Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Isolering og karakterisering MicroRNA-baserte genetisk modifisering av menneskelig Dental hårsekken stamceller

Published: November 16, 2018 doi: 10.3791/58089
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 3, 1,2, 3
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty at Rostock University, 3Department of Operative Dentistry and Periodontology, Rostock University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver forbigående genteknologi av dental stamceller hentet fra menneskelige dental hårsekken. Brukes ikke-viral endring strategi kan bli grunnlag for forbedring av terapeutiske stamcelleforskningen produkter.

Abstract

Hittil er forskjellige på forskjellige utviklingsstadier stilk cellen i fokus for behandling av degenerative sykdommer. Likevel, enkelte aspekter som første massive celledød og lav terapeutiske effekter, nedsatt deres omfattende kliniske oversettelse. Genteknologi av stamceller før transplantasjon dukket opp som en lovende metode for å optimalisere terapeutisk stamcelleforskningen effekter. Sikker og effektiv genet leveringssystemer mangler imidlertid fortsatt. Utviklingen av passende metoder kan derfor gi en tilnærming for å løse dagens utfordringer i stilk cellen-basert behandling.

Nåværende protokollen beskriver utvinning og karakterisering av menneskelig dental hårsekken stamceller (hDFSCs) og deres ikke-viral genmodifisering. Postnatal dental hårsekken avduket som en lovende og lett tilgjengelig for høsting voksen multipotent stamceller besitter høy spredning potensial. Prosedyren beskrevet isolasjon presenterer en enkel og pålitelig metode for å høste hDFSCs fra påvirket visdom tennene. Denne protokollen omfatter også metoder for å definere stamcelleforskningen egenskaper isolert celler. Genetisk engineering av hDFSCs presenteres en optimalisert kationisk lipid-baserte transfection strategi muliggjør svært effektiv microRNA Introduksjon uten forårsaker cytotoksiske effekter. MicroRNAs er egnet kandidater til forbigående celle manipulasjon, disse små translasjonsforskning regulatorer kontrollere skjebne og oppførsel av stamceller uten fare stabil genomet integrering. Derfor representerer denne protokollen en sikker og effektiv fremgangsmåte for utvikling av hDFSCs som kan bli viktig for å optimalisere deres terapeutisk effekt.

Introduction

Menneskelige dental hårsekken er en løs ectomesenchymally-avledet bindevev omgir utvikle tann1,2. Foruten sin funksjon å koordinere osteoclastogenesis og osteogenesis for tann utbruddet prosessen, havner Dette vevet stammen og stamfar celler spesielt for utviklingen av periodontium3,4,5. Derfor regnes dental hårsekken som en alternativ kilde å høste humant voksne stamceller6,7.

Flere studier vist at menneskelige dental hårsekken stamceller (hDFSCs) er i stand til å skille i periodontal slektslinje inkludert osteoblasts, leddbånd fibroblaster og cementoblasts8,9,10 . Videre disse cellene ble vist å matche alle karakteristikkene av mesenchymal stromal celler (MSCs) inkludert selv fornyende kapasitet, plast etterlevelse, uttrykk for bestemte overflate markører (f.eks, CD73, CD90, CD105) så vel som osteogenic, adipogenic og chondrogenic differensiering potensielle11,12,13. Andre studier viser også en neural differensiering potensialet i hDFSCs2,14,15,16,17,18.

Deres lovende egenskaper og enkel tilgang ble hDFSCs nylig relevante for tissue engineering19,20,21. Den første studier konsentrert om potensialet i DFSCs å regenerere beinet, periodontal og tann røtter19,22,23,24,25,26, 27,28,29,30. Kunnskap om neurogenic evnen til hDFSCs, deres program som potensielle behandling for nevrodegenerative sykdommer har vært undersøkt31,32,33. HDFSCs har også fått betydning med hensyn til den fornyelse av andre vev (f.eks hornhinnen epitel)34,35. Terapeutiske potensialet i hDFSC er ikke bare basert på deres direkte differensiering potensial men også på sin paracrine aktivitet. Nylig har hDFSCs vist seg å skille ut en rekke bioaktive faktorer, for eksempel matrise metalloproteinases (MMPs), insulin-lignende vekstfaktor (IGF), vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF) og hepatocyte vekst faktor (HGF), som spiller en avgjørende rolle for angiogenese, immunomodulation, ekstra mobil matrix remodeling og reparative prosesser36.

Bred klinisk oversettelse av stilk cellen terapi er imidlertid fortsatt nedsatt av flere utfordringer, som massiv første celledød og lav gunstig stamcelleforskningen effekter37,38. Genteknologi gir en lovende strategi for å møte disse utfordringene, og derfor kan øke den terapeutiske effekten av stamceller38,39,40. Forbigående celle manipulering er microRNAs (miRs) egnede kandidater, som disse små translasjonsforskning regulatorer kontrollere skjebne og oppførsel av stamceller uten fare for stabil genomet integrering41,42, 43. hittil har flere nyttige miRs er identifisert fremme stem celle spredning, overlevelse, homing, paracrine aktivitet samt deres differensiering inn flere overleveringslinjer44. For eksempel utviklet miR-133a MSCs viste en økt overlevelse og engraftment i infarcted rotten hjerter som resulterer i en bedre hjertefunksjon sammenlignet med uforandret MSCs45. Likeledes, miR-146a overexpressing MSCs ble vist å skille ut høyere mengder VEGF som i sin tur førte til en forbedret effektivitet i iskemiske vevet46.

Dette manuskriptet presenterer en detaljert protokoll for selektiv utvinning og genteknologi av hDFSCs. For dette formålet beskrev vi høsting og enzymatiske fordøyelsen av menneskelig dental follicles og påfølgende isolering av hDFSCs. For å karakterisere isolert celler, har viktige instruksjoner for verifikasjon av MSC egenskaper blitt inkludert i henhold til veiledning av det internasjonale samfunnet for mobilnettet terapi13. I tillegg gir vi en detaljert beskrivelse for generering av miR-modifisert hDFSCs ved å bruke en kationisk lipid-baserte transfection strategi og evalueringen av hva effektivitet og cytotoksisitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

HDFSCs er isolert fra dental follikler av utdraget visdomstennene tilbys av Institutt for Oral og Maxillofacial plastikkirurgi i Rostock University Medical Center. Informert samtykke og skriftlig godkjennelse er Hentet fra alle pasienter. Denne studien ble godkjent av den lokale etikk av universitetet i Rostock (tillatelse No. A 2017-0158).

1. isolering av hDFSCs

Merk: For å hindre bakteriell forurensning, bør visdomstennene ikke være utbrudd før utvinning

  1. Utarbeidelse av nødvendige løsninger
    1. Forberede fosfat-bufret saltvann (PBS) / Penicillin-Streptomycin-glutamin (P-S-G) løsning: Bland 495 mL PBS med 5 mL P-S-G. Lagre dele 50 mL på 4 ° C.
    2. Forberede hDFSC kultur medium: Bland 445 mL basale middels med 5 mL av antibiotika agent og 50 mL av fetal bovin serum (FBS). Butikken på 4 ° C.
    3. Forberede Collagenase type jeg lager løsning (30 mg/mL): fortynne 300 mg Collagenase type I 10 mL av basale medium supplert med 1% antibiotika agent. Kraftig bland løsningen. Filtrere løsningen bruker filtere 0,2 µm. Lagre dele 500 µL av Collagenase skriver jeg lagerløsning ved 20 ° C.
    4. Forberede Dispase II lagerløsning (40 mg/mL): fortynne 40 mg Dispase II i 10 mL av basale medium supplert med 1% antibiotika agent. Kraftig bland løsningen. Filtrere løsningen bruker filtere 0,2 µm. Lagre dele 500 µL Dispase II lager løsning på 20 ° C.
  2. Kirurgisk prosedyre
    1. Injisere tilstrekkelig (maksimal: 2 mL) av lokal bedøvelse.
    2. Opprett og heve en tre sider mucoperiosteal klaff. Heve en flerspråklig klaff er ikke nødvendig.
    3. Beskytte det flerspråklige aspektet med en periostal heis.
    4. Forsiktig mill bukkal og distale Ben med en runde hard metal burr.
    5. Løsne vev av hårsekken med en periostal heis. Fjern forsiktig fullført tann (bakterie) og hårsekken ved å trekke ut kronen (og hårsekken) med bakre (tredje-molar) tang.
    6. Debride og vanne stikkontakten grundig med NaCl løsning.
    7. Erstatte mucoperiosteal klaff med vicryl suturer (se Tabell for materiale).
    8. Fjern tann hårsekken fra munnhulen og plassere dem i en aliquot 50 ml av PBS/P-S-G løsning.
      Merk: Prøven kan lagres på 4 ° C før videre behandling.
  3. Enzymatisk fordøyelsen av tann hårsekken
    1. Forvarm hDFSC kultur medium og PBS/P-S-G løsning til romtemperatur (RT).
    2. Tine en aliquot av hver Collagenase jeg og Dispase II lager løsninger. Forberede en fordøyelsen løsning av 3 mg/mL Collagenase type jeg og 4 mg/mL Dispase II ved å legge 500 µL av hver Collagenase type I og Dispase II lagerløsning til 4 mL av basale medium som inneholder 1% antibiotika agent.
    3. Plasserer utpakkede hårsekken i et sterilt Petriskål og legge 10 mL PBS/P-S-G løsning å vaske utdraget vevet. Repeter dette vaskemaskin to ganger.
    4. Hakke utdraget hårsekken til deler av ca 1 mm x 1 mm med sterilt skalpell i Petriskål inneholder 10 mL PBS/P-S-G løsning.
    5. Overføre hakket vev og PBS/P-S-G løsning fra Petriskål inn i et 50 mL konisk sentrifuge rør. Vask Petriskål med 10 mL PBS/P-S-G og overføre løsningen til samme rør.
    6. Sentrifuge konisk sentrifuge røret i 10 min 353 x g på RT og kast nedbryting.
    7. Legge til 5 mL av fordøyelsen løsning til pelleted vev. Bland forsiktig løsningen og vev. Inkuber blandingen på 37 ° C og 5% CO2 2 h i en risting inkubator.
    8. Sentrifuger fordøyd cellen/vev suspensjon 353 x g i 10 min på RT. Forkast nedbryting og re avbryte den fått pellet 6 mL av hDFSC kultur medium.
    9. Frø celle suspensjon i en 25 cm2 celle kultur kolbe og ruge cellene på 37 ° C, 5% CO2 og 20% O2.
      Merk: Hvis ikke helt blir fordøyd vev, overføre gjenværende vevet til celle kultur kolbe også.
    10. Endre medium nøye 24 timer etter celle seeding. Etterpå endre medium hver tre dager til confluency.
      Merk: HDFSCs bør være plast-tilhenger 24 timer etter celle såing og kan skilles fra ikke-tilhenger celler og blod komponenter ved å endre medium.
  4. Cellen høsting
    1. Forvarm hDFSC kultur medium, PBS/P-S-G løsning og Trypsin/Ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) løsning RT.
    2. Forkaste nedbryting fra kultur kolbe og vask confluent celler med 5 mL PBS/P-S-G.
    3. Legg 1 mL av Trypsin/EDTA løsning til kultur kolbe og ruge i 3 minutter på 37 ° C. Stopp fordøyelsen prosessen ved å legge til 3 mL hDFSC kultur medium kultur kolbe.
    4. Overføre celle suspensjon i en 15 mL konisk sentrifuge rør og sentrifuge suspensjon i 10 min 353 x g på RT. Forkast nedbryting og å suspendere pellet i en passende mengde hDFSC kultur medium.
    5. Telle celler: Bland forsiktig 10 µL av cellen suspensjon med 10 µL Trypan blå løsning. Bruk 10 µL inn en teller kammeret og regne ut hvor hDFSC celle.

2. karakterisering av hDFSCs

  1. Immunophenotyping
    1. Utarbeidelse av celler for flyt cytometric analyse
      1. Utarbeidelse av nødvendige løsninger
        1. Forberede PBS/EDTA (2 mM): Bland 996 mL PBS med 4 mL av EDTA (0,5 M).
        2. Forberede flekker buffer: Bland 995 mL PBS/EDTA (2 mM) med 5 g av BSA. Filtrere løsningen ved å benytte en 0.22 µm filter enhet og lagre på 4 ° C før bruk.
        3. Forberede paraformaldehyde (PFA) lagerløsning (4%): fortynne 4 g PFA i 100 mL PBS og varme løsningen på 80 ° C. Bland løsningen og justere pH verdien til 7.3. Aliquot fikk PFA løsning i respektive beløp (1,5 mL) og butikk på 20 ° C før bruk.
          Advarsel: Fordi PFA gasser er giftige, forberede PFA løsningen i ventilert avtrekksvifte.
      2. Etter cellen høsting (1.4), overføre 14 eksempler på 5 x 104 celler til 1,5 mL microcentrifuge rør. Sentrifuge suspensjoner på 300 x g i 10 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
        Merk: Utfør følgende arbeid i et ganske skyggefulle rom. Holde celler og reagenser på is ikke annet er angitt.
      3. Nytt suspendere celler i visse mengder flekker buffer (4 ° C) og legge FcR blokkerer reagens (4 ° C) som vist i tabell 1.
      4. Legg til følgende antistoffer på innsiden av respektive prøven som vist i tabell 1: Allophycocyanin (APC) musen anti-menneskelige CD29; APC musen IgG1 κ isotype kontroll; Peridinin-klorofyll protein (PerCP)-Cyanine5.5 mus anti-menneskelige CD44; PerCP-Cyanine5.5 mus IgG2b κ isotype kontroll; V500 musen anti-menneskelige CD45; V500 musen IgG1 κ isotype kontroll; Phycoerythrin (PE) musen anti-menneskelige CD73; PE musen IgG1 κ isotype kontroll; PerCP-Cyanine5.5 mus anti-menneskelige CD90; PerCP-Cyanine5.5 mus IgG1 κ isotype kontroll; mus anti-human CD105: Alexa Fluor (AF) 488; IgG1 negative musekontrollen: AF488; PE-Cyanine7 mus anti-menneskelige CD117; PE-Cyanine7 mus IgG1, κ isotype kontroll. Etter antistoffer er lagt til hver prøve, Nedspinning antistoffer og bland forsiktig. Inkuber løsninger for 10 min på 4 ° C.
      5. Legg 1 mL av PBS (4 ° C) og sentrifuge prøvene på 300 x g i 10 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
      6. Nytt suspendere celler i 100 µL av PBS (4 ° C) og legge til 33 µL av PFA (4%). Bland løsninger og lagre på isen eller i 4 ° C til flyt cytometric analyse.
    2. Måling av cytometric celler
      Merk: Utfør følgende arbeid i et ganske skyggefulle rom. Holde celler på is til mål.
      1. For å undersøke uttrykk for overflate antigener, overfører du prøver til rør egnet for flyt cytometric målinger.
      2. Måle minst 2 x 104 hendelser ved hjelp av en flow cytometer. Analysere som avbildet i figur 2.
  2. Multipotent differensiering potensialet i hDFSCs
    1. Bruke en kommersielt tilgjengelig menneskelige Mesenchymal stamceller funksjonelle identifikasjon Kit for å bekrefte adipogenic, osteogenic og chondrogenic differensiering potensialet i hDFSCs. Bruke esel anti-geit AF488 sekundære antistoff til farging av fettsyrer bindende protein 4 (FABP4) og aggrecan samt esel anti-musen AF488 sekundære antistoff til farging av osteocalcin. Flekker av kjerner, bruke montering medium med 4', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI).
      Merk: Forberede prøver uten primære antistoff som negative kontroller mikroskopiske analyser.
    2. Analysere uttrykk for proteiner ved bruk av laser AC confocal mikroskopi. Mikroskopi innstillinger: 40 x målet med oljeneddyp; eksitasjon laser 488 nm (for AF488) og 405 nm (for DAPI).

3. hva av hDFSCs

  1. Etter cellen høsting (1.4), frø hDFSCs på en 24-vel celle kultur plate 24 timer før transfection.
    Merk: Starte cellen tetthet er ca 4 x 104 celler per brønn. Cellene skal nå ~ 80% samløpet dag transfection.
    Merk: Frø ett ekstra celle utvalg som kontroll for flyt cytometric analyse.
  2. Utarbeidelse av transfection komplekser
    Merk: For å hindre forurensning fra RNases, rengjør du arbeidsområdet direkte før utarbeidelse av transfection komplekser bruker RNase dekontaminering løsning. Bruk bare RNase-fritt materiale og løsninger.
    Merk: Utfør følgende arbeid i et ganske skyggefulle rom.
    1. Forberede miR lagerløsning (50 µM): nytt suspendere Cy3-merket forløper miR (5 nmol) i 100 µL nuclease-fritt vann. Aliquot fikk miR lagerløsning i respektive mengder (5 µL) og butikken i mørket på 20 ° C før bruk.
    2. Fortynne 40 pmol av miR (0,8 µL av 50 µM miR lager løsningen) i 66.7 µL av redusert serum medium. Bland løsningen forsiktig
    3. Fortynn 0.67 µL av kationisk lipid-baserte transfection reagensen i 66.7 µL av redusert serum medium. Bland løsningen forsiktig og Inkuber i 5 min på RT.
    4. Etter inkubasjon Legg pre utvannet transfection reagensen til den pre utvannet miR. Bland løsningen forsiktig og Inkuber i 15 min på RT.
  3. Legg forberedt transfection komplekser dropwise direkte til kultur medium på celler. Bland forsiktig av rocking 24-vel celle kultur plate og tilbake.
  4. Inkuber cellene på 37 ° C, 5% CO2og 20% O2 for 24 timer.

4. analyse av hva

Merk: Utfør følgende arbeid i et ganske skyggefulle rom.

  1. Cellen høsting etter hva
    Merk: Samle alle cellen løsninger av en prøve i samme 15 mL konisk sentrifuge rør.
    1. 24 timer etter transfection, samle nedbryting av prøver i respektive sentrifuge rør.
    2. Vask celler med 1 mL av PBS, overføre PBS inn i respektive sentrifuge røret og legge 500 µL Trypsin/EDTA (RT) celler. Inkuber løsninger for 3 min på 37 ° C.
    3. Stoppe trypsinization ved å legge til 1 mL av kultur medium (RT) til cellene og overføring løsningen til respektive sentrifuge røret. Sentrifuger cellene på 300 x g i 10 min på 4 ° C.
      Merk: Fra denne tiden, holde celler og reagenser på is ikke annet er angitt.
  2. Utarbeidelse av celler for flyt cytometric analyse
    1. Kast nedbryting. Nytt suspendere celler i 100 µL av flekker buffer (4 ° C) og overføring cell løsningen slik 1,5 mL microcentrifuge.
    2. Legg til 0,5 µL av Amin reaktive dye prøvene for å skille mellom levende og døde celler. Forsiktig bland løsningen og ruge i 10 min på 4 ° C.
    3. Legge til 1 mL av PBS (4 ° C) celler og sentrifuge på 300 x g for 10 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
    4. Nytt suspendere celler i 100 µL av PBS (4 ° C) og legge til 33 µL av PFA (4%). Bland løsninger og lagre på isen eller i 4 ° C til flyt cytometric analyse.
  3. Måling av cytometric celler
    Merk: Utfør følgende arbeid i et ganske skyggefulle rom. Holde celler på is til mål.
    1. Overføre prøver til rør egnet for flyt cytometric målinger.
    2. Undersøke celle levedyktighet og miR opptak effektivitet ved hjelp av en flow cytometer. Måle minst 2 x 104 hendelser. Bruke den gating avbildet i Figur 4.
      Merk: Bruk untransfected celler som negativ kontroll ordne gating for Cy3 positive celler og beregne celledød skyldes transfection.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her presenterer vi en detaljert isolasjon instruksjon å høste hDFSCs fra menneskelige dental hårsekken vev. På grunn av den lette tilgangen til dental hårsekken under rutinemessig kirurgi er det en lovende kilde for utvinning av voksne stamceller.

Den isolerte hDFSCs viste alle kjennetegn på definisjonen av MSCs13. Faktisk celler var plast-tilhenger under beskrevet oppdrettsforholdene og vist en fibroblast-lignende morfologi (figur 1). Flow cytometric analyser avslørte at hDFSCs uttrykt et panel av visse overflaten antigener, inkludert CD29, CD44, CD73, CD90 og CD105, mens CD45 og CD117 var fraværende (figur 2). Videre, den adipogenic, osteogenic og chondrogenic differensiering potensialet i celler under spesifikke i vitro kultur betingelser ble bekreftet av immunostai-fettsyrer bindende protein 4 (FABP4), osteocalcin og aggrecan (Figur 3).

Beskrevet kationisk lipid-baserte transfection strategien aktivert effektive transient genmodifisering av hDFSCs med en miR-opptak ~ 100% levedyktige cellers 24 timer etter transfection (figur 4B). Videre transfekterte (figur 4A) og untransfected (figur 4C) prøver viste sammenlignbar mengder døde celler beviser mild celle prosessforhold.

Figure 1
Figur 1: representant lys mikroskop-bilde av hDFSCs. Celler viser en fibroblast-lignende morfologi under standard kultur forhold.

Figure 2
Figur 2: representant flyt cytometric immunophenotyping av hDFSCs. Flow cytometric analyse av cellene etter farging for bestemt celle overflate markører (blå). Tilsvarende isotype kontrollene ble brukt som negative kontroller (grå). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: representant bekreftelse av adipogenic, osteogenic og chondrogenic differensiering potensialet i hDFSCs. Etter differensiering, ble adipocytter, osteocytes og chondrocytes identifisert av immunostai-(A) fettsyrer bindende protein 4 (FABP4) (grønn), (B) osteocalcin (grønn) og (C) aggrecan (grønn). Kjerner var farget med DAPI (blå). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: representant gating strategi for analyse av transfection. Skjematisk fremstilling av gating strategi anvendt for kvantifisering av (A) cytotoksisitet (blå: døde celler) og (B) Cy3-merket miR opptak effektivitet (rød: Cy3+ celler) 24 timer etter hva. Untransfected celler (C,D) ble brukt som kontroll.

MAC FcR Antistoffer [µL] Isotype kontroller [µL]
Eksempel buffer blokkerer CD29 CD44 CD45 CD73 CD90 CD105 CD117 APC PerCP-Cy5.5 V500 PE PerCP-Cy5.5 AF488 PE-Cy7
[µl] reagens [µl] APC PerCP-Cy5.5 V500 PE PerCP-Cy5.5 AF488 PE-Cy7 IgG1 IgG2b IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1
1 30 10 10
2 37,5 10 2.5
3 37,5 10 2.5
4 30 10 10
5 35 10 5
6 35 10 5
7 37,5 10 2.5
8 30 10 10
9 30 10 10
10 37,5 10 2.5
11 30 10 10
12 40 10 10
13 30 10 5
14 37,5 10 2.5

Tabell 1: Pipettering oppsett for immunophenotyping av hDFSCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Voksen stilk celler er i fokus for behandling av flere degenerative sykdommer. Spesielt bein margtransplantasjon (BM)-avledet stilk celler, inkludert blodkreft stamceller (HSCs) og MSCs, er under intens klinisk undersøkelse47. Men BM høsting er en invasiv prosedyre forårsaker smerte på stedet av donasjon og kan føre til uønskede hendelser48. Postnatal dental vevet har nylig dukket opp som en roman og lett tilgjengelig kilde til stamceller. Disse dental stamceller ble vist å møte alle MSC egenskaper og viste høyere spredning kapasitet som BM-avledet stilk celler49. Her presentert vi en detaljert protokoll for uttak, karakteristikk og utvikling av hDFSCs.

Beskrevet isolasjon prosedyren er utviklet på menneskelig dental follikler påvirket visdom tennene, som dette vevet er vanligvis pakket ut og solgt som medisinsk avfall19. Likevel kan andre dental vev, inkludert tannlegekontoret masse50,51, periodontal ligament52, skrubbet løvfellende tenner53og rot apikale papilla54, benyttes for utvinning av dental stilk celler.

Genteknologi av stamceller ved å sette inn miRs er en ny strategi å overvinne visse problemer i stilk cellen-basert behandling, for eksempel lav stamcelleforskningen overlevelse43,55,56,57. Denne protokollen presentert avgjørende instruksjoner for effektiv innføring av syntetiske miR i hDFSCs ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig kationisk lipid-baserte transfection reagens. Anvendelse av kationisk liposomal formuleringer for levering av terapeutiske reagenser, som narkotika og atomer syren, har blitt undersøkt i mange kliniske studier58,59. Men er kationisk liposomer potensielt cytotoksiske i en doseavhengig måte av forårsaker f.eks, skade integriteten av cellemembranen eller endringer i gene expression59,60,61 . Derfor må spesiell oppmerksomhet betales til toksiske effekter på celler av hva.

Spesielt er angitt transfection forhold optimalisert for miR-mediert genmodifisering av hDFSCs effektiviteten og cytotoksisitet. Likevel vist andre studier den vellykkete anvendelsen av denne transfection reagensen for levering av flere atomer syren, inkludert plasmider DNA, mRNA og siRNA, i ulike celle typer62,63, 64 , 65 , 66 , 67 , 68. resultatene av disse studiene viste at ideelle levering forhold variert betydelig og defineres for hver celle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av FORUN programmet i Rostock medisinske sentrum (889018) og fuktig Foundation (2016-11). I tillegg PM RD støttes av BMBF (VIP + 00240).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488 Bio-Rad MCA1557A488 Clone SN6, monoclonal
Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488 Bio-Rad MCA928A488 monoclonal
APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody BD Biosciences 559883 Clone MAR4, monoclonal
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 555751 Clone MOPC-21, monoclonal
PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody BD Biosciences 550257 Clone AD2, monoclonal
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 555749 Clone MOPC-21, monoclonal
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody BD Biosciences 339217 Clone 104D2, monoclonal
PE-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 557872 Clone MOPC-21, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody BD Biosciences 560531 Clone G44-26, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 558304 Clone 27-35, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90 Antibody BD Biosciences 561557 Clone 5E10, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 55095 Clone MOPC-21, monoclonal
V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody BD Biosciences 560777 Clone HI30, monoclonal
V500 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 560787 Clone X40, monoclonal
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec 130-059-901
UltraPure EDTA Thermo Fisher Scientific 15575-020 0.5M, pH 8.0
Steritop Merck Millipore SCGPT05RE 0.22 µm, radio-sterilized, polyethersulfone
BSA Sigma-Aldrich A7906
PFA Merck Millipore 1040051000
Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit R&D Systems SC006
RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution Thermo Fisher Scientific AM9780
Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 Thermo Fisher Scientific AM17120 5 nmol
Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 Thermo Fisher Scientific AM17110 5 nmol
Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11055 polyclonal
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21202 polyclonal
Mounting medium; Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057-20ML histology mounting medium
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope Zeiss
BD FACS LSRII flow cytometer BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2 BD Biosciences
ZEN2011 software Zeiss
Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%) Biochrom L2143 in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+
Amine reactive dye; LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
PBS (1x) Thermo Fisher Scientific 10010023 pH: 7.4; w/o: Ca and Mg
P-S-G (100x) Thermo Fisher Scientific 10378016
Basal medium; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 Thermo Fisher Scientific 11039021
Antibiotic, ZellShield Biochrom W 13-0050
FBS Thermo Fisher Scientific 10500064
Collagenase type I Thermo Fisher Scientific 17100017
Dispase II Thermo Fisher Scientific 17105041
Filter, Sterifix syringe filter 0.2 µm Braun 4099206
50 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62,547,254
15 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62,554,502
Cell culture flask 75 cm2 Sarstedt 833,910,002
Cell culture flask, 25 cm2 Sarstedt 833,911,002
Freezing medium, Biofreeze Biochrom F 2270
Cryotubes Thermo Fisher Scientific 377267 1.8 mL
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154 0.4 %
Counting chamber Paul Marienfeld
Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001% Mibe
NaCl solution Braun 0.9 %
Vicryl satures, Vicryl rapide Ethicon 3 - 0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: Applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839-851 (2015).
  2. Lima, R. L., et al. Human dental follicle cells express embryonic, mesenchymal and neural stem cells markers. Archives of oral biology. 73, 121-128 (2017).
  3. Wise, G. E. Cellular and molecular basis of tooth eruption. Orthodontics & craniofacial research. 12 (2), 67-73 (2009).
  4. Baykul, T., Saglam, A. A., Aydin, U., Başak, K. Incidence of cystic changes in radiographically normal impacted lower third molar follicles. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 99 (5), 542-545 (2005).
  5. Wise, G. E., Frazier-Bowers, S., D'Souza, R. N. Cellular, molecular, and genetic determinants of tooth eruption. Critical reviews in oral biology and medicine : an official publication of the American Association of Oral Biologists. 13 (4), 323-334 (2002).
  6. Ten Cate, A. R. The development of the periodontium: A largely ectomesenchymally derived unit. Periodontology 2000. 13 (1), 9-19 (1997).
  7. Park, B. -W., et al. In vitro and in vivo osteogenesis of human mesenchymal stem cells derived from skin, bone marrow and dental follicle tissues. Differentiation; research in biological diversity. 83 (5), 249-259 (2012).
  8. Sowmya, S., et al. Periodontal Specific Differentiation of Dental Follicle Stem Cells into Osteoblast, Fibroblast, and Cementoblast. Tissue engineering. Part C, Methods. 21 (10), 1044-1058 (2015).
  9. Kémoun, P., et al. Human dental follicle cells acquire cementoblast features under stimulation by BMP-2/-7 and enamel matrix derivatives (EMD) in vitro. Cell and tissue research. 329 (2), 283-294 (2007).
  10. Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
  11. Hieke, C., et al. Human dental stem cells suppress PMN activity after infection with the periodontopathogens Prevotella intermedia and Tannerella forsythia. Scientific reports. 6, 39096 (2016).
  12. Kumar, A., et al. Molecular spectrum of secretome regulates the relative hepatogenic potential of mesenchymal stem cells from bone marrow and dental tissue. Scientific reports. 7 (1), 15015 (2017).
  13. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  14. Ullah, I., et al. In vitro comparative analysis of human dental stem cells from a single donor and its neuronal differentiation potential evaluated by electrophysiology. Life sciences. 154, 39-51 (2016).
  15. Völlner, F., Ernst, W., Driemel, O., Morsczeck, C. A two-step strategy for neuronal differentiation in vitro of human dental follicle cells. Differentiation; research in biological diversity. 77 (5), 433-441 (2009).
  16. Morsczeck, C., et al. Comparison of human dental follicle cells (DFCs) and stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) after neural differentiation in vitro. Clinical oral investigations. 14 (4), 433-440 (2010).
  17. Kadar, K., et al. Differentiation potential of stem cells from human dental origin - promise for tissue engineering. Journal of physiology and pharmacology: An official journal of the Polish Physiological Society. 60, Suppl 7. 167-175 (2009).
  18. Heng, B. C., et al. Decellularized Matrix Derived from Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells Enhances the Neurogenic Potential of Dental Follicle Stem Cells. Journal of endodontics. 43 (3), 409-416 (2017).
  19. Honda, M. J., Imaizumi, M., Tsuchiya, S., Morsczeck, C. Dental follicle stem cells and tissue engineering. Journal of Oral Science. 52 (4), 541-552 (2010).
  20. Liu, J., et al. Concise reviews: Characteristics and potential applications of human dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Stem cells. 33 (3), Dayton, Ohio. 627-638 (2015).
  21. Morsczeck, C., Reichert, T. E. Dental stem cells in tooth regeneration and repair in the future. Expert opinion on biological therapy. 18 (2), 187-196 (2018).
  22. Rezai-Rad, M., et al. Evaluation of bone regeneration potential of dental follicle stem cells for treatment of craniofacial defects. Cytotherapy. 17 (11), 1572-1581 (2015).
  23. Handa, K., et al. Progenitor Cells From Dental Follicle Are Able to Form Cementum Matrix In Vivo. Connective Tissue Research. (2-3), 406-408 (2009).
  24. Tsuchiya, S., Ohshima, S., Yamakoshi, Y., Simmer, J. P., Honda, M. J. Osteogenic Differentiation Capacity of Porcine Dental Follicle Progenitor Cells. Connective Tissue Research. 51 (3), 197-207 (2010).
  25. Honda, M. J., et al. Stem cells isolated from human dental follicles have osteogenic potential. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 111 (6), 700-708 (2011).
  26. Guo, W., et al. Dental follicle cells and treated dentin matrix scaffold for tissue engineering the tooth root. Biomaterials. 33 (5), 1291-1302 (2012).
  27. Yang, B., et al. Tooth root regeneration using dental follicle cell sheets in combination with a dentin matrix - based scaffold. Biomaterials. 33 (8), 2449-2461 (2012).
  28. Bai, Y., et al. Cementum- and periodontal ligament-like tissue formation by dental follicle cell sheets co-cultured with Hertwig's epithelial root sheath cells. Bone. 48 (6), 1417-1426 (2011).
  29. Guo, S., et al. Comparative study of human dental follicle cell sheets and periodontal ligament cell sheets for periodontal tissue regeneration. Cell transplantation. 22 (6), 1061-1073 (2013).
  30. Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC biotechnology. 15, 114 (2015).
  31. Li, X., et al. A therapeutic strategy for spinal cord defect: Human dental follicle cells combined with aligned PCL/PLGA electrospun material. BioMed research international. , 197183 (2015).
  32. Yang, C., Li, X., Sun, L., Guo, W., Tian, W. Potential of human dental stem cells in repairing the complete transection of rat spinal cord. Journal of neural engineering. 14 (2), 26005 (2017).
  33. Kanao, S., et al. Capacity of Human Dental Follicle Cells to Differentiate into Neural Cells In Vitro. Stem Cells International. 2017, 8371326 (2017).
  34. Sung, I. -Y., et al. Cardiomyogenic Differentiation of Human Dental Follicle-derived Stem Cells by Suberoylanilide Hydroxamic Acid and Their In Vivo Homing Property. International journal of medical sciences. 13 (11), 841-852 (2016).
  35. Botelho, J., Cavacas, M. A., Machado, V., Mendes, J. J. Dental stem cells: Recent progresses in tissue engineering and regenerative medicine. Annals of medicine. 49 (8), 644-651 (2017).
  36. Dou, L., et al. Secretome profiles of immortalized dental follicle cells using iTRAQ-based proteomic analysis. Scientific reports. 7 (1), 7300 (2017).
  37. Lee, S., Choi, E., Cha, M. -J., Hwang, K. -C. Cell adhesion and long-term survival of transplanted mesenchymal stem cells: A prerequisite for cell therapy. Oxidative medicine and cellular longevity. 2015, 632902 (2015).
  38. Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Recent Progress in Stem Cell Modification for Cardiac Regeneration. Stem Cells International. 2018 (2), 1-22 (2018).
  39. Nowakowski, A., Walczak, P., Janowski, M., Lukomska, B. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells for Regenerative Medicine. Stem cells and development. 24 (19), 2219-2242 (2015).
  40. Nowakowski, A., Walczak, P., Lukomska, B., Janowski, M. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells to Induce Their Migration and Survival. Stem Cells International. 2016, 4956063 (2016).
  41. Gulluoglu, S., Tuysuz, E. C., Bayrak, O. F. miRNA Regulation in Dental Stem Cells: From Development to Terminal Differentiation. Dental Stem Cells. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. #350;ahin, F., Doğan, A., Demirci, S. , Springer International Publishing. (2016).
  42. Hammond, S. M. An overview of microRNAs. Advanced drug delivery reviews. 87, 3-14 (2015).
  43. Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular research. 93 (4), 614-622 (2012).
  44. Clark, E. A., Kalomoiris, S., Nolta, J. A., Fierro, F. A. Concise Review: MicroRNA Function in Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. Stem cells. 32 (5), 1074-1082 (2014).
  45. Dakhlallah, D., et al. MicroRNA-133a engineered mesenchymal stem cells augment cardiac function and cell survival in the infarct heart. Journal of cardiovascular pharmacology. 65 (3), 241-251 (2015).
  46. Seo, H. -H., et al. Exogenous miRNA-146a Enhances the Therapeutic Efficacy of Human Mesenchymal Stem Cells by Increasing Vascular Endothelial Growth Factor Secretion in the Ischemia/Reperfusion-Injured Heart. Journal of vascular research. 54 (2), 100-108 (2017).
  47. Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell stem cell. 17 (1), 11-22 (2015).
  48. Siddiq, S., et al. Bone marrow harvest versus peripheral stem cell collection for haemopoietic stem cell donation in healthy donors. The Cochrane database of systematic reviews. (1), CD006406 (2009).
  49. Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B. Dental-Related Stem Cells and Their Potential in Regenerative Medicine. Regenerative Medicine and Tissue Engineering. Andrades, J. A. , InTech. (2013).
  50. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  51. Honda, M. J., et al. Side population cells expressing ABCG2 in human adult dental pulp tissue. International endodontic journal. 40 (12), 949-958 (2007).
  52. Seo, B. -M., et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. The Lancet. 364 (9429), 149-155 (2004).
  53. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  54. Sonoyama, W., et al. Characterization of the apical papilla and its residing stem cells from human immature permanent teeth: a pilot study. Journal of endodontics. 34 (2), 166-171 (2008).
  55. Nollet, E., Hoymans, V. Y., van Craenenbroeck, A. H., Vrints, C. J., van Craenenbroeck, E. M. Improving stem cell therapy in cardiovascular diseases: the potential role of microRNA. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 311 (1), H207-H218 (2016).
  56. Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761 (2016).
  57. Schade, A., et al. Magnetic Nanoparticle Based Nonviral MicroRNA Delivery into Freshly Isolated CD105(+) hMSCs. Stem cells international. 2014, 197154 (2014).
  58. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
  59. Xue, H. Y., Liu, S., Wong, H. L. Nanotoxicity: a key obstacle to clinical translation of siRNA-based nanomedicine. Nanomedicine. 9 (2), London, England. 295-312 (2014).
  60. Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological & pharmaceutical bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
  61. Omidi, Y., Barar, J., Akhtar, S. Toxicogenomics of cationic lipid-based vectors for gene therapy: impact of microarray technology. Current drug delivery. 2 (4), 429-441 (2005).
  62. Hausburg, F., et al. Defining optimized properties of modified mRNA to enhance virus- and DNA- independent protein expression in adult stem cells and fibroblasts. Cellular physiology and biochemistry: International journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 35 (4), 1360-1371 (2015).
  63. Cardarelli, F., et al. The intracellular trafficking mechanism of Lipofectamine-based transfection reagents and its implication for gene delivery. Scientific reports. 6, 25879 (2016).
  64. Kirschman, J. L., et al. Characterizing exogenous mRNA delivery, trafficking, cytoplasmic release and RNA-protein correlations at the level of single cells. Nucleic acids research. 45 (12), e113 (2017).
  65. Li, L., Nie, Y., Ye, D., Cai, G. An easy protocol for on-chip transfection of COS-7 cells with a cationic lipid-based reagent. Lab on a chip. 9 (15), 2230-2233 (2009).
  66. Chang, K., Marran, K., Valentine, A., Hannon, G. J. RNAi in cultured mammalian cells using synthetic siRNAs. Cold Spring Harbor protocols. 2012 (9), 957-961 (2012).
  67. Sakurai, K., Chomchan, P., Rossi, J. J. Silencing of gene expression in cultured cells using small interfering RNAs. Current protocols in cell biology. , Chapter 27, Unit 27.1.1-28 (2010).
  68. Hoelters, J., et al. Nonviral genetic modification mediates effective transgene expression and functional RNA interference in human mesenchymal stem cells. The journal of gene medicine. 7 (6), 718-728 (2005).

Tags

Genetikk problemet 141 Stamcelle dental hårsekken stilk cellen mesenchymal stamceller ikke-viral modifisering genteknologi forbigående transfection microRNA
Isolering og karakterisering MicroRNA-baserte genetisk modifisering av menneskelig Dental hårsekken stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Müller, P., Ekat, K.,… More

Müller, P., Ekat, K., Brosemann, A., Köntges, A., David, R., Lang, H. Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells. J. Vis. Exp. (141), e58089, doi:10.3791/58089 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter