Summary
Здесь мы представляем протокол производить дом летать carboxylesterase белков в пробирке с системой выражение насекомых клеток бакуловирусы опосредованной и позднее функционально характеризуют их роли в метаболизм перметрин, таким образом, присвоение пиретроиды сопротивление путем проведения на основе клеток МТТ пробирного и в пробирке метаболических исследований.
Abstract
Считается, что Carboxylesterase опосредованной метаболизм играть важную роль в инсектицидам в различных насекомых. Несколько carboxylesterase гены были найдены вверх регулируются летать штамм устойчив дом, тогда как их роль в присвоении инсектицидам предстоит изучить. Здесь мы разработали протокол для функциональных характеристик carboxylesterases. Представлены три примера эксперименты: (1) выражение и изоляции carboxylesterase белков через бакуловирусы опосредованной насекомое Spodoptera frugiperda (Sf9) клеток выражение системы; (2 на основе клеток МТТ (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-ил] -2, 5-diphenyltetrazolium бромид) анализа цитотоксичности измерить толерантности насекомых клеток для лечения различных перметрин; и (3) в vitro метаболических исследования для изучения возможности метаболических carboxylesterases сторону перметрин. Джин carboxylesterase, что MdαE7 был клонирован с устойчивостью дома летать штамм ALHF и используется для конструирования рекомбинантных бакуловирусы Sf9 клетки инфекции. Жизнеспособность клеток против различных перметрин лечения были измерены с МТТ assay. Расширение ячейки терпимости экспериментальной группы (MdαE7-рекомбинантных бакуловирусы инфицированных клеток) по сравнению с теми из групп управления перметрин (CAT-рекомбинантных бакуловирусы инфицированных клеток и GFP-рекомбинантных бакуловирусы инфицированных клеток) лечение предложил возможности MdαE7 в метаболизм инсектицидов, тем самым защищая клетки от химических повреждений. Кроме того carboxylesterase белки были выражена в насекомое Sf9 клеток и изолированные провести исследование метаболизма в пробирке . Наши результаты показали значительный в vitro метаболические эффективность MdαE7 сторону перметрин, прямо указывающее участия carboxylesterases в метаболизм инсектицидов и таким образом наделение инсектицидам в доме мух.
Introduction
Резистентность к инсектицидам в настоящее время является серьезной проблемой дом летать контроль во всем мире1,2. Попытки определить механизм инсектицидам способствует лучшему пониманию этого вопроса и таким образом обеспечивают Роман стратегии эффективно предотвратить или свести к минимуму Распространение сопротивления развития3. Carboxylesterases, как один из основных детоксикации ферментов, привлекли много внимания из-за их роли в поглощения и метаболизма инсектицидов в различных насекомых4,5,6. Наши предыдущие исследования выявил несколько carboxylesterases в доме мух и их уровни выражения были не только конститутивно вверх регулируются резистентными штаммами ALHF, но также может быть индуцированных для более высоких уровнях в ответ на перметрин лечения7 . Однако функциональные характеристики этих carboxylesterase генов в метаболизм инсектицидов по-прежнему быть изучены.
После представления первого доклада в начале 1980-х8бакуловирусы опосредованной иностранных ген выражение системы широко используются из-за его эффективности производства высоким содержанием белка и эукариотических белка, обработки возможностей9. Эта двойная система состоит из двух основных элементов: сконструированный рекомбинантных бакуловирусы доставки чужеродных генов в клетки хозяина и крупномасштабных выражение заинтересованных белков в клетках, инфицированных рекомбинантного бакуловирусы. За последние десятилетия бакуловирусы опосредованной клеток выражение системы широко используется производить тысячи рекомбинантных белков, начиная от цитозольной ферментов с белками мембраны прыгните насекомых и млекопитающих клеток10. Наши предыдущие исследования успешно выразил несколько CYP450 ферментов насекомых Sf9 клетки с этой системы11. В этом исследовании, мы построен carboxylesterase рекомбинантных бакуловирусы заразить клетки насекомого Sf9, изучаются терпимости клеток для лечения различных перметрин и крупномасштабных выраженной carboxylesterase белков в пробирке для функциональных разведки. Вместо того, чтобы расследование нескольких carboxylesterase изоферменты смеси от насекомых гомогенатах, принятый ранее исследования12,13, эта система выражение бакуловирусы опосредованной насекомых клеток позволяет конкретное выражение и изоляция целевых белков для лучшего изучения их биохимических и структурных свойств.
Пробу на основе соли tetrazolium (МТТ) является высок объём колориметрическим методом разработаны и оптимизированы для измерения жизнеспособности клеток. Этот assay основан на механизме, который только живые клетки способны метаболизировать реагент МТТ желтый цвет к темный фиолетовый Цветные Формазаны осадок, который может быть проанализирован нелабильном после того, как растворяется в органических растворителях14, 15. Несколько более точным, но много времени методы, такие как Трипановый синий изоляции и тимидина титрования пробирного16,17, были разработаны в последние годы. Однако на основе клеток МТТ пробирного до сих пор в настоящее время признается как метод наиболее быстрым и легко управлять быстро обнаружить жизнеспособность клеток. Здесь мы используем МТТ assay для изучения клеток терпимость против инсектицидами лечения. Повышение толерантности клеток когда инфицированных рекомбинантного бакуловирусы carboxylesterase решительно поддерживает метаболические функции carboxylesterases чтобы инсектициды, которые в свою очередь предполагает их участие в инсектицидам.
Кроме того в пробирке метаболических assay также было проведено в этом исследовании. По сравнению с общим carboxylesterase анализов, которые используют общие субстратов, например α-napthyl ацетат (α-NA) и β-naphthyl ацетат (β-NA) для отражения гидролитическая деятельности carboxylesterases, исследование метаболизма в vitro рассматривается как точный способ для прямого измерения деятельности carboxylesterases к инсектицидам18. Этот метод успешно работает в различных насекомых характеризовать множественные цитохрома P450s совместно с инсектицидами сопротивление11,19,20. Однако этот метод еще не применяется в carboxylesterase исследованиях. При наличии carboxylesterase белков, производимые бакуловирусы опосредованной выражение системы мы можем выполнить в vitro метаболических исследование carboxylesterases сторону перметрин, который далее может предоставить убедительные доказательства участия из carboxylesterases в присвоении пиретроид сопротивления в доме мух.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. выражение и изоляции целевых белков с системой выражение бакуловирусы опосредованной насекомых ячейки
- Направленно клонирования туп законченному продуктов ПЦР целевых белков из дома мух.
- Дизайн праймеры PCR зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) и дом летать MdαE7 гена, на основе их последовательности и специальные требования выбранного вектора (Таблица 1).
- Термостабильные, корректура ДНК-полимеразы и грунты из шага 1.1.1 использовать для выполнения реакции PCR 150 мкл, (30 мкл буфера реакции, 3 мкл дНТФ 10 мм, 1.5 мкл ДНК-полимеразы, 6 мкл дом летать шаблон ДНК, 7,5 мкл вперед грунтовка 7,5 мкл обратного грунт, с водой, окончательный объем 150 мкл). Тепло реакции PCR до 98 ° C за 30 сек, после 35 циклов 98 ° C 10 s, 53 ° C за 30 s и 72 ° C для 60 s, а затем окончательное расширение при 72 ° C на 2 мин).
- Запуск гель агарозы 1% с 150 мкл продукта PCR.
- Акцизный целевых фрагментов ДНК от агарозы гель с острый, чистый скальпель: 1317 bp для MdαE7 и 858 bp для GFP. Очищайте ДНК с помощью коммерчески доступных гель kit извлечения после производителя протокол (Таблица материалов). Растворите очищенная ДНК в 15 мкл дистиллированной воды.
- Запуск гель агарозы 1% с 1 мкл очищенная ДНК для проверки целостности. Используйте другой 1 мкл очищенная ДНК для измерения концентрации с спектрофотометра.
- Создать запись плазмиду для целевых белков
- Настройка клонирования реакции. Mix свежезаваренным очищены ДНК продуктов из шага 1.1.3 и коммерчески доступные записи векторов содержащий attL-сайты (Таблица материалов) на молярное соотношение 1:1 (0,5-2 мкл свежего продукта ПЦР в 70-200 нг/мкл концентрациях: 0.5 мкл вектор). Затем добавить 1 мкл коммерчески доступных солевого раствора (1,2 М NaCl2 и 0,06 М MgCl2) и добавить воду, чтобы окончательный объем 6 мкл. Осторожно перемешать и инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Передача 4 мкл клонирования продуктов реакции в шаг 1.2.1 в 50 мкл химически сведущее Escherichia coli клетки. Инкубируйте на льду на 30 мин теплового шока клетки для 30 s в ванну воды 42 ° C без встряхивания.
- Положите трубку обратно в ice для еще 2 мин внести 250 мкл концентрированного комнатной температуре S.O.C. среды (2% Триптон; 0,5% дрожжевой экстракт 10 мм NaCl; 2,5 мм KCl; 10 мм MgCl2; 10 мм MgSO4; 20 мм глюкозы). Инкубируйте при 37 ° C за 1 час с нежно тряска.
- Распространения 50-200 мкл бактериальной культуры на шаге 1.2.3 на выборочной фунтов пластин (1 g Триптон; 0,5 г экстракта дрожжей; 1 г NaCl 1.5 g агар, растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Автоклавы и добавить 0,1% канамицин 50 мг/мл). Инкубируйте фунтов пластин для 16 ч при 37 ° C для роста колонии.
- Выбрать 5-10 колоний и вновь приостановить их индивидуально в 5 мкл дистиллированной воды.
- Выполнять ПЦР, добавив 5 мкл буфера реакции, 0.5 мкл 10 мм дНТФ, 0,25 мкл ДНК-полимеразы, 1 мкл взвешенных колоний, 1,25 мкл 10 мкм M13 вперед грунт, 1,25 мкл 10 мкм обратный грунтовка целевых генов, и воды, чтобы конечный объем 25 мкл. тепло PCR реакция на 98 ° C за 30 сек, после 35 циклов 98° C 10 s, 53 ° C за 30 s и 72 ° C для 60 s, а затем окончательное расширение при 72 ° C на 2 мин (Таблица 1).
- Повторно культура 3 мкл взвешенных колоний от шага 1.2.5 в ТБ СМИ фосфатного буфера, содержащий 0,17 М х2PO4 и 0,72 М K2HPO4 с 450 мл среды базового бульон, содержащий 6 g Триптон, 12 г дрожжей и 2 мл (100 мл. глицерин, стерилизованные, содержащие 0,1% 50 мг/мл канамицин) для 16 h. Экстракт Ультрачистые плазмида ДНК после производителя протокол.
- Использование 200 нг/мкл ультра-чистой плазмида с шагом 1.2.7 для коммерческих Сэнгер виртуализации с праймерами прямого и обратного M13. Проверьте правильность подсоединения целевого гена в векторе, основанный на карте последовательности, предоставленный производителем.
- Храните проверки последовательности Ультрачистые плазмида ДНК образцов MdαE7 и GFP в-20 ° C.
Примечание: Это запись плазмида ДНК MdαE7 и GFP.
- Постройте рекомбинантных бакуловирусы, выполняя лямбда реакции рекомбинации (LR).
- Соответственно смешайте 1 мкл 300 нг/мкл запись плазмидной ДНК гена GFP, MdαE7 из шага 1.2.7 или запись плазмида ДНК гена хлорамфеникол ацетилтрансфераза (CAT) предоставляемые комплект transfection клетки с 5 мкл коммерчески доступных (содержащий attL сайтов) C-срок линейной ДНК (содержащие attR сайты) в 250 мкл ПЦР пробирок. Добавьте TE буфер, чтобы сделать общий объем 8 мкл.
Примечание: Реакции GFP и кошки были использованы в качестве контрольных групп. - 2 мкл коммерчески доступных лямбда рекомбинации (LR) фермент смесь (Таблица материалов) в каждой смеси шага 1.3.1 катализируют реакции LR. Осторожно смешать и инкубировать при 25 ° C ночь (≈16 h).
Примечание: LR реакции облегчает рекомбинации attL-содержащих запись плазмидной ДНК с attR-содержащих линейной ДНК C-срок для создания att, B-содержащих выражая вирус. Этот шаг создает рекомбинантных бакуловирусы для каждого целевого белка. - Разбавьте 1 мкл LR продуктов реакции от шага 1.3.2 20 X. Выполнить с помощью Polyhedrin вперед праймера PCR и V5 вспять грунт (Таблица 1). Используйте 5 мкл продуктов ПЦР для запуска гель агарозы 1% для проверки качества. Рисунок 1 показывает пример продукта реакции LR от гена MdαE7.
- Соответственно смешайте 1 мкл 300 нг/мкл запись плазмидной ДНК гена GFP, MdαE7 из шага 1.2.7 или запись плазмида ДНК гена хлорамфеникол ацетилтрансфераза (CAT) предоставляемые комплект transfection клетки с 5 мкл коммерчески доступных (содержащий attL сайтов) C-срок линейной ДНК (содержащие attR сайты) в 250 мкл ПЦР пробирок. Добавьте TE буфер, чтобы сделать общий объем 8 мкл.
Рисунок 1: пример результатов MdαE7 LR реакции ПЦР анализа. Развести 2 мкл LR реакции кратное и использовать 2 мкл разбавления вместе с Polyhedrin вперед грунт и V5 обратный грунтовка для выполнения 25 мкл ПЦР. Используйте 5 мкл продуктов ПЦР для запуска гель агарозы 1% для проверки качества LR реакции. a
- Transfect насекомых Sf9 клетки
- Культура насекомых Sf9 клетки с 5 мл полное клеток роста средних (средний сыворотки свободный с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС)) в T25 лечение колбы в 27 ˚C.
- Удалить супернатант и очистить дно придают клетки с 3 мл свежего полный клеток роста средних. Перевести 0,5 мл вновь приостановлено клеток в новой T25 лечение колбу. Добавьте 4,5 мл средство полного роста. Инкубируйте на 27 ° C для 3-4 дней до следующей передачи.
- Семенной 2 мл лаг фазы роста насекомых Sf9 клетки культуры (≈3.0-5,0 × 106 клеток) равномерно на культуре клеток хорошо. Позволяют клеткам приложить для по крайней мере 3 ч при комнатной температуре в капюшоне.
- Проверьте ячейки вложение, наблюдая с инвертированным микроскопом фазы на 250 X. Удалите средство культуры клеток и заменить 2 мл Грейс насекомых среды.
- Подготовить трансфекции смесь A решение (8 мкл Реагента инфекции коммерчески доступных ячеек (Таблица материалов) с 100 мкл Грейс насекомых среды) и трансфекции смесь B решение каждого целевого гена (9 мкл LR продуктов реакции от шага 1.3 с 100 мкл unsupplemented Грейс насекомых среды) в 1,5 мл центрифуга трубы, соответственно.
- Осторожно Смешайте трансфекции смесь A и B, нажав трубы. Инкубируйте на комнатной температуре 35 мин в капюшоне.
- Равномерно добавьте смесь из шага 1.4.6 каплям на клетки в сеяный от шага 1.4.4. Печать скважин с лентами и Инкубируйте на 27 ° C ночью.
- Замените 2 мл Грейс насекомых среды с 2 мл средство полного роста. Добавьте 100 мкм ганцикловир в каждой скважине отрицательно выбрать против не рекомбинантных бакуловирусы. Печать скважин с лентой и Инкубируйте на 27 ° C в течение 72 ч.
- Собирать 72 h пост инфекции клеток культуры среднего от каждой скважины и передачи для 1.5 мл пробирок. Центрифуга на 1500 g x 5 мин при 4 ° C для удаления ячейки или большой мусора.
- Перенесите супернатант в новый 1,5 мл пробирок. Храните при 4 ° C с защитой от света.
Примечание: Это P1 вирус акций решения для каждого целевого гена. - Усилить низкий титр P1 вирусные акции (1 × 10-5-1 × 106 ОРП/мл) на высокий титр P2 вирусные акции (5 × 107-1 × 10,8 ОРП/мл).
- Семенной 2 мл лаг фазы роста насекомых Sf9 клетки культуры (≈3.0-5,0 × 106 клеток) равномерно на культуре клеток хорошо. Позволяют клеткам приложить для по крайней мере 3 ч при комнатной температуре в капюшоне.
- Прививать 5 мкл запасов вируса P1, полученный на шаге 1.4.10 в ячейке семенами и шаг 1.4.12, соответственно. Затем добавьте 100 мкм ганцикловир в каждой скважине. Печать скважин и Инкубируйте на 27 ° C в течение 72 ч.
- Собирайте P2 вирус акций решения 72 h пост инфекции. Хранить при 4 ° C с защитой от света.
Примечание: Это вирус акций решения P2 для каждого целевого гена. - (Необязательно) Повторите шаги 1.4.12-1.4.14 с 5 мкл акций вирус P2 для сбора P3 вирус акций решения.
Примечание: Это вирус акций решения P3 для каждого целевого гена. - Храните все построенные бакуловирусы при 4 ° C с защитой от света.
Примечание: Гена GFP и кошки были служил в качестве контрольной группы. Рисунок 2 показал признаки клеток когда заражен GFP-рекомбинантных бакуловирусы на этапах различные усилители.
Рисунок 2: пример зараженного признаков Sf9 клеток на этапах амплификация различных бакуловирусы. На рисунке GFP-рекомбинантных бакуловирусы клетки под естественный свет и флуоресцентный свет. На стадии инфекции P1 коэффициент инфицирования является низким. На стадии инфекции P2 коэффициент инфицирования был значительно расширен. На стадии заражения P3 почти все клетки показали симптомы отрешенности от плиты культуры клеток, увеличивает диаметр ячеек, а также прекращение роста клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- Крупномасштабные выражение целевых белков в клетках насекомых Sf9
- Культура 10 мл журнала фазы роста насекомых Sf9 клеток с полный рост среднего T25-лечение колбы.
