Generation af lukkede femur frakturer i mus: en Model til at studere knogleheling
Summary
Modellens murine lukkede collum fraktur er en kraftfuld platform at studere frakturheling og roman terapeutiske strategier til at fremskynde knogle regenerering. Målet med denne kirurgisk protokol er at generere ensidige lukkede femur frakturer i mus med et intramedullære stål stang til at stabilisere lårbenet.
Abstract
Knoglebrud være en enorm socio-økonomiske byrde for patienter, ud over væsentligt påvirker deres livskvalitet. Terapeutiske strategier, der fremmer effektiv knogleheling er ikke-eksisterende og i høj efterspørgsel. Effektiv og reproducerbare dyremodeller for frakturer healing er nødvendig for at forstå de komplekse biologiske processer forbundet med knogle regenerering. Mange dyremodeller frakturheling er blevet genereret gennem årene; dog er murine fraktur modeller for nylig dukket op som effektive værktøjer til at studere knogleheling. En bred vifte af åbne og lukkede modeller er blevet udviklet, men den lukkede collum fraktur model skiller sig ud som en simpel metode til at generere hurtige og reproducerbare resultater i en fysiologisk relevante måde. Målet med denne kirurgisk protokol er at generere ensidige lukkede femur frakturer i mus og lette en efter fraktur stabilisering af lårbenet ved at indsætte et intramedullære stål stang. Selvom enheder f.eks et søm eller en skrue giver større axial og roterende stabilitet, giver brug af et intramedullære stang en tilstrækkelig stabilisering for konsekvent helbredende resultater uden producerer nye fejl i knoglevævet eller skader i nærheden soft væv. Radiografisk imaging bruges til at overvåge udviklingen af callus dannelse, tåens og efterfølgende ombygning af den benede callus. Knogle helbredende resultater er typisk forbundet med styrken af helede knoglen og målt med torsionsstivhed test. Stadig, forstå de tidlige cellulære og molekylære begivenheder tilknyttet fraktur reparation er kritisk i studiet af knogle væv revitalisering. Modellens lukkede collum fraktur i mus med intramedullært fiksering fungerer som en attraktiv platform for at studere fraktur knogleheling og evaluere terapeutiske strategier for at fremskynde heling.
Introduction
Frakturer er blandt de mest almindelige skader opstår til bevægeapparatet og er forbundet med en enorm socioøkonomisk byrde, herunder udgifter til behandling, der forventes for at overgå 25 milliarder dollar årligt i USA1, 2. Selv om fleste af frakturer helbrede uden uheld, er healing forbundet med betydelige nedetid og tab af produktivitet. Ca 5-10% af alle knoglebrud resultere i forsinket heling eller ikke-union, på grund af alder eller andre underliggende kroniske sundhedsmæssige betingelser, såsom osteoporose og diabetes mellitus3,4,5. Ingen FDA-godkendt farmakologiske behandlinger er i øjeblikket tilgængelig at fremme effektiv knogleheling og forkorte restitutionstid.
Frakturheling er en kompleks og yderst dynamisk proces, der omfatter koordinering af flere celletyper. Derfor, en omfattende forståelse af de cellulære og molekylære begivenheder tilknyttet knogle regenerering er afgørende for identifikation af terapeutiske mål, at fremskynde denne proces. Som med andre sygdomme hos mennesker er etablering af en meget medgørlige og reproducerbare dyremodel afgørende i studiet af knogleheling. Større dyr som får og svin, har knogle remodellering egenskaber og biomekanik ligner for mennesker, men er dyre, kræver betydelige helbredende tid, og er ikke umiddelbart indstillet til genmanipulation6. På den anden side tilbyder lille dyremodeller, som rotter og mus, mange fordele, herunder en nem håndtering, lave omkostninger vedligeholdelse, korte avl cykler og en kortere helbredende tid7. Derudover er mus genom fuldt sekventeret, giver mulighed for hurtig manipulation og generation af genetiske varianter. Således er musen en kraftfuld modelsystem til at studere menneskelig sygdom, skade, og reparere8. Hos mennesker øger co-morbiditet som knogleskørhed og diabetes mellitus sandsynligheden for en forsinket heling. En række eksisterende musemodeller er tilgængelige til at studere virkningerne af co-morbiditet såsom osteoporose og diabetes mellitus på knogle skade og healing. Patienter, der lider af osteoporose har en markant nedsat knogledannelse under de senere faser af en fraktur, healing9. Ovariectomized (OVX) mus udviser hurtig knogletab og forsinket knogle heling svarende til den konstaterede i postmenopausale osteoporose10,11. Derudover mange musemodeller af type I- og type II diabetes efterligne lav knogle masse fænotyper og nedsat frakturheling set i mennesker11. Derudover murine fraktur modeller tjene som en alsidig platform til at studere de komplekse biologiske processer, der forekommer i callus og udforske roman terapeutiske strategier, der fremskynder knogle væv revitalisering.
Trods forskelle i knoglestruktur og metabolisme, den overordnede proces for knoglebrud healing er fortsat meget ens i mus og mennesker, der involverer en kombination af endochondral og intramembranous ossifikation efterfulgt af knogle remodellering. Endochondral ossifikation indebærer ansættelse af stamceller til mindre mekanisk stabile regioner omkring fraktur gap, hvor de differentiere sig til chondrocytter, der Hjertehypertrofi og mineralize brusk til at producere en blød callus. Den anden bølge af stamceller infiltrere callus og differentiere sig til modne osteoblaster, der udskiller ny knogle matrix12,13,14,15. Under intramembranous ossifikation, stamfaderen på de periosteal og knoglens endosteale overflader direkte differentiere i matrix secernerende osteoblaster og lette bridging fraktur hul9,11,12 ,13. Sammen, resultere endochondral og intramembranous ossifications i udviklingen af en hård hård hud, som er yderligere ombygget over tid til at danne en stærk sekundære knogle understøtter mekaniske belastninger13,14 ,15. Hos raske mennesker tager helingsprocessen ca 3 måneder, sammenlignet med kun 35 dage i mus16.
Frakturheling er almindeligt blevet undersøgt ved hjælp af enten åbne eller lukkede kirurgisk modeller17. Åbn kirurgisk tilgange, såsom generation af en kritisk størrelse defekt eller komplet osteotomi, standardisere skade placering og geometri at reducere afvigelser forårsaget af artikulære frakturer. Osteotomier tjene som en fremragende model til at studere de underliggende mekanisme bag en ikke-union, fordi healing er ofte forsinket i forhold til lukkede frakturer. En stiv ekstern fiksering er desuden forpligtet til at stabilisere den osteotomized knogle, hvilket betyder regenerering vil primært afhænge af intramembranous ossifikation. Åben kirurgisk tilgange bruge hjælpemidler såsom låsning negle, pin-klip og låsning plader til at give aksial og roterende stabilitet til de brækkede lemmer; men sådanne anordninger er dyre og kræver væsentligt mere tid i kirurgi18,19,20,21. På den anden side er lukkede modeller stabiliseret med en simpel intramedullært fiksering enhed, giver mulighed for nok ustabilitet at stimulere endochondral healing. Som et resultat, efterligne lukket fraktur modeller ikke let betingelserne af en ikke-union. Intern fiksering teknikker, såsom intramedullært stifter, søm og kompressionsskruer, er fordelagtigt, da de er billige, let at bruge, og minimerer tid i kirurgi21,22,23. I nogle tilfælde intramedullært nåle indsættes før frakturen, men bøjning af intramedullært pin kan føre til vinkling eller forskydning af det brækkede lårbenet, bidrager til en variabel callus størrelse og healing. Fraktur placering og geometri er mere vanskeligt at standardisere i lukkede modeller, som de er genereret ved hjælp af en tre-punkts bøjning enhed, hvori en vægt er faldet på diaphysis. Dog med den rette teknik tilbyder denne kirurgiske tilgang hurtige og konsistente resultater. Desuden fungerer lukket fraktur model som en klinisk relevant værktøj til at studere frakturer skyldes høj kraft virkning eller mekanisk stress22.
Denne kirurgisk protokol var tilpasset fra tidligere beskrevne metoder ved hjælp af et intramedullære pin til at stabilisere brækkede lårben i rotter og mus22,24,25. Først, en intramedullært nål med en lille diameter er indsat gennem intracondylar hak at oprette et kontaktpunkt, og en guidewire er indført før generering af en tværgående brud på den femorale midshaft ved hjælp af en tyngdekraft-afhængige tre-punkts bøjning enhed. Efter den vellykkede generation af en lukket collum fraktur indgår et intramedullære stang med en større diameter over guidewire til at stabilisere brækkede lårbenet. Denne metode undgår risikoen for forsinket heling forårsaget af vinkling af intramedullært pin under fraktur, som placeringen af stang efter fraktur tillader for repositionering og optimeret stabilisering af det skadede lårbenet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Målet med denne kirurgiske procedure er at generere standardiseret lukkede femur frakturer i mus. En vigtig fordel ved denne model er, at den intern fiksering finder sted efter generation af fraktur, således at man undgår en vinkling af intramedullære stang. Måske er det mest kritiske aspekt af denne protokol generation af en standardiseret tværgående brud på den femorale midshaft, fraktur geometri er afhængig af den anvendte bøjning kraft og positionering af hind lemmer. Forkert placering af lårbenet under et…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den Department of Defense (DoD) os hær medicinalforskning og Materiel kommando (USAMRMC) Kongressen instrueret Medical Research programmer (CDMRP) (PR121604) og de nationale institutter for gigt og bevægeapparat og hudsygdomme (NIAMS), NIH R01 AR068332 til Uma Sankar.
Materials
| Oster Minimax Trimmer | Animal World Network | 78049-100 | |
| POVIDONE-IODINE | Thermo Fisher Scientific | 395516 | |
| OPHTHALMIC OINTMENT | Thermo Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Styker T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific Corporation | TP-700 | |
| 1ml Sub-Q Syringe | Thermo Fisher Scientific | 309597 | |
| ENCORE Sensi-Touch PF | Moore Medical LLC | 30347 | Latex, powder-free surgical glove |
| PrecisionGlide 25G Hypodermic Needles | Thermo Fisher Scientific | 14-826-49 | |
| Ultra-High-Temperature Tungsten Wire, | McMaster-Carr | 3775K37 | 0.005" Diameter, 1/16 lb. Spool, 380' Long |
| 304 stainless steel, 24G thin walled tubing | Microgroup Inc | 304h24tw-5ft | |
| #15 Scalpel Blades | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| #10 Scalpel Blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Narrow Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | Serrated/Straight/12cm |
| Iris Forceps | Fine Science Tools | 11066-07 | 1×2 Teeth/Straight/7cm |
| Dissector Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | Slim Blades/Angled to Side/Sharp-Sharp/10cm |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | ToughCut/Straight/Sharp-Sharp/11.5cm |
| Olsen-Hegar Needle Holder with Suture Cutter | Fine Science Tools | 12002-12 | Straight/Serrated/12cm/with Lock |
| Crile Hemostat | Fine Science Tools | 13004-14 | Serrated/Straight/14cm |
| Tungsten Wire Cutter | ACE Surgical Supply Co., Inc. | 08-051-90 | ACE #150 Wire Cutter, tungsten carbide tips |
| 3-0 VICRYL Suture | Ethicon Suture | J423H | 3-0 VICRYL UNDYED 27" FS-2 CUTTING |
| piXarray 100 Digital Specimen Radiography System | Bioptics, Inc | Cabinet x-ray system | |
| Einhorn 3-Point Bending Device | N/A | N/A | Custom Built |
References
- Schnell, S., Friedman, S. M., Mendelson, D. A., Bingham, K. W., Kates, S. L. The 1-Year Mortality of Patients Treated in a Hip Fracture Program for Elders. Geriatric Orthopaedic Surgery & Rehabilitation. 1 (1), 6-14 (2010).
- Burge, R., et al. Incidence and economic burden of osteoporosis-related fractures in the United States, 2005-2025. Journal of Bone and Mineral Research. 22 (3), 465-475 (2007).
- Cunningham, B. P., Brazina, S., Morshed, S., Miclau, T. Fracture healing: A review of clinical, imaging and laboratory diagnostic options. Injury. 48, S69-S75 (2017).
- Einhorn, T. A. Can an anti-fracture agent heal fractures?. Clinical Cases in Mineral and Bone Metabolism. 7 (1), 11-14 (2010).
- Hak, D. J., et al. Delayed union and nonunions: epidemiology, clinical issues, and financial aspects. Injury. 45, S3-S7 (2014).
- Decker, S., Reifenrath, J., Omar, M., Krettek, C., Muller, C. W. Non-osteotomy and osteotomy large animal fracture models in orthopedic trauma research. Orthopaedic Reviews (Pavia). 6 (4), 5575 (2014).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Jacenko, O., Olsen, B. R. Transgenic mouse models in studies of skeletal disorders. Journal of Rheumatology Supplement. 43, 39-41 (1995).
- Nikolaou, V. S., Efstathopoulos, N., Kontakis, G., Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. The influence of osteoporosis in femoral fracture healing time. Injury. 40 (6), 663-668 (2009).
- Bain, S. D., Bailey, M. C., Celino, D. L., Lantry, M. M., Edwards, M. W. High-dose estrogen inhibits bone resorption and stimulates bone formation in the ovariectomized mouse. Journal of Bone and Mineral Research. 8 (4), 435-442 (1993).
- Haffner-Luntzer, M., Kovtun, A., Rapp, A. E., Ignatius, A. Mouse Models in Bone Fracture Healing Research. Current Molecular Biology Reports. 2 (2), 101-111 (2016).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews in Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Seminar in Cellular and Developmental Biology. 19 (5), 459-466 (2008).
- Ai-Aql, Z. S., Alagl, A. S., Graves, D. T., Gerstenfeld, L. C., Einhorn, T. A. Molecular mechanisms controlling bone formation during fracture healing and distraction osteogenesis. Journal of Dental Research. 87 (2), 107-118 (2008).
- Gerstenfeld, L. C., et al. Three-dimensional Reconstruction of Fracture Callus Morphogenesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (11), 1215-1228 (2006).
- Marsell, R., Einhorn, T. A. Emerging bone healing therapies. Journal of Orthopaedic Trauma. 24, S4-S8 (2010).
- Lybrand, K., Bragdon, B., Gerstenfeld, L. Mouse models of bone healing: fracture, marrow ablation, and distraction osteogenesis. Current Protocols of Mouse Biology. 5 (1), 35-49 (2015).
- Garcia, P., et al. The LockingMouseNail–a new implant for standardized stable osteosynthesis in mice. Journal of Surgical Research. 169 (2), 220-226 (2011).
- Histing, T., et al. An internal locking plate to study intramembranous bone healing in a mouse femur fracture model. Journal of Orthopaedic Research. 28 (3), 397-402 (2010).
- Garcia, P., et al. A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing. Journal of Biomechistry. 41 (8), 1689-1696 (2008).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. Journal of Orthopaedic Trauma. 23 (5 Suppl), S31-S38 (2009).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Holstein, J. H., Menger, M. D., Culemann, U., Meier, C., Pohlemann, T. Development of a locking femur nail for mice. Journal of Biomechistry. 40 (1), 215-219 (2007).
- McBride-Gagyi, S. H., McKenzie, J. A., Buettmann, E. G., Gardner, M. J., Silva, M. J. Bmp2 conditional knockout in osteoblasts and endothelial cells does not impair bone formation after injury or mechanical loading in adult mice. Bone. 81, 533-543 (2015).
- Williams, J. N., et al. Inhibition of CaMKK2 Enhances Fracture Healing by Stimulating Indian Hedgehog Signaling and Accelerating Endochondral Ossification. Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).
