Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

אפיון פונקציונלי Carboxylesterases הבית בקוטלי חרקים עמידים בזבובים, דומסטיקה זבוב

Published: August 23, 2018 doi: 10.3791/58106
Automatic Translation
1, 1
1Department of Entomology and Plant Pathology, Auburn University

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר בית carboxylesterase לעוף חלבונים במבחנה עם מערכת ביטוי תא חרקים baculovirus מתווכת, מאוחר יותר פונקציונלית לאפיין את תפקידיהם פרמתרין חילוף חומרים, ובכך, היוועצות pyrethroid התנגדותם מבוססת תא MTT assay, במבחנה מטבולית מחקרים.

Abstract

בתיווך Carboxylesterase חילוף החומרים הוא חשב לשחק תפקיד מרכזי בהתנגדות בקוטלי חרקים, חרקים שונים. מספר גנים carboxylesterase נמצאו למעלה מוסדר בנימה זבוב הבית עמיד, ואילו התפקידים שלהם משוחח עמידות חרקים נשארו כדי להבטיח את הזמנתכם. . תיכננו פרוטוקול עבור אפיון פונקציונלי carboxylesterases. 3 דוגמה ניסויים מוצגים: (1) בביטוי ובידוד של חלבונים carboxylesterase דרך חרק בתיווך baculovirus זחל כנימה frugiperda (Sf9) תא ביטוי מערכת; (2) MTT מבוססת-תא (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium ברומיד) cytotoxicity assay כדי למדוד את רגישות התאים חרקים כדי הטיפול בפרמתרין שונים; ומחקרים (3) במבחנה חילוף החומרים כדי לבדוק את היכולות מטבולית של carboxylesterases כלפי פרמתרין. הגן carboxylesterase MdαE7 היה שוכפלה מ בית עמיד לטוס זן ALHF, נהגו לבנות baculovirus רקומביננטי לדלקת תאים Sf9. Viabilities תא נגד שונה הטיפול בפרמתרין נמדדו עם MTT וזמינותו. הסובלנות תא משופרת של קבוצת הניסוי (MdαE7-רקומביננטי baculovirus נגוע תאים) לעומת אלו של קבוצות הבקרה (החתול-רקומביננטי baculovirus נגוע תאים ותאים GFP-רקומביננטי baculovirus נגוע) כדי פרמתרין טיפולים הציע את היכולות של MdαE7 של חילוף חומרים קוטלי חרקים, ובכך להגן על תאים מפני נזקים כימיים. חוץ מזה, חלבונים carboxylesterase היו הביע בתאים Sf9 חרקים, מבודד לנהל במבחנה מטבולית המחקר. התוצאות שלנו המצוין של משמעותי במבחנה מטבולית היעילות של MdαE7 כלפי פרמתרין, ישירות המציין את מעורבותם של carboxylesterases של חילוף חומרים קוטלי חרקים וזבובים ולכן היוועצות עמידות חרקים בבית.

Introduction

קוטל חרקים ההתנגדות היא כיום נושא מרכזי של הבית הדברת הזבוב ברחבי העולם1,2. המאמצים כדי לקבוע המנגנון של עמידות חרקים מאפשר הבנה טובה יותר של בעיה זו, ובכך לספק אסטרטגיות הרומן ביעילות למנוע או לצמצם את התפשטות ההתנגדות פיתוח3. Carboxylesterases, בתור אחד של אנזימים דטוקסיפיקציה הגדולות, משכו המון תשומת לב על השתתפותם ב sequestering, חילוף חומרים קוטלי חרקים שונים חרקים4,5,6. המחקר הקודם שלנו זיהה carboxylesterases מרובים בזבובים הבית ואת רמות הביטוי שלהם היו לא רק צורונים למעלה מוסדר בנימה ALHF עמידים, אבל גם יכול להיות רמות המושרה כדי גבוה יותר בתגובה בפרמתרין7 . עם זאת, אפיוני תפקודי הגנים האלה carboxylesterase ' בחילוף חומרים קוטלי חרקים נשארים כדי להבטיח את הזמנתכם.

מאז הדוח הראשון ב שנות ה-80 המוקדמות8, מערכת ביטוי baculovirus בתיווך גנים זרים כבר מועסקים נרחב עקב שלה יעילות ייצור חלבון וחלבון האיקריוטים עיבוד יכולות9. זו מערכת בינארית מורכב שני מרכיבים חיוניים: baculovirus רקומביננטי נבנה העברת גנים זרים לתוך התאים מארח, ואת הביטוי בקנה מידה גדול של חלבונים גם על ידי תאים נגועים baculovirus רקומביננטי. במהלך העשורים האחרונים, מערכת ביטוי תא baculovirus מתווכת כבר בשימוש נרחב כדי לייצר אלפי חומרים, החל cytosolic אנזימים מאוגד-קרום חלבונים בחרקים, יונקים תאים10. המחקר הקודם שלנו הביעה בהצלחה מספר אנזימים CYP450 בתאים Sf9 חרקים עם המערכת הזו11. במחקר זה, אנו נבנה baculovirus carboxylesterase-רקומביננטי להדביק תאים Sf9 חרקים, חקר הסובלנות תא בפרמתרין שונים, ולאחר בקנה מידה גדול carboxylesterase ביטוי חלבונים במבחנה עבור פונקציונלי חקר. במקום חוקרים מרובים איזואנזים carboxylesterase תערובות של חרקים homogenates כפי שאומצה על ידי מחקרים קודמים12,13, בתיווך baculovirus תא חרקים ביטוי המערכת מאפשרת ביטוי ספציפי, בידוד של חלבונים ממוקד יותר פלואורסנציה תכונותיהם הביוכימי ומבניים.

Tetrazolium מבוססי מלח וזמינותו (MTT) היא שיטה ערכי צבע מוחלטים תפוקה גבוהה פיתח, ממוטב כדי למדוד את הכדאיות תא. Assay זו מבוססת על מנגנון זה רק חיים תאים המסוגלים חילוף חומרים הכימית MTT בגוון צהוב חום התמיסה formazan בצבע סגול כהה, אשר יכול להיות מנותח colorimetrically לאחר מומס ממיסים אורגניים14, 15. כמה מדויק יותר אבל שיטות זמן רב, כמו אי-כלילה Trypan blue תימידין טיטור assay16,17, פותחו בשנים האחרונות. עם זאת, וזמינותו MTT מבוססת תא עדיין כיום מזוהה כמספר השיטה המהירה ביותר המופעל בקלות לזהות במהירות את הכדאיות תא. כאן, אנו משתמשים וזמינותו MTT כדי לחקור את הסובלנות תא נגד חרקים טיפולים. הסובלנות משופרת של תאים כאשר נגוע baculovirus רקומביננטי carboxylesterase חריפה תומך את התפקידים מטבולית של carboxylesterases הדברה, אשר בתורו מרמז על מעורבותם בהתנגדות בקוטלי חרקים.

בנוסף, במבחנה מטבולית assay נערך גם במחקר זה. לעומת מבחני carboxylesterase כללי המשתמשות סובסטרטים נפוצות כגון α-napthyl אצטט (α-נה) וβ-naphthyl אצטט (β-נה) כדי לשקף פעילויות hydrolytic של carboxylesterases, המחקר במבחנה מטבולית נחשבת כדרך מדויקת למדוד ישירות פעילויות של carboxylesterases לקראת הדברה18. שיטה זו כבר מועסקים בהצלחה לאפיין ציטוכרום מרובים P450s בשיתוף עם קוטל חרקים ההתנגדות11,19,20בחרקים שונים. עם זאת, שיטה זו לא טרם הוחל במחקרים carboxylesterase. עם הזמינות של חלבונים carboxylesterase המיוצר על ידי המערכת ביטוי בתיווך baculovirus, נוכל לבצע על במבחנה מטבולית המחקר של carboxylesterases כלפי פרמתרין, אשר יכול לספק עוד עדויות חזקות של מעורבות של carboxylesterases משוחח pyrethroid ההתנגדות בבית זבובים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ביטוי ובידוד חלבונים היעד עם מערכת ביטוי בתיווך Baculovirus תא חרקים

  1. Directionally לשכפל הסתיימה בלאנט מוצרי ה-PCR של חלבונים היעד מהזבובים הבית.
    1. עיצוב תחל ה-PCR של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), הבית לעוף MdαE7 הגן על סמך והרצפים שלהם, את הדרישות המיוחדות של וקטור שבחרת (טבלה 1).
    2. להשתמש של פולימראז DNA thermostable, ההגהה, תחל מהשלב 1.1.1 לביצוע לתגובה PCR 150 µL (µL 30 מאגר התגובה, µL 3 dNTPs 10 מ מ, 1.5 µL של ה-DNA פולימראז, 6 µL של הבית לטוס התבנית DNA, 7.5 µL של פריימר לפנים µL 7.5 של פריימר הפוכה, עם מים µL הסופית נפח 150). חום התגובה PCR 98 ° C ל 30 s, ואחריו 35 מחזורי 98 ° C עבור 10 s, 53 ° C ל 30 s, ו-72 מעלות 60 s ולאחר מכן סיומת הסופי ב-72 מעלות למשך 2 דקות).
      1. הפעל את agarose 1% ג'ל עם 150 µL של מוצר ה-PCR.
    3. בלו שברי DNA היעד agarose ג'ל עם איזמל חדה, נקייה: 1317 bp עבור MdαE7 ו- 858 bp GFP. לטהר את הדנ א באמצעות ערכת חילוץ ג'ל זמינים מסחרית של היצרן של הפרוטוקול (טבלה של חומרים). להמיס את ה-DNA מטוהרים ב 15 µL של מים מזוקקים.
    4. הפעל את agarose 1% ג'ל עם µL 1 של מטוהרים דנ א כדי לבדוק תקינות. השתמש µL 1 נוסף של ה-DNA מטוהרים למדידת ריכוזי עם ספקטרופוטומטרים.
  2. לבנות על פלסמיד ערך היעד חלבונים
    1. להגדיר את התגובה שיבוט. מיקס טרי טיהור DNA מוצרים משלב 1.1.3, כניסה זמינים מסחרית המומנט המכיל attL-אתרים (טבלה של חומרים) ביחס של שן טוחנת של 1:1 (0.5-2 µL של מוצר ה-PCR טריים בריכוזים 70-200 ng/µL: וקטור µL 0.5). ואז להוסיף 1 µL של תמיסת מלח זמינים מסחרית (1.2 M NaCl2 ו- 0.06 M MgCl2), להוסיף מים נפח סופי של µL 6. לערבב בעדינות, דגירה בטמפרטורת החדר מאובטח.
    2. העברת µL 4 של שיבוט התגובה מוצרים בשלב 1.2.1 µL 50 של כשיר מבחינה כימית e. coli תאים. דגירה על קרח במשך 30 דקות חום-הלם את התאים עבור 30 s באמבט מים 42 ° C ללא רועד.
    3. להחזיר את הצינור קרח עוד 2 דק להוסיף 250 µL בינוני S.O.C. בטמפרטורת החדר (2% טריפטון תמצית שמרים 0.5% 10 מ מ NaCl; 2.5 מ"מ אשלגן כלורי; 10 מ מ MgCl2; 10 מ מ MgSO4; גלוקוז 20 מ מ). דגירה ב 37 ° C עבור h 1 ברעידות בעדינות.
    4. מורחים 50-200 µL של התרבות חיידקי בשלב 1.2.3 על לוחות LB סלקטיבית (1 גר' טריפטון; 1g של NaCl; 0.5 גר' תמצית שמרים 1.5 גר' אגר מומס 100 מ של מים מזוקקים. אוטוקלב ולהוסיף 0.1% של 50 מ"ג/מ"ל kanamycin). דגירה LB לוחות עבור h 16 ב 37 מעלות צלזיוס לצמיחה המושבה.
    5. לבחור 5-10 מושבות, מחדש להשעות אותם בנפרד לתוך 5 µL של מים מזוקקים.
    6. לבצע PCR על-ידי הוספת µL 5 תגובת המאגר, 0.5 µL של 10 מ מ dNTPs, 0.25 µL של ה-DNA פולימראז, µL 1 של המושבות על תנאי, µL 1.25 של 10 מיקרומטר M13 פריימר לפנים, µL 1.25 של 10 מיקרומטר פריימר הפוכה של ג'ין היעד, והמים לנפח סופי של 25 µL. לחמם את ה-PCR בתגובה 98 ° C ל 30 s, ואחריו 35 מחזורי 98° C עבור 10 s, 53 ° C ל 30 s, ו-72 מעלות 60 s ולאחר מכן סיומת הסופי ב-72 מעלות למשך 2 דקות (טבלה 1).
    7. מחדש תרבות µL 3 מושבות מושעה מ שלב 1.2.5 בתקשורת טרה-בתים (100 מ של פוספט מאגר המכיל 0.17 מ' ח'2PO4 ו 0.72 M K2HPO4 עם 450 מ ל מרק בסיס בינוני המכיל 6 גר' טריפטון, 12 גרם של שמרים, 2 מ ל גליצרול, עיקור, המכיל 0.1% 50 מ"ג/מ"ל kanamycin) עבור ה 16 לחלץ דנ א פלסמיד אולטרה טהור לפי הפרוטוקול של היצרן.
    8. שימוש 200 ng/µL פלסמיד אולטרה טהור מהשלב 1.2.7 עבור מסחרי סנגר רצף עם M13 ואחורה תחל. ודא הכניסה הנכון של הגן היעד בוקטור המבוסס על המפה רצף המסופקים על ידי היצרן.
    9. לאחסן דגימות ה-DNA פלסמיד אולטרה טהור תבדוק-רצף של MdαE7 ו- GFP ב-20 ° C.
      הערה: אלו הן הפוסט פלסמיד ה-DNA של MdαE7 ה-GFP.
  3. בנו של baculovirus רקומביננטי על-ידי ביצוע התגובה רקומבינציה (LR) למדא.
    1. בהתאמה, לערבב 1 µL של פלסמיד ערך 300 ng/µL ה-DNA של ה-GFP, MdαE7 מהשלב 1.2.7 או ערך פלסמיד-DNA של ג'ין acetyltransferase כלורמפניקול (חתול) המסופקים על ידי ערכת תרביות תאים תאים עם µL 5 אתרי זמינים מסחרית (המכיל attL) C-המונח ליניארי דנ א (מכיל אתרים attR) ב- 250 µL המבחנות. להוסיף מאגר טה כדי להפוך את הנפח הכולל של 8 µL.
      הערה: התגובות של GFP וחתול שימשו קבוצות שליטה.
    2. להוסיף 2 µL של זמינים מסחרית למדא רקומבינציה (LR) אנזים מיקס (טבלה של חומרים) לתוך כל תערובת של צעד 1.3.1 כדי לעודד את התגובה LR. בעדינות לערבב, דגירה 25 ° c בלילה (h. ≈16).
      הערה: התגובה LR מקלה על רקומבינציה של attהמכילות L כניסה פלסמיד DNA עם attהמכילות R C-המונח ליניארי DNA כדי להפיק attהמכיל B לביטוי וירוס בלתי. שלב זה מייצר את baculovirus רקומביננטי עבור כל חלבון המטרה.
    3. למהול 1 µL LR התגובה מוצרים משלב 1.3.2 20 X. לבצע PCR באמצעות פריימר לפנים Polyhedrin, V5 להפוך פריימר (טבלה 1). השתמש µL 5 מוצרי ה-PCR כדי להפעיל ג'ל agarose 1% כדי לבדוק את האיכות. איור 1 מראה דוגמה של המוצר התגובה LR הגן MdαE7.

Figure 1
איור 1: דוגמה תוצאות של MdαE7 LR תגובה על-ידי ניתוח PCR. למהול 2 µL של תגובה LR 200-fold ולהשתמש µL 2 של דילול יחד עם פריימר לפנים Polyhedrin, פריימר הפוכה V5 לבצע µL 25 ה-PCR. השתמש µL 5 מוצרי ה-PCR כדי להפעיל.1% ג'ל agarose כדי לבדוק את איכות התגובה LR. .

  1. Transfect תאים Sf9 חרקים
    1. התרבות התאים Sf9 חרקים עם 5 מ של מדיום הגידול תא מלאה (ללא סרום בינוני עם 10% סרום שור עוברית (FBS)) ב- T25 מטופלים מבחנות ב 27 הלעפה תרוטרפמט.
    2. הסר את תגובת שיקוע, ריקון תחתון-attached תאים עם 3 מ"ל של מדיום הגידול תא שלם טרי. העברת 0.5 מ"ל של תאים מושעה מחדש לתוך בקבוקון T25 מטופלים חדשים. הוסף 4.5 מ של מדיום הגידול מלאה. דגירה ב 27 מעלות צלזיוס במשך 3-4 ימים עד ההעברה הבאה.
    3. הרעדה זרע 2 מ של יומן-שלב הצמיחה חרק Sf9 (≈3.0-5.0 × 106 תאים) באופן שווה על התרבות התא היטב. מאפשרים לתאים לצרף במשך לפחות 3 שעות בטמפרטורת החדר בשכונה.
    4. בדוק את הקובץ המצורף של התא על ידי התבוננות עם מיקרוסקופ שלב הפוכה-250 X. להסיר את המדיום תרבות תא והחלף 2 מיליליטר חרקים בינוני של גרייס.
    5. להכין תערובת של תרביות תאים פתרון (8 µL של ריאגנט זיהום תא זמינים מסחרית (טבלה של חומרים) עם µL 100 של מדיום חרקים של גרייס) תרביות תאים תערובת B פתרון של כל גן המטרה (µL 9 מוצרים התגובה LR מהשלב 1.3 עם µL 100 של מדיום חרקים של גרייס unsupplemented) ב- 1.5 mL צנטריפוגה צינורות, בהתאמה.
    6. בעדינות לערבב תערובת תרביות תאים A ו- B יחד על-ידי הקשה על הצינורות. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 35 דקות בשכונה.
    7. שווה להוסיף את התערובת מהשלב 1.4.6 dropwise על גבי התאים הזריעה מהשלב 1.4.4. חותם וולס עם קלטות, דגירה ב 27 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    8. להחליף 2 מיליליטר חרקים בינוני של גרייס 2 מ של מדיום הגידול מלאה. להוסיף 100 מיקרומטר ganciclovir בכל טוב כדי לבחור באופן שלילי נגד רקומביננטי שאינם baculovirus. חותם וולס עם קלטת, דגירה ב 27 מעלות צלזיוס במשך 72 h.
    9. לאסוף 72 h פוסט זיהום תא תרבות בינוני מכל קידוח ולהעביר ל 1.5 mL צנטריפוגה צינורות. צנטריפוגה-g x 1,500 עבור 5 דקות ב 4 ° C כדי להסיר תאים או פסולת גדולה.
    10. להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינורות צנטריפוגה 1.5 mL החדש. לאחסן אותם ב 4 ° C עם הגנה מפני אור.
      הערה: אלה P1 וירוס מלאי פתרונות לכל גן המטרה.
    11. להגביר כייל נמוך P1 ויראלי המניה (1 × 105-1 × 106 pfu/mL) כדי מניה ויראלי כייל נוגדנים גבוה P2 (5 × 107-1 × 108 pfu/mL).
    12. הרעדה זרע 2 מ של יומן-שלב הצמיחה חרק Sf9 (≈3.0-5.0 × 106 תאים) באופן שווה על התרבות התא היטב. מאפשרים לתאים לצרף במשך לפחות 3 שעות בטמפרטורת החדר בשכונה.
    13. לחסן µL 5 מניות וירוס P1 שהושג בשלב 1.4.10 בתא נזרע טוב של צעד 1.4.12, בהתאמה. לאחר מכן, להוסיף 100 מיקרומטר ganciclovir מכל קידוח. חותם בארות, דגירה ב 27 מעלות צלזיוס במשך 72 h.
    14. לאסוף P2 וירוס פתרונות מניות של 72 h פוסט זיהום. לאחסן ב 4 ° C עם הגנה מפני אור.
      הערה: אלה P2 וירוס מלאי פתרונות לכל גן המטרה.
    15. (אופציונלי) חזור על צעדים 1.4.12-1.4.14 עם µL 5 מניות וירוס P2 לאסוף P3 וירוס פתרונות מניות.
      הערה: אלה P3 וירוס מלאי פתרונות לכל גן המטרה.
    16. אחסן את כל baculovirus נבנה ב 4 ° C עם הגנה מפני אור.
      הערה: הגן GFP וחתול היו שימשה קבוצת הביקורת. איור 2 הראו הסימנים של תאים כאשר נגוע GFP-רקומביננטי baculovirus בשלבים שונים הגברה.

Figure 2
איור 2: דוגמה נגוע סימנים Sf9 תאים בשלבים הגברה שונים baculovirus. האיור מציג GFP-רקומביננטי התאים baculovirus תחת אור טבעי, פלורסנט אור. בשלב זיהום P1, היחס זיהום הוא נמוך. בשלב זיהום P2, היחס בין הזיהום היה משופרת באופן משמעותי. בשלב זיהום P3, כמעט כל התאים הראה תסמינים של ניתוק התא תרבות צלחת, מגדילה של התא קוטר, כמו גם הפסקת גידול תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. הביטוי בקנה מידה גדול של היעד חלבונים בתאים Sf9 חרקים
    1. תרבות 10 מ"ל של יומן שלב הצמיחה חרקים Sf9 תאים עם מדיום הגידול מלאה ב- T25 שאינם מטופלים מבחנות.
    2. להוסיף 200 µL של פתרון מניות של וירוס P2 (שהושג בשלב 1.4.14) כדי להדביק את תרביות תאים בשלב 1.5.1 עבור 72 h.
    3. לאסוף 72 h פוסט זיהום תא תרבות בינוני. צנטריפוגה ב g x 1500 דקות 5-4 מעלות צלזיוס.
    4. להשליך כדורי supernatant, תשטוף פעמיים עם 1 מ ל 0.1 M PBS מאגר (pH 7.5).
    5. מלא להמיס תא כדורי עם 1 מ"ל של מיצוי חלבונים תא חרקים & פירוק מאגר (טבלה של חומרים). להוסיף 10% גליצרול פירוק התא. מיד לאחסן ב- 80 ° c
    6. חזור על צעדים 1.5.1-1.5.5 עם P2 וירוס פתרון מניות של החתול חלבונים כדי לשמש קבוצת הביקורת.
      הערה: חזור על שלב 1.5 דולר על ההכנות חלבונים שונים.

2. Assay Cytotoxicity MTT מבוססת-תא

  1. תרבות 5 מ של יומן שלב הצמיחה (1.5-2.5 × 106 תאים/mL) חרקים Sf9 תאים עם מדיום הגידול מלאה ב- T25 שאינם מטופלים מבחנות.
  2. להוסיף 25 µL של פתרון מניות של וירוס P1 (שהושג בשלב 1.4.14) כדי להדביק את תרביות תאים בשלב 2.1 עבור 48 שעות עם טלטול עדין-27 הלעפה תרוטרפמט.
  3. הכן 100 מ מ פתרונות סטנדרטיים פרמתרין מניות ב- acetonitrile. השתמש acetonitrile כדי לדלל 50 מ מ, 25 מ מ, 12.5 מ מ, מ מ 6.25 על-ידי הוספת 500 µL, 250 µL, 125 µL, פרמתרין µL 62.5 פתרון מניות בהנפח הכולל של 1,000 µL, בהתאמה.
  4. זרע באופן שווה 200 µL של תרביות תאים נגועים מהשלב 2.2 בתוספת 300 µL של מדיום הגידול מלאה לתוך צלחת 24-ובכן-צפיפות של 2 × 105 תאים למ"ל.
  5. להוסיף 4 µL של פתרונות סטנדרטיים פרמתרין (6.25 מ מ, 12.5 מ מ, 25 מ מ ו- 50 מ מ) כל טוב לעשות ריכוז סופי 50 מיקרומטר, 100 מיקרומטר, מיקרומטר 200, 400 מיקרומטר, בהתאמה. רק להוסיף 4 µL של acetonitrile לתוך בארות לחישובי הכדאיות תא (איור 3).
  6. חותם צלחות עם קלטות, דגירה ב 27 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות עם הגנה מפני אור.
  7. להכין 5 מ"ג/מ"ל MTT (Thiazolyl כחול Tetrazolium ברומיד) ריאגנט מומס מאגר (2.0 g של NaCl, 0.05 גרם אשלגן כלורי, 0.36 גר' NaH2PO4∙2H2O, 0.28 גר'2PO NaH4, 0.05 גרם של ח'2PO4 מומס 200 מ של מזוקקים מים, pH 7.5).
  8. הסר בינוני תרבות תא שלב 2.6 לאחר דגירה 48 שעות בלי לגעת השכבה התחתונה-attached תא. להוסיף 200 µL של ריאגנט MTT בשלב 2.7 כל טוב. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות עד formazan סגול כהה פוחת משקעים שהוקמה ב מכל קידוח (איור 3).
  9. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות עד formazan סגול כהה ארגונייט שוקע טופס בכל טוב. להוסיף 500 µL של דימתיל סולפוקסיד מלא להתמוסס פוחת משקעים (איור 3).

Figure 3
איור 3: דוגמה של תוצאות MTT. לאחר 48 שעות פוסט זיהום עם P1 וירוס פתרון מניות של החתול baculovirus רקומביננטי פתרון, אחיד זרע 500 µL התאים לבטא החתול ג'ין בצלחת התרבות התא 24-. טוב. בהתאמה, להוסיף 4 פרמתרין µL במינון שונה (6.25 מ מ, 12.5 מ מ, 25 מ מ ו- 50 מ מ) בכל שורה כדי להפוך את הריכוז הסופי 50 מיקרומטר, 100 מיקרומטר, מיקרומטר 200, 400 מיקרומטר. השורה שליטה שטופלו acetonitrile רק ומסומנות כ CK בצלחת. (א) לאחר 48 שעות של דגירה ב 27 ° C, למחוק את המדיום התרבות התא על השכבה העליונה והחלף µL 200 של ריאגנטים MTT בצבע צהוב. ואז דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 ה סגול כהה בצבע הפחתת ארגונייט שוקע טופס בכל טוב המציין כי הישרדות התאים מסוגלים חילוף חומרים בצבע הצהוב MTT ריאגנטים לתוך התמיסה בצבע סגול כהה. (ב) 500 µL של הממס דימתיל סולפוקסיד נוספה בכל טוב כדי להמיס את התמיסה בנויה. הערך ספיגת של כל טוב אותרה על ידי ספקטרופוטומטרים-540 nm. כפי פרמתרין ריכוזים להגדיל, הצבע בהדרגה ישתנה מאדום כהה אור אדום, רומז כי viabilities תא ירדו בהדרגה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. העברת µL 200 של פתרון המומס לתוך צלחת 96-ובכן. מודדים ספיגת ערכים ב- 540 nm שימוש בקורא microplate (טבלה של חומרים).
  2. חישוב הכדאיות תא על-ידי השוואת הערכים ספיגת של תאים פרמתרין מטופלים עם אלו של acetonitrile התייחסו תאים.
  3. עבור קבוצת בקרה, חזור על כל השלבים עם P2 וירוס פתרון מניות של baculovirus acetyltransferase (חתול) כלורמפניקול רקומביננטי שהושג בשלב 1.4.
  4. חזור על 4 פעמים על ההכנות וירוסים שונים.

3. במבחנה Assay מטבולית

  1. הכן 100 מ מ פתרונות סטנדרטיים פרמתרין מניות ב- acetonitrile. השתמש acetonitrile כדי לדלל 50 מ מ, 25 מ מ, 12.5 מ מ של 6.25 מ מ. מזהה האזור שיא המתאים תחת כל הריכוז באמצעות HPLC. ליצור ולחשב את עקומת סטנדרטי של כינים המבוסס על האזור שיא עם ריכוזים שונים פרמתרין.
  2. מודדים את ריכוז חלבונים בשלב 1.5 עם ברדפורד שיטות21.
  3. להכין 700 µL של תגובה מטבולית עם 40 µM פרמתרין תקן 1 מ ג של חלבונים שהושג בשלב 1.5 מומס מ' טריס-HCl 0.2 מאגר (pH 7.4). דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך שעתיים עם טלטול עדין. להגן מפני אור.
  4. להרוות את התגובה על-ידי הוספת µL 700 של acetonitrile קר כקרח. דגירה-30 הלעפה תרוטרפמט למשך עוד 30 דקות ייבוש עדין. להגן מפני אור.
  5. Centrifuge את תערובת התגובה ב g x 16,000 למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. לאסוף את תגובת שיקוע וסינון דרך קרום מיקרומטר 0.45. להעביר את הסינון לתוך מבחנות זכוכית חום ultraclean לניתוח HPLC.
  6. הפעל את HPLC בתנאים כרומטוגרפי אופטימלית (שלב ניידים ת: 90% acetonitrile ו 10% מים; נייד שלב ב': 5% acetonitrile מותאם pH 2.3 עם 85% חומצה זרחתית). מעבר elute עם קצב זרימה של 1 mL/min ומדד באורך-גל של 232 ננומטר.
  7. לחשב את אחוז דלדול פרמתרין על-ידי השוואת התגובות ללא מדגם חלבון נוסף.
  8. השתמש חלבון החתול שהושג בשלב 1.5.6 כדי לשמש הפקד.
  9. חזור על כל השלבים עם חלבונים שונים ההכנות בשלב 1.5.7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הכדאיות תא לכיוון שונה הטיפול בפרמתרין (MTT assay)

Cytotoxicity של פרמתרין נבדק ב MdαE7-רקומביננטי baculovirus נגוע Sf9 תאים (קבוצת הניסוי) ותאים baculovirus (שסופק על-ידי ערכת baculovirus נגוע) נגוע חתול-רקומביננטי (קבוצות הבקרה). הסטייה תא משופרת כדי פרמתרין ב MdαE7 לבטא תאים חריפה לתמוך את התפקידים מטבולית של זו carboxylesterase נגד קוטלי חרקים ותאים ובכך מגן מפני נזקים כימיים. במחקר שלנו, הכדאיות תא נגד ריכוזי פרמתרין שונים (50, 100, 200 ו-400 מיקרומטר) חושבה לעומת תאים שטופלו acetonitrile לבד. התוצאות שלנו הראו הכדאיות של MdαE7 לבטא תאים היה גבוה משמעותית (החל 86.00% 101.92%) (איור 4B) מזה של תאים שליטה (החל 67.59% 81.43%) (איור 4A) כאשר הם נחשפים פרמתרין בריכוזים שונים, המציין את התפקידים החשובים של MdαE7 של חילוף חומרים פרמתרין בתאי חרקים.

Figure 4
איור 4: viabilities של תאים Sf9 חרקים תחת שונה הטיפול בפרמתרין. (א) הכדאיות של תאים שליטה נגוע על ידי החתול baculovirus רקומביננטי (ב) את הכדאיות של תאים ניסיוני נגוע MdαE7 baculovirus רקומביננטי. ארבעה שכפולי נערכו בכל ריכוז פרמתרין. הנתונים הראו כמו זאת אומרת ± ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

במבחנה מטבוליזם של פרמתרין על ידי MdαE7

פרמתרין חילוף החומרים היה לבדיקה על ידי המקננת 40 µM פרמתרין פתרון רגיל יחד עם חלבונים MdαE7 מופק Sf9 תאים נגועים. התגובות עם החתול חלבונים שימש פקדים. האחוז דלדול של פרמתרין מחושב ביחס לתגובות ללא אנזים נוסף. התגובות היו בפיקוח HPLC הפוכה-שלב לאחר תקופת דגירה 120 דקות. מאז פרמתרין רגיל הוא למעשה תערובת של isomers ציס טרנס, שתי הפסגות. נצפו בפרופילי כרומטוגרפי HPLC, עם זמנים • תנאי של 10.67 דקות ו- 10.87 min עבור טרנס-פרמתרין ו- cis-כינים, בהתאמה (איור 5). האחוז דלדול של פרמתרין על ידי חלבונים MdαE7 (39.18±3.78%) היה גבוה באופן משמעותי מזה של החתול חלבונים (7.29±0.81%) (איור 6), אשר הוא לא רק להיות עקבי עם MTT תוצאות אבל גם ישירות מפגינה את היכולות של MdαE7 חילוף חומרים פרמתרין במבחנה.

Figure 5
איור 5: HPLC הפרופיל של פרמתרין רגיל. פרמתרין סטנדרטי השתמשו במחקר זה הוא תערובת של טרנס-פרמתרין ו- cis-פרמתרין isomers. החיצים האדומים מצביעים על הפסגות עבור איזומר טרנס-פרמתרין ו איזומר ציס-כינים, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: במבחנה מטבוליזם של פרמתרין על ידי חומרים MdαE7 וחתול. חישוב האחוזים דלדול של פרמתרין על ידי חלבונים MdαE7 וחתול. שלושה שכפולי נערכו בכל ריכוז פרמתרין. הנתונים הראו כמו זאת אומרת ± ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במהלך העשורים האחרונים, מערכות ביטוי heterologous היה בשימוש נרחב כדי לבטא ולבודד כמויות גדולות של חלבונים, ובכך מאפשר נחישות הביוכימי פונקציונלי ואפיון של אנזימים במבחנה. נכון להיום, מספר מערכות מודל שונה לרבות Escherichia coli, Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiae frugiperda זחל כנימה הותאמו עבור ביטוי חלבון רקומביננטי, ואת הבחירה של במבחנה מערכת חיוני לייצור בקנה מידה גדול של חלבונים מעוניין22,23,24,25. במחקר שלנו, בתיווך baculovirus תא חרקים ביטוי למערכת להפיק carboxylesterases זבוב הבית נבחר כיוון זה מספק סביבה תאיים דומים לתאים חרקים ושומר על מספר יכולות עיבוד האיקריוטים חשוב 9. למרות היתרונות של המערכת לביטוי בתיווך baculovirus, מגבלותיו צריך גם שניתן לטפל בהן. מערכת ביטוי בתיווך baculovirus תא חרקים יכולים לייצר חלבונים היעד רק אם התאים חרקים נדבקו בנגיף נבנה baculovirus רקומביננטי. ההתפתחות הנוכחית של יצירת שורות תאים חרקים טרנספורמציה stably הפך את זה אפשרי לא רק לייצר צורונים חלבונים גם בהיעדרו של זיהום baculovirus, אלא גם כדי לשפר את היכולות תא של glycosylating וקיפול חלבונים המופקים באמצעות שינויים הנדסיים9.

כדאי לחקור את התפקידים של carboxylesterases חילוף חומרים קוטלי חרקים בתאים, ובכך מגן על התאים מפני נזקים כימיים, וזמינותו MTT נערך כדי למדוד את cytotoxicity תא נגד שונה הטיפול בפרמתרין. במהלך תהליך זה, הרבה ניסיוני פרמטרים הקשורים מטבוליזם התא, כגון יצירות בינוני תא, קצב הצמיחה של התאים, ריכוז, הצריכה של מטבוליטים אספקת אנרגיה, יכול להשפיע על ההפחתה MTT, ובכך להוביל לא מדויק תוצאות. כדי למזער את פני / underestimation של וזמינותו MTT, לשמור על המדיום התרבות תאים, תא הצמיחה המדינה והתנאים דגירה של עקביות בין טיפולים ניסיוניים שונים26. על מנת לקבוע את ההשפעות הכדאיות תא הנגרמת על ידי זיהום baculovirus ולא פרמתרין, אנחנו הראה כי התהליך זיהום של baculovirus GFP-רקומביננטי לתאים Sf9 חרקים, ומצא כי בשלב זיהום P2, התאים יש הגבוה ביותר יחס זיהום עם יחס מוות תא הנמוך, בהשוואה עם שלבים זיהום אחרים (איור 2). זה יותר טוב יכול להסביר את הסיבה של בחירת תאים בשלב זיהום P2 לערוך את הבדיקה MTT

על ידי השוואת את viabilities של תאים כאשר נגוע baculovirus MdαE7 - ואת החתול-רקומביננטי במחקר MTT, מצאנו את הכדאיות משופרת של תאים כאשר המבטאים חלבונים MdαE7, אשר יכולים לתת תמיכה טובה את התפקידים מטבולית של carboxylesterases כדי פרמתרין בתאי חרקים להגן על תאים מפני נזקים כימיים (איור 4). במבחנה מטבולית המחקר, אשר מזוהה כשיטה ישיר כדי לשקף את היכולות מטבולית של carboxylesterases כלפי קוטלי חרקים, צריך גם כבר בחנו כדי לפצות על המגבלות של MTT assay בצורה טובה יותר אפיון חלבון פונקציות מטבוליות.

במחקר זה, הביטוי heterologous של carboxylesterases בתאים Sf9 חרקים עם מערכת בתיווך baculovirus ביטוי, את המדידה של תא viabilities לכיוון שונה הטיפול בפרמתרין מאת וזמינותו MTT, אפיון carboxylesterases דרך מטבוליזם במבחנה assay שכולנו נעבוד ביחד כדי לספק אסטרטגיה שיטתית, מדעי ומדויק לחקור את התפקידים של דטוקסיפיקציה לאנזימים חרקים, ובכך להקל על הבנה טובה יותר של חרקים מנגנוני עמידות, ובכך לפתח אסטרטגיות חדשניות לניהול הדברה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs inc. M0491L
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen by life technology K240020 S.O.C medium and universal M13 sequence primers were included in this kit.
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen by life technology K210002
Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirectTM Kits Invitrogen by life technology 11791-023
BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit Invitrogen by life technology 12562-019 Cellfectin transfection reagent and ganciclovir were included in this kit
pENTR-CAT plasmid Invitrogen by life technology Included in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentration: 0.5 ug/uL
Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified Gibco by Life Technologies 10082-139
Sf9 cells in Sf-900 III SFM Gibco by Life Technologies 12659017
Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction & Lysis Buffer G Biosciences by A Geno Technology Inc 786-411
Sf-900 III SFM (1×) Serum Free Medium Complete Gibco by Life Technologies 12658-019
Grace's Insect Medium, unsupplemented Gibco by Life Technologies 11595030
Permethrin (isomers) analytical standard SUPELCO by Solutions WithinTM 442748
Methanol (analytical graded) Sigma-Aldrich 67-56-1
Acetonitrile (analytical graded) Sigma-Aldrich 75-05-8
GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters with 0.45 μm GHP Membrane (HPLC Certified) Pall Life Sciences 21890388
Alliance Waters 2695 HPLC System Waters
T100 Thermal Cycle Bio-Rad Laboratories Inc. 1861096
Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometers ThermoFisher Scientific ND2000CLAPTOP
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader BioTek

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scott, J. G., et al. Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 377-384 (2013).
  2. Li, M., et al. A whole transcriptomal linkage analysis of gene co-regulation in insecticide resistant house flies, Musca domestica. BMC Genomics. 14, 803 (2013).
  3. Liu, N. Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions. Annual Review of Entomology. 60, 537-559 (2015).
  4. Grigoraki, L., et al. Transcriptome profiling and genetic study reveal amplified carboxylesterase genes implicated in temephos resistance, in the Asian tiger mosquito Aedes albopictus. e0003771. 9, e0003771 (2015).
  5. Grigoraki, L., et al. Carboxylesterase gene amplifications associated with insecticide resistance in Aedes albopictus: Geographical distribution and evolutionary origin. PLOS Neglected Tropical Diseases. 11, e0005533 (2017).
  6. Wheelock, C., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30, 75-83 (2005).
  7. Feng, X., Li, M., Liu, N. Carboxylesterase genes in pyrethroid resistant house flies, Musca domestica. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 30-39 (2018).
  8. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  9. Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).
  10. Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22 (12), 1583 (2004).
  11. Gong, Y., Li, T., Feng, Y., Liu, N. The function of two P450s, CYP9M10 and CYP6AA7, in the permethrin resistance of Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 7 (1), 587 (2017).
  12. Cao, C. W., Zhang, J., Gao, X. W., Liang, P., Guo, H. L. Overexpression of carboxylesterase gene associated with organophosphorous insecticide resistance in cotton aphids, Aphis gossypii (Glover). Pesticide Biochemistry and Physiology. 90 (3), 175-180 (2008).
  13. Zhang, L., Gao, X., Liang, P. Beta-cypermethrin resistance associated with high carboxylesterase activities in a strain of house fly, Musca domestica (Diptera: Muscidae). Pesticide Biochemistry and Physiology. 89, 65-72 (2007).
  14. Van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Cancer cell culture. , Humana Press. 237-245 (2011).
  15. Stockert, J. C., Blázquez-Castro, A., Cañete, M., Horobin, R. W., Villanueva, Á MTT assay for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid droplets. Acta Histochemica. 114 (8), 785-796 (2012).
  16. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. , A3-B (2001).
  17. Riss, T. L., Moravec, R. A., Niles, A. L., Duellman, S., Benink, H. A., Worzella, T. J., Minor, L. Cell viability assays. Assay Guidance Manual. , (2013).
  18. Wheelock, C. E., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30 (2), 75-83 (2005).
  19. Li, X., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics. Annual Review of Entomology. 52, 231-253 (2007).
  20. Nakamura, Y., et al. The in vitro metabolism of a pyrethroid insecticide, permethrin, and its hydrolysis products in rats. Toxicology. 235 (3), 176-184 (2007).
  21. Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. The protein protocols handbook. , Humana Press. 15-21 (2002).
  22. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
  23. Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22 (12), 1583 (2004).
  24. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211 (2006).
  25. Bulter, T., et al. Functional expression of a fungal laccase in Saccharomyces cerevisiae by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 69 (2), 987-995 (2003).
  26. Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).

Tags

ביוכימיה גיליון 138 עמידות חרקים carboxylesterases בתיווך baculovirus תא חרקים ביטוי מערכת cytotoxicity assay וזמינותו חילוף החומרים חוץ גופית בתוך
אפיון פונקציונלי Carboxylesterases הבית בקוטלי חרקים עמידים בזבובים, <em>דומסטיקה זבוב</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feng, X., Liu, N. Functional… More

Feng, X., Liu, N. Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica. J. Vis. Exp. (138), e58106, doi:10.3791/58106 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter