Summary
キヌレニン経路 (KP) 生理代謝の変化は、精神疾患に関与しています。変更されたキヌレニン経路代謝、体内の齧歯動物での機能的帰結を調査新規治療法の解明を助けるかもしれない。現在のプロトコルは、ラットにおける急性キヌレニン挑戦の影響を調査する生化学的および行動のアプローチを組み合わせたものです。
Abstract
トリプトファン分解のキヌレニン経路 (KP) は、精神疾患に関与しています。具体的には、アストロ サイト由来の代謝産物キヌレン酸 (カイナ) 両方のNで拮抗薬-メチル-d-アスパラギン酸 (NMDA) と α 7 ニコチン性アセチルコリン (α7nACh) 受容体、健康と病気における認知プロセスに関与しています。統合失調症患者の脳でカイナ レベルが上昇するいるとグルタミン酸作動性およびコリン作動性受容体での誤動作は作因的認知機能の障害、病気の精神病理学のコア ドメインに関連すると考えられます。カイナは、統合失調症者の病態生理学的に重要な役割を果たす可能性があります。ラットにおける前臨床研究はカイナの急性の高度は、彼らの学習・記憶プロセスに影響を与える可能性を示しているし、直接 bioprecursor キヌレニンに動物を扱うことによって齧歯動物の脳内の内因性カイナを昇格することが可能です。現在のプロトコル詳細でこの実験的アプローチを説明し、キヌレニン血糖と脳カイナ形成 (高速液体クロマトグラフィーを使用して)、a) の生化学的解析を組み合わせた b) 行動テスト プローブを海馬依存性の文脈の記憶 (受動的回避反応パラダイム) と c) 睡眠・覚醒行動 [脳波と筋電図 (EMG) を組み合わせた遠隔録音] の評価ラット。一緒に取られて、高いカイナ、睡眠、認知の関係を研究して、このプロトコルの詳細に記述するキヌレニン標高とカイナ形成生体内でラットの関数の結果を理解するための実験的アプローチ。このプロトコルの変化により得られた成果は、KP とカイナが睡眠と健康と病気の状態で認知を調節する際に極めて重要な役割を果たす仮説をテストします。
Introduction
KP は必須アミノ酸トリプトファン1の約 95% を分解します。哺乳類の脳キヌレニン アストロ サイトには主に酵素キヌレニン アミノトランスフェラーゼ (KAT) II2によって生理小分子カイナに代謝されます。カイナは脳2,3,の4NMDA と α7nACh 受容体拮抗薬として機能し、またターゲット シグナル受容体 G タンパク質およびアリール炭化水素受容体 (AHR) を含む結合受容体 35 (GPR35)5 ,6。実験動物で行動アッセイ2,7,8,9,10の配列の認識性能に支障をきたす脳カイナの高度が示されています。.カイナは、こうして睡眠の神経生物学におけるアストロ サイト由来の分子の役割をさらにサポートによる睡眠・覚醒行動11、認知機能を調節する際に不可欠な役割を果たして新たな仮説を提案し、認知12。
カイナで標高を統合失調症13,14,15,16、衰弱させる精神障害患者の脳脊髄液と死後の脳の組織で発見されている臨床的に認知障害によって特徴づけられます。統合失調症患者もよく、17の病気を悪化させる可能性があります睡眠障害に悩まされています。統合失調症やその他のこれらの貧しい人々 の成果を治療するための新規治療法の開発につながる可能性があります睡眠と認知、学習と記憶、特に間の関係を調節することで KP 代謝とカイナの役割を理解精神科の病気です。
信頼性と一貫性のある KP 代謝物の測定法は、KP 生物学の科学的な理解に様々 な機関から新たな研究を統合できることを保証するために重要です。現在、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) によるラット血漿中キヌレニンとラット脳におけるカイナを測定する手法について述べる.Zn2 +の存在下で蛍光検出の使用になります、まず柴田18など最近適応し、ポストカラム試薬として 500 mM 酢酸亜鉛と derivatize に最適化によって開発された現在のプロトコル脳11カイナ内因性、ナノモル量の検出。
議定書に従って、 de novoの内因性カイナの生産を刺激する直接 bioprecursor キヌレニンを腹腔内注入 (i. p.) ラットで。カイナ生産の度を決定する生化学的評価と組み合わせて、海馬依存性の記憶 (受動的回避反応パラダイム) で、キヌレニンの影響に挑戦はまた、睡眠アーキテクチャ (脳波、筋電図信号)検討した11。これらの技術の組み合わせは、キヌレニン チャレンジ生体内でラットの生化学的, 機能的影響の研究のためことができます。
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Protocol
私達の実験のプロトコルはメリーランド大学施設動物ケアおよび使用委員会によって承認され、ケアと実験動物の使用のため、国立衛生研究所のガイドに従いました。
注: ラット (250-350 g) は、すべての実験で使用されました。動物の別のコホートは、生化学的解析、行動実験と睡眠の記録で使用されました。動物は、メリーランド州精神医療研究センターで温度制御の施設で収容されました。据え置かれたライトの 12/12 時間の明暗周期同調因子時 (ZT) 0 と ZT 12 時消灯。動物は、実験中にアドリブへの食料や水を受け取った。施設は研究所動物介護認定のアメリカの協会によって完全に認定されました。
1. ラット キヌレニン腹腔内投与
注: このプロトコルで ZT 0 (光の位相の先頭) に投与したキヌレニンと ZT 2 と ZT 4 キヌレニン代謝の時間コースを決定するために組織を採取します。コントロールとして生理食塩水を注入した動物が使用されました。例えば、ラットの重さ 500 g と必要な量は 100 mg/kg、ラット キヌレニンの 10 mg/mL の溶液の 5 mL 注射器が表示されます。
- L キヌレニン硫酸 (「キヌレニン」) 重量を量り、20 mL のバイアルに。すべての回で氷上キヌレニンを維持することを確認します。
-
必要な濃度を達成し、7.6 1 N 水酸化ナトリウム (NaOH) を使用するために pH を調整する生理食塩水を追加します。渦、キヌレニンが完全に溶けるまでソリューションを超音波と。
注意: 水酸化ナトリウムを処理しながら推奨事項に従ってください。- たとえば、10 mg/mL の溶液を成し遂げるためには、キヌレニンの 200 mg を量り、ガラス瓶の場所します。15 mL の生理食塩水と渦を追加し、(5-10 秒、1/8 インチ径の陰極の 20 kHz) を超音波解散。NaOH を使用すると、ソリューションの pH を調整します。最後に、生理食塩水を使って 20 mL にボリュームを調整します。
- 各実験ラットの重量を量るし、動物の体重と所望の治療線量に基づいてそれぞれの噴射量を計算します。慎重に家檻から動物を削除、腹腔、薬液を注入、そのケージに動物を返します。
2. キヌレニン測定を用いた高速液体クロマトグラフィー
- 組織の採取
注: このプロトコルで ZT 0 (光の位相の先頭) に投与したキヌレニンと ZT 2 と ZT 4 キヌレニン代謝の時間コースを決定するために組織を採取します。コントロールとして生理食塩水を注入した動物が使用されました。- 炭酸ガスを使用して、動物を安楽死させます。呼吸の兆候が 1 分間停止した後、斬首でセカンダリの安楽死法を実行します。
- 全トランク血を収集するために K3の 20 μ L を含む 15 mL チューブに使い捨て漏斗を配置-EDTA (0.5 M)。チューブに体から流出する血液を許可します。EDTA は全体で混合できるように繰り返しチューブを反転します。
- はさみを使用して、頭蓋骨を公開する正中線を頭の上に皮膚をカットします。頭蓋骨と、フロントに戻ってから頭蓋骨を切って脊髄のオープニングを背面に任意の余分な首の筋肉を削除します。
- 頭蓋骨の両サイドを軽く引いて開きます脳を公開して、それを損傷しないように鉗子で脳を慎重に取り外します。かみそりの刃で嗅球を削除し、正中線を半分に脳をカットします。鉗子を使用して、(すなわち海馬と皮質) の関心の領域に、hemibrain を解剖します。
- ドライアイスにアルミ箔上すべて解剖脳作品を配置します。組織が完全に固定後、20 mL プラスチック バイアルにそれを転送、-80 ° C で保存
- 10 分清 (プラズマ) を削除し、-80 ° C で保存する前に新しいの遠沈管にそれを転送 300 x gで全トランク血を遠心分離します。
- サンプル準備
- プラズマ: 扱われた動物から収集
- プラズマ管の凍結を解凍 (手順 2.1 組織のコレクションを参照してください) ぬれた氷の上。
- 新しい遠心管に超純水 (1:2 1:10 カイナのキヌレニンの) サンプルを希釈します。希釈試料 100 μ L 6% 過塩素酸の 25 μ L を追加します。
注意: 過塩素酸を処理しながら推奨事項に従ってください。 - 渦すべてのサンプル、遠心分離機に 12,000 × g 10 分間。終わったら、(各管) から上澄みの 100 μ L を削除し、キヌレニンやカイナ測定に小さな 0.25 mL 遠心チューブに配置します。
- 脳: 扱われた動物から収集
- ドライアイスに (手順 2.1 組織のコレクションを参照してください) 冷凍脳サンプル チューブを配置します。個別に各脳サンプル、精密分析用天秤で重量を量る。チューブに戻るし、ドライアイスの背面に配置します。
- すべての試料重量を量られ後、は、濡れた氷にチューブを移動します。各サンプル 1:10 の希釈 w/v 超純水超音波発生装置 (5-10 秒、1/8 インチ径の陰極の 20 kHz) を使用してそれらをホモジナイズしてくださいと。たとえば、脳組織の 100 mg は、純水の 900 μ L を追加します。
- 希釈それぞれ 100 μ L 分注新しいチューブにサンプルを 25 μ 25% 過塩素酸酸性.渦、12,000 × gで 10 分間、遠心分離します。
- 、遠心分離後の上清 100 μ L を削除、カイナ定量のための小型 0.25 mL 遠心チューブに置きます。
- プラズマ: 扱われた動物から収集
- 高速液体クロマトグラフィーの設定と実行
- 50 mM ナトリウム酢酸移動相を準備します。1 l の純水酢酸ナトリウム三水和物の 6.81 g を溶解します。6.2 氷酢酸を使用して pH を調整し、真空はきれいなガラスにそれをフィルターします。ナトリウムのアセテートの移動相をきれいな 1 リットルのガラス瓶に転送します。
- 500 mM 酢酸亜鉛を準備します。フィルターを掃除し、超高純度水の 500 mL の酢酸亜鉛の 54.88 g を溶解します。クリーン 500 mL ガラス瓶に転送します。純水で 1 L ボトルと HPLC グレード アセトニ トリル 500 mL のボトルを記入してください。
- 別々 に、移動相、純水と 100% アセトニ トリル HPLC マシンから吸気管を配置します。酢酸亜鉛溶液を移動相後列とは、誘導体化前を組み合わせた蠕動ポンプによって別途ポンプします。
- コンピューターのコントロール パネルを使用して、プログラムを実行 5% アセトニ トリルと 95% 超純水水 0.5 mL/分で安定した圧力とベースラインを達成するために 20-30 分間実行を許可します。
- 安定したベースラインが確立される、95% ナトリウム酢酸移動相と 5% アセトニ トリル溶液組成に変更します。30 分間平衡します。
- 蛍光検出器のランプを点灯し、ウォーム アップすること。
- 一方で、0.1 mL/分の流量にポストカラム ポンプをオンにも約 20 分後に約 500 psi の安定した圧力に達することができます。
- 基準を準備します。
- カイナ、1 mM の原液で始めるし、5 の標準濃度を準備するそれを希釈 (すなわち、10 nM、5 nM の, 2.5 nM、1 nM と 500 pM)。
注: これは標準曲線に至る 200 fmoles 10 fmoles 20 μ L 注入量が生成されます。 - キヌレニン、1 mM の原液で始めるし、5 の標準濃度を準備するそれを希釈 (すなわち、10 μ M、5 μ M、2.5 μ M、1 μ M、500 nM)。
注: これは標準曲線に至る 200 pmoles 10 pmoles 20 μ L 注入量が生成されます。
- カイナ、1 mM の原液で始めるし、5 の標準濃度を準備するそれを希釈 (すなわち、10 nM、5 nM の, 2.5 nM、1 nM と 500 pM)。
- サンプル シーケンスのパラメーターを制御し、複数のサンプルの autoinjections を可能にする高速液体クロマトグラフィー システム ソフトウェアを設定します。
- 「サンプルの実行」画面で"ファイル"をクリックして、「サンプル セットの新規作成」ドラッグします。新しいウィンドウが開き、「空」を選択します。すべて基準 (手順 2.3.8 参照) またはそれらを実行する必要があります順序でサンプルを個別に一覧表示します。
- 「機能」列で、標準およびサンプルを指定します。基準は、先頭と末尾のシーケンスの試金する必要があります。すべての 5 つのサンプルの間に水を注入します。
- 脳ホモジネート準備からサンプルの 30 μ L を注入または基準とプラズマ準備からサンプルの 15 分注入 20 μ L に各サンプルの実行時間を設定します。
- キヌレニン励起の励起・発光波長 (評価される化合物に依存) を設定: 365 nm、発光: 480 nm、および保持時間: 〜 6 分、励振をカイナ: 344 の nm、発光: 398 の nm、および保持時間: ~ 11 分。
- すべてのパラメーターが設定されているし、マシンが平衡、シーケンスを実行します。
- データを定量化するには、「プロジェクト参照」画面に移動します。「サンプル セット」タブ下サンプルを定量化するセットをダブルクリックします。すべての注射のリストからすべての基準を強調表示し、右クリックします。新しいウィンドウで「プロセス」を選択し、「調整と量的」を選択するドロップ ダウン メニューを使用して、"どのように"の横にある:。
- すべての基準を再度強調表示、右クリックし、「レビュー」を選択。クロマト グラムが開くと、上部にあるボタンを使用して「統合」と、各規格を「調整」する標準的な曲線が自動的に作成されます。
- 「サンプル セット」タブに戻り、サンプル セットをダブルクリックします。次に、すべての規格を強調表示します。プロセス上記、その代わりに、ドロップ ダウン メニューから"Quantitate"を選択することを繰り返します。すべてのサンプルを再度強調表示し、右クリックし「レビュー」を選択します。クロマト グラムを開くと、「統合」を上部にあるボタンを使用して、それぞれは、「量的」サンプル。
注: これは、以前に作成した標準曲線に基づく各サンプルの濃度を出力します。
3. 受動的回避反応パラダイム
注: これらの行動実験は急性キヌレニン課題と私たちの血液生化学的所見に基づいて設計されていた。脳カイナの増加を最大にするには、は、ZT 2 で発生した海馬を介した学習をテストする受動的回避反応パラダイムで ZT 0、トレーニング セッションの前に 2 h でキヌレニン (100 mg/kg) を投与されました。装置は、2 同様に大きさで分類されたコンパートメント (21.3 cm 高、20.3 cm 幅と 15.9 cm 深い) ギロチン ドアで区切られ、防音ボックス内で構成されます。試験装置の 2 つのコンパートメントは、「ライト側」と「ダークサイド」と呼ばれています。光の側の壁はクリアと、試験中にライトがオンにするさらに照らすこの区画。暗い室の壁は、ブラック アウト状態を維持するために完全に覆われています。
-
1 日目: 訓練試験
- テスト前に 70% のエタノールで装置をきれいに。
- テストの部屋に動物を持って来る。
- 優しく装置と閉じるのライト側に実験動物を配置し、ラッチ装置ドアおよび防音ボックス。
- 関連するソフトウェアを使用して、試験を開始します。ホーム画面から、ドロップ ダウン メニューから「ファイル」をクリックし、「セッションを開く」を選択します。新しいウィンドウで、正しい手順と装置が選択されていることを確認し、「閉じる」をクリックします。次に、「設定」をクリックし、「信号」を選択します。新しいウィンドウで正しい装置を選択し、「問題」をクリックします。
注: ソフトウェアを装置のライト側でオンにし、2 つのコンパートメント間のギロチン扉を開く光が開始されます。タイマーが開始されます。 - 動物が完全に装置、ギロチンのドアが閉じると避けられない足衝撃のダークサイドに入ったとき (0.56 mA 1 s) が届けられます。
- 動物暗いコンパートメントに入る前に経過した時間を記録します。
- 動物が、ショックを受けた後、許可 30 装置から動物を削除する前にリカバリ時間の s。
- その家のケージに動物の背部を配置します。
- 次の動物で試験を開始する前に濡れタオルと、糞便のペレットの dispose で装置を拭きます。
- すべての動物は訓練され後、は、動物施設に戻る。
-
2 日目: テスト試用版
- 訓練試験の後、実験室 24 h に戻って動物をもたらします。装置の光の側に配置することを閉鎖し、ドア、防音ボックス ラッチによって最初の動物のテストの試みを開始します。
- 前の日と同じソフトウェア コマンドを使用してテスト試用を開始します。装置のライト側で点灯して 2 つのコンパートメント間のギロチン扉が開きます。タイマーが開始されます。
- 動物に入る暗いコンパートメントと、ギロチンのドアが閉じられます。レコードの経過時間。
注: 試験後に終了ソフトウェアを介して最大 300 s 動物は試験装置の光の側に残っている場合。 - ホーム ケージに動物の背部を置き、次の動物で試験を開始する前に (前述の手順 3.1.9) 装置をきれい。
4. 睡眠解析
- 無線脳波/筋電図送信機の外科的移植
注: 遠隔送信機が滅菌、手術の前に準備します。- かみそりの刃を使用して、リード線、明らかにプラスチック コーティングの小さな長さを慎重に取り外します。満ちている殺菌ソリューション 50 mL の円錐管に送信機を置く [例えばWavecide (2.65% グルタルアルデヒド)]。
- 少なくとも 12 時間消毒ソリューションに送信機を残します。その後、手術前に廃棄物コンテナーにソリューションに転送します。滅菌生理食塩水で送信機をすすいでください。
- 手術の日、動物麻酔室にそれを置く前に重量を量る。100% O2と 3-5% イソフルランを誘発します。
- 成功した麻酔の時に動物を削除し、慎重にひげをそるの胸郭のすぐ下と少しだけ残って、体の背面に電気かみそり、頭と首の上部だけでなく、髪の小さなパッチを使用します。
- カルプロフェン術後鎮痛の皮下 (5 mg/kg) を管理します。
- 手術中の動物の体の温度を維持するために動物の下で 37 ° C で設定サーモスタットに制御された温水加熱パッドを配置します。
- 脳定位固定装置のフレームに麻酔状態を維持し、頭を安定させる耳バーを配置して鼻の円錐形に動物を配置します。Betadine スクラブと 70% のエタノールの綿棒を交互に剃ら肌を滅菌します。それらを円滑にする目に opthalamic 軟膏を適用します。
- 最初の切開する前に十分な麻酔を確保するため、つま先ピンチ テストを使用します。
- 生殖不能のメスを使用すると、首の後ろに目のすぐ後ろから切開を行います。頭蓋骨と背側頚部首の筋肉を公開する必要があります。
- 頭蓋骨を公開する必要な場合は、綿棒を使用して任意の膜を削除します。マイクロ ブルドッグ クランプは、頭蓋骨から肌を保持するために使用できます。検索し、前の位置をマークします。2 バリ穴をドリルし、金属ネジ 2.0 mm 前方の挿入/+ 1.5 mm 外側と 7.0 mm 後部/-1.5 mm 前を基準にして水平。完全な 2 回転ネジを締めます。ガーゼの部分で公開されている頭蓋骨をカバーします。
- 滅菌手術用ハサミを使用して、肋骨のすぐ下、体腔に切開を行います。
- 手術用のシートに植え付けられるべき送信機のシリアル番号を記録してください。
- 体腔内の滅菌機を挿入します。ボディの外ワイヤー リードがはずです。
- 筋肉の壁のすべてのリード線は切開の一方の端に集まっての確保をステッチするのに吸収性縫合糸を使用します。
- 頭からガーゼを外し、切開のすぐ下の皮膚を持ち上げます。側に切開する頭の切開から皮膚の下に長い滅菌止血剤のペアを実行します。任意の損傷を最小限に抑える皮膚に圧力を保ちます。
- 一度、止血剤が体切開近くに見える、外科はさみ、止血剤とリードして 4 つの送信機をつかむとそれらをカバー可能性があります任意の膜をクリップします。ワイヤは、皮膚の下に置くし、頭蓋骨に実行するようにゆっくりと、止血剤を描画します。
- 2 つながる頭蓋骨に接続されますを指定します。鉗子を使用して、1 つの手と他のプラスチックの鞘の端のすぐ下のワイヤーの端を持ちます。ワイヤーを引ちょうど個々 のループが可能します。
- 3-4 x 1 つ金属ネジの周り露出のワイヤーがしっかりとラップします。一度、安全な解明からワイヤーを防ぎ、余分なワイヤーを切り取ってネジを締めます。秒のリード スクリューと、この手順を繰り返します。
- 体腔から両方の脳波のリードを引き出し、頭蓋骨に対してぴったり座るので。
- ネジをカバーする歯科用セメントを使用し、皮質リード、露出した頭蓋骨上のキャップを作成します。歯科用セメントが皮膚や筋肉にくっついてないとシャープなエッジが作成されないことを確認します。乾燥する歯科用セメントを許可します。
注: キャップは上に皮膚を縫合できること十分に小さいはずです。 - EMG のリードの 4.1.15 の手順で説明するようワイヤーとプラスチック鞘の端を把握します。個々 のループが明らかに識別できるまでワイヤーを伸ばします。
- 2-3 mm の右側に出現するそれを許可する前に首の筋肉の下に 22 G 針を実行します。裁断の縫合糸を使用して、埋め込みの針の周り 1 つ、緩やかな縫合を配置します。
- スレッドは、針に EMG ワイヤ、筋の下のスレッドに筋線を可能にするため針を引き出します。ワイヤーは場所に残り、筋肉から余分なワイヤーをクリップが現れることがありますように縫合糸を締めます。
- 手順 4.1.20 と 4.1.21 を秒筋のリード、最初のリードから下約 1 mm。
- 体腔から両方の EMG のリードを引き出し、筋肉に対してぴったり座る。
- 頭と首の切開を閉じるため抗生の針を使用します。体の皮膚の下のすべての余分なワイヤーを挟むし、体切開を閉じるため傷クリップを使用します。
- 術後疼痛の動物を支援するために両方の切開サイトにリドカイン軟膏を適用されます。
- 動物を動物が麻酔から回復するまで加熱パッドの上に座るにケージをできるようにホーム ケージに戻ります。
注: 動物は、録音を開始する前に 7-10 日間回復するべき。
- かみそりの刃を使用して、リード線、明らかにプラスチック コーティングの小さな長さを慎重に取り外します。満ちている殺菌ソリューション 50 mL の円錐管に送信機を置く [例えばWavecide (2.65% グルタルアルデヒド)]。
- 脳波/筋電図記録
注: このプロトコルで生理食塩水または ZT 0 でキヌレニンを投与し、24 時間動物の睡眠覚醒のパターンを記録しました。- 記録の期間、動物が中断されない指定部屋のすべての睡眠のレコーディングを完了します。
- 受信ユニットに (注入された脳波/筋電図送信機軸受) 動物の家のケージを配置します。磁石を用いた外科的移植機をオンにします。
注: 送信機がアクティブになったときに、レシーバー ユニットの光が表示されます。 - 関連ソフトウェアを用いた脳波/筋電図データの記録を設定します。
- ドロップ ダウン メニューから「実験」をクリックし、「作成」を選択します。実験の名前、それを保存します。次に、「ハードウェア」、そして「MX2 構成の編集」を選択します。
- 新しいウィンドウで実験で使用されているすべての送信機を選択し、どの受信パッドを組み合わせて指定します。準備ができたら、「すべてを開始する連続」押すと録音を開始します。
- 実験の終了に関連付けられているソフトウェアの「停止すべて連続」選択し、マグネットを使用して送信機をオフにします。
- 心臓穿刺続いて CO2窒息によって動物を安楽死させます。手術用ハサミで頭のてっぺんに沿って切開を再開と歯科用セメントおよび首の筋肉から無料のリードによって慎重にトランスミッターを外します。
- 次に、体腔を開き、送信機を見つけて、ゆっくりと体からそれを削除します。
- 脳波/筋電図解析
- 関連するソフトウェアを使用して、睡眠データを分析します。プログラムを開き、「新しい場所の追加」を選択します。新しいウィンドウでスコアリング ソフトウェアにインポートするデータを選択します。
注: これは実験中に収集されたすべての生波形を含むソフトウェア内で新しいファイルを作成します。 - 手動で必要な実験のための警戒状態をスコアします。獲得した後、総計の持続時間、発作、数および様々 な警戒状態 [急速な目動き (レム)、非-レム nrem 睡眠、およびスリープ解除] の平均試合時間などのパラメーターを分析します。
注: 分析することができます全体の録音を実行または興味のポイントを特定の時間に短縮します。ここでは、ZT 0 ZT 2 間録音の期間の分析を行いました。
- 関連するソフトウェアを使用して、睡眠データを分析します。プログラムを開き、「新しい場所の追加」を選択します。新しいウィンドウでスコアリング ソフトウェアにインポートするデータを選択します。
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Representative Results
カイナの脳を高める方法として腹腔内キヌレニン注射の使用を検証するため、組織の HPLC 分析を行った。標準曲線 (図 1) は、関連ソフトウェアを使用でき、組織サンプルの定量化のために建設されました。キヌレニンとカイナの代表的なクロマト グラムを図 2に掲載されています。キヌレニン 6 分の保持時間が観測され、カイナは 11 分の保持時間を持っていた。KP ダイナミクスを観察するこのプロトコルでキヌレニンの 100 mg/kg を投与し、組織はすぐに次の注射、または 2 または 4 h 後注入 (図 3 a) 収集されました。プラズマ キヌレニン (図 3 b) そして海馬カイナ (図 3 c) を定量化しました。キヌレニン代謝物の高速液体クロマトグラフィー定量で使用される特定のパラメーターは表 1のとおりです。このプロトコルによって生成される用量反応曲線は、投与 2 時間後およびベースライン 4 h 後射出に戻ったカイナのレベルで達成されるピークを持つ脳カイナ レベルを高めるための方法として急性キヌレニン注射の説明をサポートします。
前述の血液生化学的所見に基づき、受動的回避反応パラダイムでトレーニングを行った 2 h キヌレニン投与 (図 4 a)。訓練試験 (図 4 b) の中にグループに差は認められなかった。テスト試用期間中対照動物は文脈ラーニングを示すダークサイドを入力に遅延が大幅に増加を表示されます。前日のキヌレニンと注入される動物は、遅延、学習の欠損を示す同じ増加を表示されませんでした。これらの調査結果に基づいて、我々 はメモリ集録との統合の時間の間に、急性キヌレニン標高が海馬を介した作業では障害者のパフォーマンス結果を判断できます。
睡眠アーキテクチャの段階で光急性キヌレニン標高の影響を調べるためには、動物はキヌレニン ZT 0 (図 5 a) で 2 日目と 1 日目に生理食塩水を注入しました。脳波/筋電図は、全体の 48 時間の期間の telemetrically に記録されました。1 日目に生理食塩水注入 (車) と 2 日目キヌレニン注入の比較を行った。注射後総レム睡眠短時間 (ベースラインからの変化率として表されて) 最初の 2 h (図 5 b) の減少が示唆されました。これがこれらの期間中にスリープ解除期間の増加と NREM 睡眠のわずかな減少によってミラー化されました。これらの結果は、急性キヌレニン標高が睡眠ダイナミクスの妨害を引き起こすことを示しています。
図 1: キヌレニンとカイナ注入の標準曲線。各標準の 20 μ L 注入キヌレニン (A) と (B) カイナの標準曲線を作成します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: キヌレニンとカイナの代表的なクロマト グラム。基準は、サンプルの保持時間を確認する前に実行されました。これらのパネルは、(A) 血清キヌレニンと (B) 脳はカイナの代表的なサンプルを表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 血清およびキヌレニン挑戦に続く高速液体クロマトグラフィーによる海馬組織の解析。(A) キヌレニン (100 mg/kg) または生理食塩水を同調因子 (ZT) 0 時に腹腔内投与による投与します。組織を採取した 2 か 4 h 後注入。次のパネルの表示 (B) キヌレニン高架血清キヌレニンへの露出、(C) 海馬カイナ注射後 2 h のレベルします。P < 0.001、双方向の分散分析 (ANOVA) ボンフェローニtが続くことで意義を示します-修正をテストします。N = グループあたり 4-5。すべてのデータは、平均 ± SEM.この図は、Pocivavsekらから変更されています。11.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 受動的回避反応パラダイムで海馬に依存するメモリのキヌレニン標高の影響。(A) キヌレニン (100 mg/kg) または生理食塩水を同調因子 (ZT) 0 時に腹腔内投与による投与します。動物は、ZT 2 で仕事に訓練を受けていた。24 時間訓練の後動物の記憶形成にテストされました。(B) トレーニング前キヌレニンへの露出テストの日に嫌悪の暗いコンパートメントを避けるために遅延が減少。P < 0.01、* * * P < 0.001、双方向の分散分析 (ANOVA) ボンフェローニt続いてによって意義を示す-修正をテストします。N = グループあたり 8-14。すべてのデータは、平均 ± SEM.この図は、Pocivavsekらから変更されています。11.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: キヌレニン立面図の睡眠構築に及ぼす影響します。(A) 生理食塩水 (1 日目)、キヌレニン (100 mg/kg; 2 日目) は、同調因子 (ZT) 0 時に腹腔内投与によって管理されました。急速な目動き (レム) の睡眠時間が減った後 24 時間 (B) 記録した睡眠・覚醒行動、ウェイク期間はキヌレニン注入最初の 2 h で増加しました。P < 0.05 は、双方向の分散分析 (ANOVA) ボンフェローニt続いてによって意義を示します-修正をテストします。N = グループあたり 6-8。すべてのデータは、平均 ± SEM.この図は、Pocivavsekらから変更されています。11.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 移動相組成 | 50 mM 酢酸ナトリウム, pH 6.2 |
| 5% アセトニ トリル | |
| 移動相流量 | 0.5 mL/分 |
| ポストカラム誘導体化試薬 | 500 mM 酢酸亜鉛 |
| ポストカラム流量 | 0.1 ml/分 |
| 列の型 | ReproSil Pur C18 |
| 列のサイズ | 4 × 150 mm2 |
| 検出器温度 | 4.0 ° C |
| キヌレニン波長 | Ex: 365、Em: 480 |
| キヌレニン保持時間 | 〜 6 分 |
| カイナ波長 | Ex: 344、Em: 398 |
| カイナ保持時間 | 〜 11 分 |
表 1: キヌレニン経路代謝物の高速液体クロマトグラフィー定量用パラメーター。
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Discussion
周辺キヌレニン投与後脳のカイナの信頼性の評価を組み合わせて、機能的な生化学的実験を解釈に重要です。ここでは、プラズマ キヌレニンとラットのカイナの脳を測定する効果的な方法を確立する新しいユーザーを可能にする詳細なプロトコルを提案する.プラズマに於けるキヌレニンの測定確認正確な注入しカイナ代謝物の測定は、脳におけるデノボ合成を確認します。柴田18から存在下で Zn2 +、ナノモル範囲で脳にカイナの内因性の量を正確に検出する機能を含むカイナを derivatize に適応説明蛍光高速液体クロマトグラフィー法のいくつかの利点があります。.さらに、メソッドは、検出 bioprecursor キヌレニン マイクロモルの範囲でプラズマの励起・発光、蛍光波長を調整することによってプロトコルで説明されているように適応されています。
治療と、安楽死との間の特定の時間など、プロトコルの中で重要なステップは、正確に判断して脳内カイナ形成の時間的経過とデザインと行動の分析を導く睡眠説明実験を監視します。受動的回避反応パラダイムを用いて海馬を介した学習評価し、脳波/筋電図データの遠隔録音、睡眠解析を実施しました。我々 は最高 2 時間投与後に脳カイナ レベルが判断、我々 を計った行動パラダイムのトレーニング セッションに応じて、カイナ レベルが最も高く、ZT 2 受動的回避反応課題における買収が発生しましたので、さらに、また睡眠・覚醒行動解析に着目 ZT 2 時間フレーム中にカイナ レベルが脳で最高に重要な ZT 0。一緒に取られて、慎重に考慮された実験的なデザインは私たち認知と睡眠・覚醒行動11の変調器として、カイナを導入, 生化学的, 機能的の実験からの結果を一緒に埋めることができました。
記述されていたプロトコルで制限数を見なす必要があります。カイナの内因性の生産を刺激するために直接 bioprecursor キヌレニンは末梢のラットに注入されました。キヌレニンは容易に血液脳関門を通過し、脳領域2の様々 な刺激の KP 代謝が発生します。我々 は現在; 海馬におけるアストロ サイトの派生カイナの上昇に焦点を当てるただし、キヌレニンの全身注射も KP 3 hydroxykynurenine (3 HK) ヒドロキシピコリン酸などの神経毒性のブランチの代謝を高めることを検討することが重要です。離れて 3 HK カイナ標高によって引き起こされたものと比較しての標高によって引き起こされる効果をいじめる方法論を調整する必要があります。さらに、脳11中 KP 代謝 perfuse 標高は行動の変化を仲介する、脳の特定の領域に限られている洞察力を提供します。
ここで示した行動実験を設計するとき文脈の記憶の海馬介在に従事を詳細に説明するよう我々 は既存のメソッドによって、受動的回避反応パラダイムを最適化しました。メモリは、主要な 3 つのサブプロセスで構成されています: エンコーディング、統合、および検索。メモリ統合プロセスの最適条件は、メモリは長期的なストレージ ・19,20に統合されて新しくエンコード時の睡眠中に発生します。齧歯動物の研究が狭い時間 windows メモリの統合に焦点を当てた、特定メモリ表示最も敏感な買収後睡眠が遅れるとき、キヌレニンこの敏感な時に脳のカイナの形成を高めることにしましたタイム ウィンドウは、買収と統合は、この記事の仮説をテストするために影響を与えます。テストしませんでした、しかし、現在メモリの検索は示した21キヌレニン標高の影響を受ける場合。それがまたタスクを実行する齧歯動物で従事している脳の領域を考慮する重要です。この研究の認知における海馬の役割に興味を持っていた主、プロトコルへの変更は急性キヌレニンの影響を示されている代替行動パラダイムの中で動物をテストするのには役に立つかもしれませんチャレンジ、エアコン、作業メモリ タスク2,7,8,9,10恐怖など。
さらに、脳カイナを高めるキヌレニンの全身注射に代わる代替戦略を検討する、関心のある領域または薬理学的に合成酵素キャット II の阻害を標的にカイナの直接注入ツールまたはメカニズムの仮説をテストするため、特定の脳領域で分子のノック ダウン アプローチ。これらのアプローチが測定機能の成果を個別に影響する潜在的侵襲を導入しても、最適な制御条件の設計実験は欠かせません。
最後に、睡眠脳波/筋電図プロトコルを記録には、テザー、電気的なノイズ、動きのアーティファクト、および連結ケーブルを引っ張っている動物で負傷の危険を排除することではなく遠隔であることの利点があります。物理的なサイズと軽量遠隔装置とその配置の皮下ではなく腹腔内手術後の回復を最適化するためにラット、無料で自然主義的な睡眠覚醒の動作をキャプチャ無線の録音を有効運動の範囲です。テレメーター システムを使用するときの重要な考慮事項は、限られた能力の記録に複数チャンネル同時からです。現在のパラダイムの 1 つの脳波チャネルと 1 つの筋チャネルをペアでレム、nrem 睡眠、およびスリープ解除動作の得点が可能になります。
現在記載されている方法の組み合わせは、キヌレニン昇格の機能的帰結を明らかにする行動および生化学的アッセイに洞察力を提供します。これらのプロトコルは、KP、認知、および睡眠、以前に未踏のダイナミックとの関係をデモンストレーションします。ここで提供される詳細な実験的手法を活用して、キヌレニンと動物のカイナ神経機能への影響の科学的理解を強化します。最終的には、この分野での継続的な作業は精神障害と睡眠障害と闘う個人の結果を軽減するために新しい治療上のアプローチにつながる可能性があります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
本研究は健康の国民の協会 (R01 NS102209) とクレア e. フォーブスの信頼からの寄付によって部分的に資金を供給されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wistar rats | Charles River Laboratories | adult male, 250-350 g | |
| L-kynurenine sulfate | Sai Advantium | ||
| ReproSil-Pur C18 column (4 mm x 150 mm) | Dr. Maisch GmbH | ||
| EZ Clips | Stoelting Co. | 59022 | |
| Mounting materials screws | PlasticsOne | 00-96 X 1/16 | |
| Nonabsorbable Sutures | MedRep Express | 699B | CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOX of 12 |
| Absorbable Sutures | Ethicon | J310H | 4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1 |
| Dental Cement | Stoelting Co. | 51458 | |
| Drill Bit | Stoelting Co. | 514551 | 0.45 mm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alliance HPLC system | |||
| E2695 separation module | Waters | 176269503 | |
| 2475 fluorescence detector | Waters | 186247500 | |
| post-column reagent manager | Waters | 725000556 | |
| Lenovo computer | Waters | 668000249 | |
| Empower software | Waters | 176706100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Passive avoidance box for rat | |||
| Extra tall MDF sound attenuating cubicle | MedAssociates | ENV-018MD | Interior: 22" (W) x 22" (H) x 16" (D) |
| Center channel modulator shuttle box chamber | MedAssociates | ENV-010MC | |
| Stainless steel grid floor for rat | MedAssociates | ENV-010MB-GF | |
| Auto guillotine door | MedAssociates | ENV-010B-S | |
| Quick disconnect shuttle grid floor harness for rat | MedAssociates | ENV-010MB-QD | |
| Stimulus light, 1" white lens, mounted on modular panel | MedAssociates | ENV-221M | |
| Sonalert module with volume control for rat chamber | MedAssociates | ENV-223AM | |
| SmartCtrl 8 input/16 output package | MedAssociates | DIG-716P2 | |
| 8 Channel IR control for shuttle boxes | MedAssociates | ENV-253C | |
| Infrared source and dectector array strips | MedAssociates | ENV-256 | |
| Tabletop interface cabinet, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080C | |
| Dual range constant current aversive stimulation module | MedAssociates | ENV-410B | |
| Solid state grid floor scrambler module | MedAssociates | ENV-412 | |
| Dual A/B shock control module | MedAssociates | ENV-415 | |
| 2' 3-Pin mini-molex extension | MedAssociates | SG-216A-2 | |
| 10' Shock output cable, DB-9 M/F | MedAssociates | SG-219G-10 | |
| Shuttle shock control cable 15', 6 | MedAssociates | SG-219SA | |
| Small tabletop cabinet and power supply, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080D | |
| PCI interface package | MedAssociates | DIG-700P2-R2 | |
| Shuttle box avoidance utility package | MedAssociates | SOF-700RA-7 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sleep-Wake Monitoring Equipment | |||
| Ponehmah software | Data Sciences International (DSI) | PNP-P3P-610 | |
| MX2 8 Source Acquisition interface | Data Sciences International (DSI) | PNM-P3P-MX204 | |
| Dell computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bit | Data Sciences International (DSI) | 271-0112-013 | |
| Dell 19" computer monitor | Data Sciences International (DSI) | 271-0113-001 | |
| Receivers for plastic cages, 8x | Data Sciences International (DSI) | 272-6001-001 | |
| Cisco RV130 VPN router | Data Sciences International (DSI) | RV130 | |
| Matrix 2.0 | Data Sciences International (DSI) | 271-0119-001 | |
| Network switch | Data Sciences International (DSI) | SG200-08P | |
| Neuroscore software | Data Sciences International (DSI) | 271-0171-CFG | |
| Two biopotential channels transmitter, model TL11M2-F40-EET | Data Sciences International (DSI) | 270-0134-001 |
References
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