Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Funktionell karakterisering av Carboxylesterases i insektsmedel resistenta hus flugor, Musca Domestica

Published: August 23, 2018 doi: 10.3791/58106
Automatic Translation
1, 1
1Department of Entomology and Plant Pathology, Auburn University

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att producera house fly karboxylesteras proteiner i vitro med en baculoviridae medierad insekt cell uttryck systemet och senare funktionellt präglar deras roller i Fettnedbrytande permetrin, därmed ger pyretroidbaserade motstånd av cellbaserade MTT assay och in vitro- metaboliska studier.

Abstract

Karboxylesteras-medierad metabolism tros spela en viktig roll i insektsmedel resistens hos olika insekter. Flera karboxylesteras gener hittades uppreglerat i resistenta house fly stam, medan deras roller i ger insektsmedel resistens återstod för att utforskas. Här har vi utformat ett protokoll för funktionell karakterisering av carboxylesterases. Tre exempel experiment presenteras: (1) uttryck och isolering av karboxylesteras proteiner genom en baculoviridae-medierad insekt Spodoptera frugiperda (Sf9) cell uttryck systemet; (2) en cellbaserade MTT (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-yl] -2, 5-diphenyltetrazolium bromid) cytotoxicitet analys att mäta toleransen av insekt celler på olika permetrin behandlingar. och (3) i vitro metabola studier att utforska de metaboliska funktionerna i carboxylesterases mot permetrin. Karboxylesteras genen MdαE7 klonats från en resistent hus flyga stam ALHF och används för att konstruera en rekombinant baculoviridae Sf9 celler angripits. De cellen förmåga mot olika permetrin behandlingar mättes med MTT-analys. Förbättrad cell toleransen för den experimentella gruppen (MdαE7-rekombinant baculoviridae infekterade celler) jämfört med kontrollgrupperna (CAT-rekombinant baculoviridae infekterade celler och GFP-rekombinant baculoviridae infekterade celler) till permetrin behandlingar föreslås funktionerna i MdαE7 i metaboliserande insekticider, därigenom skydda celler från kemiska skador. Förutom att var karboxylesteras proteiner uttrycks i insekt Sf9 celler och isolerade för att genomföra en in vitro- metabola studie. Våra resultat visade en betydande in vitro- metabolisk effektivitet av MdαE7 mot permetrin, som direkt visar medverkan av carboxylesterases i metaboliserande insekticider och således ger insektsmedel resistens i hus flyger.

Introduction

Insektsmedel motstånd är för närvarande en huvudfråga hus flugkontroll världsomspännande1,2. Ansträngningar för att fastställa mekanismen av insektsmedel motstånd underlättar bättre förståelse av problemet och ger därmed nya strategier för att effektivt förhindra eller minimera spridning av resistens utveckling3. Carboxylesterases, har som en av de stora avgiftning enzymerna, lockat en hel del uppmärksamhet för sina roller i komplexbildare och metaboliserar insekticider i olika insekter4,5,6. Vår tidigare studie har identifierat flera carboxylesterases i hus flugor och deras uttryck nivåer var inte bara konstitutivt uppreglerat i den resistent ALHF stammen men kan också induceras till högre nivåer som svar på permetrin behandlingar7 . De funktionella karakteriseringar av dessa karboxylesteras gener i metaboliserande insekticider återstår dock undersökas.

Sedan den första rapporten i början av 1980-talet8, har en baculoviridae-medierad utländska gen uttryck system varit allmänt anställd på grund av dess höga protein produktionseffektivitet och eukaryota protein bearbetning kapacitet9. Denna binära systemet består av två grundläggande element: den konstruerade rekombinant baculoviridae att leverera främmande gener i värdcellerna och storskaliga uttrycket av intresserade av proteiner av celler som smittats av rekombinant baculoviridae. Under de senaste decennierna, baculoviridae medierad cell uttryck systemet har använts i stor utsträckning att producera tusentals rekombinanta proteiner, alltifrån cytosoliska enzymerna till membran-bundna proteiner i insekt och däggdjurs celler10. Vår tidigare studie har framgångsrikt uttryckte flera CYP450-enzymer i insekt Sf9 celler med detta system11. I denna studie vi konstruerade en karboxylesteras-rekombinant baculoviridae för att infektera insekt Sf9 celler, utforskade den cell toleransen mot olika permetrin behandlingar och storskaliga uttryckt karboxylesteras proteiner i vitro för funktionell utforskning. Istället för att undersöka flera karboxylesteras isozymet blandningar från insekt homogenates antagits av tidigare studier12,13, detta baculoviridae-medierad insekt cell uttryck systemet tillåter det specifika uttrycket och isolering av riktade proteiner för bättre karaktärisering av deras biokemiska och strukturella egenskaper.

