Summary
Здесь мы описываем в situ гибридизация assay который позволяет чувствительной и конкретных обнаружения последовательностей как короче 50 нуклеотидов с единого нуклеотидом резолюции на уровне одной ячейки. Анализа, который может выполняться автоматически или вручную, можно включить визуализация сращивания варианты, коротких последовательностей и мутации в контексте ткани.
Abstract
Поскольку точность медицина сильно зависит от точного обнаружения биомаркеров, существует растущая потребность стандартизированных и надежные технологии, которые измеряют РНК биомаркеров в situ в клинических образцах. В то время как grind и bind анализов, как RNAseq и количественного RT-PCR включение высокочувствительный ген выражение измерения, они также требуют РНК добыча и тем самым предотвратить ценные выражение анализа в контексте морфологических ткани. В situ гибридизация (ISH) пробирного описанных здесь можно обнаружить РНК последовательности как короче 50 нуклеотидов в резолюции единого нуклеотидом и на уровне одной ячейки. Этот assay дополняет ранее разработанной коммерческих пробирного и позволяет чувствительной и конкретных на месте обнаружения сращивания варианты, короткие цели и точечные мутации в ткани. В этом протоколе зонды были разработаны для целевых уникальных экзона развязок для двух вариантов клинически важные соединения, EGFRvIII и METΔ14. Обнаружение короткие последовательности была продемонстрирована конкретного обнаружения последовательностей CDR3 Т-клеточных рецепторов α и β в строке Jurkat Т-клеток. Также показана полезность этот assay ISH для различения РНК последовательности в резолюции (точечные мутации) единого нуклеотидом через визуализацию EGFR L858R и КАРСТЕ G12A единого нуклеотидом вариации в клеточных линий, с помощью автоматизированных пятнать платформы. Таким образом протокол показывает специализированных РНК ISH assay, который позволяет обнаружение сращивания вариантов, коротких последовательностей, и мутации в situ для ручной работы и на автоматизированных stainers.
Introduction
Высок объём транскриптомики технологии, такие как microarrays и следующего поколения РНК последовательности (RNAseq) экспоненциально повысили открытия биомаркеров РНК с диагностические, прогностические и прогнозирования клиническое значение для различных заболеваний, в том числе Рак1,2. Чтобы продвинуть использование этих биомаркеров в точности медицины, есть высокая потребность в стандартизированной и надежные технологии, которые можно измерить РНК биомаркеров в контексте клинических образцов ткани. Хотя широко grind и bind анализы как RNAseq и количественного RT-PCR включение высокочувствительный ген выражение измерения, требуемые ткани гомогенизации и РНК изоляции подразумевают потери в естественных условиях специфики камерного типа и Морфологическая информация3. Обычные в situ РНК методологиях обнаружения отсутствие чувствительности и специфичности, необходимые для надежного измерения редких или низкий выражая биомаркеров РНК в контексте ткани4.
Коммерческая в situ гибридизация (ISH) пробирного (например., проба RNAscope) является одной из технологий, которая имеет решить эти проблемы, а также позволяет весьма деликатного и конкретных визуализации одной молекулы РНК, больше чем 300 нуклеотидов в контексте морфологических ткани. Этот тип анализа использует уникальный олигонуклеотида зонд дизайн примерно 6 – 20 двойной Z зонд пар в сочетании с усиления передовые на основе гибридизации сигнала5.
Это исследование описывает специализированных пробирного РНК ISH, BaseScope, в дополнение к ранее конструированного коммерческие технологии, которая может обнаружить РНК последовательности как короче 50 нуклеотидов в единичных нуклеотидных резолюции. Этот assay рассматриваются сложные сложности транскриптом и применима для точного обнаружения экзона развязок, короткие последовательности и точечные мутации в контексте ткани (Таблица 1), с помощью одной двойной Z зонд пары. Этот доклад свидетельствует протокол assay полный и его использование в обнаружении сращивания вариантов, CDR3 последовательности для Т-клеточный рецептор клонов, и единого нуклеотидом мутации в FFPE клеточной линии и опухолевых тканей.
Protocol
Человека опухоли образцы, используемые в данном исследовании были deidentified и приобрела из коммерческих источников в соответствии с местными этические руководящие принципы для исследований человеческого.
1. образец, оборудование и подготовка реагента
-
Подготовка образца FFPE
- Ткани
- Сразу после вскрытия, исправить ткани (нарезать блоки 3-4 мм в толщину) в 10% буферизацией нейтрального формалина (NBF) для 16-32 ч при комнатной температуре (RT).
Примечание: Время фиксации будет варьироваться в зависимости от типа ткани и размер. - Вымойте образца с 1 x фосфат амортизированное saline (PBS) и обезвоживанию, с помощью ряда стандартных этанола (EtOH) (70% EtOH за 30-60 мин, 80% EtOH за 30-60 мин, 90% EtOH для 30 – 60 минут, 95% EtOH за 30-60 мин, 3 x 100% для EtOH 30-60 мин) следуют ксилол.
- Внедрить образца в парафин, используя стандартные процедуры6 и обрезать парафиновых блоков при необходимости для удаления избыточных парафина.
Примечание: Размер блока будет варьироваться в зависимости от размера выборки ткани, но типичный размер – 0.75 x 0,75 дюйма2 или меньше.
- Сразу после вскрытия, исправить ткани (нарезать блоки 3-4 мм в толщину) в 10% буферизацией нейтрального формалина (NBF) для 16-32 ч при комнатной температуре (RT).
- Линии клетки
- Собирать и Пелле клетки согласно Рекомендуемые методы для конкретной ячейки строки.
- Исправьте клетки в 10% формальдегида на RT для 24 h на ротатора.
- Подготовка клетки как гранулы в подогретую обработки гель (например., Histogel). Разрешить Пелле затвердеть, поместив гель клеточной гранул на кусок парафина на льду и пусть сидят на 2 – 3 мин Submerge гель клеточной Пелле в однократном ПБС.
- Обезвоживанию и вставлять ячейки гранулы, как описано в шаге 1.1.1.
- В разделе Подготовка
- Нарезать 5 ± 1 мкм разделы, используя микротом встроенных ткани/клетки, смонтировать разделы на слайдах электростатически клей стекла и просушите их на ночь на RT.
Примечание: Слайды могут храниться на RT под высыхания до 3-х месяцев. - Место слайды в стойку слайд и выпекать навесные ткани слайды в циркулирующего воздуха печи при 60 ° C для 1 h перед выполнением assay.
Примечание: Используйте слайды сразу или хранить их в RT с сиккативов на срок до 1 недели. Длительного хранения может привести к деградации РНК.
- Нарезать 5 ± 1 мкм разделы, используя микротом встроенных ткани/клетки, смонтировать разделы на слайдах электростатически клей стекла и просушите их на ночь на RT.
- Ткани
-
Подготовка оборудования
- Установить печь гибридизации до 40 ° C. Тщательно мокрой увлажнения бумаги и удалите любые остаточные dH2O. Вставьте бумагу в лоток контроля влажности и Вставьте лоток в печь гибридизации prewarm по крайней мере 30 минут перед использованием.
-
Подготовка реагента
- Заполнить два очистки агента блюда с 200 мл ксилол и заполнить два окрашивание блюда с 200 мл 100% EtOH, который будет использоваться для депарафинизации секций.
- Подготовка 200 mL реагента коммерчески доступных 1 x целевой поиск путем добавления 180 мл dH2O 20 мл 10 x цели получения реагента. Место два слайд Держатели в пароварку. Заполнить один слайд держатель с 200 мл 1 x цели получения реагента и заполнить другой слайд держатель с 200 мл dH2O. тепла оба решения до кипения, используя пароварку.
- Подогретую буфера мытья теплой 50 x до 40 ° C на 10 – 20 мин подготовить 3 L 1 x мыть буфера путем разбавления 60 мл 50 x мыть буфер с 2,94 Л dH2O.
- В Зонта Подготовьте 50% Гилл гематоксилином counterstaining решение, добавив гематоксилином Гилл в 100 мл до 100 мл dH2O. В Зонта Подготовьте воронение реагента (0,02% (w/v) аммиачная вода), добавив 1,43 мл гидроксида аммония 28 – 30% в 250 мл dH2O.
- Prewarm целевой зондов при 40 ° C за 10 мин до зонд гибридизации и принести RT. усилительных реагентов (AMP 0-6)
2. РНК в Situ гибридизация Assay
-
Депарафинизации и обезвоживания
- После выпечки, как описано в шаге 1.1.3.2 (необязательный остановочный пункт 1), deparaffinize разделы в ксилоле на 5 мин с агитации. Deparaffinize снова в свежих ксилол для 5 минут Dehydrate в 100% EtOH на 2 мин с агитация и повторять снова в свежих 100% EtOH на 2 мин.
- Воздух сухой слайды для 5 мин при 60 ° C в циркулирующего воздуха печи или на RT до тех пор, пока они полностью сухой (необязательный остановочный пункт 2).
-
Образец взрывоопасностью
- Инкубируйте секции с ~ 4 капель перекиси водорода готовых к использованию для 10 мин на RT для утоления активности эндогенной пероксидазы. Декантируют раствор из слайдов и промойте их дважды dH2O.
- Инкубируйте секции с 200 мл реагента целевого поиска для 15 – 30 мин при температуре 100 ° C в пароварку.
Примечание: Время инкубации может варьироваться в зависимости от типа ткани. В этом протоколе целевого поиска была исполнена для 15 мин как образцы опухоли, так и клеток гранулы. - Декантируют раствор из слайдов, дважды промыть dH2O, окунуть в 100% EtOH 3 мин, и сухой, слайды в 60 ° C в циркулирующего воздуха печи или в РТ, до тех пор, пока полностью сухой.
- Нарисуйте гидрофобный барьер вокруг секции с использованием гидрофобных пера, приблизительно 0,75 х 0,75 дюйма2.
Примечание: Не рекомендуется сделать меньше барьер. Для более крупных разделов больше барьер нужно будет извлечь. - Пусть барьер сухой полностью за 1 мин, или оставить на ночь на RT (необязательный остановочный пункт 3).
- Место слайды в слайд владельца и поместите слайд владельца в лоток контроля влажности. Добавить ~ 4 капли протеазы III для каждого слайда и Инкубируйте 15 – 30 мин при 40 ° C в гибридизации печи для переваривания белка.
Примечание: Время инкубации может варьироваться в зависимости от типа ткани. В этом протоколе протеазы пищеварение была исполнена для 30 минут для образцов опухоли и 15 минут для ячейки окатышей. - Декантируют раствор из слайдов и промойте их дважды dH2O.
-
Зонд гибридизации
- Добавьте ~ 4 капли раствора соответствующие готовых к использованию зонд для покрытия всего раздела. При использовании более крупные разделы, добавить ~ 5-6 капель.
- Гибридизируйте зонды для 2 ч при 40 ° C в печь гибридизации. Декантируют раствор из слайдов и мыть слайды в 200 мл 1 x мыть буфер для 2 мин на RT с случайные агитации. Повторите процедуру стиральная в этом шаге.
-
Усиления сигнала
- Инкубировать разделы с ~ 4 капли AMP 0 на слайде при 40 ° C в гибридизации духовку на 30 мин Decant решение и мыть слайды в 200 мл 1 x мыть буфера для 2 мин на RT с случайные агитации. Повторите процедуру стиральная в этом шаге.
- Инкубировать разделы с ~ 4 капли AMP 1 каждого слайда при 40 ° C в гибридизации духовку на 15 мин Decant решение и мыть слайды в 200 мл 1 x мыть буфер для 2 мин на RT с случайные агитации. Повторите процедуру стирки.
- Инкубировать разделы с ~ 4 капли AMP 2 каждого слайда при 40 ° C в гибридизации духовку на 30 мин Decant решение и мыть слайды в 200 мл 1 x мыть буфер для 2 мин на RT с случайные агитации. Повторите процедуру стирки.
- Инкубировать разделы с ~ 4 капли AMP 3 на слайде при 40 ° C в гибридизации духовку на 30 мин Decant решение и мыть слайды в 200 мл 1 x мыть буфер для 2 мин на RT с случайные агитации. Повторите процедуру стирки.
- Инкубировать разделы с ~ 4 капли AMP 4 на слайде при 40 ° C в гибридизации духовку на 15 мин Decant решение и мыть слайды в 200 мл 1 x мыть буфер для 2 мин на RT с случайные агитации. Повторите процедуру стирки.
- Инкубировать разделы с ~ 4 капли AMP 5 на слайд в РТ на 30 мин Decant решение и мыть слайды в 200 мл 1 x мыть буфер для 2 мин на RT с случайные агитации. Повторите процедуру стирки.
- Инкубировать разделы с ~ 4 капель AMP 6 каждого слайда на RT на 15 мин Decant решение и мыть слайды в 200 мл 1 x мыть буфер для 2 мин на RT с случайные агитации. Повторите процедуру стирки.
-
Обнаружение сигнала
- Подготовьте быстро красный краситель рабочего раствора. Для одного слайда с 0,75 х 0,75 дюйма2 барьер, добавить 2 мкл краска быстро красно-B 120 мкл быстро красно-A в трубку и хорошо перемешать.
Примечание: В зависимости от размера гидрофобный барьер и количество слайдов, будет отличаться томов быстро красный рабочего раствора. - Декант избыток жидкости от слайды и добавить быстро красный краситель рабочего раствора к слайдам. Инкубируйте слайды для 10 мин на RT в лоток с крышкой, чтобы избежать воздействия света.
Примечание: Используйте быстрый красный рабочего раствора в течение 5 мин, подготовки и не подвергать его прямого солнечного света или ультрафиолетового света. - Сцеживаться быстро Красного раствора и промыть слайды дважды с водопроводной водой. Место слайды обратно в слайд стойку.
- Подготовьте быстро красный краситель рабочего раствора. Для одного слайда с 0,75 х 0,75 дюйма2 барьер, добавить 2 мкл краска быстро красно-B 120 мкл быстро красно-A в трубку и хорошо перемешать.
-
Counterstaining
- Counterstain разделов ткани с 50% Гилл гематоксилином решение для 2 мин на RT. мыть слайды с водопроводной водой и повторите это несколько раз, пока не ясно, в то время как разделы остаются фиолетовый слайды. Окуните слайды в 0,02% аммиачной воды для воронение (dip 2 – 3 раза). Замените воду аммиака с водопроводной водой и вымыть слайды 3 – 5 раз.
-
Монтаж на салазках
- Сухой слайды в циркулирующего воздуха печи на 60 ° C в течение 15 мин или RT до тех пор, пока полностью сухой. Место 1 – 2 капли реагента монтажа на каждый слайд и место coverslips над каждой секции. Избегайте любой перехват воздушных пузырьков. Воздух сухой слайды для по крайней мере 5 минут.
Примечание: Быстро красный субстрат алкоголя чувствительных. Не обезвоживая слайды в спирте.
- Сухой слайды в циркулирующего воздуха печи на 60 ° C в течение 15 мин или RT до тех пор, пока полностью сухой. Место 1 – 2 капли реагента монтажа на каждый слайд и место coverslips над каждой секции. Избегайте любой перехват воздушных пузырьков. Воздух сухой слайды для по крайней мере 5 минут.
-
Визуализация
- Наблюдать за слайды под микроскопом стандартного brightfield.
Representative Results
В situ гибридизация пробирного рабочий процесс:
Рабочий процесс изображен на рисунке 1 и состоит из четырех частей: permeabilization клеток или тканей с целевого поиска и протеазы решения, Гибридизация зондов к целевому РНК, сигнал амплификация и визуализация сигнала. Сигнал также могут быть количественно с помощью цифровых изображений программного обеспечения систем или полуколичественного образом основанный на количество точек на ячейку. Ручной процедуры, описанной в рисунке 2 также полностью автоматизированной в коммерческих системах, auto окрашивание.
Представитель пятнать экзона Джанкшен обнаружения (EGFRvIII соединитель вариант): EGFRvIII представляет собой вариант рецептор эпидермального фактора роста, который возникает от рамы геномной удаления экзонов 2-7, ведущей к конститутивно активных онкогенные сигнальные7 . Проба была использована для выявления EGFRvIII статус в образцах опухоли глиобластома (GBM) FFPE. Одноместный Двухместный Z зонды были разработаны для диапазона экзона развязок с целью обнаружения либо WT, мутант, или обоих протоколов (рис. 3A). Зонды WT EGFR охватывают развязок экзонов 1 и 2 (E1/E2) или экзонов 7 и 8 (E7/E8), в то время как EGFRvIII конкретных зонды охватывают стыке экзонов 1 и 8 (E1/Е8). Общие зонд, который охватывает стыке экзонов 8 и 9 (E8/E9) также используется для обнаружения всего EGFR (WT и EGFRvIII стенограммы). Все датчики были затем используется для определения EGFR статус в FFPE GBM образцов. Два представителя примера, показано на рисунке 3B были взяты из более широкого исследования. EGFR статус был подтвержден самостоятельного метода, RT-PCR. Обе WT зонды обнаружен сигнал в обоих образцах, указав, что двух образцов Экспресс WT EGFR (рисунок 3B). Однако мутант зонд показали только обнаружения сигнала в EGFRvIII + образца, подтверждающий, что этот пример действительно позитивным для EGFRvIII вариант (рисунок 3B, левой панели). И наоборот мутант зонд не обнаруживает сигнал в образце EGFRvIII (рисунок 3B, правой панели). Взятые вместе, эти результаты показывают, что экзона Джанкшен assay может определить статус EGFRvIII в образцах опухоли GBM FFPE.
Представитель пятная для нескольких целей:
CDR3 или дополнительных определяющих регион 3, является весьма переменной домен в Т-клеточных рецепторов. Как правило последовательность CDR3 довольно короткий; к примеру, CDR3 α и β последовательности от линии Jurkat Т-клеток, 51 и 48 нуклеотидов в длину, соответственно (рис. 4A). Для выявления специфических последовательностей CDR, выраженная в Jurkat клетки, антисмысловых зонды для CDR3 α и β, которые выражаются в строке Jurkat Т-клеток были созданы, в дополнение к чувство зонды для CDR3 α и β в качестве отрицательного контроля датчиков. Все датчики были затем испытания в подготовленный FFPE Jurkat клеток с assay. Надежные окрашивание было отмечено с анти смысле зонды для обоих CDR3 α и β в Jurkat клетках, тогда как смысл зонды обнаружено мало не сигнал (рис. 4B). Эти результаты демонстрируют короткие целевого анализа способность различать между весьма переменной, но короткие последовательности CDR для клоны Т-клеточного рецептора.
Представитель пятная для Точечная мутация EGFR L858R:
Точечная мутация зонды были разработаны для выявления единичных нуклеотидных вариации и небольшие вставки или удаления (INDELs) в контексте опухоли. Рисунок 5A демонстрирует способность в месте обнаружения Точечная мутация EGFR L858R (2573T > G). Были разработаны два датчика: один для обнаружения L858R мутировал EGFR последовательности, а другой для определения последовательности EGFR L858 WT. Обе зонды были протестированы в двух подготовленных FFPE клеточных линий: H2229, который только выражает EGFR L858 WT; и H1975, который является гетерозиготных EGFR L858R мутации. L858R мутант зонд обнаружил сигнал только в линии клеток H1975, но не в строке ячейки H2229. Однако WT зонд обнаружил сигнала в обеих линий клетки. Аналогично, Рисунок 5B визуализирует в месте обнаружения Точечная мутация крас G12A (35 G > C). Два зонда были предназначены для обнаружения крас G12A MT и КАРСТЕ G12 WT последовательности, а затем испытания на линии клеток HuT78, (который только выражает крас G12 WT) и линии клетки SW116 (которая является гетерозиготных крас G12A мутации). В то время как зонд крас G12 WT обнаружен сигнал в обоих клеточных линий, крас G12A зонд только обнаружен сигнал в линии клетки SW116. Взятые вместе, эти данные продемонстрировать технические возможности анализа Точечная мутация в обнаружение единичных нуклеотидных полиморфизмов в контексте клеток и тканей.
Представитель окрашивания для assay автоматизированной на месте :
Автоматические тесты позволяют большее количество образцов выполняться более надежно, минимизации изменчивости между пользователем и практический время и генерации последовательно воспроизводимость результатов. Таким образом была разработана автоматизированная версия assay. Чтобы продемонстрировать автоматического окрашивания с этот assay, было рассмотрено обнаружения соединитель вариант METΔ14. Этот вариант является результатом 14 экзона гена MET, пропускаются при пре мРНК сплайсинга, что приводит к активации учредительного и онкогенных трансформации ВСТРЕТИЛ рецептор8,9. Конкретно определить вариант METΔ14, были разработаны два экзона Джанкшен зондов: один, который охватывает стыке экзонов 13 и 15 (E13/E15) для обнаружения METΔ14 вариант Стенограмма и другой, который охватывает стыке экзонов 14 и 15 (E14/E15) для обнаружения ВСТРЕТИЛ WT Конспект (рис. 6A). Обоих зондов затем были протестированы в 2 FFPE-подготовлен клеточных линий: H596, которая выражает METΔ14 вариант, и A549, который выражает ген WT встретились. Обоих зондов показала шаблоны взаимоисключающих выражений, с зонд E13/E15, только обнаружения сигнала в H596 клетки и зонд E14/E15, только обнаружение сигнала в A549 клетках (цифры 6B и 6 C). И наконец зонда для dapB показал не сигнал, указывающий нет фонового сигнала (цифры 6B и 6 C). В целом эти данные демонстрирует конкретные обнаружение ВСТРЕТИЛ вариант METΔ14 в месте использования автоматизированных BaseScope assay.
Рисунок 1 : Рабочий процесс пробирного. Рабочий процесс состоит из 4 основных этапов: предварительной обработки для разрушения клеток или тканей, гибридизация зонда к целевому РНК, сигнал амплификация и сигнал обнаружения по визуализации под brightfield или люминесцентных микроскопов. Отдельные точки могут быть количественно с помощью платформы анализа цифровых изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Иллюстрация протокол ручной assay. Весь assay может быть завершена в 9 ч. время может варьироваться в зависимости от типа ткани, поэтому рекомендуется консультироваться с добавление A в руководстве пользователя для ткани предварительной рекомендации относительно время инкубации предварительной обработки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Представитель изображений экзона Джанкшен обнаружения. (A) показанный здесь являются экзона Организации EGFR WT и EGFRvIII стенограммы и схема с изображением двойной Z экзона Джанкшен зонды, попадающие на двустраничный перекрестка для обнаружения EGFR WT или EGFRvIII. (B) экзона Джанкшен пробирного была выполнена на двух образцах глиобластома FFPE с помощью зондов, перечисленных в (A), а также положительный контроль зонда, POLR2A и отрицательный контроль зонда, dapB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Представитель изображения короткие цели последовательности обнаружения. (A) показанный здесь являются CDR3 последовательности в Jurkat клетках. Последовательность в черном фланкируя общую последовательность и последовательность в красном является уникальной для CDR3α или CDR3β. Одноместный Двухместный Z короткие целевой последовательности зонды были разработаны против этих последовательностей. (B) короткие целевого анализа была выполнена на Jurkat клетки, подготовленных как Пелле FFPE клеток, с использованием анти чувство или ощущение датчики ориентации последовательности в (A), и dapB был использован в качестве отрицательного контроля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Представитель образы обнаружения Точечная мутация. (A) проба была выполнена на H2229 клетки (гомозиготных для EGFR L858) и H1975 клетки (гетерозиготных EGFR L858R мутации) подготовлен как Пелле клеток FFPE, с помощью одной двойной Z Точечная мутация датчики ориентации EGFR L858 WT последовательности или EGFR L858R Мутировавшие последовательность. (B) пробирного Точечная мутация была выполнена на HuT78 клетки (гомозиготных для крас G12A) и SW116 клетки (гетерозиготных крас G12A мутации) подготовлен как Пелле клеток FFPE, с помощью одной двойной Z Точечная мутация датчики ориентации крас G12 WT последовательности или Крас G12A мутировал последовательности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Представитель изображения автоматического окрашивания с перекрестка assay экзона. (A) показанный здесь является экзона организации встретились WT и METΔ14 стенограммы и схема с изображением одной двойной Z экзона Джанкшен зонды, попадающие на двустраничный перекрестка для обнаружения ВСТРЕТИЛ WT или METΔ14. (B) и (C) автоматизированных экзона Джанкшен пробирного была исполнена на H596 клетки (выражая METΔ14) и A549 клетки (выражая ВСТРЕТИЛ WT) подготовлен как Пелле FFPE клеток, с использованием зондов, перечисленных в (A), а также отрицательный контроль зонда dapB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Эксон Джанкшн | Короткую последовательность | Точечная мутация |
| Вариант/изоформы для сращивания | Последовательности между 50 и 300 nt | Точечная мутация |
| Циркуляр РНК (circRNA) | Весьма гомологичных последовательности | Короткие indel |
| Джин фьюжн | CDR3 последовательность TCR клонов | Джин редактирования |
| Нокаут гена (KO) | Pre-miRNA | |
| Малые ядрышковые РНК (snoRNA) | ||
| Джин редактирования |
Таблица 1: применение на месте assay. Существует 3 основных категории для приложений этот assay: экзона Джанкшен, короткие последовательности и Точечная мутация. В каждом столбце перечислены некоторые конкретные примеры для каждой категории.
Discussion
В настоящем докладе подробно обсуждались Роман протокол assay иш и ее применения. Assay позволяет для прямого визуализации экзона развязок, короткие цель и высоко гомологичных последовательности и точечные мутации в контексте ткани. Проба основана на технологии RNAscope5 и поэтому способен одной молекулы обнаружения. Однако из-за передовых Усилительная система, сигнал могут быть обнаружены с зондами, содержащие как одна пара двойных Z или целевой шаблон длиной всего 50 нуклеотидов. Потому что зонды могут быть как короткий как один двойной Z в длину, это позволяет для обнаружения экзона развязок, короткие цель и высоко гомологичных последовательности и точечные мутации (Таблица 1).
Для успешного выполнения анализа существует несколько технических рекомендаций. Во-первых тканей должна быть исправлена в свежие 10% буферизацией нейтрального формалина (NBF) при комнатной температуре для 16 – 32 h10. Underfixation (< 16 h) или overfixation (> 32 h) будет ухудшить производительность пробирного и может потребовать дополнительной оптимизации. Во-вторых для обеспечения оптимального контроля температуры и влажности, которые требуются для надежной зонд гибридизации и сигнала Усилители, слайд обработки системы и гибридизации печи должны использоваться для протокола шаги 2.3-5 (протеазы предварительной обработки, зонд Гибридизация, усиления сигнала и сигнала). Третьих, превышение остаточных буферы должны быть должным образом отстой перед каждым шагом на протяжении протокол (но не настолько, что в разделах ткани высохнуть). Если слайды высохнуть, значительные неспецифичный сигнал будет развиваться. В-четвертых в зависимости от типа ткани, может потребоваться предварительная оптимизация. Использование неправильно протеазы или выполнении субоптимальные количество времени может привести к в под - или над - digestion и отрицательно будет влиять на сигнал. И наконец важно всегда запускать положительной и отрицательной контроля с зондами теста. Отрицательный контроль зонды убедитесь, что нет фонового сигнала, и зонды позитивного управления убедитесь, что assay было сделано правильно, и что качество РНК в образце является оптимальным для интерпретации результатов тестов зонд. Если нет сигнала с положительный контроль зонда, то качество РНК в образце, скорее всего неоптимальной и сигнал не может быть видно с пробник.
В дополнение к ручной assay способность выполнить пробу на автоматизированных stainers был также продемонстрировал (рис. 6). Этот автоматизированный assay иш дает высокое соотношение сигнал шум и применима для тех же приложениях, как показано в таблице 1; Однако преимущества автоматизированных assay включают стандартизации анализа условий, минимизации изменчивости между пользователем и практический времени и пособие для высокопроизводительного скрининга образцов ткани надежным способом.
Хотя иммуногистохимия (IHC) и qRT ПЦР позволяет для обнаружения сращивания вариантов (особенно EGFRvIII), в FFPE клинических образцов, эти методы необходимые неконкретны и не предлагаем проницательность в пространственное разрешение сращивания выражение типа Variant, соответственно11,12. Ключевым преимуществом assay в этот протокол является его весьма деликатного и конкретных визуализации сращивания стыков при сохранении контексте морфологических ткани. Здесь способность пробирного точного уникальный экзона развязок для нескольких вариантов соединения, включая EGFRvIII и METΔ14, была продемонстрирована (рисунки 3 и 6). Кроме того было показано assay обнаружить соединитель вариант AR-V7 рака простаты, нескольких изоформ ErbB4 в мозге и подтверждение нокаут круговой Cdr1as РНК в мыши мозга3,,1314.
Короткие последовательности обнаружения, этот assay иш позволяет для визуализации РНК последовательности как 50 нуклеотидов в длину, короче, как свидетельствует обнаружение CDR3 последовательностей, производный от Jurkat клеток (рис. 3). Assay может также обнаружить последовательности гена, которые высоко гомологичных для других членов семьи или видов, как показано на Revêchon и др., которые использовали короткий целевого анализа для выявления человеческого progerin, выраженные в мыши подкожной жировой ткани белых15. Кроме того малые ядрышковые РНК (snoRNA), ТРИФОСФАТЫ опосредованной гена редактирования и прекурсоров микроРНК могут быть обнаружены в situ с короткой целевой assay. Совсем недавно Фу et al. сочетаются этот assay иш IHC определить точные клеток в сетчатке, выражая в pre-miRNA mir125b16.
Мутация, профилирование в опухоли имеет решающее значение для изучения прогрессии опухоли и для разработки целевой терапии. Хотя мутация профилирования может быть достигнуто через высокопроизводительного секвенирования, эта технология не может полностью решить внутриопухолевых ссылку или неоднородность генетические изменения с клеточной морфологии17,18. Определение наличия мутаций точки, используя этот assay иш позволяет различия РНК последовательности с разрешением сингл база, как проверенных путем обнаружения EGFR L858R и КАРСТЕ G12A единичных нуклеотидных изменений в клеточных линиях (рис. 5). Кроме того Baker et al. используется Точечная мутация assay целевой несколько мутации онкогенов BRAF, крас и PIK3CA в18колоректального рака. Они были в состоянии выявлять и пространственно карта редких мутантов subclones опухолевых клеток, в конечном счете показаны, как они способствуют интра опухоль неоднородности.
В целом был разработан специализированный пробирного РНК ISH. Эта методология позволяет для обнаружения сращивания вариантов, коротких последовательностей, и мутации в situ. Это чувствительных, конкретных, поддающихся количественной оценке и адаптируемой производительности как ручной методами, так и на автоматизированных stainers.
Disclosures
Все авторы являются сотрудниками расширенный клеток диагностики, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HybEZ Oven (110 or 220 VAC) or HybEZ II Oven (110 or 220V) | ACD | 310010 or 310013 (HybEZ™), 321710 or 321720 (HybEZ™ II) | |
| HybEZ Humidity Control Tray (with lid) | ACD | 310012 | |
| ACD EZ-Batch Slide Rack (20 slide capacity) 1 rack 310017 | ACD | 310017 | |
| HybEZ Humidifying Paper | ACD | 310015 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (required) | Vector Laboratory | H-4000 | |
| SuperFrost Plus Slides (required) | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 10% neutral-buffered formalin (NBF) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Paraffin wax | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Microtome | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Gill’s Hematoxylin I | American Master Tech Scientific/MLS | HXGHE1LT | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Xylene | Fisher Scientific/MLS | X3P-1GAL | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Tissue-Tek Vertical 24 Slide Rack | American Master Tech Scientific/MLS | LWSRA24 | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Tissue-Tek Staining Dishes | American Master Tech Scientific/MLS | LWT4457EA | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Tissue-Tek Clearing Agent Dishes, xylene resistant | American Master Tech Scientific/MLS | LWT4456EA | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| 100% alcohol (EtOH) | American Master Tech Scientific/MLS | ALREACS | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| VectaMount Permanent Mounting Medium (required) | Vector Labs | H-5000 | |
| Cover Glass, 24 mm x 50 mm | Fisher Scientific/MLS | 12-545-F | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Ammonium hydroxide, 28–30% | Sigma-Aldrich/MLS | 320145-500mL | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Carboy (>3L) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Oster Steamer Model 5712, Black and Decker Steamer HS3000, or the Braun Multiquick FS 20 Steamer | / | / | |
| Digital thermometer | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Water bath or incubator, capable of holding temperature at 40 +/– 1 °C | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Pipettors and tips, 1–1,000 μL | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Distilled water | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Tubes (various sizes) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Fume hood | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Graduated cylinder | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Parafilm | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Paper towel or absorbent paper | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Microcentrifuge | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Microscope and accessories | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Drying oven, capable of holding temperature at 60 +/– 1 °C | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Formaldehyde | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Histogel | Fisher Scientific/MLS | 22-110-678 | |
| BaseScope Reagent Kit - RED | Advanced Cell Diagnostics | 322900 | |
| BaseScope Hs-EGFR-E1E2 | Advanced Cell Diagnostics | 701701 | |
| BaseScope Hs-EGFR-E1E8 | Advanced Cell Diagnostics | 701711 | |
| BaseScope Hs-EGFR-E7E8 | Advanced Cell Diagnostics | 701721 | |
| BaseScope Hs-EGFR-E8E9 | Advanced Cell Diagnostics | 701731 | |
| BaseScope Hs-MET-E14E15 | Advanced Cell Diagnostics | 701811 | |
| BaseScope Hs-MET-E13E15 | Advanced Cell Diagnostics | 701801 | |
| BaseScope Hs-KRAS-G12A | Advanced Cell Diagnostics | 705491 | |
| BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT | Advanced Cell Diagnostics | 705531 | |
| BaseScope Hs-EGFR-L858R | Advanced Cell Diagnostics | 705451 | |
| BaseScope Hs-EGFR-L858WT | Advanced Cell Diagnostics | 705461 | |
| BaseScope Control Probe Pack Human | Advanced Cell Diagnostics | 322975 |
References
- Bolha, L., Ravnik-Glavač, M., Glavač, D. Circular RNAs: Biogenesis, Function, and a Role as Possible Cancer Biomarkers. International Journal of Genomics. 2017, 6218353 (2017).
- Yamada, A., Yu, P., Lin, W., Okugawa, Y., Boland, C. R., Goel, A. A RNA-Sequencing approach for the identification of novel long non-coding RNA biomarkers in colorectal cancer. Scientific Reports. 8 (1), 575 (2018).
- Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. , Epub ahead of print (2017).
- Mahmood, R., Mason, I. In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections. Methods in Molecular Biology. 461, 675-686 (2008).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Paraffin processing of tissue. Protocols Online. , Available from: https://www.protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2016).
- An, Z., Aksoy, O., Zheng, T., Fan, Q. W., Weiss, W. A. Epidermal growth factor receptor and EGFRvIII in glioblastoma: signaling pathways and targeted therapies. Oncogene. , Epub ahead of print (2018).
- Frampton, G. M., et al. Activation of MET via diverse exon 14 splicing alterations occurs in multiple tumor types and confers clinical sensitivity to MET inhibitors. Cancer Discovery. 5 (8), 850-859 (2015).
- Awad, M. M., et al. MET Exon 14 Mutations in Non-Small-Cell Lung Cancer Are Associated With Advanced Age and Stage-Dependent MET Genomic Amplification and c-Met Overexpression. Journal of Clinical Oncology. 34 (7), 721-730 (2016).
- Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 134 (6), 907-922 (2010).
- Gan, H. K., Cvrljevic, A. N., Johns, T. G. The epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII): where wild things are altered. Federation of European Biochemical Societies Journal. 280 (21), 5350-5370 (2013).
- Wheeler, S. E., Egloff, A. M., Wang, L., James, C. D., Hammerman, P. S., Grandis, J. R. Challenges in EGFRvIII detection in head and neck squamous cell carcinoma. Public Library of Science One. 10 (2), e0117781 (2015).
- Zhu, Y., et al. Novel Junction-specific and Quantifiable In Situ Detection of AR-V7 and its Clinical Correlates in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer. European Urology. , Epub ahead of print (2017).
- Piwecka, M., et al. Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function. Science. , Epub ahead of print (2017).
- Revêchon, G., et al. Rare progerin-expressing preadipocytes and adipocytes contribute to tissue depletion over time. Scientific Reports. 7 (1), 4405 (2017).
- Fu, Y., et al. Functional ectopic neuritogenesis by retinal rod bipolar cells is regulated by miR-125b-5p during retinal remodeling in RCS rats. Scientific Reports. 7 (1), 1011 (2017).
- Yates, L. R., et al. Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing. Nature Medicine. 21 (7), 751-759 (2015).
- Baker, A. M., et al. Robust RNA-based in situ mutation detection delineates colorectal cancer subclonal evolution. Nature Communications. 8 (1), 1998 (2017).
