellules souches, tels que des cellules souches faible survie43,55,56,57. Ce protocole présenté instructions cruciale pour la mise en place efficace de miR synthétique en hDFSCs à l’aide d’un réactif de transfection de base de lipides cationiques disponibles dans le commerce. L’application des formulations liposomale cationiques pour la livraison de réactifs thérapeutiques, tels que les médicaments et les acides nucléiques, a été étudiée dans nombreux essais cliniques58,59. Toutefois, les liposomes cationiques sont potentiellement cytotoxiques de manière dose-dépendante en endommageant par exemple, à l’intégrité des membranes cellulaires et des modifications dans l’expression de gène59,60,61 . Donc, attention particulière doit être portée aux effets toxiques sur les cellules induites par la transfection.

Notamment, conditions de transfection indiquées ont été optimisées pour la modification génétique induite par le miR de hDFSCs en ce qui concerne l’efficacité et la cytotoxicité. Néanmoins, d’autres études ont démontré l’application réussie de ce réactif de transfection pour la livraison de supplémentaires des acides nucléiques, y compris l’ADN plasmidique, siRNA et l’ARNm en cellule différentes types62,63, 64 , 65 , 66 , 67 , 68. les résultats de ces études ont révélé que les conditions de livraison idéal varient de manière significative et doivent être définis pour chaque type de cellule.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le programme FORUN de l’Université de Rostock Medical Centre (889018) et la Fondation humide (2016-11). En outre, h. et R.D. sont pris en charge par le BMBF (VIP + 00240).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488 Bio-Rad MCA1557A488 Clone SN6, monoclonal
Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488 Bio-Rad MCA928A488 monoclonal
APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody BD Biosciences 559883 Clone MAR4, monoclonal
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 555751 Clone MOPC-21, monoclonal
PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody BD Biosciences 550257 Clone AD2, monoclonal
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 555749 Clone MOPC-21, monoclonal
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody BD Biosciences 339217 Clone 104D2, monoclonal
PE-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 557872 Clone MOPC-21, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody BD Biosciences 560531 Clone G44-26, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 558304 Clone 27-35, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90 Antibody BD Biosciences 561557 Clone 5E10, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 55095 Clone MOPC-21, monoclonal
V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody BD Biosciences 560777 Clone HI30, monoclonal
V500 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 560787 Clone X40, monoclonal
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec 130-059-901
UltraPure EDTA Thermo Fisher Scientific 15575-020 0.5M, pH 8.0
Steritop Merck Millipore SCGPT05RE 0.22 µm, radio-sterilized, polyethersulfone
BSA Sigma-Aldrich A7906
PFA Merck Millipore 1040051000
Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit R&D Systems SC006
RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution Thermo Fisher Scientific AM9780
Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 Thermo Fisher Scientific AM17120 5 nmol
Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 Thermo Fisher Scientific AM17110 5 nmol
Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11055 polyclonal
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21202 polyclonal
Mounting medium; Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057-20ML histology mounting medium
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope Zeiss
BD FACS LSRII flow cytometer BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2 BD Biosciences
ZEN2011 software Zeiss
Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%) Biochrom L2143 in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+
Amine reactive dye; LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
PBS (1x) Thermo Fisher Scientific 10010023 pH: 7.4; w/o: Ca and Mg
P-S-G (100x) Thermo Fisher Scientific 10378016
Basal medium; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 Thermo Fisher Scientific 11039021
Antibiotic, ZellShield Biochrom W 13-0050
FBS Thermo Fisher Scientific 10500064
Collagenase type I Thermo Fisher Scientific 17100017
Dispase II Thermo Fisher Scientific 17105041
Filter, Sterifix syringe filter 0.2 µm Braun 4099206
50 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62,547,254
15 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62,554,502
Cell culture flask 75 cm2 Sarstedt 833,910,002
Cell culture flask, 25 cm2 Sarstedt 833,911,002
Freezing medium, Biofreeze Biochrom F 2270
Cryotubes Thermo Fisher Scientific 377267 1.8 mL
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154 0.4 %
Counting chamber Paul Marienfeld
Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001% Mibe
NaCl solution Braun 0.9 %
Vicryl satures, Vicryl rapide Ethicon 3 - 0

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References

  1. Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: Applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839-851 (2015).
  2. Lima, R. L., et al. Human dental follicle cells express embryonic, mesenchymal and neural stem cells markers. Archives of oral biology. 73, 121-128 (2017).
  3. Wise, G. E. Cellular and molecular basis of tooth eruption. Orthodontics & craniofacial research. 12 (2), 67-73 (2009).
  4. Baykul, T., Saglam, A. A., Aydin, U., Başak, K. Incidence of cystic changes in radiographically normal impacted lower third molar follicles. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 99 (5), 542-545 (2005).
  5. Wise, G. E., Frazier-Bowers, S., D'Souza, R. N. Cellular, molecular, and genetic determinants of tooth eruption. Critical reviews in oral biology and medicine : an official publication of the American Association of Oral Biologists. 13 (4), 323-334 (2002).
  6. Ten Cate, A. R. The development of the periodontium: A largely ectomesenchymally derived unit. Periodontology 2000. 13 (1), 9-19 (1997).
  7. Park, B. -W., et al. In vitro and in vivo osteogenesis of human mesenchymal stem cells derived from skin, bone marrow and dental follicle tissues. Differentiation; research in biological diversity. 83 (5), 249-259 (2012).
  8. Sowmya, S., et al. Periodontal Specific Differentiation of Dental Follicle Stem Cells into Osteoblast, Fibroblast, and Cementoblast. Tissue engineering. Part C, Methods. 21 (10), 1044-1058 (2015).
  9. Kémoun, P., et al. Human dental follicle cells acquire cementoblast features under stimulation by BMP-2/-7 and enamel matrix derivatives (EMD) in vitro. Cell and tissue research. 329 (2), 283-294 (2007).
  10. Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
  11. Hieke, C., et al. Human dental stem cells suppress PMN activity after infection with the periodontopathogens Prevotella intermedia and Tannerella forsythia. Scientific reports. 6, 39096 (2016).
  12. Kumar, A., et al. Molecular spectrum of secretome regulates the relative hepatogenic potential of mesenchymal stem cells from bone marrow and dental tissue. Scientific reports. 7 (1), 15015 (2017).
  13. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  14. Ullah, I., et al. In vitro comparative analysis of human dental stem cells from a single donor and its neuronal differentiation potential evaluated by electrophysiology. Life sciences. 154, 39-51 (2016).
  15. Völlner, F., Ernst, W., Driemel, O., Morsczeck, C. A two-step strategy for neuronal differentiation in vitro of human dental follicle cells. Differentiation; research in biological diversity. 77 (5), 433-441 (2009).
  16. Morsczeck, C., et al. Comparison of human dental follicle cells (DFCs) and stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) after neural differentiation in vitro. Clinical oral investigations. 14 (4), 433-440 (2010).
  17. Kadar, K., et al. Differentiation potential of stem cells from human dental origin - promise for tissue engineering. Journal of physiology and pharmacology: An official journal of the Polish Physiological Society. 60, Suppl 7. 167-175 (2009).
  18. Heng, B. C., et al. Decellularized Matrix Derived from Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells Enhances the Neurogenic Potential of Dental Follicle Stem Cells. Journal of endodontics. 43 (3), 409-416 (2017).
  19. Honda, M. J., Imaizumi, M., Tsuchiya, S., Morsczeck, C. Dental follicle stem cells and tissue engineering. Journal of Oral Science. 52 (4), 541-552 (2010).
  20. Liu, J., et al. Concise reviews: Characteristics and potential applications of human dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Stem cells. 33 (3), Dayton, Ohio. 627-638 (2015).
  21. Morsczeck, C., Reichert, T. E. Dental stem cells in tooth regeneration and repair in the future. Expert opinion on biological therapy. 18 (2), 187-196 (2018).
  22. Rezai-Rad, M., et al. Evaluation of bone regeneration potential of dental follicle stem cells for treatment of craniofacial defects. Cytotherapy. 17 (11), 1572-1581 (2015).
  23. Handa, K., et al. Progenitor Cells From Dental Follicle Are Able to Form Cementum Matrix In Vivo. Connective Tissue Research. (2-3), 406-408 (2009).
  24. Tsuchiya, S., Ohshima, S., Yamakoshi, Y., Simmer, J. P., Honda, M. J. Osteogenic Differentiation Capacity of Porcine Dental Follicle Progenitor Cells. Connective Tissue Research. 51 (3), 197-207 (2010).
  25. Honda, M. J., et al. Stem cells isolated from human dental follicles have osteogenic potential. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 111 (6), 700-708 (2011).
  26. Guo, W., et al. Dental follicle cells and treated dentin matrix scaffold for tissue engineering the tooth root. Biomaterials. 33 (5), 1291-1302 (2012).
  27. Yang, B., et al. Tooth root regeneration using dental follicle cell sheets in combination with a dentin matrix - based scaffold. Biomaterials. 33 (8), 2449-2461 (2012).
  28. Bai, Y., et al. Cementum- and periodontal ligament-like tissue formation by dental follicle cell sheets co-cultured with Hertwig's epithelial root sheath cells. Bone. 48 (6), 1417-1426 (2011).
  29. Guo, S., et al. Comparative study of human dental follicle cell sheets and periodontal ligament cell sheets for periodontal tissue regeneration. Cell transplantation. 22 (6), 1061-1073 (2013).
  30. Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC biotechnology. 15, 114 (2015).
  31. Li, X., et al. A therapeutic strategy for spinal cord defect: Human dental follicle cells combined with aligned PCL/PLGA electrospun material. BioMed research international. , 197183 (2015).
  32. Yang, C., Li, X., Sun, L., Guo, W., Tian, W. Potential of human dental stem cells in repairing the complete transection of rat spinal cord. Journal of neural engineering. 14 (2), 26005 (2017).
  33. Kanao, S., et al. Capacity of Human Dental Follicle Cells to Differentiate into Neural Cells In Vitro. Stem Cells International. 2017, 8371326 (2017).
  34. Sung, I. -Y., et al. Cardiomyogenic Differentiation of Human Dental Follicle-derived Stem Cells by Suberoylanilide Hydroxamic Acid and Their In Vivo Homing Property. International journal of medical sciences. 13 (11), 841-852 (2016).
  35. Botelho, J., Cavacas, M. A., Machado, V., Mendes, J. J. Dental stem cells: Recent progresses in tissue engineering and regenerative medicine. Annals of medicine. 49 (8), 644-651 (2017).
  36. Dou, L., et al. Secretome profiles of immortalized dental follicle cells using iTRAQ-based proteomic analysis. Scientific reports. 7 (1), 7300 (2017).
  37. Lee, S., Choi, E., Cha, M. -J., Hwang, K. -C. Cell adhesion and long-term survival of transplanted mesenchymal stem cells: A prerequisite for cell therapy. Oxidative medicine and cellular longevity. 2015, 632902 (2015).
  38. Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Recent Progress in Stem Cell Modification for Cardiac Regeneration. Stem Cells International. 2018 (2), 1-22 (2018).
  39. Nowakowski, A., Walczak, P., Janowski, M., Lukomska, B. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells for Regenerative Medicine. Stem cells and development. 24 (19), 2219-2242 (2015).
  40. Nowakowski, A., Walczak, P., Lukomska, B., Janowski, M. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells to Induce Their Migration and Survival. Stem Cells International. 2016, 4956063 (2016).
  41. Gulluoglu, S., Tuysuz, E. C., Bayrak, O. F. miRNA Regulation in Dental Stem Cells: From Development to Terminal Differentiation. Dental Stem Cells. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. #350;ahin, F., Doğan, A., Demirci, S. , Springer International Publishing. (2016).
  42. Hammond, S. M. An overview of microRNAs. Advanced drug delivery reviews. 87, 3-14 (2015).
  43. Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular research. 93 (4), 614-622 (2012).
  44. Clark, E. A., Kalomoiris, S., Nolta, J. A., Fierro, F. A. Concise Review: MicroRNA Function in Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. Stem cells. 32 (5), 1074-1082 (2014).
  45. Dakhlallah, D., et al. MicroRNA-133a engineered mesenchymal stem cells augment cardiac function and cell survival in the infarct heart. Journal of cardiovascular pharmacology. 65 (3), 241-251 (2015).
  46. Seo, H. -H., et al. Exogenous miRNA-146a Enhances the Therapeutic Efficacy of Human Mesenchymal Stem Cells by Increasing Vascular Endothelial Growth Factor Secretion in the Ischemia/Reperfusion-Injured Heart. Journal of vascular research. 54 (2), 100-108 (2017).
  47. Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell stem cell. 17 (1), 11-22 (2015).
  48. Siddiq, S., et al. Bone marrow harvest versus peripheral stem cell collection for haemopoietic stem cell donation in healthy donors. The Cochrane database of systematic reviews. (1), CD006406 (2009).
  49. Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B. Dental-Related Stem Cells and Their Potential in Regenerative Medicine. Regenerative Medicine and Tissue Engineering. Andrades, J. A. , InTech. (2013).
  50. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  51. Honda, M. J., et al. Side population cells expressing ABCG2 in human adult dental pulp tissue. International endodontic journal. 40 (12), 949-958 (2007).
  52. Seo, B. -M., et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. The Lancet. 364 (9429), 149-155 (2004).
  53. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  54. Sonoyama, W., et al. Characterization of the apical papilla and its residing stem cells from human immature permanent teeth: a pilot study. Journal of endodontics. 34 (2), 166-171 (2008).
  55. Nollet, E., Hoymans, V. Y., van Craenenbroeck, A. H., Vrints, C. J., van Craenenbroeck, E. M. Improving stem cell therapy in cardiovascular diseases: the potential role of microRNA. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 311 (1), H207-H218 (2016).
  56. Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761 (2016).
  57. Schade, A., et al. Magnetic Nanoparticle Based Nonviral MicroRNA Delivery into Freshly Isolated CD105(+) hMSCs. Stem cells international. 2014, 197154 (2014).
  58. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
  59. Xue, H. Y., Liu, S., Wong, H. L. Nanotoxicity: a key obstacle to clinical translation of siRNA-based nanomedicine. Nanomedicine. 9 (2), London, England. 295-312 (2014).
  60. Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological & pharmaceutical bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
  61. Omidi, Y., Barar, J., Akhtar, S. Toxicogenomics of cationic lipid-based vectors for gene therapy: impact of microarray technology. Current drug delivery. 2 (4), 429-441 (2005).
  62. Hausburg, F., et al. Defining optimized properties of modified mRNA to enhance virus- and DNA- independent protein expression in adult stem cells and fibroblasts. Cellular physiology and biochemistry: International journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 35 (4), 1360-1371 (2015).
  63. Cardarelli, F., et al. The intracellular trafficking mechanism of Lipofectamine-based transfection reagents and its implication for gene delivery. Scientific reports. 6, 25879 (2016).
  64. Kirschman, J. L., et al. Characterizing exogenous mRNA delivery, trafficking, cytoplasmic release and RNA-protein correlations at the level of single cells. Nucleic acids research. 45 (12), e113 (2017).
  65. Li, L., Nie, Y., Ye, D., Cai, G. An easy protocol for on-chip transfection of COS-7 cells with a cationic lipid-based reagent. Lab on a chip. 9 (15), 2230-2233 (2009).
  66. Chang, K., Marran, K., Valentine, A., Hannon, G. J. RNAi in cultured mammalian cells using synthetic siRNAs. Cold Spring Harbor protocols. 2012 (9), 957-961 (2012).
  67. Sakurai, K., Chomchan, P., Rossi, J. J. Silencing of gene expression in cultured cells using small interfering RNAs. Current protocols in cell biology. , Chapter 27, Unit 27.1.1-28 (2010).
  68. Hoelters, J., et al. Nonviral genetic modification mediates effective transgene expression and functional RNA interference in human mesenchymal stem cells. The journal of gene medicine. 7 (6), 718-728 (2005).

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Müller, P., Ekat, K., Brosemann, A., Köntges, A., David, R., Lang, H. Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells. J. Vis. Exp. (141), e58089, doi:10.3791/58089 (2018).

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