Tetrazolium saltbaserade analysen (MTT) är en hög genomströmning kolorimetrisk metod utvecklad och optimerad för att mäta cellviabilitet. Denna analys bygger på den mekanism som endast levande celler kan av metaboliserande gul-färgade MTT reagens till en mörk lila färgade formazan fällning, som kan analyseras kolorimetriskt efter upplöst i organiska lösningsmedel14, 15. Flera mer exakt, men tidskrävande metoder, såsom Trypan blå utslagning och tymidin titrering assay16,17, har utvecklats under de senaste åren. Cellbaserade MTT analysen redovisas dock fortfarande närvarande som den mest snabb och lättmanövrerad metoden att snabbt upptäcka cellviabilitet. Här, använder vi MTT analysen för att utforska cell toleransen mot insektsmedel behandlingar. Förbättrad tolerans av celler när infekterade med karboxylesteras rekombinant baculoviridae starkt stöder carboxylesterases till insekticider, vilket i sin tur tyder på deras engagemang i insektsmedel motstånd metabola roller.

Dessutom genomfördes ett in vitro- metabola test också i denna studie. Jämfört med allmänna karboxylesteras analyser som använder vanliga substrat såsom α-napthyl acetat (α-NA) och β-naftyl acetat (β-NA) för att återspegla hydrolytiska verksamhet av carboxylesterases, betraktas in vitro- metabola studien som ett korrekt sätt att direkt mäta aktiviteter av carboxylesterases mot insekticider18. Denna metod har använts framgångsrikt i olika insekter att karakterisera flera cytokrom P450s i samband med insektsmedel motstånd11,19,20. Men har denna metod ännu inte tillämpats i karboxylesteras studier. Med tillgängligheten av karboxylesteras proteiner som produceras av baculoviridae-medierade uttryck systemet, kan vi utföra en in vitro- metabola studie av carboxylesterases mot permetrin, vilket ytterligare kan ge starka bevis för inblandning av carboxylesterases i ger pyretroidbaserade resistens i hus flyger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. uttryck och isolering av målproteiner med en baculoviridae-medierad insekt Cell uttryck systemet

  1. Directionally klona blunt-slutade PCR-produkter av målproteiner från hus flugor.
    1. Design PCR primers av grönt fluorescerande protein (GFP) och huset flyga MdαE7 genen baserat på deras sekvenser och de särskilda kraven för den valda vektorn (tabell 1).
    2. Använd en termostabila, korrekturläsning DNA-polymeras och primers från steg 1.1.1 för att utföra en 150 µL PCR-reaktion (30 µL av reaktion buffert, 3 µL av 10 mM dNTP, 1,5 µL av DNA-polymeras, 6 µL av huset flyga mall DNA, 7,5 µL av forward primer 7,5 µL av reverse primer, med vatten till en slutlig volym 150 µL). Värma PCR-reaktionen till 98 ° C i 30 s, följt av 35 cykler av 98 ° C för 10 s, 53 ° C för 30 s och 72 ° C för 60 s, och sedan en sista förlängning vid 72 ° C i 2 min).
      1. Kör en 1% agarosgel med 150 µL av PCR-produkten.
    3. Punktskatt mål DNA fragment från agarosen gel med en skarp, ren skalpell: 1317 bp för MdαE7 och 858 bp för god Jordbrukarsed. Rena DNA med hjälp av kommersiellt tillgängliga gel utvinning kit följande tillverkarens protokoll (Tabell för material). Lös upp renade DNA i 15 µL destillerat vatten.
    4. Kör en 1% agarosgel med 1 µL renade DNA för att kontrollera integritet. Använd en annan 1 µL renade DNA för att mäta koncentrationer med spektrofotometer.
  2. Konstruera en intrade plasmid för målproteiner
    1. Ställa in kloning reaktionen. Mix nymalen renade DNA produkter från steg 1.1.3 och kommersiellt tillgängliga post vektorer innehållande attL-platser (Tabell för material) på en molar förhållandet 1:1 (0,5-2 µL av färska PCR-produkten vid 70-200 ng/µL koncentrationer: 0,5 µL vektor). Sedan tillsätt 1 µL av kommersiellt tillgängliga salt lösning (1,2 M NaCl2 och 0,06 M MgCl2) och tillsätt vatten till en slutlig volym av 6 µL. Blanda försiktigt och inkubera i rumstemperatur i 1 h.
    2. Över 4 µL av kloning reaktionsprodukter i steg 1.2.1 till 50 µL av kemiskt behöriga E. coli celler. Inkubera på is för 30 min. Heat-shock cellerna för 30 s i 42 ° C vattenbad utan att skaka.
    3. Sätt tuben tillbaka is för en annan 2 min. Lägg 250 µL av rumstemperatur S.O.C. medium (2% trypton 0,5% jästextrakt 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl; 10 mM MgCl2; 10 mM MgSO4; 20 mM glukos). Inkubera vid 37 ° C i 1 h med försiktigt skaka.
    4. Sprida 50-200 µL av den bakteriella kulturen i steg 1.2.3 på selektiv LB plattorna (1 g trypton; 1 g NaCl; 0,5 g jästextrakt 1,5 g agar löses i 100 mL destillerat vatten. Autoklav och Lägg 0,1% av 50 mg/mL kanamycin). Inkubera LB plattor för 16 h vid 37 ° C för kolonin tillväxt.
    5. Välj 5-10 kolonier och slamma dem individuellt i 5 µL destillerat vatten.
    6. Utföra PCR genom att lägga till 5 µL reaktion buffert, 0,5 µL 10 mM dNTP, 0,25 µL av DNA-polymeras, 1 µL svävande kolonier, 1,25 µL 10 µM M13 framåt primer, 1,25 µL 10 µM reverse primer av målgenen och vatten till slutvolymen av 25 µL. Värm PCR reaktion till 98 ° C i 30 s, följt av 35 cykler av 98° C för 10 s, 53 ° C för 30 s och 72 ° C för 60 s, och sedan en sista förlängning vid 72 ° C under 2 minuter (tabell 1).
    7. Nytt kultur 3 µL av suspenderade kolonier från steg 1.2.5 i TB media (100 mL fosfatbuffert som innehåller 0.17 M KH2PO4 och 0,72 M K2HPO4 med 450 mL bas buljong medium innehållande 6 g trypton, 12 g jäst och 2 mL glycerol, är steriliserad, som innehåller 0,1% 50 mg/mL kanamycin) för 16 h. extrahera ultrarent plasmid DNA efter tillverkarens protokollet.
    8. Använd 200 ng/µL ultrarent plasmid från steg 1.2.7 för kommersiella Sanger sekvensering med M13 framåt och bakåt grundfärger. Verifiera korrekt införande av målgenen i vektor baserat på sekvens karta som tillhandahålls av tillverkaren.
    9. Lagra sekvens-verifierade ultrarent plasmid DNA-prover av MdαE7 och god Jordbrukarsed i-20 ° C.
      Obs: Dessa är de post plasmid DNA av MdαE7 och god Jordbrukarsed.
  3. Konstruera en rekombinant baculoviridae genom att utföra Lambda rekombination (LR) reaktion.
    1. Respektive, blanda 1 µL 300 ng/µL posten plasmid DNA av GFP, MdαE7 från steg 1.2.7 eller posten plasmid DNA av kloramfenikol kolinacetyltransferas genen (CAT) som tillhandahålls av cell transfection kit med 5 µL av kommersiellt tillgängliga (innehållande attL platser) C-term linjära DNA (innehållande attR platser) i 250 µL PCR-rören. Lägg till för att göra en total volym på 8 µL buffert på TE.
      Obs: GFP och katt reaktioner användes som kontrollgrupper.
    2. Tillsätt 2 µL av kommersiellt tillgängliga Lambda rekombination (LR) enzymet mix (Tabell för material) i varje blandning av steg 1.3.1 katalysera LR reaktionen. Blanda försiktigt och inkubera vid 25 ° C över natten (≈16 h).
      Obs: LR reaktionen underlättar rekombination av en attL-innehållande posten plasmid DNA med en attR-innehållande C-term linjära DNA att generera en attB-innehållande uttrycker virus. Detta steg ger den rekombinanta baculoviridae för varje målprotein.
    3. Späd 1 µL LR reaktionsprodukterna från steg 1.3.2 20 X. Utföra PCR använder en Polyhedrin forward primer och V5 reverse primer (tabell 1). Använd 5 µL av PCR-produkter för att köra en 1% agarosgel för att kontrollera kvaliteten. Figur 1 visar ett exempel på LR reaktionsprodukten från den MdαE7 genen.

Figure 1
Figur 1: exempel på resultat av MdαE7 LR reaktion av PCR-analys. Späd 2 µL av LR reaktion 200-fold och använda 2 µL av utspädning tillsammans med Polyhedrin framåt primer och V5 reverse primer för att utföra en 25 µL PCR. Använd 5 µL av PCR-produkter för att köra 1% agarosgel för att kontrollera kvaliteten på LR reaktion. en

  1. Transfect insekt Sf9 celler
    1. Kultur insekt Sf9 celler med 5 mL komplett cell odlingsmedium (serumfritt medium med 10% fetalt bovint serum (FBS)) i T25 behandlas kolvar vid 27 ˚C.
    2. Avlägsna supernatanten och spola botten-anslutna celler med 3 mL färsk komplett cell odlingsmedium. Och över 0,5 mL åter suspenderade celler till en ny T25 behandlas. Tillsätt 4,5 mL komplett odlingsmedium. Inkubera vid 27 ° C i 3-4 dagar tills nästa överföring.
    3. Utsäde 2 mL log-fas tillväxt insekt Sf9 celler kultur (≈3.0-5,0 × 106 celler) jämnt på cellkulturen väl. Tillåta celler att fästa för minst 3 h i rumstemperatur i huven.
    4. Kontrollera den cell fastsättning genom att observera med en inverterad fas Mikroskop på 250 X. Ta bort cellodlingsmedium och ersätta med 2 mL av Graces insekt medium.
    5. Förbereda transfection blandning A lösning (8 µL av kommersiellt tillgängliga cell infektion reagens (Tabell för material) med 100 µL av Graces insekt medium) och transfection blandning B lösning av varje målgenen (9 µL av LR reaktionsprodukter från steg 1.3 med 100 µL av unsupplemented Graces insekt medium) i 1,5 mL Centrifugera rören, respektive.
    6. Blanda försiktigt transfection blandning A och B tillsammans genom att trycka på rören. Odla i rumstemperatur i 35 min i huven.
    7. Jämnt tillsätt blandningen från steget 1.4.6 droppvis till seedade cellerna från steg 1.4.4. Täta brunnarna med band och inkubera vid 27 ° C under natten.
    8. Byt ut 2 mL av Graces insekt medium med 2 mL komplett odlingsmedium. Tillsätt 100 µM ganciklovir i varje brunn för att välja negativt mot icke-rekombinanta baculoviridae. Försegla brunnar med tejp och inkubera vid 27 ° C i 72 h.
    9. Samla in 72 h post infektion cellodlingsmedium från varje brunn och överföra till 1,5 mL centrifugrör. Centrifugera vid 1500 x g i 5 minuter vid 4 ° C att ta bort celler eller stora skräp.
    10. Över supernatanten till nya 1,5 mL centrifugrör. Lagra dem vid 4 ° C med skydd från ljus.
      Obs: Dessa är de P1 virus lager lösningarna för varje målgenen.
    11. Förstärka låg-titer P1 viral beståndet (1 × 105-1 × 106 pfu/mL) till en hög titer P2 viral lager (5 × 107-1 × 108 pfu/mL).
    12. Utsäde 2 mL log-fas tillväxt insekt Sf9 celler kultur (≈3.0-5,0 × 106 celler) jämnt på cellkulturen väl. Tillåta celler att fästa för minst 3 h i rumstemperatur i huven.
    13. Inokulera 5 µL P1 virus beståndet erhölls i steg 1.4.10 i cellen seedade väl av steg 1.4.12, respektive. Lägg sedan till 100 µM ganciklovir till varje brunn. Försegla brunnar och inkubera vid 27 ° C i 72 h.
    14. Samla P2 virus stamlösningar av 72 h efter infektion. Förvaras vid 4 ° C med skydd från ljus.
      Obs: Dessa är de P2 virus lager lösningarna för varje målgenen.
    15. (Valfritt) Upprepa steg 1.4.12-1.4.14 med 5 µL P2 virus lager att samla in P3 virus stamlösningar.
      Obs: Dessa är de P3 virus lager lösningarna för varje målgenen.
    16. Lagra alla de konstruerade baculoviridae vid 4 ° C med skydd från ljus.
      Obs: Genen för GFP och katt var serveras som kontrollgruppen. Figur 2 visade tecken på celler när infekterad av GFP-rekombinant baculoviridae olika förstärkning skeden.

Figure 2
Figur 2: exempel på infekterade tecken på Sf9 celler i olika baculoviridae förstärkning skeden. Figuren visar GFP-rekombinant baculoviridae celler under dagsljus och fluorescerande ljus. Det skedet P1 infektion är infektion kvoten låg. Det skedet P2 infektion, har infektion förhållandet avsevärt förbättrats. Det skedet P3 infektion, nästan alla celler visade symptom på avskildhet från cell kultur plattan, ökar cell diameter, samt upphörande av celltillväxt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Storskaliga uttryck för målproteiner i insekt Sf9 celler
    1. Kultur 10 mL av loggen fas tillväxt insekt Sf9 celler med komplett odlingsmedium i T25 icke behandlat kolvar.
    2. Tillsätt 200 µL av P2 virus stamlösning (erhålls i steg 1.4.14) för att infektera cellkulturer i steg 1.5.1 för 72 h.
    3. Samla in 72 h post infektion cellodlingsmedium. Centrifugera vid 1 500 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
    4. Kassera supernatanten och tvätta pellets två gånger med 1 mL 0,1 M PBS-bufferten (pH 7,5).
    5. Helt lös cell pellets med 1 mL av insekt cell protein utvinning & lyseringsbuffert (Tabell för material). Lägga till 10% glycerol i cellys. Omedelbart lagra vid-80 ° C.
    6. Upprepa steg 1.5.1-1.5.5 med P2 virus stamlösning av CAT proteiner som kontrollgruppen.
      Anm: Upprepa steg 1,5 i tre exemplar för olika protein preparat.

2. en cellbaserade MTT cytotoxicitet analys

  1. Kultur 5 mL log fas tillväxt (1,5-2,5 × 106 celler/mL) insekt Sf9 celler med komplett odlingsmedium i T25 icke behandlat kolvar.
  2. Tillsätt 25 µL av P1 virus stamlösning (erhålls i steg 1.4.14) för att infektera cellkulturer i steg 2.1 för 48 h under varsam skakning vid 27 ˚C.
  3. Förbereda 100 mM permetrin lager standardlösningar i acetonitril. Använda acetonitril till späd till 50 mM, 25 mM, 12,5 mM och 6,25 mM genom att lägga till 500 µL, 250 µL, 125 µL och 62,5 µL permetrin stamlösning i en total volym på 1000 µL, respektive.
  4. Jämnt utsäde 200 µL av infekterade cellkulturer från steg 2.2 kompletteras med 300 µL av komplett odlingsmedium i 24-väl plattan på en densitet på 2 × 105 celler/mL.
  5. Tillsätt 4 µL av permetrin standardlösningar (6,25 mM, 12,5 mM, 25 mM och 50 mM) i varje brunn för att göra en slutlig koncentration 50 µM, 100 µM, 200 µM och 400 µM, respektive. Bara tillsätt 4 µL av acetonitril i brunnar för cell livskraft beräkningar (figur 3).
  6. Seal-plattor med band och inkubera vid 27 ° C för 48 h med skydd från ljus.
  7. Förbereda 5 mg/mL MTT (Thiazolyl Blue Tetrazolium bromid) reagens upplöst i buffert (2,0 g NaCl, 0,05 g kaliumklorid, 0,36 g NaH2PO4∙2H2O, 0,28 g av NaH2PO4, 0,05 g KH2PO4 upplöst i 200 mL destillerat vatten, pH 7.5).
  8. Ta bort cellodlingsmedium från steg 2,6 efter 48 h inkubation utan att röra botten-anslutna cell lagret. Tillsätt 200 µL av MTT reagens i steg 2,7 till varje brunn. Inkubera vid 37 ° C i 4 h tills mörk lila formazan fällningar bildas i varje brunn (figur 3).
  9. Inkubera vid 37 ° C i 4 h tills mörk lila formazan påskyndar form i varje brunn. Tillsätt 500 µL av DMSO att helt upplösa fällningar (figur 3).

Figure 3
Figur 3: exempel på MTT resultat. Efter 48 h efter infektion med P1 virus stamlösning av CAT rekombinant baculoviridae lösning, jämnt utsäde 500 µL celler uttrycker katt genen i en 24-väl cell kultur plattan. Respektive lägga 4 µL permetrin vid en annan dos (6,25 mM, 12,5 mM, 25 mM och 50 mM) i varje rad att göra slutliga koncentration till 50 µM, 100 µM, 200 µM och 400 µM. Raden kontroll var behandlade med acetonitril endast och markeras som CK i plattan. (A) efter 48 h för inkubation vid 27 ° C, kassera cellodlingsmedium på det övre lagret och ersätta med 200 µL av gul färgade MTT reagenser. Sedan Inkubera vid 37 ° C för 48 h. mörk lila färgade minskning påskyndar form i varje väl indikerar att överlevnad cellerna klarar av metaboliserande den gula färgen MTT reagenser i den mörka lila färgad fällningen. (B) 500 µL av DMSO lösningsmedel lades in i varje brunn för att upplösa den bildade fällningen. Absorbansvärdet för varje väl upptäcktes av spektrofotometer vid 540 nm. Som permetrin koncentrationer öka, ändras gradvis färg från mörkröd till ljusröda, vilket tyder på att de cellen förmåga var gradvis minskat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Över 200 µL av upplöst lösning in i plattan med 96 brunnar. Mät absorbansvärden vid 540 nm med en microplate reader (Tabell för material).
  2. Beräkna cellviabilitet genom att jämföra absorptionsvärdena för permetrin behandlade celler med endast acetonitril behandlade celler.
  3. För kontrollgruppen, upprepa alla steg med P2 virus stamlösning av kloramfenikol kolinacetyltransferas (CAT) rekombinant baculoviridae erhölls i steg 1.4.
  4. Upprepa 4 gånger för olika virus preparat.

3. in Vitro metabola test

  1. Förbereda 100 mM permetrin lager standardlösningar i acetonitril. Använda acetonitril till späd till 50 mM, 25 mM, 12,5 mM och 6,25 mM. Upptäcka den motsvarande topparean under varje koncentration med HPLC. Skapa och beräkna standardkurvan permetrin baserat på toppens med olika permetrin koncentrationer.
  2. Mätning av protein koncentrationerna i steg 1,5 med Bradford metoder21.
  3. Förbereda 700 µL av metabolisk reaktion med 40 µM permetrin standard och 1 mg av proteiner som erhölls i steg 1,5 upplöst i 0.2 M Tris-HCl buffert (pH 7,4). Inkubera vid 30 ° C under 2 h med milda skakningar. Ljuskänsligt.
  4. Släcka reaktionen genom att lägga till 700 µL iskall acetonitril. Inkubera vid 30 ° c för en annan 30 min med milda skakningar. Ljuskänsligt.
  5. Centrifugera reaktionsblandningen vid 16 000 x g under 2 minuter vid rumstemperatur. Samla in supernatanten och filtrera genom ett 0,45 µm-membran. Över filtrering till ultraclean bruna glasflaskor för HPLC analys.
  6. Kör HPLC under de optimala gaskromatografiska förhållandena (mobil fas A: 90 procent acetonitril och 10% vatten. Mobil fas B: 5% acetonitril justerat till pH 2.3 med 85% fosforsyra). Gradient eluera med en flödeshastighet av 1 mL/min och åtgärd vid en våglängd av 232 nm.
  7. Beräkna avskrivning permetrin genom att jämföra med reaktioner utan protein prov lagt till.
  8. Använda CAT protein erhölls i steg 1.5.6 för att fungera som kontroll.
  9. Upprepa alla steg med olika protein preparat i steg 1.5.7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cellviabiliteten mot olika permetrin behandlingar (MTT assay)

Cytotoxiciteten hos permetrin undersöktes i MdαE7-rekombinant baculoviridae infekterade Sf9 (experimentgruppen) och katt-rekombinant baculoviridae (tillhandahålls av baculoviridae infekterade kit) infekterade celler (kontrollgrupperna). Förbättrad cell toleranser att permetrin i MdαE7 uttrycker cellerna starkt stödja detta karboxylesteras mot insekticider och därmed skydda celler från kemiska skador metabola roller. I vår studie, cellviabiliteten mot olika permetrin koncentrationer (50, 100, 200 och 400 µM) beräknades i jämförelse med celler behandlas med acetonitril ensam. Våra resultat visade att MdαE7 livskraft uttrycker celler var betydligt högre (alltifrån 86,00% till 101.92%) (Figur 4B) än som control Cells (alltifrån 67.59% till 81.43%) (Figur 4A) när den utsätts för permetrin vid olika koncentrationer, som anger MdαE7 viktiga roller i metaboliserande permetrin i insekt celler.

Figure 4
Figur 4: förmåga av insekt Sf9 celler under olika permetrin behandlingar. (A) livskraft control cells smittade av CAT rekombinant baculoviridae b experimentell celler som smittats av MdαE7 rekombinant baculoviridae livskraft. Fyra replikeringar genomfördes för varje permetrin koncentration. Data visades som medelvärde ± SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

In vitro metabolismen av permetrin av MdαE7

Permetrin metabolism var analyseras genom ruvning 40 µM permetrin standardlösning tillsammans med MdαE7 proteiner som utvunnits ur infekterade Sf9 celler. Reaktionerna med CAT proteiner fungerade som kontroller. Utarmning andelen permetrin beräknades i jämförelse med reaktioner utan enzym lagt till. Reaktioner övervakades av HPLC med omvänd fas efter en 120 min inkubationstid. Eftersom den standard permetrin är faktiskt en blandning av cis - och transisomerer, två toppar observerades i HPLC kromatografiska profiler, med eluering tider av 10,67 min och 10.87 min för trans-permetrin och cis-permetrin, respektive (figur 5). Utarmning andelen permetrin av MdαE7 proteiner (39.18±3.78%) var signifikant högre än för katt proteiner (7.29±0.81%) (Figur 6), som är inte bara att vara konsekvent med MTT resultat men också direkt visar funktionerna i MdαE7 i metaboliserande permetrin i vitro.

Figure 5
Figur 5: The HPLC profil permetrin standard. Den permetrin standard används i denna studie är en blandning av trans-permetrin och cis-permetrin isomerer. De röda pilarna visar topparna för trans-permetrin isomer och cis-permetrin isomer, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: In vitro metabolismen av permetrin av MdαE7 och katt rekombinanta proteiner. Utarmning procentsatserna för permetrin av MdαE7 och katt proteiner beräknades. Tre replikeringar genomfördes för varje permetrin koncentration. Data visades som medelvärde ± SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Under de senaste decennierna har heterologa uttryck system använts att uttrycka och isolera stora mängder proteiner, vilket möjliggör biokemiska och funktionell bestämning och karakterisering av enzymer in vitro. Hittills har flera olika modellsystem inklusive Escherichia coli, Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiaeoch Spodoptera frugiperda har anpassats för rekombinant proteinuttryck, och valet av den in vitro -system är avgörande för storskaliga generation intresserade proteiner22,23,24,25. I vår studie valdes baculoviridae-medierad insekt cell uttryck systemet att generera hus flyga carboxylesterases eftersom det ger en liknande intracellulära miljön till insekt celler och upprätthåller vissa viktiga eukaryota processkapacitet 9. Trots fördelarna med baculoviridae-medierad uttrycker systemet, dess begränsningar bör också behandlas. Baculoviridae-medierad insekt cell uttryck systemet kan producera målproteiner endast om insekt cellerna infekterades med Byggyta rekombinant baculoviridae. Den nuvarande utvecklingen att skapa stabilt transformerad insekt cellinjer har gjort det möjligt inte bara konstitutivt producera intresserad av proteiner i avsaknad av baculoviridae infektion, men också att förbättra cell kapacitet av glycosylating och vikning genererade proteiner genom tekniska ändringar9.

För att bättre undersöka rollerna som carboxylesterases i metaboliserande insekticider i cellerna och därmed skydda celler från kemiska skador, utfördes MTT analysen för att mäta cell cytotoxiciteten mot olika permetrin behandlingar. Under denna process, kan en massa experimentella parametrar är associerad med cellmetabolism, såsom cell medium kompositioner, cell tillväxthastighet, koncentration och konsumtion av energi leverans metaboliter, påverka den MTT-reduktion och därmed leda till felaktiga resultat. Att minimera över / underskattning av MTT analysen, hålla cellodlingsmedium, cell tillväxt tillstånd och inkubationsförhållanden konsekvent mellan olika experimentella behandlingar26. För att bestämma de cell livskraft effekter som orsakas av baculoviridae infektion i stället för permetrin, vi visade att infektionsprocessen för GFP-rekombinant baculoviridae till insekt Sf9 celler, och fann att det skedet P2 infektion, cellerna har den högsta infektion förhållandet med lägsta cell death ratio jämfört med andra infektion stadier (figur 2). Detta kan bättre förklara anledningen att välja celler i P2 infektion skede genomföra MTT analysen.

Genom att jämföra förmåga av celler när infekterad av MdαE7 - och CAT-rekombinanta baculoviridae i en MTT-studie, fann vi en förbättrad viabiliteten hos celler när uttrycker MdαE7 proteiner, som bättre kan stödja carboxylesterases att permetrin metabola roller i insekt celler och skyddar cellerna från kemiska skador (figur 4). In vitro- metabola studien, som är erkänd som en direkt metod att återspegla de metaboliska funktionerna i carboxylesterases mot insekticider, bör också varit utforskade att kompensera begränsningarna av MTT-analysen i bättre karakterisera protein metaboliska funktioner.

I denna studie, ett heterologt uttryck för carboxylesterases i insekt Sf9 celler med ett baculoviridae-medierade uttryck system för mätning av cellen förmåga mot olika permetrin behandlingar av MTT analysen och karakterisering av carboxylesterases genom en in vitro- metabolism assay alla arbeta tillsammans för att ge en systematisk, vetenskaplig och korrekt strategi för att undersöka rollerna för avgiftning enzymer i insekter, vilket underlättar förståelsen av insektsmedel resistensmekanismer och därmed utveckla innovativa strategier för växtskydd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs inc. M0491L
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen by life technology K240020 S.O.C medium and universal M13 sequence primers were included in this kit.
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen by life technology K210002
Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirectTM Kits Invitrogen by life technology 11791-023
BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit Invitrogen by life technology 12562-019 Cellfectin transfection reagent and ganciclovir were included in this kit
pENTR-CAT plasmid Invitrogen by life technology Included in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentration: 0.5 ug/uL
Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified Gibco by Life Technologies 10082-139
Sf9 cells in Sf-900 III SFM Gibco by Life Technologies 12659017
Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction & Lysis Buffer G Biosciences by A Geno Technology Inc 786-411
Sf-900 III SFM (1×) Serum Free Medium Complete Gibco by Life Technologies 12658-019
Grace's Insect Medium, unsupplemented Gibco by Life Technologies 11595030
Permethrin (isomers) analytical standard SUPELCO by Solutions WithinTM 442748
Methanol (analytical graded) Sigma-Aldrich 67-56-1
Acetonitrile (analytical graded) Sigma-Aldrich 75-05-8
GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters with 0.45 μm GHP Membrane (HPLC Certified) Pall Life Sciences 21890388
Alliance Waters 2695 HPLC System Waters
T100 Thermal Cycle Bio-Rad Laboratories Inc. 1861096
Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometers ThermoFisher Scientific ND2000CLAPTOP
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader BioTek

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scott, J. G., et al. Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 377-384 (2013).
  2. Li, M., et al. A whole transcriptomal linkage analysis of gene co-regulation in insecticide resistant house flies, Musca domestica. BMC Genomics. 14, 803 (2013).
  3. Liu, N. Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions. Annual Review of Entomology. 60, 537-559 (2015).
  4. Grigoraki, L., et al. Transcriptome profiling and genetic study reveal amplified carboxylesterase genes implicated in temephos resistance, in the Asian tiger mosquito Aedes albopictus. e0003771. 9, e0003771 (2015).
  5. Grigoraki, L., et al. Carboxylesterase gene amplifications associated with insecticide resistance in Aedes albopictus: Geographical distribution and evolutionary origin. PLOS Neglected Tropical Diseases. 11, e0005533 (2017).
  6. Wheelock, C., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30, 75-83 (2005).
  7. Feng, X., Li, M., Liu, N. Carboxylesterase genes in pyrethroid resistant house flies, Musca domestica. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 30-39 (2018).
  8. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  9. Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).
  10. Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22 (12), 1583 (2004).
  11. Gong, Y., Li, T., Feng, Y., Liu, N. The function of two P450s, CYP9M10 and CYP6AA7, in the permethrin resistance of Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 7 (1), 587 (2017).
  12. Cao, C. W., Zhang, J., Gao, X. W., Liang, P., Guo, H. L. Overexpression of carboxylesterase gene associated with organophosphorous insecticide resistance in cotton aphids, Aphis gossypii (Glover). Pesticide Biochemistry and Physiology. 90 (3), 175-180 (2008).
  13. Zhang, L., Gao, X., Liang, P. Beta-cypermethrin resistance associated with high carboxylesterase activities in a strain of house fly, Musca domestica (Diptera: Muscidae). Pesticide Biochemistry and Physiology. 89, 65-72 (2007).
  14. Van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Cancer cell culture. , Humana Press. 237-245 (2011).
  15. Stockert, J. C., Blázquez-Castro, A., Cañete, M., Horobin, R. W., Villanueva, Á MTT assay for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid droplets. Acta Histochemica. 114 (8), 785-796 (2012).
  16. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. , A3-B (2001).
  17. Riss, T. L., Moravec, R. A., Niles, A. L., Duellman, S., Benink, H. A., Worzella, T. J., Minor, L. Cell viability assays. Assay Guidance Manual. , (2013).
  18. Wheelock, C. E., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30 (2), 75-83 (2005).
  19. Li, X., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics. Annual Review of Entomology. 52, 231-253 (2007).
  20. Nakamura, Y., et al. The in vitro metabolism of a pyrethroid insecticide, permethrin, and its hydrolysis products in rats. Toxicology. 235 (3), 176-184 (2007).
  21. Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. The protein protocols handbook. , Humana Press. 15-21 (2002).
  22. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
  23. Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22 (12), 1583 (2004).
  24. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211 (2006).
  25. Bulter, T., et al. Functional expression of a fungal laccase in Saccharomyces cerevisiae by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 69 (2), 987-995 (2003).
  26. Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).

Tags

Biokemi fråga 138 insektsmedel motstånd carboxylesterases baculoviridae-medierad insekt cell uttryck systemet cytotoxicitet analys in vitro ämnesomsättning analys
Funktionell karakterisering av Carboxylesterases i insektsmedel resistenta hus flugor, <em>Musca Domestica</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feng, X., Liu, N. Functional… More

Feng, X., Liu, N. Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica. J. Vis. Exp. (138), e58106, doi:10.3791/58106 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter