Summary
クローズド マウスの大腿骨骨折モデルは骨折治癒を勉強する強力なプラットフォームで骨の再生を加速する新しい治療戦略です。この外科手術の目的は、大腿骨を安定させるために髄内鋼棒を用いたマウスで一方的な閉鎖大腿骨骨折を生成します。
Abstract
骨の骨折は、大幅に生活の質に影響を与えるだけでなく、患者に途方もない社会経済的負担を課する。効率的な骨の治癒を促進する治療戦略は存在しないと需要が高いです。骨折治癒の効果的かつ再現可能な動物モデルは、骨の再生に関連付けられている複雑な生物学的プロセスを理解する必要です。骨折治癒の多くの動物モデルは、長年にわたり; 生成されています。ただし、マウス骨折モデル最近骨の治癒を研究する強力なツールとして浮上しています。さまざまなオープンとクローズのモデルが開発されているが、生理学的に関連する方法で迅速かつ再現性のある結果を生成するための簡単な方法として際立っている閉じた大腿骨骨折モデル。この外科手術の目的は、マウスの一方的な閉鎖大腿骨骨折を生成し、髄内に鋼棒を挿入することによって大腿骨の骨折後の安定化を促進します。髄内ロッドの使用が骨組織で新たな不具合を生産やソフトの近くに損なうことがなく一貫した治癒転帰のための十分な安定化を提供しますが、釘やネジなどのデバイスより高い軸と回転安定性を提供組織。放射線イメージングを使用して、カルスの形成、骨性癒合および骨のカルスの後改造の進行を監視します。骨治癒転帰は通常治癒後の骨の強さに関連付けられているし、ねじり試験で計測。まだ、損傷修復に関連付けられている初期の細胞・分子のイベントについて骨再生の研究で重要です。髄内固定を持つマウスで閉じた大腿骨骨折モデルは骨骨折治癒研究・治癒を促進する治療戦略を評価するための魅力的なプラットフォームとして機能します。
Introduction
骨折などの筋骨格系に発生する最も一般的な傷害と $ 250 億アメリカ合衆国1で毎年を上回ると予想される治療費を含む多大な経済的負担に関連付けられて 2。骨折の大半は、何事もなく治癒、癒しは実質的なダウンタイムや生産性の損失に関連付けられています。全骨折の約 5-10% は、遅延癒しや非組合員、年齢や骨粗鬆症、糖尿病の3,4,5などの他の基になる慢性の健康状態のために します。現在効率的な骨の治癒を促進し、回復時間を短縮できる FDA 承認の薬理学的治療法がありません。
骨折治癒は種類の細胞の調整を含む複雑な非常にダイナミックなプロセスです。したがって、骨再生に関連する細胞・分子のイベントの包括的な理解は、このプロセスを加速させる治療標的の同定に重要です。他の人間の病気と同様に、非常に従順で再現可能な動物モデルの確立も骨の治癒の研究で非常に重要です。羊や豚などの大型動物骨改造プロパティとバイオメカニクス、人間に似ていますが高価、実質的な癒しの時間を必要とする、ない遺伝子操作6に簡単に従わないです。その一方で、ラットやマウスなどの小型の動物モデルは処理、メンテナンス、短い繁殖サイクル、および短い癒し時間7の低コスト性を含めて多くの利点を提供します。さらに、マウスのゲノムは、迅速な操作と遺伝的変異の生成を可能にする完全に、シーケンスです。したがって、マウスは人間の病気、怪我、研究および8を修復する強力なモデル システムです。人間では、骨粗鬆症や糖尿病の合併症は、治癒遅延の可能性を高めます。既存マウス モデルの数は骨の損傷に及ぼす骨粗鬆症や糖尿病などの合併症を研究利用可能癒し。骨粗鬆症患者治癒9破壊の後の段階で著しく減少した骨形成があります。卵巣摘出 (ovx) は、急速な骨量の減少と閉経後骨粗鬆症10,11にみられるような治癒遅延骨を示します。さらに、多くの種類のマウス ・ モデル私は、II 型糖尿病低骨マス表現型と模倣障害骨折治癒人間11に見られます。また、マウス骨折モデルはカルスで発生する複雑な生物学的過程を研究している多才なプラットホームとして役立ち、骨再生を加速する新規の治療戦略を探る。
骨の構造と代謝、骨骨折のままマウスとヒトに非常によく似たを治癒のプロセス全体の違いにもかかわらず軟骨と骨リモデリングに続いて膜内骨化の組み合わせを含みます。軟骨内骨化には、前駆細胞の肥大し、柔らかいカルスを生成する軟骨を石化する軟骨細胞に分化し、どこ破壊ギャップの周辺より機械的に安定した地域への採用が含まれます。前駆細胞の 2 番目の波は、カルスに潜入し、新しい骨マトリックス12,13,14,15を分泌する成熟した骨芽細胞に分化します。中膜内骨化、骨膜と骨の表面に前駆細胞は直接骨芽細胞の分泌の行列に区別して破壊ギャップ9,11,12 のブリッジを容易にします。 ,13。一緒に、軟骨と膜内の ossifications がさらに機械的負荷13,14 をサポートできる強力な二次骨を形成するため時間をかけて改造ハード カルスの開発につながる、15。健康な人間で癒しのプロセスは、マウス16で 35 日間と比較して、約 3 カ月かかります。
骨折治癒よく研究されているか開いているか閉じて手術モデル17を使用しています。批判的に大きさで分類された欠陥の生成などの外科的アプローチを開くまたは傷害の位置および粉砕骨折による偏差を軽減するジオメトリを標準化し、骨切りを完了します。閉鎖骨折と比較して治癒がよく遅れているので非組合員の背後にあるメカニズムを研究する優秀なモデルとしては、骨切り術。さらに、厳格な外部固定が再生は主に、膜内骨化の依存を意味、切り離した骨骨を安定させるために必要です。オープン手術アプローチが骨折した手足をもがれる軸と回転安定性を提供するためにロックの釘、ピン、クリップ、ロック プレートなどデバイスを使用します。ただし、このようなデバイスは高価であり、大きく手術18,19,20,21のより多くの時間を必要とします。その一方で、クローズド モデルは軟骨の治癒を促進するのに十分な不安定性を可能にする単純な髄内固定装置で安定しました。その結果、容易に閉じた破壊モデルは非組合員の条件を模倣しません。髄内ピン、釘、ネジ、圧縮などの内部固定技法は、安い、使いやすい、手術21,22,で23時間を最小限に抑えるため有利です。いくつかのケースで、破断前に髄内ピンを挿入が、湾曲や骨折大腿骨、変数カルスの大きさに貢献し、癒しの変位につながる髄内ピンの曲げ。破壊位置やジオメトリは、骨幹に重量をドロップする前記三点曲げ装置を使用して生成されたときクローズド モデルで標準化がより困難です。ただし、適切な技術と、この手術方法は迅速かつ一貫性のある結果を提供しています。また、閉鎖骨折モデルは高い力への影響や機械的ストレス22による骨折を研究する臨床的に関連性の高いツールとして提供しています。
この外科手術は、ラットおよびマウス22,24,25骨折大腿骨を安定させるために髄内ピンを使用して上記の方法から適応されました。まず、小径の髄内針はエントリのポイントを確立する intracondylar ノッチを通して挿入され、横重力依存性の 3 ポイントを使用して大腿骨骨幹骨折を生成する前にガイドワイヤーを導入曲げ装置です。閉じた大腿骨骨折の発生の成功、次のより大きな直径の髄内ロッドはガイドワイヤー骨折大腿骨を安定させるために組み込まれています。このメソッドは、治癒遅延、破壊時に髄内ピンの湾曲によって引き起こされる骨折後ロッドの配置により、負傷した大腿骨の再配置と最適化された安定化のため、危険を回避できます。
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Protocol
次の手順は、インディアナ大学学校の医学機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) からの承認を行った。すべての生存手術は、NIH のガイドラインに従って滅菌条件の下で行われました。痛みや感染症のリスクは、適切な鎮痛剤と抗生物質の正常な結果を確保するために管理されていました。
1. 麻酔や準備
- マウスの重量を量るし、ケタミン (100 mg/kg) とキシラジン (10 mg/kg) の投与の混合物を介しての腹腔内 (i. p.) ルートで麻酔すること。空の檻の中にマウスを置くし、それが完全に鎮静するまでそれを監視します。
- つま先ピンチ反射を使用して、マウスを鎮静することを確認します。その目を乾燥から保護するために眼軟膏を適用されます。
- 右下肢から毛皮を削除します。ヨウ素系スクラブと 70% エタノールで手術部位を拭きます。手術部位、膝の中央から開始し、外側円形掃引をスクラブします。新鮮なスクラブ、70% エタノールで終わるこの 3 倍を繰り返します。
- 即時術後疼痛管理のため皮下ブプレノルフィン塩酸塩鎮痛 (0.03 mg/kg) の術前投与量を管理します。
- 滅菌手術用パッドで覆われて加熱パッドの上にマウスを置きます。
2. 外科的アプローチ
注: 破断前に重量と落下高さ経験的決定してください特定のひずみ、年齢、手術前にマウスのセックスに。この手術は、10 週齢で C57BJ6 男性マウスに最適です。
- その裏にマウスを置き、手術足の膝を屈曲します。メスの刃を使用して、膝関節の中央に 1.5 cm の切開を作る。
- 横方向に鉗子を使用して大腿骨の遠位端を公開する膝蓋骨を置き換えません。大腿骨の近位端を逆行性に髄運河の長さの下の滑車溝の中心に 1.5 インチ長い 25 サージカル ステンレス製の注射針を挿入します。ピンの適切な配置を確保するため x 線を取る。
注: 針ガイドワイヤのパスを作成するのには、マウスの背側を終了する必要があります。 - 大腿骨遠位部にハブを介して出入りマウスの背側に面取りをする針のシャフトを 4-36 ゲージ長いタングステン ガイドワイヤを渡します。
- ガイドワイヤの成功の配置、次の場所でリムとガイドワイヤを押しながらハブを注意深く引いて 25 ゲージの針を慎重に取り外します。X 線によるガイドワイヤーの配置を確認します。
- 影響を与えるディスク (図 1 a) 上記 34.6 cm の高さから 391 g 重量を保持します。水平方向に 2 つの間で大腿骨の位置支持点、大腿骨の大腿骨、大腿骨領域サポート アンビル (図 1 b) の残りの部分、リムの側面には、荷重点 (図 1 を直面しているように).体重を落とすし、すぐに破壊された後のデバイスからマウスを慎重に取り外します。
- X 線による破壊の場所を確認します。
- 骨折大腿骨を安定させるためにガイドワイヤ上 24 ゲージ ステンレス鋼管皮下に挿入します。
注: このアプリケーションのエントリ ポイントは、小さい直径の針を使用して生成された、いくつかの力を必要があります。この直径の違いは、大腿骨の近位端から 24 ゲージ棒の潜在的な移行を効果的に防止します。鈍のチューブは、大転子の皮質骨を満たしているように、挿入の深さは手動で感じることができます。 - ガイドワイヤを削除する前に x 線による骨折大腿骨の安定化と鉄筋の位置を確認します。
- ワイヤー カッターを用いた大腿骨の遠位端で余分なチューブをカットします。鉗子を使用して膝関節を脱臼しないように注意して、穏やかな下向きの力を適用する顆の表面の下で露出配管を埋めます。
- 鉗子を用いた膝蓋骨の位置を変更します。5-0 吸収性縫合糸で切開部位を閉じます。
3. 術後管理
- 術では、術後回復にそれらを支援するために i. p. ルートにマウス可能性があります最大 500 μ L の滅菌生理食塩水を介してを注入します。
- 手術から目を覚ますまで、温水回復ベッド上の動物を監視します。一度、歩行、ケージに戻します。
- 彼らは適切に治癒されており、可動性を取り戻すように手術後数日間マウスを密接に監視し続けます。ブプレノルフィン塩酸塩鎮痛 0.03 mg/kg 皮下すべて 6 h 術後、3 日間のおよび管理に応じてその後。彼らは手術後骨の治癒過程を阻害する示されている、非ステロイド性抗炎症薬 (NSAIDs) の使用を避けてください。
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Representative Results
手術の成功の実装は、放射線イメージングと監視されました。キーの手順には、髄内針、ガイドワイヤーの配置、横骨折大腿骨骨幹と (図 2 a私- 2Aiv) 髄内ロッドと適切な安定化の誘導の挿入が含まれます。破壊カルスの治癒の進行 (図 2 b) 術後 28 日を毎週放射線画像監視だった。日 10-16 後破壊で、軟骨細胞は肥大を施行し、著名なカルスを形成する石灰化軟骨を生成.
骨骨折治癒を勉強して軟骨と膜内の ossifications に関与する分子・細胞の初期イベントを理解することは重要です。大腿骨とトルイジン ブルー 7 および 14 日後破壊破壊ギャップ (図 3 a) で軟骨の形成を視覚化するために染色されました。軟骨形成骨折後検出の 7 日、14 日後の破壊による破壊ギャップを揃えています。
柔らかいカルスの形成、破骨細胞の吸収石灰化軟骨と成熟した骨芽細胞が新しい骨を合成しました。最初、カルス内骨マトリックス蒸着が空間的非特定のしかし、時間をかけて、石灰化した軟骨の改造製作中部と破壊カルスの周囲より定義された構造。1 型コラーゲン (COL1) は骨基質の主要なコンポーネントとその表現空間構成と現在の 14 日後破壊 (図 3 b) をした骨の相対的な量を示した。一緒に取られて、これらのデータは、軟骨内の癒しの中に軟骨と骨マトリックスの連携生産を示してください。
その後、17-35 日後破壊の中に原発性骨徐々 に皮質の骨幹部12に似た強い二次骨を形成する改造しました。マイクロ (マイクロ CT) の解析には、カルス (図 4 a ・ 4 b) の効果的な改造を示す骨折、14 と 28 日後間約 50% 減のカルスのボリュームが明らかにしました。放射線イメージング技術は、骨量とマイクロ アーキテクチャの貴重な評価を提供するにはねじりのテストを実行して、非負傷した対側大腿骨に対する骨強度を適切に評価する必要があります。
図 1: 破壊装置および破壊の生成中のマウスの位置の図。(A) このパネルは骨折とコンポーネントの id を生成するために使用される装置の図を示す:(1)ディスクへの影響、(2)ナッツ、通された棒、(3)上のプラットフォーム(4)垂直の記事、(5)春とシャンク、(6)下方のプラットフォーム、(7)サポート段階、(A8) ローレットつまみと (A 9) ベース。矢印は、重量は影響を与えるディスク ドロップ後に通された棒およびすねの下方変位を示します。(B) 骨折、転子間中 (B1) ギロチンの刃を使用して中間の骨幹で生成され (B2) アンビルによる大腿骨の大腿骨領域がサポートされます。(C) これらのイメージは、破壊の生成する前にサポートのアンビルにわたってマウスの後肢の位置を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 破壊誘導と癒しの進行の撮影の使用を監視します。(A) マウスの放射線画像が (の前に 30 ゲージ タングステン ガイドワイヤの配置 (Aii) 大腿骨の長さを介して逆行性 (Ai) 25 g 針の挿入を示す手術中撮影されました。Aiii) 世代の横骨折と 24 ゲージ棒で骨折大腿骨の安定化 (Aiv)。(B) 週放射線画像は、28 日後破壊するまで治癒の進行を監視する使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 軟骨形成と軟骨内骨化の中に新しい骨マトリックス析出します。このパネル (A) 組織学的セクションの 7 および 14 日古い角質に染まったトルイジン ブルーを示しています。カルス周辺は赤く縁取られます。(B) このパネル免疫染色型コラーゲンの破壊カルス中緑 1 式 14 日後破壊 (40 X と 100 倍の倍率) を示しています。サンプルはブルーとして核を視覚化する DAPI で counterstained いた。車 = 軟骨;BM = 骨髄;10 月 = 古い皮質骨;Mu = 筋肉。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 破壊カルスのマイクロ CT 解析します。(A) このパネルを縦表示し、破壊の断面のマイクロ CT 画像の 14 および 28 日後破壊でカルス (n = 6/グループ)。(B) このパネルは、14、28 日後破壊で平均カルス ボリューム (3mm) を示しています。誤差範囲は、標準偏差を表します。試験治療グループ間で統計の比較は、対になっていない 2 スチューデントのtを用いて行った-テストします。標準偏差;p < 0.05。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
この手術の目的は、マウスで標準化された閉じた大腿骨骨折を生成することです。このモデルの主な利点は内部固定の髄内ロッドの湾曲を回避するため、破壊の発生後に行われる。おそらくこのプロトコルの最も重要な側面は、骨折の幾何学は、曲げ力や後肢の位置に依存して標準化された横骨折大腿骨骨幹の世代です。大腿骨の不適切な配置は、曲げモーメントの間に斜めのまたは粉砕骨折につながることができます。重量とドロップの高さは、年齢、性別、およびマウスのひずみに依存しており、経験的に決められたなければなりません。試験機は装備ドロップ重量24の代わりに三点曲げ装置材料を用いた応用力をさらに制御できます。ただし、生成ドロップ重量と骨折は高衝撃やストレス関連の傷害の臨床的に関連するモデルです。
さらに、手術中に合併症を生じる。ガイドワイヤは脱臼骨折、髄内ロッドと安定化中に負傷した大腿骨のミスアラインメントにリードの生成後になるかもしれません。これは、骨折の発生の前後に放射線イメージングによるモニタリングによって防ぐことができます。粉砕骨折の場合動物は研究から除外する必要があります。さらに、移動性および傷つけられた肢の治癒に影響を与える可能性と動物を密接に髄内ロッドを移行するため手術後モニタリングされなければなりません。技術の 1 つの制限は、生体内でマイクロ CT または磁気共鳴画像 (MRI) 分析では不可能なステンレス鋼として髄内ロッド画像の品質が損なわれてしまいます。したがって、これらの分析は、実行前のヴィヴォ、髄内ロッドを慎重に除去、次のみできます。
多くのマウス骨折モデルが閉じた大腿骨骨折モデルとして際立っているシンプルで効率的と骨の再生を研究する臨床的に関連するメソッド。髄内ロッドと内部固定このプロトコルで記述されている癒し、一貫性のある骨の十分な安定性を提供しますが負傷した大腿骨の軸と回転の動きのある程度をできる場合があります。オープン モデルのような標準化された「骨折」の生成を可能にする骨切り術、骨の堅い外固定が必要し、癒し膜内骨化に依存しています。急性長管骨骨折は、通常膜内骨化と軟骨内の組み合わせを通してヒーリングします。したがって、このプロトコルで記述されている閉鎖の大腿骨骨折は、骨の治癒のメカニズムを研究する生理学的に関連するモデルを提供します。クローズド マウスの大腿骨骨折を含む今後の研究は生体内イメージング技術などの新しい血管の形成を測定するコントラスト染料の使用を許可する radiolucent 髄内ロッドの開発の恩恵を受けるだろう、手足を負傷しました。完全に、クローズド マウスの大腿骨骨折モデルは骨の損傷と再生に関連する細胞・分子のイベントを研究する魅力的なプラットフォームであり、骨の治癒を促進する新たな治療標的を識別します。
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Disclosures
この原稿の著者が明らかに何もありません。著者は、本稿で報告される調査で使用されるすべての材料へのフル アクセスに制限がない状態をさらに。
Acknowledgments
この作品は、国防省 (DoD) 米国陸軍衛生研究資材コマンド (USAMRMC) 議会監督医学研究プログラム (CDMRP) (PR121604) と国立機関の関節筋骨格系からの補助金によって支えられました。や皮膚病 (NIAMS)、ユマ sankar さんに NIH R01 AR068332。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oster Minimax Trimmer | Animal World Network | 78049-100 | |
| POVIDONE-IODINE | Thermo Fisher Scientific | 395516 | |
| OPHTHALMIC OINTMENT | Thermo Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Styker T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific Corporation | TP-700 | |
| 1ml Sub-Q Syringe | Thermo Fisher Scientific | 309597 | |
| ENCORE Sensi-Touch PF | Moore Medical LLC | 30347 | Latex, powder-free surgical glove |
| PrecisionGlide 25G Hypodermic Needles | Thermo Fisher Scientific | 14-826-49 | |
| Ultra-High-Temperature Tungsten Wire, | McMaster-Carr | 3775K37 | 0.005" Diameter, 1/16 lb. Spool, 380' Long |
| 304 stainless steel, 24G thin walled tubing | Microgroup Inc | 304h24tw-5ft | |
| #15 Scalpel Blades | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| #10 Scalpel Blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Narrow Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | Serrated/Straight/12cm |
| Iris Forceps | Fine Science Tools | 11066-07 | 1x2 Teeth/Straight/7cm |
| Dissector Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | Slim Blades/Angled to Side/Sharp-Sharp/10cm |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | ToughCut/Straight/Sharp-Sharp/11.5cm |
| Olsen-Hegar Needle Holder with Suture Cutter | Fine Science Tools | 12002-12 | Straight/Serrated/12cm/with Lock |
| Crile Hemostat | Fine Science Tools | 13004-14 | Serrated/Straight/14cm |
| Tungsten Wire Cutter | ACE Surgical Supply Co., Inc. | 08-051-90 | ACE #150 Wire Cutter, tungsten carbide tips |
| 3-0 VICRYL Suture | Ethicon Suture | J423H | 3-0 VICRYL UNDYED 27" FS-2 CUTTING |
| piXarray 100 Digital Specimen Radiography System | Bioptics, Inc | Cabinet x-ray system | |
| Einhorn 3-Point Bending Device | N/A | N/A | Custom Built |
References
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