Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hele cellen Elektrofysiologi primær kulturperler Murine Enterochromaffin celler

Published: September 26, 2018 doi: 10.3791/58112
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1, 1
1Enteric Neuroscience Program, Division of Gastroenterology & Hepatology,Department of Physiology & Biomedical Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Gastroenterology, Department of Medicine, University of Massachusetts Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Enterochromaffin (EF) celler omfatter en lille delmængde af gastrointestinale epitelceller. EF celler er elektrisk overgearet og frigive serotonin, men vanskeligheder i dyrkning og identificere EF celler har begrænset fysiologiske undersøgelser. Metoden præsenteres her etablerer en primær kultur model imødekommenhed over for undersøgelse af enkelt EF celler af Elektrofysiologi.

Abstract

Enterochromaffin (EF) celler i den gastrointestinal (GI) epitel udgør den største delpopulation af enteroendocrine celler. Som specialiseret sensoriske celler, EF celler fornemme luminale stimuli og konvertere dem til serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release begivenheder. Dog er Elektrofysiologi af disse celler dårligt forstået, fordi de er vanskelige at kultur og identificere. Metoden fremlægges i dette papir skitserer primære EF cellekulturer optimeret til enkelt celle Elektrofysiologi. Denne protokol udnytter en transgene cyan fluorescerende proteiner (FFP) reporter for at identificere mus EF celler i blandet primære kulturer, fremme tilgangen til at opnå høj kvalitet optagelser af hele cellen Elektrofysiologi i spænding og strøm klemme tilstande.

Introduction

Gastrointestinale (GI) epitel er et mangfoldigt samfund består af flere celletyper. Enteroendocrine celler udgør omkring 1% af alle epitelceller, og enterochromaffin (EF) celler er den største enteroendocrine celle befolkning1. Nylige undersøgelser viser, at enteroendocrine2 og EF3,4 celler er elektrisk overgearet. Vi er interesseret i at forstå primære EF celle Elektrofysiologi. Således er var formålet med denne undersøgelse at etablere primære EF cellekulturer optimeret til hele cellen Elektrofysiologi.

Eksisterende EF-celle linier, der producerer og udskiller 5-HT (f.eks. QGP-15, BON6, KRJ-17) og har været brugt til at undersøge Elektrofysiologi5,8 er typisk genereres fra udødeliggjort neoplastiske væv. Mens de oplysninger, der er erhvervet fra disse cellelinjer er værdifulde5,8, er undersøgelser af primære celle Elektrofysiologi nødvendigt at korrekt forstå EF celle fysiologi. Elektrofysiologi primær EF celler kræver isolering og kultur af enkelt epitelceller, som har været begrænset af lav rentabilitet af epitel kulturer.

Metoden kultur præsenteres i denne undersøgelse er afhængig af Transgene mus med fluorescently mærket EF celler, som Tph1-fælles fiskeripolitik9, brugt i denne undersøgelse. Metoden optimerer blandet primære epitelial kulturer udviklet tidligere2,10 for enkelt celle Elektrofysiologi3. Tidligere metoder anvendes kombinationer af Trypsin/EDTA plus Collagenase A eller EDTA og DTT for enzymatisk fordøjelsen og brugt tæthed gradienter at specifikt isolere og kultur marsvin11 og rotte EF celler12. Mere nylig, tarm organoids blev genereret og mekanisk forstyrret for elektrofysiologiske optagelser4. Kulturer ved hjælp af disse metoder er velegnede for serotonin frigive eksperimenter, RT-qPCR analyse, og mens de kunne bruges til Elektrofysiologi, er afhængige af succesen af tidskrævende organoid generation, tæthed gradienter at identificere EF celler, og de cellulære forstyrrende virkninger af Trypsin og EDTA. Derimod protokollen beskrevet her forbedrer enzymatiske og mekaniske behandlinger, optimerer dyrkningsbaserede betingelser, og strømliner procedurerne for at producere enkelt og sundt EF celler egnet til de høje cellulære standarder behov for Elektrofysiologi.

Denne metode vil være nyttig for forskere, der ønsker at arbejde på primære EF celler i blandede kulturer i stedet udødeliggjort kulturer og vil undersøge Elektrofysiologi af enkelt celler. Men det kan vise sig mindre egnede til at studere cellepopulationer, der har brug for sortering eller langsigtede kulturer, der kræver overlevelse sidste 72 h.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Mayo Clinic. Den primære celle kultur del af denne protokol er baseret på tidligere udgivne metoder, som kan bruges som reference for yderligere detaljer10. Alle eksperimentelle procedurer skal godkendes af (IACUC), og alle forsøg skal udføres i overensstemmelse med relevante retningslinjer og forordninger.

1. kultur forberedelse

  1. Medier.
    1. Forberede EF celle komplet Kulturmedier med høje glukose [4500mg/L] Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) suppleret med 5% føtal bovint Serum (FBS), 1 L-glutamin og 1% Penicillin-Streptomycin (tabel 1).
      Bemærk: Medier kan opbevares ved 4 ° C i op til en måned.
    2. Filtrer EF celle komplet dyrkningsmedier og anbringes 25 mL af medier i en 50 mL tube ved 37 ° C.
    3. Forbereder fordøjelsen medier med høje glukose [4.500 mg/L] DMEM suppleret med 0,1% bovint serumalbumin (BSA) (tabel 1).
    4. Filtrer fordøjelsen medier og placere fire 10 mL alikvoter af medier i separate 50 mL rør og Inkuber i et 37 ° C vandbad.
      Bemærk: Medier kan opbevares ved 4 ° C i op til en måned.
  2. Enzym.
    1. Veje ud af 4 mg (for jejunum) eller 24 mg (for kolon) Collagenase XI [≥800 enheder/mg] i 1,5 mL microcentrifuge rør.
      Bemærk: Collagenase er stabil ved-20 ° C i op til et år.
    2. Resuspend collagenase alikvot i 1 mL af is kold PBS med Ca2 + og Mg2 +. Vortex løsning til grundigt kombinere, og Anbring på is.
  3. Belægning kultur plader.
    1. Tø 150 µL af ekstracellulære matrix overnatning på 4 ˚C på is.
    2. Lav en 5% w/v ekstracellulære matrix løsning ved at blande 100 µL af optøede ekstracellulære matrix med 2 mL iskold serumfrit high-glucose DMEM.
      Bemærk: Ekstracellulære matrix størkner ved stuetemperatur og skal håndteres med pre kølet pipetter, rør og medier indtil klar til frakke retter.
    3. Straks pels glas inderkreds af glas-bund 35 mm retter med 250 µL af opløsningen 5% ekstracellulære matrix. Denne opskrift vil dække op til 8 retter.
    4. Placer glas-bund retter i et 37 ° C inkubator under de resterende celle kultur isolation trin. Den ekstracellulære matrix tager mindst 1 time at sætte men kan være inkuberes i op til 2,5 timer mens de udfører andre isolation trin.
      Bemærk: Inkubationer længere end 3 h kan skabe en ophobning af ekstracellulære matrix, som kunne hindre forsegle dannelse under hele cellen Elektrofysiologi.

2. Vævscentre Isolation

  1. Ifølge etiske retningslinjer, ofre en 3for 6 uger gamle mandlige eller kvindelige Tph1-fælles fiskeripolitik Transgene mus (The Jackson laboratorium Stock: 028366)9 eller en anden reporter stamme.
    Bemærk: Vi anvender en dødelig dosis af stigende niveauer af kuldioxid og en cervikal dislokation som en sekundær adgang til sikre død. AVAM Udvalget om eutanasi også anser cervikal dislokation en tilladte primære eutanasi af personer uddannet i dets anvendelse, hvis dyrene er først bedøvet.
  2. Pin det aflivede mus ud på en polystyren skum dissektion scene ved hjælp af 21 G nåle. Dekontaminering mus maven med 70% ethanol.
  3. Træk musen hud stram ved hjælp af mikro-dissektion pincet (#5), og derefter bruge skarpe kirurgisk saks til at lave et tværgående snit i bunden af musen maven til at udsætte den intraperitoneal hulrum. Gøre et andet snit lodret op i maven, indtil brystkassen er eksponeret.
  4. Brug mikro-dissektion pincet til at flytte coecum til venstre for musen til at opnå en klar visning af tyktarmen.
  5. Brug mikro-dissektion saks til at klippe den mest distale del af colon (men stadig proksimalt for endetarmen) og gøre en anden klippe distale til maven. Sted de udpakkede tarmene i et 100 x 15 mm2 petriskål fyldt med 20 mL iskold phosphat bufferet saltvand (PBS).
  6. Brug en lille lineal til at måle og skære 10 cm af enten midten af tyktarmen eller jejunum. Uddrag colon ved at måle ud 10 cm segment af tarmen placeret proksimalt til den første cut taget over endetarmen. Identificere jejunum ved at folde hele tyndtarmen i halve og gør en første snit på halvvejs og et andet snit 10 cm proksimalt for først skær.
    Bemærk: Fortsæt til at udføre alle efterfølgende isolation trin på is.
  7. Fyld en 6 mL sprøjte med is kold PBS og placere sprøjte nål i lumen af de udtrukne intestinal segment. Brug mikro-dissektion pincet klemme og forsegle tarmene omkring sprøjte nål og forsigtigt flush 10 mL PBS gennem lumen at skylle væk fecal spørgsmål.
  8. Vend den intestinale væv ved forsigtigt at vævning mikro-dissektion pincet gennem lumen, klemme en tarmvæggen og tilbagetrækningskraften væv proksimalt for spidsen af pincet. Gentag denne proces, indtil segmentet er indefra og ud med lumen vender udad.
  9. Brug mikro-dissektion saks til at skære væv segment i 1 cm stykker.
  10. Brug mikro-dissektion pincet til at overføre væv segmenterne i en 50 mL-bægerglasset fyldes med 5 mL steril PBS. Brug af mikro-dissektion saks til hakkekød væv stykker til en flydende konsistens.
  11. Sted hakket væv og 15 mL af is kold PBS i en ren 50 mL tube med overførsel pipette. Hakkede 2 gange med overførsel pipette, vent for væv til at bosætte sig, fjerne 15 mL PBS supernatant og erstatte med frisk PBS. Gentag denne proces tre gange indtil PBS er klar.
  12. Placer 50 mL tube med vasket væv stykker på isen og bringe isspand i vævskultur hætte.

3. enzymatiske og mekaniske fordøjelsen

  1. Første fordøjelsen
    1. Hente en af de 50 mL rør indeholdende 10 mL af pre varmede fordøjelsen medier fra vandbad. 50 mL tube, tilføje 250 µL af PBS collagenase løsning og hakket tarmens væv stykker.
      Bemærk: sørge for at undgå at medtage eventuelle PBS fra tidligere vask trin.
    2. 50 mL røret anbringes i et vandbad i 5 minutter (colon eller jejunum) ved 37 ° C. Ryst tube 2 x pr. min.
      Bemærk: Den optimale timing og intensitet af mekaniske fordøjelsen kan variere og skal bestemmes af brugeren. For at bestemme optimal fordøjelse betingelser, kan en 10 µL alikvot af celler ses efter hver fordøjelse. Under fordøjelsen 1, bør supernatanten bestå af klumper af celler.
    3. Langsomt hakkede vævet én gang med 10 mL serologisk pipette. Kort Lad vævet nøjes med stykker, så brug en overførsel pipette til at fjerne det hele 10 mL af supernatanten.
  2. Anden fordøjelse: Gentag trin 3.1.1 til 3.1.3. Øge inkubationstiden til 10 min. Hvis fordøje kolon og holde inkubationstiden på 5 min til jejunum.
    Bemærk: Efter observation, supernatanten bør stadig bestå af store klumper af celler.
  3. Tredje fordøjelsen
    1. Gentag trin 3.1.1
    2. 50 mL røret anbringes i vandbad 37 ˚C for 10 min (kolon eller lille jejunum). Ryst glasset 2-3 x pr. min. ved en højere intensitet end Digestions 1 og 2.
    3. Langsomt afpipetteres væv op og ned med en 10-mL serologisk pipette. Tillad væv stykker at bosætte sig i kort tid.
      Bemærk: Supernatanten bør bestå af en kombination af enkelt celler og små klumper.
    4. Brug overførsel pipette til at placere 10 mL af supernatanten ind i en ny 15 mL tube, tilsættes 2 mL varmede EF celle komplet dyrkningsmedier og vendes en gang for at blande.
    5. Spin på 100 x g i 5 min ved stuetemperatur, så brug en overførsel pipette til Fjern supernatanten. Bruge en overførsel pipette til resuspenderes resterende i 2,5 mL af varmede EF celle komplet kultur medier.
  4. Fjerde fordøjelse: Gentag trin 3.3.1 til 3.3.5. Øge inkubationstiden til 15 min for kolon og forblive på 10 min til jejunum.
    Bemærk: Supernatanten bør nu består af enkelt celler.

4. cellekultur

  1. Brug overførsel pipette til at kombinere celle suspensioner indsamlet fra Digestions 3 og 4 ind i en ny 15 mL rør (5 mL samlede volumen).
  2. Fjerne en 10 µL alikvot af celler til at regne med en hemocytometer og spin den resterende cellesuspension ved 100 x g i 5 min ved stuetemperatur.
    NOTE: Den endelige cellesuspension vil bestå af små klumper og enkelt celler.
  3. Fjern supernatanten med en overførsel pipette og resuspenderes i EF celle komplet kultur medier med en tæthed på 1.000.000 celler pr. mL.
    NOTE: Den endelige mængden af cellesuspension vil afhænge af den endelige celletal. Typiske celle tæller spænder fra 2.000.000 til 4.000.000.
  4. Fjerne coatede glas-bund kultur retter fra rugemaskinen. Bruge en P1000 pipette til at erstatte ekstracellulære matrix fra hver kultur parabol med 250 µL af den endelige cellesuspension.
    Bemærk: Ekstracellulære matrix belægning har tendens til at holde sig til kanten af glas-bund fad. Særlig forsigtig skal træffes til at fjerne belægningen fra langs kanten til at forhindre gel oprustning.
  5. Lave en stamopløsning af ROCK hæmmer Y-27632 på 1 mM. Tilføje 2,5 µL af stamopløsningen til hvert glas bund fad til at opnå en arbejdsgruppe koncentration på 10 µM ROCK inhibitor i hver skål.
    Bemærk: Dette trin er afgørende for overlevelsen af jejunum kulturer men er valgfri for kolon.
  6. Placer hver kultur fad i et 37 ° C og 5% CO2 inkubator i 24 til 72 timer (figur 1).

5. forberedelse af EF celler for hele cellen Elektrofysiologi

  1. Linje den indvendige diameter af mikroskop fase med to 5 x 0,5 cm strimler af voks film til at skabe en O-ring. Montere 35-mm celle kultur fadet inden for O-ring (figur 2A-B).
  2. Skyl begge flydende vragrester, såsom løstliggende ekstracellulære matrix eller døde celler og kultur medier serum helt væk fra EF celler forhindre enten fra vanskeliggør forsegle dannelse mellem EF celle og elektrode. Brug af de tre følgende indstillinger for at opnå en grundig celle vask tilstrækkeligt for Elektrofysiologi:
    1. Valgmulighed 1: Løsning exchange er mere effektiv i en lang kammer mere så end en cirkulær kammer. Da EF-celler blev kulturperler i runde 35 mm retter, oprette en elliptisk plastindsats til fadet.
      1. Oprette indsatsen ved 3D udskrivning eller ved traditionelle fræsning metoder. Indsæt vi brugte var fræset fra acryl plast med følgende dimensioner (i mm): ydre diameter, 34,5; indre ellipse, 20 x 9; ydre højde, 10; indre højde, 1,5; broen span, 3 x 3; broen clearance, 1,5; luftindtag og -udtag, 4 x 4 hver.
      2. Lavere indsætte i kultur parabol (figur 2A-B) og fastgøre den til toppen af mikroskop scenen med to 0,15 til 0,2 g stykker modeling clay presses i 1.2 x 0,3 x 0,1 cm rektangler (figur 2A-C).
      3. Med en plastik overførsel pipette, langsomt tilføje ekstracellulære løsning til den ene side af parabol (fjorden) mens sugning fra anden siden (outlet).
    2. Valgmulighed 2: Uden en manipuleret plastindsats, tilføje ekstracellulære løsning ved overførsel pipette fra den ene side af parabol (fjorden) mens sugning fra den modsatte side (outlet). Langsomt rotere placeringen af overførsel pipette (f.eks. N e s) mens spejling placeringen af aspiration nålen på den modsatte side (f.eks. S til W-n).
    3. Mulighed 3: Coat ekstracellulære matrix på rektangulære coverslips i trin 1.3.3., og kultur cellesuspension på disse coverslips i trin 4.4. Overføre denne coverslip til et rektangulært kammer fyldt med ekstracellulære løsning, udelade trin 5.1 og springe trin 5.3. Skyl kammer med ekstracellulære løsning fra plast overførsel pipette, som beskrevet i indstilling 1 (5.2.1.3).
  3. Re-vedhæfte scenen med cellekultur ovenfor den inverterede mikroskop (figur 2D). Inkuber EF cellekultur i serumfrit ekstracellulære løsning ved stuetemperatur.
  4. Efter 4 timer, skyl kultur igen med ekstracellulære løsning som beskrevet ovenfor. Fortsætte med hele cellen Elektrofysiologi.

6. hele cellen Elektrofysiologi EF celler fra primære kultur

  1. At opnå en hele cellen Giga-forsegling
    1. Trække en halv snes elektroder til en modstand på 1-5 MΩ.
      NOTER: Pipetter af 1 – 2 MΩ modstand, der giver 10-100 GΩ sæler udføre bedst. Brand polering elektrode tips er ikke nødvendigt at opnå GΩ sæler.
    2. Pels jævnt næsen kegle af alle pipetter med polymer. Hold pipette vandret til jorden og vinkelret på forsiden af en varmepistol. Langsomt dreje pipette indtil polymeren hærder.
    3. Hæld en alikvot af intracellulære løsning i en 15 mL konisk slange. Overføre 1,2 mL af denne opløsning til en 1,5 mL microcentrifuge tube via 1-mL sprøjte. Trække en anden 0,7 mL af intracellulære ind i sprøjten. Fjerne luft fra slutningen af sprøjten. Vedhæfte en fleksibel 34 G, 67 mm nål til at sprøjte og skylle ud eventuelle resterende luft fra denne nål.
    4. Identificere en Tph1-fælles fiskeripolitik + celle, der ikke er i kontakt med andre celle eller snavs.
    5. Udfylde elektrode tip med intracellulære løsning. Opfyldning pipette af sprøjten. Omhyggeligt svirp pipette med en fingernegl til at fjerne luft boble interface.
    6. Med stemplet udarbejdet med 0,3 mL luft, tillægge en 6 mL sprøjte outlet af indehaveren af slanger. Montere elektroden i holderen.
      Bemærk: Slut sprøjten til slangen før elektroden træder bad løsning for at opretholde neutral eller positiv pres inden for den intracellulære løsning inden forsegling.
    7. Indlæse en to-trins spænding-clamp protokol, der registrerer steady-state aktiverende strømme af en spænding stige på det første skridt og registrerer de tilgængelige strømme af en enkelt spænding på andet trin. Åbn seal test (5 mV på 50 kHz).
    8. Lavere elektroden i Bad løsningen. Med micromanipulators, manøvrere elektrode tip i-flyet med og direkte vandret fra cellen. Udvise 0,3 mL luft fra sprøjten.
    9. Forsigtigt flytte elektrode vandret langs x-aksen til at røre cellen. Watch for et smilehul vises på cellen EF og/eller en stigning i membranen modstand på sæl-test. Hvis det er nødvendigt, justere elektroden ned langs z-aksen og/eller vandret langs x-aksen, ikke bevæger sig forbi midterlinjen af cellen.
    10. Anvende 0,1-0,2 mL suge på 6-mL sprøjte. Holde stemplet konstant indtil 100 MΩ er opnået, derefter slippe grebet fra stemplet. Vent for cellen at giga-seal. Forsigtigt afbryde sprøjte med en dreje motion.
      Bemærk: Hvis en EF celle ikke forsegle i første omgang, det kan være muligt at re forsegle det med en efterfølgende forsøg. For at gøre dette, træk forsigtigt elektroden fra en EF-celle med < 20 MΩ seal modstand. Styretøj brugt elektrode med micromanipulators, sejle den målrettede EF celle manuelt klar væk matrix eller snavs. Derefter forsøge at forsegle EF celle med en frisk elektrode.
  2. Optag hele celle spænding-gated Na+ nuværende.
    1. Vedhæfte en 3 mL sprøjte udarbejdet med 0,5 – 1,0 mL luft. Anvende et hurtigt tryk sug (0,1-0,5 mL) på en 3 mL sprøjten. Gentag indtil hele cellen adgang er opnået, derefter forsigtigt frakoble sprøjten.
      Bemærk: som udførelsen af en sprøjte kan variere i starten og ændrer sig gradvist med tiden og brug, praksis på forhånd med 3 mL sprøjten (forsegling ende med en pegefinger) for at sikre, at stemplet vil rekyl inden for 0,1-0,2 mL sin start position. Hvis ikke, så bytte sprøjte for en ny.
    2. Slå hele cellen kapacitans kompensation. Justere kapacitans og serie modstand. Tænde serie modstand kompensation. Forsinkelse på 60 ms, justere forudsagt så rettede serie modstand kompensation. Luk seal test.
    3. Optage et gennemsnit på 5 kører hele-celle spænding-gated Na+ nuværende (fig. 3A).
    4. Hurtigt tage hensyn til to parametre af spænding-gated Na+ nuværende: spænding på nuværende-vinduet (figur 3B, røde symboler, skæringspunktet af steady-state aktivering og inaktivering kurver) og peak Na+ nuværende tæthed.
      Bemærk: EF celler med peak Na+ strømme mere end-50 pA i spænding klemme tilstand almindeligvis vil gå at fyre fremkaldte potentialer i nuværende klemme tilstand. Derudover strømninger større end-200 pA i spænding klemme (fig. 3A) derefter normalt brand handling potentialer spontant i nuværende klemme fra membran potentialer (rød linje, figur 3D) i nærheden af spænding på den vinduet aktuel (røde symboler, figur 3B).
  3. Post fremkaldte handling potentialer.
    1. Slukke serie modstand kompensation. Deaktivere den eksterne kommando. Switch mode fra V-klemme til klemme. Justere gevinsten. Indlæse en episodisk nuværende klemme protokol. Justere mængden af bedriften aktuelle til 0 pA. Tænd for den eksterne kommando.
      Forsigtig: Ikke skifte fra V-klemme til klemme (eller omvendt) uden først at slukke den eksterne kommando.
    2. Bemærk den hvilende membran potentiale. Justere bedriften aktuelle input, så membranen potentiale læser under det aktuelle vindue (f.eks. -80 til -100 mV). Justere episodisk nuværende klemme protokollen, så trin interval af aktuelle input er mindre end værdien af den aktuelle bedrift (figur 3C inset, + 2 pA trin for-3 pA holding nuværende).
    3. Post fremkaldte handling potentialer. Bemærk den mindste mængde af nuværende injiceres for at affyre en aktionspotentialet (figur 3C, feje 3 ud af 5, + 4 pA trin fra-3 pA holding = + 1 pA).
  4. Optag spontan handling potentialer.
    1. Deaktivere den eksterne kommando. Indlæse en gap-fri (ikke-episodisk) nuværende klemme protokol.
      Bemærk: Ikke slå de eksterne kommando igen indtil mængden af holder strøm i det hul-fri nuværende klemme protokol er blevet bekræftet for at være egnet til cellen.
    2. Ændre bedriften nuværende skal mængden strøm injiceres i den sidste feje i elicited protokollen, som ikke fyre en aktionspotentialet (figur 3D, den aktuelle input under den anden feje, + 2 pA trin fra-3 pA holding =-1 pA).
    3. Tænd for den eksterne kommando. Dobbelt-tjekke at den forudsagte bedrift nuværende bringer membran potentiale tærsklen til at fyre en aktionspotentialet. Eventuelt justere den aktuelle bedrift. Optage spontane aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kulturer:
Primære murine epitelceller fremstillet af genetisk modificeret Tph1-fælles fiskeripolitik model tillægger retter efter 4 timer og er klar til fysiologiske forsøg mellem 24 til 72 h. Når dyrkningsbetingelser ikke havde været optimeret, bestod kultur epitelcelle af store klumper, flydende celleaffald, beskadigede membraner og svage fælles fiskeripolitik signal i EF celler (fig. 1A). Kulturer, der er blevet optimeret til Elektrofysiologi bestod af enkelt celler og små klumper. Sund EF celler var let identificeres af lyse fælles fiskeripolitik fluorescens og havde stadig levet op til fadet efter kraftig vask (figur 1B).

Elektrofysiologi:
EF hele celler blev indhentet på bare 15 ±4% forsøg fra kolon kulturer uden ROCK inhibitor (29 hele celler ud af 182 forsøg fra 22 kulturer) men 30 ±7% forsøg fra kolon kulturer med ROCK inhibitor (27 hele celler ud af 102 forsøg fra 50 kulturer) (< C1 > figur 4A; p < 0,05 af en ikke-parametrisk to-sidede t-test, kolon kulturer uden vs med ROCK-hæmmer). Ligeledes jejunum EF celler uden ROCK hæmmer ikke overlevede længe nok for Elektrofysiologi, mens EF hele celler blev indhentet på 41 ±3% forsøg fra jejunum kultur med ROCK inhibitor (186 hele celler ud af 447 forsøg fra 50 kulturer) (figur 4A; p > 0,05 af en ikke-parametrisk to-sidede t-test, jejunum vs kolon med ROCK-hæmmer).

Af hele cellen Elektrofysiologi, blev Na+ strømninger registreret i spænding-clamp tilstand og handling potentialer (AP) i nuværende-clamp tilstand. Na+ strømninger blev indspillet fra 81.3 ±4.0% af TPH1-fælles fiskeripolitik + celler fra jejunum eller 64.1 ±9.2% fra kolon3. 59 EF celler fra jejunum kulturer bekræftet af spænding-klemme til har Na+ peak strøm større end-25 pA, 19 EF celler i strøm-clamp tilstand fyret spontan AP ("spontan"), 29 EF celler fyret AP kun når fremkaldes ved en skridt protokol i strøm-klemme tilstand ("fremkaldte kun") og 11 EF celler ikke brand AP spontant eller af trin protokol ("ikke-fyring") (fig. 4B). Spontan celler havde en gennemsnitlig peak Na+ strømtæthed (IPEAK) af-108.0 ±19.3 pA/pF, fremkaldte-kun celler havde en Itoppen af-60.2 ±9.2 pA/pF, mens ikke-fyring celler havde en Itoppen af-43.3 ±14 pA/pF (figur 4 B; p < 0,05, spontane vs fremkaldte-only eller ikke-fyring grupper; p > 0.05 fremkaldte-kun vs. ikke-fyring grupper). Forskellen i strømtætheder ikke var en afspejling af hele cellen kapacitans, som spontane (3,3 ±0.2 pF), fremkaldte-only (2,9 ±0.2 pF) og ikke-fyring (3.1 ±0.3 pF) celler havde lignende hele cell capacitances (P > 0,05). EF celle Na+ strømninger og fremkaldte AP var følsomme over for [Na+]o koncentration og NaV1,3 hæmning3.

Figure 1
Figur 1 : Repræsentativt udvalg af kultur resultater. DIC med epifluorescensmikroskop billeder af en primær epitelial jejunum kultur fra en Tph1 fælles fiskeripolitik mus belagt på en glas bund fad og kulturperler i 24 timer. Disse to billeder viser en række kultur resultater fra denne protokol. Fælles fiskeripolitik fluorescerende celler (hvide) er enterochromaffin (EF) celler. (A) repræsentative billede fra en kultur, der er dårlig kvalitet for Elektrofysiologi. Kultur består af store klumper, beskadigede cellemembraner, lav fluorescens signal og flydende grupper af døde celler. (B) repræsentative billede fra en kultur, der er blevet optimeret til Elektrofysiologi. Kultur består hovedsageligt af enkelt, sunde celler og små klumper, der har levet op til pladen. EF celler i denne kultur opretholde en stærk fluorescens signal. Skalalinjen = 100 µm; paneler er skaleret 1:1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Forberedelse af celle kulturer for Elektrofysiologi. En strategi for effektiv og grundig skylning af EF cellekulturer med serumfrit ekstracellulære løsning er kritisk for at reducere ekstracellulære matrix og serum, som ville hæmme seal dannelse. (A) materialer. Med uret, fra øverste venstre hjørne: fase to 5 mm brede strimler af voks film, to 200 mg stykker modeling clay, plast overførsel pipette, #5 pincet, elliptiske optagelse kammer, 35 mm kultur fad med glas bund. (B) overholde voks film den indvendige diameter af scenen, sænke de elliptiske kammer i kultur skål og flade leret i rektangulære strimler. (C) forsigtigt tryk kultur parabol i voks film-foret fase og immobilisere optagelse kammer ved at strække modeling ler over kanten af fadet, fra salen til scenen. Skyl EF celler med flere bind af ekstracellulære løsning. (D) tilbagevenden scenen til monteringsbeslag ovenfor den inverterede mikroskop. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Repræsentant Elektrofysiologi resultater. (A) hele cellen Na+ strømninger, registreres af en to-trins spænding-clamp protokol (indsatser). 50 ms depolarizations fra -120 mV aktivere kanaler under trin 1 (●), mens en yderligere depolarisering til 0 mV under trin 2 (○) aktiveres kanaler, ikke havde endnu inaktiveret (dvs. er stadig tilgængelig at åbne). Røde spor, nuværende fremkaldes ved spænding skridt fra -120 til-40 til 0 mV. (B) nuværende spænding forholdet mellem peak Na+ strømninger fra panelet A, trin 1 (●, steady-state aktivering) eller trin 2 (○, steady-state inaktivering). Skæringspunktet mellem steady-state aktivering og inaktivering kurver viser et lille vindue ved-40 mV (røde symboler). (C) handling potentialer fremkaldes ved depolariserende nuværende stimuli. En aktionspotentialet kan fyre forbi 0 mV (grå linje) når membran potentiale når spændingen for Na+ vindue nuværende (rød linje,-40 mV). Indsatser, løbende-clamp protokol, hvori 0 til + 8 pA blev sprøjtet for 50-ms depolarizations fra en baseline af -3 pA. (D) handling potentialer ild fra toppen af spontan begivenheder, der har depolariseret til-40 mV. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Gennemløb af hele cellen Elektrofysiologi. (A) gennemsnitlig procentdel af hele celler pr. forsøg for n dage arbejde i fravær (-) eller tilstedeværelse (+) af ROCK inhibitor (10 µM). EF celler fra jejunum ikke overleve 24 h i kultur uden ROCK inhibitor. (B) Na+ strømtætheder målt i spænding-klemme fra n EF celler, hvor handling potentialer ikke brand (Non-fyring), fyret kun når fremkaldes ved en episodisk aktuelle-clamp protokol (Elicited-only), eller fyret spontant i gap-fri strøm-clamp tilstand (spontan) (fejllinjer er SEM). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fuldt ud forstå EF cellefunktion kræver en høj kvalitet primære kultur metode til at generere celler for hele cellen Elektrofysiologi. Primære kulturer af GI epitel havde traditionelt været vanskelig på grund af lav overlevelse. Lindre denne konfunderende faktor, udbytter den nuværende metode kulturer af ental EF celler fra enten små eller store tarm, der er i stand til at overleve i flere dage.

Vi fandt, at de var afgørende for forbedring af kvaliteten af kulturer at være egnet til Elektrofysiologi: (1) invertere slimhinden i stedet skrælning det, (2) tilføje en lille mængde af BSA til fordøjelsen medier og FBS kultur medier, (3) sænke den Collagenase XI koncentration, (4) justere varigheden og intensiteten af mekaniske agitation at øge antallet og sundhed af enkelt celler, (5) plating den ekstracellulære matrix på en lav koncentration, og (6) dyrkning med ROCK inhibitor.

På samme måde følgende tilpasninger var afgørende for at opnå hele celler mens patch fastspænding: (1) grundigt skylning kulturer med serumfrit ekstracellulære løsning, (2) at lade EF celler stå i den ekstracellulære løsning for mindst 4 h (3). genanvendelse en brugte elektroder-lignende dem fra mislykkede sæler-at rydde væk debris på vej til den næste EF celle, (4) tilføjer 10 µM Gd3 + at den ekstracellulære løsning til at blokere leak strømme (hvis tilstede) og lette tilslutning af pattedyr celle suspensioner til glas. Vi advarer dog, at Gd3 + kunne blokere spænding-gated Ca2 + og/eller mechanosensitive kanaler udtrykt i EF celler.

På trods af at have nøje optimeret de dyrkningsbaserede betingelser, fandt vi et par begrænsninger: EF celler brug 24 h til fuldt Vedhæft endnu udløber efter ~ 72 h i kultur; Derfor, de har en 48-timers vindue, når de ville være egnet til elektrofysiologiske eksperimenter. Fordi klumpet celler ofte indføre kapacitans transienter, der ikke kan kompenseres fra optagelser, generation af enkelt EF celler er kritisk. Dog ved at adskille EF celler fra epitel, cellerne så leve i et ikke-hjemmehørende miljø (dvs., høje glukose medier med føtal bovint serum og ROCK inhibitor på toppen af den ekstracellulære matrix som en kunstig basalmembranen) og kunne reagere på stimuli ikke helt repræsentativ for EF celle funktion i vivo. På trods af disse begrænsninger, stadig giver de primære dyrkning af EF celler indblik i deres fysiologi.

EF celler spiller en afgørende rolle i at opretholde et velfungerende mave-tarmkanalen og kroppen, og som sådan, der har været mange metoder udviklet for at opnå en forståelse om EF celle Elektrofysiologi. Enteroendocrine og EF celle Elektrofysiologi blev undersøgt i udødeliggjort cell modeller5,8,13, primære EF cellekulturer fra guinea gris11, og musen3,4, vores metoden udnytter celle kvalitet-bevarelse metoder til at skabe en kultur, der har været minimalt forarbejdede og afspejler de oprindelige EF-celler. Vi bruger en transgene musemodel, Tph1-FFP, der viser en cyan fluorescens i cytoplasmaet, når Tph1 er nuværende9. Denne metode kan også bruges til andre reporter eller afstamning-spores enteroendocrine celletyper. Vores metode også udretter isolering af enkelt EF celler i minimal tid og enzymatisk behandling, som cellerne er kun udsat for en blid Collagenase XI i en minimal endnu effektiv koncentration på 0,1 mg/mL (jejunum) og 0,6 mg/mL (kolon) for mindre end en time. Resultatet af disse ændringer er en kultur, der er blevet optimeret for elektrofysiologiske undersøgelser af EF-celler.

Vi har med succes brugt denne metode til at studere Elektrofysiologi og serotonin udgivelse i murine EF celler3. Evnen hen til med held isolere, identificere og kultur enkelt EF celler letter vigtige fremtidige retninger i undersøgelser på EF celle fysiologi. Denne metode kan bruges til yderligere bestemme kritiske veje og kanaler er involveret i EF celle exocytose af serotonin og andre EF celle-specifikke sendere. Metoden kan også ændres for at isolere og karakterisere fysiologi af den menneskelige EF celle sammen med brugen af acridin orange til EF celle identifikation13.

Som med de fleste videnskabelig protokol udvikling, var kommunikation og upartiske observationer kritiske i fejlfinding i denne protokol. Da vi testede nye kultur metoder for overlevelse af vores kulturer, var det nyttigt at tælle antallet af fluorescerende celler som en foranstaltning af levedygtighed, anslår celle tætheder i hvert fad, og indsamle repræsentative billeder og videoer af kulturer på tværs af mange tid point. Efter cellerne har kunnet overleve forbi 24 h i kultur, arbejdede vi på ændre vores kulturer for Elektrofysiologi eksperimenter. Sammen med indsamling af billeder og detaljerede observationer, var det vigtigt at opretholde en klar kommunikation mellem lab personale om justeringer til mekanisk fordøjelse og supplement og/eller substrat koncentrationer, således at sunde EF celler var klar for elektrofysiologiske karakterisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen

Acknowledgments

Forfatterne takke fru Lyndsay Busby for administrativ bistand og Mr. Robert Highet fra Mayo Clinic Division of Engineering for design og 3D udskrivning af kultur parabol Indsæt. Dette arbejde blev støttet af NIH K08 til AB (DK106456)-, Pilot- og Feasibility tilskud til AB fra Mayo Clinic Center for celle signalering i gastroenterologi (NIH P30DK084567) og 2015 amerikanske allergierbortsetfraastma Association forskning Scholar Award (AGA RSA) til AB og NIH R01 til GF (DK52766).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm x 15 mm culture dish Corning (Falcon) 351029
Transfer Pipette Fisherbrand 13-711-7M
10 mL serological pipette Corning (Falcon)  357551
50 mL Conical Corning (Falcon)  352098
15 mL Conical Corning (Falcon)  352097
1,000 mL Barrier Pipet Tips Thermo Scientific (Art) 2079E Keep sterile
MatTek Glass Bottom Dishes MatTek Corporation P35G-1.5-14-C Keep sterile
Micro-dissection Forceps - Very Fine, Extra-Long Points Fine Science Tools SB12630M
Surgical Scissors-Sharp Nasco 14002-14
Micro-Dissection Scissors Nasco SB46568M
Monoject Hypo Needle, 21 G x 1" A, 100/BX Covidien 8881250172
 Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice Jackson Stock # 028366 Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks
Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm) World Precision Instruments MF34G-5
Parafilm "M" Laboratory Film Pechiney Plastic Packaging
R6101 Dow Corning
6 mL syringe with regular luer tip Monoject
3 mL syringe with regular luer tip Monoject
Electrophysiology Equipment
Amplifier Molecular Devices Axopatch 200B
Data acquisition system (daq) Molecular Devices Digidata 1440A
Signal conditioner Molecular Devices CyberAmp 320
Software Molecular Devices pClamp 10.6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
  2. Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of Physiology. 589, Pt 5 1081-1093 (2011).
  3. Strege, P. R., et al. Sodium channel NaV1.3 is important for enterochromaffin cell excitability and serotonin release. Scientific Reports. 7 (15650), (2017).
  4. Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198 (2017).
  5. Alcaino, C., Knutson, K., Gottlieb, P. A., Farrugia, G., Beyder, A. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is inhibited by D-GsMTx4. Channels. 11 (3), 245-253 (2017).
  6. Kim, M., Javed, N. H., Yu, J. G., Christofi, F., Cooke, H. J. Mechanical stimulation activates Galphaq signaling pathways and 5-hydroxytryptamine release from human carcinoid BON cells. Journal of Clinical Investigation. 108 (7), 1051-1059 (2001).
  7. Modlin, I. M., Kidd, M., Pfragner, R., Eick, G. N., Champaneria, M. C. The functional characterization of normal and neoplastic human enterochromaffin cells. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (6), 2340-2348 (2006).
  8. Wang, F., et al. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is important for enterochromaffin cell response to mechanical forces. The Journal of Physiology. 595 (1), 79-91 (2017).
  9. Li, H. J., et al. Distinct cellular origins for serotonin-expressing and enterochromaffin-like cells in the gastric corpus. Gastroenterology. 146 (3), 754-764 (2014).
  10. Psichas, A., Tolhurst, G., Brighton, C. A., Gribble, F. M., Reimann, F. Mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells. Journal of Visualized Experiments. (122), 55687 (2017).
  11. Raghupathi, R., et al. Identification of unique release kinetics of serotonin from guinea-pig and human enterochromaffin cells. The Journal of Physiology. 591, Pt 23 5959-5975 (2013).
  12. Nozawa, K., et al. TRPA1 regulates gastrointestinal motility through serotonin release from enterochromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3408-3413 (2009).
  13. Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, Pt 1 161-175 (2005).

Tags

Biologi sag 139 gastrointestinale epitel enterochromaffin celler primære kultur hele cellen Elektrofysiologi spænding klemme nuværende klemme
Hele cellen Elektrofysiologi primær kulturperler Murine Enterochromaffin celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Knutson, K., Strege, P. R., Li, J.,… More

Knutson, K., Strege, P. R., Li, J., Leiter, A. B., Farrugia, G., Beyder, A. Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells. J. Vis. Exp. (139), e58112, doi:10.3791/58112 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter