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Biochemistry

Caratterizzazione funzionale di Carboxylesterases in casa resistente all'insetticida mosche, Musca Domestica

Published: August 23, 2018 doi: 10.3791/58106
Automatic Translation
1, 1
1Department of Entomology and Plant Pathology, Auburn University

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per produrre casa volare carbossilesterasi proteine in vitro con un sistema di espressione di baculovirus mediata delle cellule di insetto e successivamente funzionalmente caratterizzano i loro ruoli in che metabolizza permetrina, quindi, che conferisce piretroidi resistenza conducendo basati su cellule MTT assay e in vitro gli studi metabolici.

Abstract

Il metabolismo mediato carbossilesterasi è pensato per svolgere un ruolo importante nella resistenza agli insetticidi in vari insetti. Diversi carbossilesterasi geni sono stati trovati up-regolato nel ceppo resistente casa volare, mentre loro ruoli che conferiscono resistenza agli insetticidi è rimasto per essere esplorato. Qui, abbiamo progettato un protocollo per la caratterizzazione funzionale di carboxylesterases. Vengono presentati tre esperimenti di esempio: (1) espressione e l'isolamento delle proteine carbossilesterasi attraverso un insetto baculovirus-mediata Spodoptera frugiperda (Sf9) sistema di espressione delle cellule; (2) un MTT basati su cellule (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-yl] -2, 5-dimethylthiazolyl bromuro) analisi di citotossicità per misurare la tolleranza delle cellule di insetto a permetrina diversi trattamenti; e (3) in vitro gli studi metabolici per esplorare la capacità metabolica di carboxylesterases verso permetrina. Il gene carbossilesterasi MdαE7 è stato clonato da una casa resistente volare ceppo ALHF e utilizzato per costruire un baculovirus ricombinanti per l'infezione di cellule Sf9. La viabilità cellulare contro permetrina diversi trattamenti sono stati misurati con l'analisi di MTT. La tolleranza cellulare avanzata del gruppo sperimentale (cellule di baculovirus infettati MdαE7-ricombinante) rispetto a quelli dei gruppi di controllo (CAT-ricombinante baculovirus infettato cellule e le cellule di baculovirus infettati GFP-ricombinante) a permetrina trattamenti suggerito le funzionalità del MdαE7 nel metabolismo insetticidi, proteggendo le cellule dai danni chimici. Oltre a questo, carbossilesterasi proteine sono stati espressi in cellule di insetto Sf9 e isolati per condurre uno studio metabolico in vitro . I nostri risultati hanno indicato una significativa in vitro efficienza metabolica di MdαE7 verso permetrina, direttamente che indica il coinvolgimento di carboxylesterases nel metabolismo insetticidi e conferendo resistenza agli insetticidi in casa mosche.

Introduction

Resistenza agli insetticidi è attualmente un problema importante di casa controllo della Mosca in tutto il mondo1,2. Gli sforzi per determinare il meccanismo della resistenza agli insetticidi facilita la comprensione di questo problema e quindi fornire nuove strategie per efficacemente prevenire o ridurre al minimo la diffusione di resistenza sviluppo3. Carboxylesterases, come uno degli enzimi più importanti di disintossicazione, hanno attirato molta attenzione per i loro ruoli in sequestranti e metabolizzare gli insetticidi in vari insetti4,5,6. Il nostro studio precedente ha identificato più carboxylesterases in casa mosche e loro livelli di espressione non erano solo costitutivamente up-regolato nel ceppo resistente ALHF ma possono anche essere indotta a più alti livelli in risposta ai trattamenti di permetrina7 . Tuttavia, le caratterizzazioni funzionali di questi geni carbossilesterasi nel metabolismo insetticidi rimangono per essere esplorato.

Dal primo rapporto nei primi anni 19808, un sistema di espressione di baculovirus-mediata del gene straniero è stato ampiamente impiegato grazie alla sua efficienza di produzione ad alta percentuale proteica e la proteina eucariotica elaborazione capacità9. Questo sistema binario è composto da due elementi essenziali: il baculovirus ricombinanti costruito offrendo geni estranei in cellule dell'ospite e l'espressione su larga scala di proteine interessate da cellule infettate da baculovirus ricombinanti. Negli ultimi decenni, il sistema di espressione di baculovirus mediata delle cellule è stato ampiamente utilizzato per produrre migliaia di proteine ricombinanti, che vanno da enzimi citosolici alle proteine di membrana-limitano in insetto e cellule di mammifero10. Il nostro studio precedente ha correttamente espresso più enzimi CYP450 in cellule di insetto Sf9 con questo sistema11. In questo studio, abbiamo costruito un baculovirus carbossilesterasi-ricombinante per infettare cellule di insetto Sf9, esplorato la tolleranza delle cellule a permetrina diversi trattamenti e su larga scala carbossilesterasi espresse proteine in vitro per funzionale esplorazione. Invece di indagare più miscele di isozima carbossilesterasi da insetto omogeneati adottata dal precedente studi12,13, questo sistema di espressione di baculovirus-mediata delle cellule di insetto permette l'espressione specifica e isolamento di proteine mirati per la migliore caratterizzazione delle loro proprietà biochimiche e strutturali.

Base di sale tetrazolio (MTT) è un metodo colorimetrico di alto-rendimento sviluppato e ottimizzato per misurare la vitalità cellulare. Questa analisi è basata sul meccanismo che solo le cellule viventi sono in grado di metabolizzare il reagente MTT di colore giallo di un precipitato di formazan colorato viola scuro, che può essere analizzato colorimetricamente dopo dissolto in solventi organici14, 15. Molti più accurata, ma metodi che richiede tempo, come esclusione in Trypan blue e la timidina titolazione dosaggio16,17, sono stati sviluppati negli ultimi anni. Tuttavia, l'analisi di MTT basati su cellule è ancora attualmente riconosciuto come il metodo più rapido e facilmente azionabile per rilevare rapidamente la vitalità cellulare. Qui, usiamo l'analisi di MTT per esplorare la tolleranza delle cellule contro trattamenti insetticidi. La maggiore tolleranza delle cellule quando infettati con baculovirus ricombinanti carbossilesterasi fortemente supporta i ruoli metabolici di carboxylesterases agli insetticidi, che a sua volta suggerisce loro coinvolgimento nella resistenza agli insetticidi.

Inoltre, un'analisi metabolica in vitro è stata anche condotta in questo studio. Rispetto generale carbossilesterasi saggi che utilizzano substrati comuni come acetato di α-napthyl (α-NA) e β-naftil acetato (β-NA) per riflettere l'attività idrolitica di carboxylesterases, lo studio metabolico in vitro è considerato come un modo accurato misurare direttamente attività di carboxylesterases verso insetticidi18. Questo metodo è stato impiegato con successo in vari insetti per caratterizzare più citocromo P450s in associazione con insetticida resistenza11,19,20. Tuttavia, questo metodo non è stato ancora applicato negli studi carbossilesterasi. Con la disponibilità di carbossilesterasi proteine prodotte dal sistema di espressione di baculovirus-mediata, possiamo eseguire uno studio metabolico in vitro di carboxylesterases verso permetrina, in grado di fornire ulteriore forte evidenza del coinvolgimento di carboxylesterases nel conferire resistenza piretroide in casa mosche.

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Protocol

1. espressione e l'isolamento di proteine bersaglio con un sistema di espressione di Baculovirus-mediata delle cellule di insetto

  1. Direzionalmente clonazione smussato-conclusa i prodotti PCR di proteine bersaglio da mosche domestiche.
    1. Progettazione degli iniettori PCR della proteina fluorescente verde (GFP) e il gene della MdαE7 di casa volo basato sulle loro sequenze e i requisiti speciali del vettore scelto (tabella 1).
    2. Utilizzare una DNA polimerasi termostabile, correzione di bozze e primer dal punto 1.1.1 per eseguire una reazione di PCR di 150 µ l (30 µ l di tampone di reazione, 3 µ l di 10 mM dNTPs, 1,5 µ l di DNA polimerasi, 6 µ l di DNA di casa modello fly, 7,5 µ l di primer in avanti 7,5 µ l di primer reverse, con acqua a un volume finale 150 µ l). Riscaldare la reazione di PCR a 98 ° C per 30 s, seguita da 35 cicli di 98 ° C per 10 s, 53 ° C per 30 s e 72 ° C per 60 s e quindi un'estensione finale a 72 ° C per 2 min).
      1. Eseguire un gel di agarosio 1% con 150 µ l di prodotto di PCR.
    3. I frammenti di DNA bersaglio dall'agarosio gel con un bisturi affilato, pulito delle accise: 1317 bp per MdαE7 e 858 bp per GFP. Purificare il DNA utilizzando gel disponibili in commercio kit di estrazione seguendo il protocollo del produttore (Tabella materiali). Sciogliere il DNA purificato in 15 µ l di acqua distillata.
    4. Eseguire un gel di agarosio 1% con 1 µ l di DNA purificato per controllare l'integrità. Utilizzare un altro 1 µ l di DNA purificato per misurare le concentrazioni con lo spettrofotometro.
  2. Costruire un plasmide di voce per proteine bersaglio
    1. Impostare la reazione di clonazione. Mix appena purificato prodotti del DNA dal punto 1.1.3 e voce commercialmente disponibili file vettoriale contenente attL-siti (Tabella materiali) con un rapporto molare di 1:1 (0,5-2 µ l di prodotto PCR fresco alle concentrazioni di 70-200 ng / µ l: vettore di 0,5 µ l). Aggiungere 1 µ l di soluzione salina commercialmente disponibili (1,2 M NaCl2 e 0.06 M MgCl2), quindi aggiungere acqua ad un volume finale di 6 µ l. Miscelare delicatamente ed incubare a temperatura ambiente per 1 h.
    2. Trasferire 4 µ l di clonazione prodotti di reazione al punto 1.2.1 in 50 µ l di chimicamente competente Escherichia coli cellule. Incubare in ghiaccio per 30 min. shock termico delle celle per 30 s in bagnomaria a 42 ° C senza agitazione.
    3. Inserire il tubo nel ghiaccio per un altro 2 min aggiungere 250 µ l di temperatura S.O.C medium (2% tryptone; 0,5% di Estratto di lievito; 10 mM NaCl; 2,5 mM KCl; 10mm MgCl2; 10 mM MgSO4; 20 millimetri di glucosio). Incubare a 37 ° C per 1 h con agitando delicatamente.
    4. Diffondere il 50-200 µ l della coltura batterica nel passaggio 1.2.3 sulle piastre LB selettive (1 g di NaCl; 0,5 g di Estratto di lievito, 1 g di tryptone; 1,5 g di agar disciolto in 100 mL di acqua distillata. Autoclave e aggiungere 0,1% di kanamicina 50 mg/mL). Incubare le piastre LB per 16 h a 37 ° C per la crescita della Colonia.
    5. Prendere 5-10 colonie e risospendere loro individualmente in 5 µ l di acqua distillata.
    6. Eseguire PCR aggiungendo 5 µ l di tampone di reazione, 0,5 µ l di 10 mM dNTPs, 0,25 µ l di DNA polimerasi, 1 µ l di sospensione colonie, 1.25 µ l di 10 primer forward di M13 µM, la PCR di calore 1.25 µ l 10 primer reverse µM il gene bersaglio e l'acqua ad un volume finale di 25 µ l. reazione a 98 ° C per 30 s, seguita da 35 cicli di 98° C per 10 s, 53 ° C per 30 s e 72 ° C per 60 s e quindi un'estensione finale a 72 ° C per 2 min (tabella 1).
    7. Ri-cultura 3 µ l di sospensione colonie dal punto 1.2.5 media TB (100 mL di tampone fosfato contenente 0.17 M KH2PO4 e 0,72 M K2HPO4 con 450 mL di mezzo di brodo base contenente 6 g di tryptone, 12 g di lievito e 2 mL di glicerolo, sterilizzato, contenente kanamicina 50 mg/mL 0,1%) per 16 h. Estrarre il DNA plasmidico ultra-puro seguendo il protocollo del produttore.
    8. Uso 200 ng / µ l plasmide ultra-puro dal punto 1.2.7 per commerciale Sanger sequenziamento con primer forward e reverse M13. Verificare il corretto inserimento del gene target nel vettore basato sulla sequenza mappa fornita dal produttore.
    9. Conservare i campioni di DNA di sequenza-verificato plasmide ultra-puro di MdαE7 e GFP a-20 ° C.
      Nota: Queste sono la voce plasmide DNA di MdαE7 e GFP.
  3. Costruire un baculovirus ricombinanti eseguendo la reazione di ricombinazione (LR) Lambda.
    1. Rispettivamente, mescolare 1 µ l di plasmide di entrata 300 ng / µ l DNA di GFP, MdαE7 dal punto 1.2.7 o voce plasmide DNA del gene di acetiltransferasi del cloramfenicolo (CAT) fornito con il kit di transfezione delle cellule con 5 µ l di commercialmente disponibile (contenenti attL siti) C-termine DNA lineare (contenente siti attR) in provette per PCR 250 µ l. Aggiungere buffer di TE per rendere un volume totale di 8 µ l.
      Nota: Le reazioni di GFP e CAT sono state utilizzate come gruppi di controllo.
    2. Aggiungere 2 µ l di commercialmente disponibile mix di Lambda ricombinazione (LR) di enzima (Tabella materiali) in ciascuna miscela di passaggio 1.3.1 per catalizzare la reazione di LR. Delicatamente mescolare e incubare a 25 ° C durante la notte (≈16 h).
      Nota: La reazione di LR facilita la ricombinazione un attcontenenti L entrata del DNA del plasmide con un attR contenenti DNA lineare C-termine per generare un virus esprimenti attB-contenenti. Questo passaggio produce il baculovirus ricombinanti per ogni proteina bersaglio.
    3. Diluire 1 µ l di prodotti di reazione di LR dal punto 1.3.2 20x. Eseguire PCR utilizzando un primer avanti Polyhedrin e V5 reverse primer (tabella 1). Utilizzare 5 µ l di prodotti di PCR per eseguire un gel di agarosio all'1% per controllare la qualità. Figura 1 Mostra un esempio del prodotto di reazione LR dal gene MdαE7.

Figure 1
Figura 1: risultati di esempio di reazione di MdαE7 LR dall'analisi di PCR. Diluire 2 µ l di reazione LR 200 volte e 2 µ l della diluizione insieme Polyhedrin primer forward e reverse primer V5 per eseguire un 25 µ l di PCR. Utilizzare 5 µ l di prodotti di PCR per eseguire gel di agarosio 1% per verificare la qualità della reazione di LR. un

  1. Transfect cellule di insetto Sf9
    1. Cultura dell'insetto Sf9 cellule con 5 mL di medium di crescita cellulare completo (medium senza siero con 10% siero bovino fetale (FBS)) in T25 trattate matracci a 27 ˚ c.
    2. Eliminare il surnatante e lavare le cellule attaccate inferiore con 3 mL di terreno di coltura fresco cella completa. Trasferire 0,5 mL di cellule risospese in un matraccio di T25 trattati nuovo. Aggiungere 4,5 mL di medium di crescita completa. Incubare per 3-4 giorni fino al successivo trasferimento a 27 ° C.
    3. Semi 2 mL di insetto di log-in fase di sviluppo Sf9 cellule cultura (≈3.0-5.0 × 106 cellule) in modo uniforme sulla coltura delle cellule ben. Consentire alle cellule di fissare per almeno 3 ore a temperatura ambiente nella cappa.
    4. Controllare il collegamento delle cellule osservando con un microscopio invertito di fase a 250 X. Rimuovere il mezzo di coltura cellulare e sostituire con 2 mL di insetto medium di grazia.
    5. Preparazione della soluzione di miscela A transfezione (8 µ l di reagente di infezione cellulare disponibile in commercio (Tabella materiali) con 100 µ l di insetto medium di grazia) e soluzione di miscela B di transfezione di ogni gene bersaglio (9 µ l dei prodotti di reazione di LR dal passaggio 1.3 con 100 µ l di insetto medium di grazia senza aggiunte) in 1,5 mL centrifuga tubi, rispettivamente.
    6. Mescolare delicatamente miscela di transfezione A e B insieme toccando i tubi. Incubare a temperatura ambiente per 35 min nella cappa.
    7. In modo uniforme aggiungere la miscela dal punto 1.4.6 goccia a goccia sulle celle seminate dal punto 1.4.4. Pozzetti con nastri ed incubare a 27 ° C durante la notte.
    8. Sostituire 2 mL di insetto medium di grazia con 2 mL di terreno di crescita completa. Aggiungere 100 µM ganciclovir in ogni pozzetto per selezionare negativamente contro non-ricombinante baculovirus. Pozzetti con nastro adesivo ed incubare a 27 ° C per 72 h.
    9. Raccogliere il mezzo di coltura cellulare di 72 h post infezione da ciascun pozzetto e trasferimento in provette per centrifuga da 1,5 mL. Centrifugare a 1.500 x g per 5 min a 4 ° C per rimuovere le cellule o detriti di grandi dimensioni.
    10. Trasferire il surnatante in nuove provette da 1,5 mL. Conservarli a 4 ° C con protezione dalla luce.
      Nota: Queste sono le soluzioni di riserva di virus P1 per ogni gene bersaglio.
    11. Amplificare lo stock virale di basso-titolo P1 (1 × 105-1 × 106 pfu/mL) a un ceppo virale di alto titolo P2 (5 × 107-1 × 108 pfu/mL).
    12. Semi 2 mL di insetto di log-in fase di sviluppo Sf9 cellule cultura (≈3.0-5.0 × 106 cellule) in modo uniforme sulla coltura delle cellule ben. Consentire alle cellule di fissare per almeno 3 ore a temperatura ambiente nella cappa.
    13. Inoculare 5 µ l di brodo di virus P1 ottenuta al passaggio 1.4.10 nella cella seminato bene di passaggio 1.4.12, rispettivamente. Quindi, aggiungere 100 µM ganciclovir in ciascun pozzetto. Pozzetti ed incubare a 27 ° C per 72 h.
    14. Raccogliere P2 soluzioni di riserva di virus di 72 h post infezione. Conservare a 4 ° C con protezione dalla luce.
      Nota: Queste sono le soluzioni di riserva di virus P2 per ogni gene bersaglio.
    15. (Opzionale) Ripetere i passaggi 1.4.12-1.4.14 con 5 µ l di stock di virus P2 per raccogliere soluzioni «stock» virus P3.
      Nota: Queste sono le soluzioni di riserva di virus P3 per ogni gene bersaglio.
    16. Memorizzare tutti i baculovirus costruito a 4 ° C con protezione dalla luce.
      Nota: Il gene GFP e gatto erano serviti come gruppo di controllo. Figura 2 ha mostrato i segni delle cellule quando infettati da baculovirus GFP-ricombinante a stadi di amplificazione diversi.

Figure 2
Figura 2: esempio di infetti segni di Sf9 cellule a stadi di amplificazione diversi baculovirus. La figura mostra che le cellule di baculovirus GFP-ricombinante sotto luce naturale e fluorescente luce. Nella fase di infezione P1, il rapporto di infezione è basso. Nella fase di infezione P2, il rapporto di infezione è stato migliorato significativamente. Nella fase di infezione P3, quasi tutte le cellule hanno mostrato i sintomi di distacco dalla piastra di coltura delle cellule, aumenta di diametro delle cellule, nonché la cessazione della crescita delle cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Espressione su larga scala di proteine in cellule di insetto Sf9
    1. 10 mL di registro fase crescita dell'insetto Sf9 delle cellule con il mezzo di crescita completa in T25 non trattata boccette di cultura.
    2. Aggiungere 200 µ l di soluzione di riserva di virus di P2 (ottenuta al passaggio 1.4.14) per infettare le colture cellulari nel passaggio 1.5.1 per 72 h.
    3. Raccogliere il mezzo di coltura cellulare di 72 h post infezione. Centrifuga a 1.500 x g per 5 min a 4 ° C.
    4. Scartare il pellet surnatante e lavare due volte con 1 mL di tampone PBS 0.1 M (pH 7.5).
    5. Sciogliere completamente il pellet cellulare con 1 mL di estrazione della proteina delle cellule di insetto & buffer di lisi (Tabella materiali). Aggiungere 10% glicerolo nella lisi delle cellule. Immediatamente conservare a-80 ° C.
    6. Ripetere i passaggi 1.5.1-1.5.5 con soluzione di riserva del virus P2 di proteine CAT per fungere da gruppo di controllo.
      Nota: Ripetere passaggio 1.5 in triplice copia per preparati proteici differenti.

2. un saggio di citotossicità Cell-based MTT

  1. 5 mL di registro fase crescita (1.5-2.5 × 106 cellule/mL) insetto Sf9 delle cellule con il mezzo di crescita completa in T25 non trattata boccette di cultura.
  2. Aggiungere 25 µ l di soluzione madre di virus P1 (ottenuta al passaggio 1.4.14) per infettare le colture di cellule in fase 2.1 per 48 h con agitazione delicata a 27 ˚ c.
  3. Preparare 100 mM permetrina soluzioni stock standard in acetonitrile. Utilizzare acetonitrile per diluire a 50 mM, 25 mM, 12,5 mM e 6,25 mM aggiungendo 500 µ l, 250 µ l, 125 µ l e 62,5 permetrina µ l di soluzione in un volume totale di 1.000 µ l, rispettivamente.
  4. Uniformemente il seeding 200 µ l di colture cellulari infettate dal passaggio 2.2 supplementato con 300 µ l di terreno di crescita completa piastra a 24 pozzetti ad una densità di 2 × 105 cellule/mL.
  5. Aggiungere 4 µ l di permetrina soluzioni standard (6,25 mM, 12.5 mM, 25 mM e 50 mM) in ogni pozzetto per rendere una concentrazione finale di 50 µM, 100 µM, 200 µM e 400 µM, rispettivamente. Solo aggiungere 4 µ l di acetonitrile in pozzetti per i calcoli di attuabilità delle cellule (Figura 3).
  6. Piastre con nastri ed incubare a 27 ° C per 48 h con protezione dalla luce.
  7. Preparazione del reagente MTT (bromuro di Tetrazolium blu Thiazolyl) 5 mg/mL dissolto nel buffer (2,0 g di NaCl, 0,05 g di KCl, 0,36 g di NaH2PO4∙2H2O, 0,28 g di NaH2PO4, 0,05 g di KH2PO4 disciolto in 200 mL di distillato acqua, pH 7.5).
  8. Togliere terreno di coltura cellulare dal passaggio 2.6 dopo 48 h di incubazione senza toccare lo strato inferiore-collegato delle cellule. Aggiungere 200 µ l di reagente MTT nel passaggio 2.7 in ciascun pozzetto. Incubare a 37 ° C per 4 h fino a precipitati formazan viola scuro formano in ciascun pozzetto (Figura 3).
  9. Incubare a 37 ° C per 4 h fino a formazano viola scuro precipita forma in ciascun pozzetto. Aggiungere 500 µ l di DMSO per sciogliere completamente precipitati (Figura 3).

Figure 3
Figura 3: esempio di risultati MTT. Dopo 48 h post infezione con soluzione di riserva di virus P1 della soluzione di baculovirus ricombinanti CAT, uniformemente seme 500 µ l cellule che esprimono il gene di CAT in una piastra di coltura cellulare 24 pozzetti. Rispettivamente, aggiungere 4 µ l permetrina ad una dose diversa (6,25 mM, 12.5 mM, 25 mM e 50 mM) in ogni riga per rendere la concentrazione finale di 50 µM, 100 µM, 200 µM e 400 µM. La riga del controllo è stata trattata con acetonitrile solo e contrassegnata come CK nella piastra. (A) dopo 48 h di incubazione a 27 ° C, ignorare il terreno di coltura cellulare sul livello superiore e sostituire con 200 µ l di reagenti MTT colorati gialli. Poi incubare a 37 ° C per 48 h. viola scuro colorate riduzione precipita forma in ogni bene che indica che le cellule di sopravvivenza sono capace di metabolizzare il colore giallo reagenti MTT nel precipitato colorato viola scuro. (B) 500 µ l di solvente DMSO è stato aggiunto in ogni pozzetto per sciogliere il precipitato formato. Il valore di assorbanza di ciascun bene è stato rilevato mediante lo spettrofotometro a 540 nm. Come aumentano le concentrazioni di permetrina, il colore cambierà gradualmente dal rosso scuro al rosso chiaro, suggerendo che la viabilità cellulare sono stati diminuiti gradualmente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Trasferire 200 µ l di soluzione disciolti in piastra a 96 pozzetti. Misurare i valori di assorbanza a 540 nm utilizzando un lettore di micropiastre (Tabella materiali).
  2. Calcolare la vitalità cellulare confrontando i valori di assorbanza delle cellule di permetrina trattato con quelli delle cellule di acetonitrile trattati solo.
  3. Per il gruppo di controllo, ripetere tutti i passaggi con soluzione di riserva del virus P2 di cloramfenicolo acetiltransferasi (CAT) baculovirus ricombinanti ottenuti al punto 1.4.
  4. Ripetere 4 volte per preparazioni differenti del virus.

3. in Vitro test metabolici

  1. Preparare 100 mM permetrina soluzioni stock standard in acetonitrile. Utilizzare acetonitrile per diluire a 50 mM, 25 mM, 12,5 mM e 6,25 mM. Rilevare l'area del picco corrispondente sotto ogni concentrazione mediante HPLC. Creare e calcolare la curva standard di permetrina sulla base dell'area di picco con permetrina diverse concentrazioni.
  2. Misurare le concentrazioni di proteina nel passaggio 1.5 con Bradford metodi21.
  3. Preparare 700 µ l di reazione metabolica con standard di permetrina 40 µM e 1 mg di proteine ottenuta al passaggio 1.5 dissolto nel buffer di 0,2 M Tris-HCl (pH 7.4). Incubare a 30 ° C per 2 h con agitazione delicata. Proteggere dalla luce.
  4. Placare la reazione aggiungendo 700 µ l di acetonitrile ghiacciata. Incubare a 30 ˚ c per altri 30 min con agitazione delicata. Proteggere dalla luce.
  5. Centrifugare la miscela di reazione a 16.000 x g per 2 min a temperatura ambiente. Raccogliere il surnatante e filtrare attraverso una membrana di 0,45 µm. Trasferire la filtrazione in fiale di vetro marrone ultraclean per l'analisi HPLC.
  6. Eseguire l'HPLC sotto le ottimale condizioni cromatografiche (fase Mobile r: 90% acetonitrile e 10% di acqua; Fase mobile b: 5% acetonitrile regolata a pH 2.3 con acido fosforico 85%). Sfumatura eluire con una portata di 1 mL/min e misura una lunghezza d'onda di 232 nm.
  7. Calcolare la percentuale di svuotamento di permetrina confrontando con reazioni senza campione della proteina aggiunto.
  8. Utilizzare proteine CAT ottenuta al passaggio 1.5.6 per servire come il controllo.
  9. Ripetere tutti i passaggi con le preparazioni differenti della proteina nel passaggio 1.5.7.

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Representative Results

L'attuabilità delle cellule verso permetrina diversi trattamenti (analisi di MTT)

La citotossicità di permetrina è stata esaminata in MdαE7-ricombinante baculovirus infettati Sf9 (gruppo sperimentale) e CAT-ricombinante baculovirus (fornito dal kit di baculovirus infettati) infettata cellule (gruppi di controllo). Le tolleranze di avanzata delle cellule a permetrina in MdαE7 che esprimono le cellule fortemente supportano i ruoli metabolici di questo carbossilesterasi contro gli insetticidi e quindi proteggere le cellule dai danni chimici. Nel nostro studio, l'attuabilità delle cellule contro le concentrazioni differenti di permetrina (50, 100, 200 e 400 µM) è stata calcolata rispetto alle cellule trattate con acetonitrile da solo. I nostri risultati hanno mostrato che la redditività delle MdαE7 che esprimono le cellule era significativamente più alta (che vanno da 86,00% al 101.92%) (Figura 4B) rispetto a quello delle cellule di controllo (che vanno da 67.59% a 81,43%) (Figura 4A) quando esposti a permetrina alle concentrazioni differenti, che indica l'importante ruolo di MdαE7 nel metabolismo permetrina in cellule di insetto.

Figure 4
Figura 4: la viabilità di cellule di insetto Sf9 sotto trattamenti diversi permetrina. (A) la vitalità delle cellule di controllo infettato da baculovirus ricombinanti CAT (B) la redditività delle sperimentale cellule infettate da baculovirus ricombinanti MdαE7. Quattro le repliche sono state condotte per ogni concentrazione di permetrina. Dati è stati indicati come media ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Metabolismo in vitro di permetrina da MdαE7

Metabolismo di permetrina è stata analizzata incubando una soluzione standard di 40 µM permetrina insieme MdαE7 proteine estratte da cellule Sf9 infettate. Le reazioni con le proteine CAT serviti da comandi. La percentuale di svuotamento di permetrina è stata calcolata rispetto alle reazioni senza enzima aggiunto. Le reazioni sono state controllate mediante HPLC in fase inversa dopo un periodo di incubazione di 120 min. Poiché la permetrina standard è in realtà una miscela degli isomeri cis - e trans-, due picchi sono stati osservati nei profili cromatografici HPLC, con tempi di eluizione di 10,67 e 10,87 min per trans-permetrina e cis-permetrina, rispettivamente (Figura 5). La percentuale di svuotamento di permetrina da proteine MdαE7 (39.18±3.78%) era significativamente superiore a quella delle proteine CAT (7.29±0.81%) (Figura 6), che non è solo essere coerenti con MTT risultati ma anche direttamente dimostra le capacità del MdαE7 nel metabolismo permetrina in vitro.

Figure 5
Figura 5: profilo di The HPLC di permetrina standard. La permetrina standard utilizzata in questo studio è una miscela di isomeri trans-permetrina e cis-permetrina. Le frecce rosse indicano le cime per l'isomero trans-permetrina e isomero cis-permetrina, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: metabolismo In vitro di permethrin di proteine ricombinanti MdαE7 e CAT. Sono state calcolate le percentuali di svuotamento di permetrina da proteine MdαE7 e CAT. Tre le repliche sono state condotte per ogni concentrazione di permetrina. Dati è stati indicati come media ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Negli ultimi decenni, i sistemi di espressione eterologhi sono stati ampiamente usati per esprimere e isolare grandi quantità di proteine, permettendo la determinazione biochimica e funzionale e caratterizzazione di enzimi in vitro. Ad oggi, diversi sistemi di modello diverso tra cui Escherichia coli, Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiaee Spodoptera frugiperda sono stati adattati per espressione recombinant della proteina e la scelta della sistema in vitro è cruciale per la produzione su larga scala delle proteine interessate22,23,24,25. Nel nostro studio, il sistema di espressione di baculovirus-mediata delle cellule di insetto per generare carboxylesterases volare casa è stato scelto perché fornisce un simile ambiente intracellulare in cellule di insetto e mantiene alcune funzionalità di elaborazione eucariotiche importante 9. nonostante i vantaggi del sistema di espressione di baculovirus-mediata, dovrebbero essere affrontati anche suoi limiti. Il sistema di espressione di baculovirus-mediata delle cellule di insetto possa produrre proteine bersaglio solo se le cellule di insetto sono state infettate con baculovirus ricombinanti costruito. L'attuale sviluppo della creazione di linee cellulari di insetto stabilmente trasformati ha reso possibile non solo producono costitutivamente interessati proteine in assenza di infezione di baculovirus, ma anche per migliorare le capacità delle cellule di glicosilanti e pieghevole proteine generate attraverso Ingegneria modifiche9.

Per meglio studiare i ruoli di carboxylesterases a metabolizzare gli insetticidi in cellule e proteggendo le cellule dai danni chimici, è stata condotta l'analisi di MTT per misurare la citotossicità delle cellule contro permetrina diversi trattamenti. Durante questo processo, un sacco di parametri sperimentali associati con il metabolismo delle cellule, quali composizioni medio delle cellule, tasso di crescita delle cellule, concentrazione e il consumo di metaboliti di fornitura di energia, possa influenzare la riduzione di MTT e quindi portare a imprecise risultati. Per ridurre al minimo gli oltre / sottovalutazione del dosaggio MTT, mantenere il mezzo di coltura cellulare, dello stato di crescita delle cellule e le condizioni di incubazione coerente tra diversi trattamenti sperimentali26. Al fine di determinare gli effetti di attuabilità delle cellule causati dall'infezione di baculovirus anziché permetrina, ci ha dimostrato che il processo di infezione di baculovirus GFP-ricombinante in cellule di insetto Sf9 e trovato che nella fase di infezione P2, le cellule hanno il più alto rapporto di infezione con più basso rapporto di morte delle cellule rispetto ad altre fasi di infezione (Figura 2). Questo può spiegare meglio il motivo della scelta di cellule in fase di infezione P2 per condurre l'analisi di MTT.

Confrontando la viabilità delle cellule quando infettati da MdαE7 - e CAT-ricombinante baculovirus in uno studio MTT, abbiamo trovato una maggiore vitalità delle cellule quando che esprimono le proteine MdαE7, in grado di supportare meglio i ruoli metabolici di carboxylesterases a permetrina in cellule di insetto e proteggere le cellule dai danni chimici (Figura 4). Lo in vitro studio metabolico, che è riconosciuto come un metodo diretto per riflettere la capacità metabolica di carboxylesterases verso insetticidi, dovrebbe anche stato esplorato per compensare le limitazioni di analisi di MTT in meglio di proteine funzioni metaboliche.

In questo studio, l'espressione eterologa di carboxylesterases in cellule di insetto Sf9 con un sistema di espressione di baculovirus-mediata, la misura della viabilità cellulare verso trattamenti di permetrina diverso dall'analisi di MTT e la caratterizzazione di carboxylesterases attraverso un metabolismo in vitro test lavorare tutti insieme per fornire una strategia sistematica, scientifica e accurata per studiare i ruoli degli enzimi di disintossicazione in insetti, facilitando così una migliore comprensione di insetticida meccanismi di resistenza e quindi di sviluppo strategie innovative per la gestione dei parassiti.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs inc. M0491L
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen by life technology K240020 S.O.C medium and universal M13 sequence primers were included in this kit.
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen by life technology K210002
Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirectTM Kits Invitrogen by life technology 11791-023
BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit Invitrogen by life technology 12562-019 Cellfectin transfection reagent and ganciclovir were included in this kit
pENTR-CAT plasmid Invitrogen by life technology Included in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentration: 0.5 ug/uL
Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified Gibco by Life Technologies 10082-139
Sf9 cells in Sf-900 III SFM Gibco by Life Technologies 12659017
Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction & Lysis Buffer G Biosciences by A Geno Technology Inc 786-411
Sf-900 III SFM (1×) Serum Free Medium Complete Gibco by Life Technologies 12658-019
Grace's Insect Medium, unsupplemented Gibco by Life Technologies 11595030
Permethrin (isomers) analytical standard SUPELCO by Solutions WithinTM 442748
Methanol (analytical graded) Sigma-Aldrich 67-56-1
Acetonitrile (analytical graded) Sigma-Aldrich 75-05-8
GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters with 0.45 μm GHP Membrane (HPLC Certified) Pall Life Sciences 21890388
Alliance Waters 2695 HPLC System Waters
T100 Thermal Cycle Bio-Rad Laboratories Inc. 1861096
Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometers ThermoFisher Scientific ND2000CLAPTOP
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader BioTek

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References

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Biochimica problema 138 resistenza agli insetticidi carboxylesterases sistema di espressione di baculovirus-mediata delle cellule di insetto analisi di citotossicità analisi di metabolismo in vitro
Caratterizzazione funzionale di Carboxylesterases in casa resistente all'insetticida mosche, <em>Musca Domestica</em>
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Feng, X., Liu, N. Functional… More

Feng, X., Liu, N. Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica. J. Vis. Exp. (138), e58106, doi:10.3791/58106 (2018).

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