- 200 мкл P2 вирус раствор (полученные на шаге 1.4.14), чтобы заразить клеточных культур в шаге 1.5.1 за 72 ч.
- Собирайте 72 h пост инфекции клеток питательной среды. Центрифуга на 1500 x g 5 мин при 4 ° C.
- Выбросите супернатанта и мыть гранулы дважды с 1 мл 0,1 М PBS буфера (рН 7,5).
- Полностью растворяют гранулы клеток с 1 мл раствора насекомых клеток белка добычу и буфера lysis (Таблица материалов). Добавьте 10% глицерина в лизис клеток. Сразу же хранить при температуре-80 ° C.
- Повторите шаги 1.5.1-1.5.5 с P2 вирус раствор CAT белков в качестве контрольной группы.
Примечание: Повторите шаг 1,5 в трех экземплярах для различных белковых препаратов.
2 на основе клеток МТТ цитотоксичность Assay
- Культура 5 мл журнала фазе роста (1,5-2,5 × 106 клеток/мл) насекомых Sf9 клеток с полный рост среднего T25-лечение колбы.
- 25 мкл P1 вирус раствор (полученные на шаге 1.4.14), с тем чтобы заразить клеточных культур в шаге 2.1 за 48 ч с нежным встряхивания на 27 ˚C.
- Подготовка 100 мм перметрин стандартные складе решения в ацетонитриле. Используйте ацетонитриле, чтобы разбавить 50 мм, 25 мм, 12,5 мм и 6,25 мм, добавляя 500 мкл, 250 мкл, 125 мкл и 62,5 мкл перметрин Стоковый раствор в общем объеме 1000 мкл, соответственно.
- Равномерно семян 200 мкл зараженных клеточных культур от шага 2.2 дополнена 300 мкл среднего полного роста в 24-ну пластину на плотности тарелок5 2 × 10 кл/мл.
- Мкл 4 стандартных растворов перметрин (6,25 мм, 12,5 мм, 25 мм и 50 мм) в каждой скважине сделать окончательный концентрации 50 мкм, 100 мкм, 200 мкм и 400 мкм, соответственно. Только мкл 4 Ацетонитрил в скважины для расчетов жизнеспособность клеток (рис. 3).
- Печать пластины с лентами и Инкубируйте на 27 ° C в течение 48 часов с защитой от света.
- Подготовить 5 мг/мл реагента MTT (Thiazolyl Blue Tetrazolium бромид) растворяют в буфере (2,0 г NaCl, 0,05 г KCl, 0,36 г NaH,2PO4∙2H2O, 0,28 g NaH2PO40,05 г х2PO4 растворяют в 200 мл дистиллированной воды, рН 7,5).
- Удалите ячейку культуры среднего из шага 2.6 после 48 ч инкубации без касатьться слой придает нижней клетки. Добавьте 200 мкл Реагента MTT на шаге 2.7 в каждой скважине. Инкубируйте при 37 ° C за 4 ч до тех пор, пока темно фиолетовый Формазаны преципитаты сформированная в каждой скважине (рис. 3).
- Инкубируйте при 37 ° C за 4 ч до тех пор, пока темно фиолетовый Формазаны осаждает формы в каждой скважине. 500 мкл ДМСО полностью растворить преципитаты (рис. 3).
Рисунок 3: пример результатов MTT. После 48 ч пост инфекции с P1 вирус Стоковый раствор CAT рекомбинантных бакуловирусы решения, равномерно семян 500 мкл клетки выражения гена CAT в пластине 24-ну клетки культуры. Соответственно добавьте 4 мкл перметрин в различных дозах (6,25 мм, 12,5 мм, 25 мм и 50 мм) в каждой строке, чтобы сделать окончательный концентрации до 50 мкм, 100 мкм, 200 мкм и 400 мкм. Строка элемента управления был относиться с Ацетонитрил только и помечены как CK в пластине. (A) после 48 ч инкубации при 27 ° C отказаться от среднего культуры клеток на верхний слой и замените 200 мкл желтого цвета МТТ реагентов. Затем Инкубируйте на 37 ° C в течение 48 ч. темно-фиолетовый Цветные снижения осаждает форму в каждом хорошо о том, что выживание клетки способные метаболизировать желтый цвет МТТ реагентов в темный фиолетовый Цветные осадок. (B) 500 мкл растворителя ДМСО был добавлен в каждой скважине распустить сформированного преципитата. Значение absorbance каждого хорошо был обнаружен спектрофотометр на 540 Нм. По мере увеличения концентрации перметрин, цвет будет постепенно меняться от темно-красного до светло-красный, предполагая, что жизнеспособность клеток постепенно снижалась. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- Перевести 200 мкл раствора растворяют в 96-луночных пластины. Измерения оптической плотности на 540 Нм, используя Считыватель микропланшетов (Таблица материалов).
- Вычислить жизнеспособность клеток, сравнивая значения поглощения перметрин лечение клеток с тех клеток, Ацетонитрил лечить только.
- Для контрольной группы повторите все шаги с P2 вирус Стоковый раствор хлорамфеникол рекомбинантных бакуловирусы ацетилтрансфераза (CAT) полученный на шаге 1.4.
- Повторите 4 раза для подготовки различных вирусов.
3. в Vitro метаболического анализа
- Подготовка 100 мм перметрин стандартные складе решения в ацетонитриле. Используйте ацетонитриле, чтобы разбавить 50 мм, 25 мм, 12,5 мм и 6,25 мм. Обнаружить соответствующие площади пика под каждой концентрации с помощью ВЭЖХ. Создание и расчет калибровочной кривой перметрин, основанный на площади пика с различными перметрин концентрации.
- Измерьте концентрацию белка на шаге 1.5 с Брэдфорд методы21.
- Готовить 700 мкл метаболические реакции с 40 мкм перметрин стандарта и 1 мг белков, полученного на шаге 1.5 растворенных в 0,2 М трис-HCl буфере (рН 7,4). Инкубируйте на 30 ° C в течение 2 ч с нежным встряхивания. Защищайте от света.
- Утолите реакции, добавив 700 мкл ледяной ацетонитриле. Инкубируйте на 30 градусов для еще 30 мин с нежным встряхивания. Защищайте от света.
- Центрифуга реакционной смеси в 16000 x g на 2 мин при комнатной температуре. Собирайте супернатант и процеживают через мембрану 0,45 мкм. Перенесите фильтрации в ultraclean коричневого стекла флаконы для ВЭЖХ анализа.
- Запустите ВЭЖХ при оптимальных условиях хроматографического (мобильный этап A: Ацетонитрил 90% и 10% водой; Подвижная фаза B: 5% Ацетонитрил скорректирована с рН 2,3 с 85% фосфорной кислоты). Градиент элюировать с расходом 1 мл/мин и измерения на длине волны 232 Нм.
- Вычислить процент истощения перметрин, сравнивая с реакции без добавлен образец протеина.
- Используйте кошки белка, полученный на шаге 1.5.6 в качестве элемента управления.
- Повторите все шаги с различных белковых препаратов в шагом 1.5.7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Жизнеспособность клеток к лечения различных перметрин (МТТ проба)
Цитотоксичность перметрин рассматривался в MdαE7-рекомбинантных бакуловирусы инфицированных Sf9 клетки (экспериментальная группа) и CAT-рекомбинантных бакуловирусы (предоставляется комплект бакуловирусы инфицированных) зараженные клетки (контрольные группы). Расширение ячейки допуски перметрин в MdαE7 решительно выражая клетки поддерживают метаболических функций этой carboxylesterase против инсектицидов и таким образом защищая клетки от химических повреждений. В нашем исследовании, жизнеспособность клеток против концентрации различных перметрин (50, 100, 200 и 400 мкм) была рассчитана по сравнению с клетки лечат Ацетонитрил только. Наши результаты показали, что жизнеспособность MdαE7 выражая клетки была значительно выше (от 86,00% до 101.92%) (Рис. 4B) чем у управления клеток (от 67.59% до 81.43%) (Рис. 4A) при контакте с перметрин в различных концентрациях, указывающее важную роль MdαE7 в метаболизм перметрин в клетках насекомых.
Рисунок 4: жизнеспособность клеток насекомых Sf9 при различных перметрин лечения. (A) жизнеспособности клетки управления инфицированных рекомбинантного бакуловирусы CAT (B жизнеспособность экспериментальной клеток, инфицированных рекомбинантного бакуловирусы MdαE7. Для каждого перметрин концентрации были проведены четыре репликаций. Данные показали как среднее ± SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
В vitro метаболизм перметрин, MdαE7
Перметрин метаболизма был assayed путем инкубации 40 мкм перметрин стандартного решения вместе с MdαE7 белками, извлеченные из инфицированных клеток Sf9. Реакции с CAT белков, служил в качестве элементов управления. Истощение процент перметрин рассчитывалась по сравнению с реакции без фермента добавил. Реакции были под наблюдением реверс фаза ВЭЖХ после инкубационного периода 120 мин. Поскольку стандарт перметрин является на самом деле смесь цис - и транс изомеров, две вершины были замечены в ВЭЖХ хроматографические профили, с элюции времена 10,67 мин и 10,87 мин для транс перметрин и СНГ перметрин, соответственно (рис. 5). Истощение доля перметрин, MdαE7 белков (39.18±3.78%), была значительно выше, чем у кошки белков (7.29±0.81%) (Рис. 6), который является не только согласуется с МТТ результаты, но также непосредственно демонстрирует возможности MdαE7 в метаболизм перметрин в пробирке.
Рисунок 5: ВЭЖХ профиль перметрина стандарт. Перметрин стандарт используется в настоящем исследовании представляет собой смесь изомеров транс перметрин и СНГ перметрин. Красные стрелки указывают вершины для изомера trans перметрин и СНГ перметрин изомера, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: В пробирке метаболизм перметрин, MdαE7 и Кот рекомбинантных белков. Истощение проценты перметрин, MdαE7 и Кот белки были рассчитаны. Для каждого перметрин концентрации были проведены три репликаций. Данные показали как среднее ± SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В последние десятилетия гетерологичных выражение системы широко использовались выразить и изолировать большое количество белков, таким образом позволяя биохимических и функциональных определение и характеристика ферментов в пробирке. На сегодняшний день, были адаптированы для рекомбинантных белков и выбор несколько различных моделей систем, включая кишечная палочка, Pichia сумка, Sacccharomyces cerevisiaeи Spodoptera frugiperda в vitro системы имеет решающее значение для больших масштабах поколения заинтересованных белки22,23,24,25. В нашем исследовании системе выражение бакуловирусы опосредованной насекомых ячейки для создания дом летать carboxylesterases был выбран потому что он предоставляет аналогичные внутриклеточную среду для насекомых клеток и поддерживает некоторые возможности важных эукариотических обработки 9. Несмотря на преимущества бакуловирусы опосредованной выражая системы, следует также учитывать его ограничения. Бакуловирусы опосредованной насекомых клеток выражение система может производить белков-мишеней, только если насекомых клетки были заражены построенных рекомбинантных бакуловирусы. Нынешний уровень развития создание стабильно преобразованные насекомых клеточных линий стало возможным не только производить конститутивно заинтересованных белков в отсутствие бакуловирусы инфекции, но и улучшить возможности клеток glycosylating и складные сгенерированный белков через инженерные изменения9.
Лучше изучить роль carboxylesterases в метаболизм инсектицидов в клетках и таким образом защищая клетки от химических повреждений, МТТ assay был проведен для измерения цитотоксичности клетки против различных перметрин лечения. В ходе этого процесса много экспериментальных параметры, связанные с метаболизм клеток, клеток средних композиции, темпы роста клеток, концентрации и потребление энергии питания метаболитов, могут влиять МТТ сокращения и тем самым привести к неточной результаты. Чтобы свести к минимуму более / недооценка МТТ assay, сохранить клетки питательной среды, состояния роста клеток и условия инкубации согласованность среди различных экспериментальное лечение26. Для того, чтобы определить эффекты жизнеспособность клеток, вызванные бакуловирусы инфекции, вместо того, чтобы перметрин, мы показали, что процесс инфицирования GFP-рекомбинантных бакуловирусы насекомых Sf9 клетки и обнаружил, что на стадии инфекции P2, клетки имеют самые высокие коэффициент инфицирования с низкие соотношения смерти ячейки, по сравнению с с других стадиях инфекции (рис. 2). Это можно лучше объяснить причину выбора ячейки на стадии инфекции P2 для проведения анализа МТТ.
Сравнивая жизнеспособность клеток при инфекционном MdαE7 - и CAT-рекомбинантных бакуловирусы в исследовании MTT, мы нашли повышение жизнеспособности клеток при выражении MdαE7 белков, которые могут лучше поддерживать метаболизм роли carboxylesterases перметрин в клетках насекомых и защищают клетки от химических повреждений (рис. 4). В vitro метаболических исследование, которое признается как прямой метод отражает метаболических возможности carboxylesterases к инсектицидам, следует также были изучены для компенсации ограничения анализа МТТ лучше характеризующих белка метаболические функции.
В этом исследовании, гетерологичных выражение carboxylesterases клетках насекомых Sf9 с системой бакуловирусы опосредованной выражение, измерение жизнеспособность клеток к различных перметрин лечения путем анализа МТТ и квалификация carboxylesterases через метаболизм в vitro пробирного все работают вместе для обеспечения систематического, научного и точной стратегии для изучения роли энзимы detoxification в насекомых, способствуя тем самым лучшему пониманию инсектицидов механизмы сопротивления и тем самым разработке новаторских стратегий для борьбы с вредителями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs inc. | M0491L | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen by life technology | K240020 | S.O.C medium and universal M13 sequence primers were included in this kit. |
| PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen by life technology | K210002 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirectTM Kits | Invitrogen by life technology | 11791-023 | |
| BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit | Invitrogen by life technology | 12562-019 | Cellfectin transfection reagent and ganciclovir were included in this kit |
| pENTR-CAT plasmid | Invitrogen by life technology | Included in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentration: 0.5 ug/uL | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified | Gibco by Life Technologies | 10082-139 | |
| Sf9 cells in Sf-900 III SFM | Gibco by Life Technologies | 12659017 | |
| Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction & Lysis Buffer | G Biosciences by A Geno Technology Inc | 786-411 | |
| Sf-900 III SFM (1×) Serum Free Medium Complete | Gibco by Life Technologies | 12658-019 | |
| Grace's Insect Medium, unsupplemented | Gibco by Life Technologies | 11595030 | |
| Permethrin (isomers) analytical standard | SUPELCO by Solutions WithinTM | 442748 | |
| Methanol (analytical graded) | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | |
| Acetonitrile (analytical graded) | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | |
| GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters with 0.45 μm GHP Membrane (HPLC Certified) | Pall Life Sciences | 21890388 | |
| Alliance Waters 2695 HPLC System | Waters | ||
| T100 Thermal Cycle | Bio-Rad Laboratories Inc. | 1861096 | |
| Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek |
References
- Scott, J. G., et al. Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 377-384 (2013).
- Li, M., et al. A whole transcriptomal linkage analysis of gene co-regulation in insecticide resistant house flies, Musca domestica. BMC Genomics. 14, 803 (2013).
- Liu, N. Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions. Annual Review of Entomology. 60, 537-559 (2015).
- Grigoraki, L., et al. Transcriptome profiling and genetic study reveal amplified carboxylesterase genes implicated in temephos resistance, in the Asian tiger mosquito Aedes albopictus. e0003771. 9, e0003771 (2015).
- Grigoraki, L., et al. Carboxylesterase gene amplifications associated with insecticide resistance in Aedes albopictus: Geographical distribution and evolutionary origin. PLOS Neglected Tropical Diseases. 11, e0005533 (2017).
- Wheelock, C., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30, 75-83 (2005).
- Feng, X., Li, M., Liu, N. Carboxylesterase genes in pyrethroid resistant house flies, Musca domestica. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 30-39 (2018).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).
- Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22 (12), 1583 (2004).
- Gong, Y., Li, T., Feng, Y., Liu, N. The function of two P450s, CYP9M10 and CYP6AA7, in the permethrin resistance of Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 7 (1), 587 (2017).
- Cao, C. W., Zhang, J., Gao, X. W., Liang, P., Guo, H. L. Overexpression of carboxylesterase gene associated with organophosphorous insecticide resistance in cotton aphids, Aphis gossypii (Glover). Pesticide Biochemistry and Physiology. 90 (3), 175-180 (2008).
- Zhang, L., Gao, X., Liang, P. Beta-cypermethrin resistance associated with high carboxylesterase activities in a strain of house fly, Musca domestica (Diptera: Muscidae). Pesticide Biochemistry and Physiology. 89, 65-72 (2007).
- Van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Cancer cell culture. , Humana Press. 237-245 (2011).
- Stockert, J. C., Blázquez-Castro, A., Cañete, M., Horobin, R. W., Villanueva, Á MTT assay for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid droplets. Acta Histochemica. 114 (8), 785-796 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. , A3-B (2001).
- Riss, T. L., Moravec, R. A., Niles, A. L., Duellman, S., Benink, H. A., Worzella, T. J., Minor, L. Cell viability assays. Assay Guidance Manual. , (2013).
- Wheelock, C. E., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30 (2), 75-83 (2005).
- Li, X., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics. Annual Review of Entomology. 52, 231-253 (2007).
- Nakamura, Y., et al. The in vitro metabolism of a pyrethroid insecticide, permethrin, and its hydrolysis products in rats. Toxicology. 235 (3), 176-184 (2007).
- Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. The protein protocols handbook. , Humana Press. 15-21 (2002).
- Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
- Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22 (12), 1583 (2004).
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211 (2006).
- Bulter, T., et al. Functional expression of a fungal laccase in Saccharomyces cerevisiae by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 69 (2), 987-995 (2003).
- Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
