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选择与无选择生物鉴定研究蛾 grisescens的化蛹偏好及出现的成功

Published: October 30, 2018 doi: 10.3791/58126
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 4, 5, 1, 1, 1, 1
1Guangdong Key Laboratory for Innovation Development and Utilization of Forest Plant Germplasm, College of Forestry and Landscape Architecture, South China Agricultural University, 2College of Agriculture, South China Agricultural University, 3Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, 4College of Horticulture, South China Agricultural University, 5College of Coast and Environment, Louisiana State University

Summary

在这里, 我们提出了一个协议, 以研究蛾 grisescens成熟幼虫的化蛹偏好, 以响应土壤因子 (如基质类型和含水量) 使用选择生物鉴定。我们还提出了一种无选择生物鉴定的协议, 以确定影响 grisescens 化蛹行为和存活的因素.

Abstract

许多昆虫生活在地面之上作为幼虫和成人, 并在地下化蛹。与他们生命周期的上述阶段相比, 在土壤中化蛹环境因素对这些昆虫的影响较少。蛾 grisescens (鳞翅目: 尺蛾科) 是茶树的一种严重害虫, 在华南造成了巨大的经济损失。本文所述的协议旨在通过多种选择生物鉴定研究, 即成熟的末龄grisescens幼虫是否能鉴别土壤变量, 如基底类型和含水量, 并通过无选择来确定生物鉴定, 基质类型和含水量对化蛹行为的影响以及 grisescens 的出现成功.研究结果将加深对grisescens化蛹生态学的认识, 并可为抑制grisescens种群的土壤管理策略带来深刻的见解。此外, 还可以对这些生物鉴定进行修改, 研究各种因素对土壤玉米螟害虫化蛹行为和存活的影响。

Introduction

与昆虫幼虫和成虫阶段相比, 由于蛹的移动能力有限, 蛹阶段非常脆弱, 无法迅速逃离危险的环境。玉米螟下面是一个共同的战略使用的不同群体的昆虫 (例如, 在命令双翅目1,2,3,4, 鞘翅目5, 膜翅目6,缨翅目7, 和鳞翅目8,9,10,11,12) 保护他们免受地面捕食者和环境危害。其中许多是严重的农林害虫1、2、3、4、5、6、7、8 ,9,10,11,12。这些土壤玉米螟昆虫的成熟幼虫通常离开主人, 落在地上, 漫步寻找一个合适的地点, 挖洞进入土壤, 并为玉米螟8,10建造一个蛹室。

茶套,蛾 grisescens (鳞翅目: 尺蛾科), 是茶树山茶属植物中最重要的柱坑害虫之一.13。虽然这一物种在1894年首次被描述, 它已被错误地识别为蛾真菌Prout (鳞翅目: 尺蛾科) 在过去的几十年14,15。最近的一些研究14,15,16描述了两种同级物种之间的形态学、生物学和地理分布的差异。例如, 张等。15报告说, 该地区的倾斜主要发生在中国三个省份 (安徽、江苏和浙江) 的边界, 而grisescens的分布较斜的大得多.因此, grisescens造成的经济损失在很大程度上被忽视了, 这一害虫的知识需要被广泛修订和更新16,17,18,19.我们以前的研究表明, E. grisescens更喜欢在土壤中化蛹, 但也可以在土壤不可用时化蛹 (无化蛹基质条件)11,12。

本文提供了一个循序渐进的过程, 以 (1) 确定grisescens的化蛹偏好, 以响应的因素, 如基底类型和水分含量, 通过使用多选择生物鉴定, 和 (2) 确定非生物因素的影响grisescens生物鉴定的化蛹行为及出现的成功。所有这些生物鉴定都是在控制良好的实验室条件下进行的。此外, 这些生物鉴定也适用于评估其他因素对不同土壤玉米螟昆虫化蛹行为和存活的影响。

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Protocol

1. 水分选择生物鉴定, 以确定化蛹偏好的E. grisescens

  1. 获得grisescens的成熟的末龄幼虫
    1. 茶树 (山茶) 的鲜芽 (30-40 厘米长)。将 25-30 芽插入250毫升三角烧瓶中。用自来水灌满烧瓶。在塑料盆中放入 3-4 烧瓶 (带茶树) (上部: 直径51厘米; 底面: 直径40厘米; 高度:16 厘米)。
    2. 释放 1000-2000 幼虫 (第二到第五龄) 的实验室殖民地的grisescens到茶叶芽在每个盆地的叶子。在受控实验室条件下保持这些幼虫 [14 小时的光周期, 其次是10小时的黑暗 (14:10 L: D), 60-90% 相对湿度 (RH) 和 24-28 °c]。每1至 2 d, 用手小心地将幼虫转移到新鲜的叶子上。每天从盆底清除粪便和碎屑。
    3. 选择从茶树茎叶脱落的成熟的最后龄幼虫, 并积极地在盆底徘徊。获得至少240成熟的幼虫, 以确保足够的幼虫可用于生物鉴定。
      注意: 仅选择主动流浪幼虫进行实验。不要选择留在叶子上的幼虫, 因为它们还没有准备好化蛹。此外, 不要选择预蛹与有限的移动活动, 因为他们不会积极寻找适当的条件后被释放到生物测定领域。
  2. 基材制备
    1. 使用比重计方法20收集和鉴定4种基质 (如沙子、沙质壤土1、沙地壤土2和淤泥壤土)。对土壤和沙子进行消毒, 在80摄氏度烘箱干燥器 > 3 d, 然后完全干燥的土壤和沙子在50摄氏度的几个星期, 直到基质样品的干燥重量不再改变随着时间的推移。
    2. 用木头杵和迫击炮把干土磨碎。通过3毫米的筛网筛查沙子和接地土壤, 并将其存放在密封塑料袋中。
    3. 计算每个基底的不同含水量 (沙子、沙质壤土1、沙质壤土2或淤泥壤土), 如下所示2:
      Equation 1
    4. 将所需的蒸馏水添加到含有干燥土壤或沙子的密封塑料袋中, 准备5%、20%、35%、50%、65% 和80% 水分基板。彻底混合蒸馏水和土壤或沙子。
  3. 生物测定竞技场准备
    1. 同样除以聚丙烯容器 (上部: 20.0 厘米长 x 13.5 厘米宽, 底部: 17.0 厘米长 x 10.0 厘米宽, 高: 6.5 厘米) 到6室与防水聚氯乙烯 (PVC) 床单 (高度: 3.5 厘米)。使用热胶修复 PVC 板材并密封裂纹。
      注: 完全密封任何裂缝, 防止渗水。
    2. 对于每个测试, 使用与不同含水量 (5%-、20%-、35%-、50%-、65%-和 80%-水分) 相同的基材填充6腔室 (图 1a)。
      注: 在每次测试中仅使用1种不同含水量的基底。随机分配含有6水分含量的衬底的腔室顺序。
    3. 用小片胶带粘贴 4-6 片新鲜茶叶, 覆盖聚丙烯容器盖子的内表面 (图 1b)。

Figure 1
图 1: 选择测试的生物测定竞技场示例.(a) 使用防水聚氯乙烯 (PVC) 板材将聚丙烯容器均匀地分成6个腔室。PVC 板材用热胶固定, 任何裂缝都要小心密封。在本例中, 沙质壤土2具有不同含水量 (5%、20%、35%、50%、65% 和80% 水分), 用于在随机分配的订单中填充分室。(b) 新鲜的茶叶被贴在盖子的内侧, 成熟的蛾 grisescens幼虫将被释放。(c) PVC 板材用于将聚丙烯容器均匀地分成4个腔室, 其中填充4种基材 (沙子、砂质壤土1、沙质壤土2和淤泥壤土), 50% 水分。这个数字是从王等的修改。11.请点击这里查看这个数字的更大版本.

  1. 生物测定设置和数据记录
    1. 释放30成熟的最后龄幼虫 (获得在步骤 1.1.3) 到新鲜的茶叶粘贴在聚丙烯容器的盖子上。小心翻转盖子, 紧紧盖住聚丙烯容器。
    2. 重复每个测试8x。在 14:10 (L: D) 光照和26摄氏度的环境室设置中保持生物测定竞技场。
    3. 在5天, 计算每个燃烧室土壤表面的蛹数。此外, 拆除生物鉴定和计数在基板内的蛹数。
      注意: 只计算在基板或内部的活蛹。通过使用镊子接触蛹后观察腹部运动, 检查蛹的存活能力。
  2. 数据分析
    1. 对于每个测试, 计算每个复制的每个分庭中发现的蛹的百分比。使用简洁和马尔姆格伦21提供的方法将百分比数据传输到日志比率。
    2. 使用方差 (方差分析) 对每个腔室中蛹 (转化数据) 的百分比进行比较。为每个测试设置α = 0.05 的意义级别。

2. 基底选择生物鉴定确定E grisescens的化蛹偏好

  1. 重复步骤1.1 以获得成熟的最后龄幼虫, 步骤1.2 制备不同含水量的基质。这一次, 只需要20%、50% 和80% 水分基板。
  2. 生物测定领域的制备
    1. 与步骤1.3.1 类似, 使用 PVC 板材将聚丙烯容器均匀地分成4室。使用热胶修复 PVC 板材并密封裂纹。
    2. 对于每种测试, 请将具有相同含水量 (20%、50% 或80% 水分) 的4种底物 (沙子、沙质壤土1、砂壤土2和淤泥壤土) 的分室填充到随机分配的订单 (图 1c)。重复步骤1.3.3 准备盖子。
  3. 重复步骤1.4 设置生物鉴定并记录数据和步骤1.5 以分析数据。

3. 无选择生物鉴定确定grisescens的土壤挖洞行为和出现的成功

  1. 重复步骤1.1 以获得成熟的最后龄幼虫, 步骤1.2 准备4底物 (沙子, 沙质壤土 1, 砂壤土2和淤泥壤土) 在3水分含量 (20%, 50%, 和80% 水分)。
  2. 生物测定设置
    1. 将衬底添加到塑料容器 (上部: 直径11.5 厘米; 底部: 直径8.5 厘米; 高度: 6.5 厘米) 到3厘米的深度。总共, 确保将有12种处理 (4 基板类型和3水分含量的组合)。重复每治疗7x。
    2. 释放15个成熟的最后龄幼虫到每个生物测定领域的基底上。用盖子盖紧密封容器。在 14:10 (L: D) 光照和26摄氏度的环境室设置中保持生物鉴定。
      注意: 将不需要粘贴新鲜的茶叶在盖子上提到的选择生物鉴定。
  3. 数据记录和分析
    1. 在3天, 计数在每个复制的基底表面的蛹和任何死幼虫的数量。计算按如下方式钻进基底的E. grisescens个体的百分比:
      Equation 2
    2. 每天记录出现的成人人数, 直到没有更多的成人出现 15 d. 计算出出现的成功情况, 如下所示:
      Equation 3
    3. 用单向方差分析法比较掘出个体的百分比和治疗中的出现成功率。设置α = 0.05 的显著性水平。

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Representative Results

生物鉴定的水分选择表明, 与80% 水分砂相比, grisescens个体 pupated 在 5%-35%-水分砂中的含量明显增加 (图 2a)。然而, 有相当多的人更倾向于在土壤中或内化蛹 (沙质壤土1和2和淤泥壤土), 具有中间含水量 (图 2b - 2d)。

Figure 2
图 2: 水分选择生物鉴定的结果.这些面板显示了在每个分庭中发现的活蛹的百分比 (5%、20%、35%、50%、65% 和80% 水分) (a) 沙子、(b) 沙地壤土1、(c) 沙质壤土2或 (d) 淤泥壤土。数据显示为平均± SE。不同的字母表示显著差异 (P < 0.05)。这个数字是从王等的修改。11.请点击这里查看这个数字的更大版本.

基材选择生物鉴定表明, grisescens个体比砂壤土 (1 和 2) 在20% 水分条件下 (图 3a) 更倾向于沙子。在含有50% 水分含量的4基质的腔室中发现的蛹的百分比没有显著差异 (图 3b)。在 80%-水分条件下, pupated 或在沙子中的个体比在其他基质中或在其他基材上大得多 (图 3c)。

Figure 3
图 3: 来自基板选择生物鉴定的结果.这些面板显示了在每一个包含沙子、沙质壤土1、沙质壤土2或淤泥壤土 (a) 20%-, (b) 50%-或 (c) 80% 水分含量的每个室中发现的活蛹的百分比。数据显示为平均± SE。不同的字母表示显著差异 (P < 0.05)。这个数字是从王等的修改。11.请点击这里查看这个数字的更大版本.

不同含水量的沙子没有显著影响掘人的百分比和grisescens (图 4a和4b) 的出现成功。显著减少grisescens掘进干燥 (20% 水分) 或湿 (80% 水分) 土壤为玉米螟 (图 4a)。此外, 从20% 水分沙质壤土2和淤泥壤土中出现的成年人明显减少, 比那些在 50%-或 80%-水分沙质壤土2和淤泥壤土中 pupated 的人 (图 4b)。

Figure 4
图 4: 无选择生物鉴定的结果.这些面板显示 (a) 掘进个体的百分比和 (b)蛾 grisescens在响应不同基质类型 (沙子、沙质壤土1、沙质壤土2和淤泥壤土) 和水分含量 (20%,50% 和 80%)。数据显示为平均± SE。不同的字母表示显著差异 (P < 0.05)。这个数字是从王等的修改。11.请点击这里查看这个数字的更大版本.

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Discussion

在一些害虫6、9、22、23中对不同土壤变量的化蛹偏好进行了研究。例如, 为了研究桔小实 tryoni (乔安妮弗罗加) (双翅目: 实蝇科) 成熟幼虫在不同土壤湿度条件下的偏好, Hulthen 和克拉克22设置 3 x 3 拉丁方形设计, 其中包含9个容器, 填充土壤的 0%, 75%, 或100% 场容量, 和25成熟的幼虫被释放到每个容器的表面。Alyokhin等。23放置100容器 (填充土壤) 在一个木框架, 与36中心容器 (干燥或湿) 安排在 "棋盘" 模式, 和 350-450 晚期第三龄幼虫的桔小实蝇(蝇) (双翅目:实蝇科) 被释放到36容器的中心。这些研究适用于tryoni和b. 蝇幼虫, 因为它们中的大多数在生物测定竞技场22,23中的土壤中得到了恢复。然而, 这些竞技场并没有被覆盖。因此, 具有强大移动能力的流浪幼虫可能会长距离飞行并逃离竞技场。在这里, 我们提供了一个简单的方法来研究土壤玉米螟昆虫的偏好, 无论其大小和移动能力。与以前的研究相比, 这些生物鉴定很容易设置。此外, 土壤变量的多级 (如> 4) 可以在相对较小的竞技场中进行研究。

值得注意的是, 从此处所述的选择测试中获得的数据不能使用方差分析进行直接解析, 因为百分比数据不独立 (每个分庭中蛹的百分比总和总是等于 1, 因此, 增加在1室中蛹的百分比将导致其余的百分比下降)。在这里, 我们执行了对数比转换, 因为它是一个简单的过程, 它 "有效地从任何组合数据中移除 CSC (恒定和约束), 同时保留其真正的协方差结构"21。在本研究中, grisescens蛹的存活率很高, 而我们只记录了每室中活蛹的百分比。然而, 一些土壤玉米螟害虫, 如松树 processionary 蛾, Thaumetopoea pityocampa (丹尼斯 & Schiffermüller) (鳞翅目: Thaumetopoeidae), 通常表现出高死亡率在玉米螟24。在这种情况下, 对活体和死蛹进行计数是正确的。

无选择生物鉴定已被广泛应用于研究土壤化蛹害虫产生的效果。在这些研究中, 基质类型和含水量是最常研究的因素2、3、4、5、9、10、11,12. E. grisescens可以在基板内或化蛹。结果, 我们记录了掘入人员的百分比。这一结果对于帮助理解grisescens的化蛹模式很重要。

选择和无选择生物鉴定都可以进行修改, 以调查其他土壤因素 (如土壤密度、表面致密度、有机质含量等) 对各种土壤玉米螟昆虫的偏爱和性能的影响。在最近的一项工作中, 我们修改了这些生物鉴定研究 (1) 土壤中使用化学农药或生物防治剂排斥玉米螟grisescens (活和死蛹计数), 和 (2) 这种处理对化蛹的影响grisescens的行为 (例如, 掘出个体的百分比) 和出现的成功.

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢玉珍、圣哲和燕骏 (华南农业大学林业与景观建筑学院) 对昆虫饲养和实验设置的帮助。这项工作由中国国家自然科学基金 (赠款号 31600516)、广东自然科学基金 (赠款号 2016A030310445) 和广东省科技规划项目 (批准号 2015A020208010) 资助。.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Triangular flask Bomex Chemical (Shanghai) Co., LTD 99 250 mL
Plastic basin Chahua, Fuzhou, China 100 upper side: 51 cm in diameter; bottom side: 40 cm in diameter; height: 16 cm
Zip lock bags Glad, Guangzhou, China 126/133
Polypropylene containers Youyou Plastic Factory, Taian, China 139/155/160/161/190 upper side: 20.0 cm [L] × 13.5 cm [W], bottom side: 17.0 cm [L] × 10.0 cm [W], height: 6.5 cm
Waterproof polyviny chloride sheet Yidimei, Shanghai, China 141
Tape V-tech, Guangzhou, China VT-710
Oven drier Kexi, Shanghai, China KXH-202-3A
Environmental chamber Life Apparatus, Ningbo, China PSX-280H

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References

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