Summary
Altérations dans les métabolites de neuroactive kynurénine voie (KP) sont impliquées dans les troubles psychiatriques. Enquête sur les résultats fonctionnels d’une altération kynurénine voie métabolisme in vivo chez les rongeurs peut aider à expliquer des nouvelles approches thérapeutiques. Le protocole actuel combine les approches biochimiques et comportementales afin d’étudier l’impact d’un défi de kynurénine aiguë chez le rat.
Abstract
La voie de la kynurénine (KP) de la dégradation du tryptophane a été impliquée dans les troubles psychiatriques. Plus précisément, l’astrocyte dérivé métabolite acide kynurénique (frederic), un antagoniste à deux N-méthyl-d-aspartate (NMDA) et α7 des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine (α7nACh), a été impliquée dans des processus cognitifs dans la santé et la maladie. Comme cristano taux sont élevés dans le cerveau des patients atteints de schizophrénie, un dysfonctionnement au récepteurs cholinergiques et glutamatergiques est censé être causalement liée à la dysfonction cognitive, un domaine du noyau de la psychopathologie de la maladie. FREDERIC jouerait un rôle pathophysiologically important chez les individus atteints de schizophrénie. Il est possible d’élever cristano endogène dans le cerveau des rongeur de traiter les animaux avec la kynurénine bioprecursor direct, et des études précliniques sur des rats ont montré que cristano élévation aiguë peut avoir une incidence leurs processus d’apprentissage et de mémoire. Le protocole actuel décrit cette approche expérimentale en détail et combine un) une analyse biochimique de kynurénine sanguin et cerveau formation KYNA (à l’aide de la chromatographie liquide à haute performance), des tests b) comportementaux pour sonder la hippocampe-dépendantes mémoire contextuelle (paradigme de l’évitement passif) et c) une évaluation du comportement de veille-sommeil [enregistrements télémétriques combinant l’électroencéphalogramme (EEG) et les signaux de l’électromyogramme (EMG)] chez le rat. Pris ensemble, une relation entre élevées cristano, sommeil et cognition est étudiée, et ce protocole décrit en détail une approche expérimentale à la compréhension des résultats de la fonction de kynurénine élévation et cristano formation in vivo chez le rat. Résultats obtenus par les variations de ce protocole permettra de tester l’hypothèse que le KP et frederic servent un rôle essentiel dans la modulation de sommeil et la cognition dans les États de santé et la maladie.
Introduction
Le KP est responsable de la dégradation de près de 95 % de l’acide aminé essentiel tryptophane1. Dans le cerveau des mammifères, kynurénine pris en astrocytes est métabolisé en la petite molécule de neuroactive cristano principalement par l’enzyme kynurénine aminotransférase (KAT) II2. CRISTANO agit comme un antagoniste des récepteurs NMDA et α7nACh dans le cerveau2,3,4, et également cible les récepteurs dont le récepteur d’hydrocarbures aryliques (AHR) et la G-protéine de signalisation récepteur couplé à la 35 (GPR35)5 ,6. Chez les animaux expérimentaux, élévations dans cerveau cristano ont démontré qu’amoindrir leurs performances cognitives dans un tableau de tests comportementaux2,7,8,9,10 . Une nouvelle hypothèse suggère que cristano joue un rôle important dans la modulation des fonctions cognitives en influant le comportement de sommeil-éveil11, soutenant ainsi davantage le rôle des molécules dérivées astrocyte dans la modulation de la neurobiologie du sommeil et cognition,12.
Sur le plan clinique, élévations cristano ont été trouvées dans le liquide céphalorachidien et tissus post-mortem du cerveau de patients atteints de schizophrénie13,14,15,16, un trouble psychiatrique débilitant caractérisée par des troubles cognitifs. Patients atteints de schizophrénie sont aussi souvent minées par les troubles du sommeil qui peuvent aggraver la maladie17. Comprendre le rôle du métabolisme de la KP et frederic en modulant une relation entre le sommeil et cognition, particulièrement entre l’apprentissage et la mémoire, peut conduire au développement de nouvelles thérapies pour traiter ces piètres résultats dans la schizophrénie et d’autres maladies psychiatriques.
Une méthode fiable et cohérente pour la mesure des métabolites KP est importante pour assurer que les recherches émanant de diverses institutions peuvent être intégrés dans la compréhension scientifique de la biologie de la KP. Actuellement, nous décrivons la méthodologie permettant de mesurer la kynurénine dans le plasma du rat et frederic dans le cerveau de rat par chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Le présent protocole, qui fait utiliser une détection fluorimétrique en présence de Zn2 +, a été développée par Shibata18 et plus récemment adapté et optimisé pour derivatize avec l’acétate de zinc 500 mM comme réactif postcolonne, permettant la détection de quantités de nanomolaires endogène, de frederic dans le cerveau11.
Pour stimuler la production de novo KYNA endogène comme décrit dans le présent protocole, la kynurénine bioprecursor direct est injecté par voie intrapéritonéale (i.p.) chez les rats. En combinaison avec les quotes-parts biochimiques pour déterminer le degré de production cristano, les impacts d’un kynurénine contestent sur la mémoire de l’hippocampe-dépendantes (paradigme de l’évitement passif) et l’architecture du sommeil-éveil (signaux EEG et EMG) est aussi enquête11. Une combinaison de ces techniques permet l’étude de l’impact biochimique et fonctionnel d’un kynurénine défi in vivo chez le rat.
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Protocol
Nos protocoles expérimentaux ont été approuvées par le Comité de l’utilisation et le soin des animaux institutionnels Université du Maryland et suivi Guide des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.
Remarque : Les rats Wistar mâles adultes (250 à 350 g) ont été utilisés dans toutes les expériences. Plusieurs cohortes d’animaux ont été utilisés pour les analyses biochimiques, expériences comportementales et des enregistrements de sommeil-éveil. Les animaux étaient logés dans un établissement à température contrôlée au Maryland Psychiatric Research Center. Ils étaient conservés sur un cycle lumière-obscurité de 12/12 h, avec des lumières en temps zeitgeber (ZT) 0 feux éteints à 12 ZT. Les animaux avaient reçu ad libitum accès à la nourriture et l’eau au cours des expériences. L’installation a été entièrement accréditée par l’Association américaine pour l’Accreditation of Laboratory Animal Care.
1. intrapéritonéale kynurénine Administration à des Rats
Remarque : Dans ce protocole, kynurénine a été administré à ZT 0 (début de la phase éclairée) et les tissus ont été collectées au 2 ZT et ZT 4 pour déterminer une évolution temporelle pour le métabolisme de kynurénine. Injection de solution saline animaux ont été utilisés comme un contrôle. Par exemple, si un rat pèse 500 g et la dose souhaitée est de 100 mg/kg, le rat doit recevoir une injection de 5 mL d’une solution de 10 mg/mL de kynurénine.
- Peser le sulfate de L-kynurénine (« kynurénine ») et placez-le dans un flacon de verre de 20 mL. Assurez-vous de garder la kynurénine sur glace à tout moment.
-
Ajouter une solution saline pour obtenir la concentration désirée et ajuster le pH à 7,6 en utilisant 1 N d’hydroxyde de sodium (NaOH). Vortex et laisser agir la solution jusqu'à ce que la kynurénine soit complètement dissout.
ATTENTION : Suivez toutes les consignes de recommandation lors de la manipulation de NaOH.- Par exemple, pour parvenir à une solution de 10 mg/mL, peser 200 mg de kynurénine et placez-le dans un flacon en verre. Ajouter 15 mL d’une solution saline et vortex et laisser agir (20 kHz pour 5 à 10 s, 1/8 de pouce de diamètre microtip) à dissoudre. À l’aide de NaOH, ajuster le pH de la solution. Enfin, utiliser une solution saline pour régler le volume à 20 mL.
- Peser chaque rat expérimental et calculer le volume de chaque injection basé sur le poids corporel de l’animal et la dose de traitement désiré. Soigneusement retirer l’animal de sa cage maison, injecter la solution par voie intrapéritonéale et regagner sa cage de l’animal.
2. kynurénine mesures à l’aide de chromatographie liquide à haute performance
- Collection de tissus
Remarque : Dans ce protocole, kynurénine a été administré à ZT 0 (début de la phase éclairée) et les tissus ont été collectées au 2 ZT et ZT 4 pour déterminer une évolution temporelle pour le métabolisme de kynurénine. Injection de solution saline animaux ont été utilisés comme un contrôle.- Utiliser le dioxyde de carbone pour euthanasier l’animal. Après que les signes de respiration ont cessé pendant 1 min, exécuter une méthode d’euthanasie secondaire par décapitation.
- Pour recueillir le sang de tronc entier, placez un entonnoir jetable dans un tube de 15 mL contenant 20 μL de K3-EDTA (0,5 M). Laisser le sang s’écouler de l’organisme dans le tube. Inverser le tube à plusieurs reprises pour s’assurer que l’EDTA est mélangé dans l’ensemble.
- À l’aide de ciseaux, couper la peau sur le dessus de la tête vers le bas de la ligne médiane pour exposer le crâne. Supprimer n’importe quel muscle du cou excès sur l’arrière du crâne et, lors de l’ouverture de la moelle épinière, coupée à travers le crâne de l’arrière vers l’avant.
- Tirer doucement sur les deux côtés du crâne ouvert pour exposer le cerveau et puis retirer délicatement le cerveau avec une pince pour éviter de l’endommager. Retirer les bulbes olfactifs avec une lame de rasoir et couper la moitié vers le bas de la ligne médiane du cerveau. À l’aide de pinces, disséquer la hemibrain dans les régions d’intérêt (c.-à-d., l’hippocampe et le cortex).
- Placer tous les morceaux de cerveau disséqué sur feuille d’aluminium sur la glace sèche. Une fois le tissu a complètement gelé, transférer dans un flacon en plastique de 20 mL et conserver à-80 ° C.
- Centrifuger le sang entier coffre à 300 g pour 10 min. Retirez le surnageant (plasma) et les transférer dans nouveaux tubes à centrifuger avant leur stockage à-80 ° C.
- Préparation des échantillons
- Plasma : recueillis provenant d’animaux traités
- Décongeler le tube congelé avec du plasma (Voir l’étape 2.1 pour la collection de tissus) sur glace mouillée.
- Dans un nouveau tube à centrifuger, diluer l’échantillon avec de l’eau ultrapure (1:2 pour kynurénine, 01:10 pour frederic). 100 μl de l’échantillon dilué, ajouter 25 μL de 6 % d’acide perchlorique.
ATTENTION : Suivez toutes les consignes de recommandation lors de la manipulation d’acide perchlorique. - Vortex tous les échantillons, puis centrifuger eux à 12 000 x g pendant 10 min. Une fois terminé, enlever 100 μL de surnageant (à partir de chaque tube) et placez-les dans un tube de microcentrifuge petit 0,25 mL pour la kynurénine ou détermination de frederic.
- Cerveau : recueillis provenant d’animaux traités
- Placer les tubes avec des échantillons de cerveau gelé (Voir l’étape 2.1 pour la collection de tissus) sur la glace sèche. Peser individuellement chaque échantillon de cerveau sur une balance analytique précise. Retourner le tube et placez-le sur la glace sèche.
- Après que tous les échantillons ont été pesés, déplacer les tubes sur la glace humide. Diluer chaque échantillon 01:10 w/v avec de l’eau ultrapure et homogénéiser à l’aide d’un sonicateur (20 kHz pour 5 à 10 s, 1/8 de pouce de diamètre microtip). Par exemple, pour 100 mg de tissu cérébral, ajouter 900 μL d’eau ultrapure.
- Aliquote 100 μl de chaque dilution échantillon dans un nouveau tube et il acidifier avec 25 μL de 25 % d’acide perchlorique. Vortex, centrifuger à 12 000 x g pendant 10 min.
- Après la centrifugation, enlever 100 μL de surnageant et placez-le dans des tubes de microcentrifuge petit 0,25 mL pour le dosage de frederic.
- Plasma : recueillis provenant d’animaux traités
- Run et mise en place par CLHP
- Préparer la phase mobile de 50 mM sodium acétate. Dissoudre 6,81 g d’acétate de sodium trihydraté dans 1 L d’eau ultrapure. Ajuster le pH de 6,2 à l’aide d’acide acétique glacial et puis vide la filtrer dans propre verrerie. Transférer la phase mobile de l’acétate de sodium à une bouteille de verre de 1 L propre.
- Préparer l’acétate de zinc de 500 mM. Dissoudre 54,88 g d’acétate de zinc dans 500 mL d’eau ultrapure, puis la filtrer sous vide. Transférer dans une bouteille en verre propre de 500 mL. Remplir une bouteille de 1 L avec de l’eau ultrapure et une bouteille de 500 mL avec de l’acétonitrile grade HPLC.
- Placer le tuyau d’aspiration de la machine HPLC séparément dans la phase mobile, l’eau ultrapure et le 100 % d’acétonitrile. La solution d’acétate de zinc séparément via une pompe péristaltique qui combine avec le postcolonne phase mobile et avant la dérivation de la pompe.
- Utilisation du panneau de contrôle sur la machine, programmer pour exécuter l’acétonitrile 5 % et 95 % d’eau ultrapure à 0,5 mL/min. autoriser à s’exécuter pendant 20 à 30 min obtenir une référence et une pression stable.
- À établir une ligne de base stable, changer la composition de la solution à 5 % d’acétonitrile et de phase mobile de 95 % sodium acétate. Équilibrer pendant 30 min.
- Allumez la lampe dans le détecteur de fluorescence et laissez-le se réchauffer.
- Dans l’intervalle, également allumer la pompe postcolonne à un débit de 0,1 mL/min permettent d’atteindre une pression stable d’environ 500 psi après environ 20 min.
- Préparer les normes.
- Pour frederic, commencer avec une solution mère de 1 mM et le diluer pour préparer 5 concentrations standards (p. ex., 10 nM, 5 nM, 2,5 nM, 1 nM et 500 h).
Remarque : Ceci permet d’obtenir une courbe standard allant de 200 fmoles à 10 fmoles par injection de μL 20. - Pour kynurénine, commencer avec une solution mère de 1 mM et le diluer pour préparer 5 concentrations standards (p. ex., 10 μM, 5 μM, 2,5 μM, 1 μM et 500 nM).
Remarque : Ceci permet d’obtenir une courbe standard allant de 200 pmol à 10 pmol par 20 injection μL.
- Pour frederic, commencer avec une solution mère de 1 mM et le diluer pour préparer 5 concentrations standards (p. ex., 10 nM, 5 nM, 2,5 nM, 1 nM et 500 h).
- Mettre en place le logiciel du système HPLC pour contrôler les paramètres de séquence d’échantillon et permettre l’autoinjections de plusieurs échantillons.
- Quand sur l’écran « Exécuter Sample », cliquez sur « Fichier » et faites glisser vers le bas « Créer nouveau Set d’échantillon ». Quand la nouvelle fenêtre s’ouvre, sélectionnez « Vider ». Individuellement la liste toutes les normes (voir étape 2.3.8) ou des échantillons dans l’ordre, qu'ils doivent être exécutés.
- Dans la colonne « Fonction », désigner les échantillons et étalons. Les normes doivent être dosés au début et à la fin de la séquence. Injecter de l’eau entre chaque 5 échantillons.
- Régler la durée pour chaque échantillon à 15 min. injecter 20 μl de l’échantillon de normes et de la préparation de plasma ou d’injecter 30 μl de l’échantillon de la préparation de l’homogénat de cerveau.
- Définir les longueurs d’onde d’excitation et d’émission (selon le composé évalué) pour kynurénine à une excitation : 365 nm ; émission : 480 nm et les temps de rétention : ~ 6 min et pour frederic à une excitation : 344 nm ; émission : 398 nm et les temps de rétention : ~ 11 min.
- Une fois tous les paramètres ont été réglés et que la machine a équilibrée, exécutez la séquence.
- Afin de quantifier les données, accédez à l’écran de projet « parcourir ». Sous l’onglet « Ensembles d’échantillons », double-cliquez sur l’échantillon à doser la valeur. Dans la liste de toutes les injections, mettez en surbrillance toutes les normes et faites un clic droit. Dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez « Processus », puis utilisez le menu déroulant pour sélectionner « Calibrer et doser » à côté de « Comment » :.
- Souligner toutes les normes encore, faites un clic droit et sélectionnez « Review ». Lorsque les chromatogrammes ouvrez, utilisez les touches haut pour « Intégrer » et ensuite « calibrer » chaque norme ; Cela va automatiquement créer la courbe d’étalonnage.
- Revenir à l’onglet « Ensembles d’échantillons » et double-cliquez sur l’ensemble de l’échantillon. Ensuite, mettez en surbrillance toutes les normes. Répétez le processus indiqué ci-dessus, mais au contraire, en sélectionnant « Quantitate » dans le menu déroulant. Mettre en évidence tous les échantillons à nouveau, puis faites un clic droit et sélectionnez « Review ». Quand chromatogrammes ouvert, utilisez les boutons sur le haut de « Intégration » et ensuite « Quantifier » chaque échantillon.
NOTE : Ceci va afficher la concentration de chaque échantillon basé sur la courbe d’étalonnage créée précédemment.
3. passive Avoidance paradigme
Remarque : Ces expériences comportementales ont été conçus selon nos résultats biochimiques avec le défi de kynurénine aiguë. Afin de maximiser l’augmentation cerveau cristano, kynurénine (100 mg/kg) a été administré à ZT 0, 2 h avant la séance d’entraînement dans le paradigme de l’évitement passif pour tester l’hippocampe-mediated d’apprentissage, qui s’est produite à 2 ZT. L’appareil se compose de 2 compartiments même tailles (21,3 cm de haut, 20,3 cm de large et 15,9 cm de profondeur) séparée par une porte guillotine et contenue dans une boîte insonorisée. Les deux compartiments de l’appareil d’essai sont appelés « côté lumineux » et « côté obscur ». Les murs du côté lumineux sont claires et, au cours des essais, une lumière s’allume à éclairer davantage ce compartiment. Les parois du compartiment sombre sont entièrement couverts afin de maintenir une condition de coupure.
-
1er jour : procès de formation
- Avant l’essai, nettoyez l’appareil avec l’éthanol à 70 %.
- Amener les animaux à la salle d’examen.
- Doucement placer l’animal expérimental dans le côté lumineux de l’appareil et fermer et verrouiller la porte de l’appareil et la boîte insonorisée.
- En utilisant le logiciel associé, commencer le procès. Depuis l’écran d’accueil, sélectionnez « Fichier », puis « Ouvrir Session » dans le menu déroulant. Dans la nouvelle fenêtre, vérifiez que la procédure correcte et l’appareil est sélectionnés, puis cliquez sur « Fermer ». Ensuite, sélectionnez « Configurer » puis « Signaux ». Dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez l’appareil correct et cliquez sur « Question ».
Remarque : Le logiciel va lancer une lumière s’allumer dans le côté lumineux de l’appareil et ouvrez la porte guillotine entre les deux compartiments. Une minuterie sera initiée. - Quand l’animal entre pleinement dans le côté obscur de l’appareil, la guillotine porte ne ferme et un choc inévitable pied (0,56 mA pour 1 s) seront livrés.
- Compte rendu du temps qui s’est écoulé avant que l’animal entre dans le compartiment sombre.
- Après que l’animal a reçu le choc, permettre à 30 s de temps de récupération avant de retirer l’animal de l’appareil.
- Remettre l’animal dans sa cage maison.
- Avant de commencer le procès avec le prochain animal, essuyez l’appareil avec une serviette mouillée et la jeter des boulettes fécales.
- Après que tous les animaux ont été formés, renvoyez-les à l’animalerie.
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Jour 2 : tests d’essai
- Ramener les animaux dans la salle d’examen 24h après le procès de la formation. Commencer le procès test pour le premier animal en le plaçant dans le côté lumineux de l’appareil, fermeture et verrouillage de la porte et la boîte insonorisée.
- Débuter l’essai essai utilisant les mêmes commandes de logiciels comme le jour précédent ; la lumière s’allume dans le côté lumineux de l’appareil et la porte guillotine entre les deux compartiments s’ouvrira. Une minuterie sera initiée.
- Lorsque l’animal entre dans le compartiment sombre, la porte guillotine se fermera. Enregistrer le temps écoulé.
Remarque : Le procès se terminera par le logiciel après un maximum de 300 s si l’animal reste sur le côté lumineux de l’appareil d’essai. - Remettre les animaux dans leur cage maison et nettoyer l’appareil (comme indiqué au point 3.1.9) avant de commencer le procès avec l’animal suivant.
4. analyse de dormir
- Implantation chirurgicale d’un émetteur sans fil d’EEG/EMG
Remarque : Les émetteurs télémétriques devraient être stérilisés et préparés avant la chirurgie.- À l’aide d’une lame de rasoir, retirez doucement une petite longueur du revêtement en plastique pour révéler que le fils. Placer les émetteurs dans un tube conique de 50 mL, rempli de solution stérilisante [par exemple, Wavecide (2,65 %, glutaraldéhyde)].
- Laissez les émetteurs dans la solution désinfectante pendant au moins 12 h. Puis, avant la chirurgie, transvaser la solution dans un conteneur à déchets. Rincer l’émetteur avec du sérum physiologique stérile.
- Le jour de la chirurgie, peser l’animal avant de placer dans une chambre d’anesthésie. Induire l’isoflurane 3 à 5 % avec 100 % O2.
- Après une anesthésie réussie, enlever l’animal et raser avec soin, en utilisant un rasoir électrique, le dessus de la tête et du cou, ainsi qu’une petite touffe de poils sur le dos du corps, légèrement à gauche et au-dessous de la cage thoracique.
- Administrer le carprofène (5 mg/kg) par voie sous-cutanée pour l’analgésie postopératoire.
- Poser un tampon contrôlé par thermostat eau chaude Chauffage fixé à 37 ° C sous l’animal pour maintenir la température du corps de l’animal pendant la chirurgie.
- Dans un cadre stéréotaxique, placez l’animal sur un cône de nez pour maintenir l’État anesthésique et placer les barres d’oreilles pour stabiliser la tête. Stériliser la peau rasée en alternant les écouvillons de betadine scrub et 70 % d’éthanol. Opthalamic pommade pour les yeux pour les lubrifier.
- Afin d’assurer une anesthésie suffisante avant la première incision, utiliser le test du pincement-orteil.
- À l’aide d’un scalpel stérile, pratiquer une incision de juste derrière les yeux jusqu'à l’arrière du cou. Le crâne et le muscle dorsal cou cervicales doivent être exposées.
- Si nécessaire pour exposer le crâne, utilisez cotons-tiges pour supprimer toute les membranes. Pinces micro-bulldog peuvent servir à maintenir la peau du crâne. Repérer et marquer la position de la bregma. Percer 2 trous de burr et insérez les vis métalliques antérieure 2,0 mm / + 1,5 mm latéralement et 7,0 mm postérieur /-1,5 mm latéral par rapport à la bregma. Toutes les 2 tours pour serrer les vis. Couvrir le crâne exposé avec un morceau de gaze.
- À l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles, faites une incision dans la cavité du corps, juste sous les côtes.
- Sur la feuille chirurgicale, veillez à enregistrer le numéro de série de l’émetteur à implanter.
- Insérez l’émetteur stérile à l’intérieur de la cavité du corps. Les fils conducteurs doivent rester en dehors du corps.
- Utiliser des sutures résorbables piquer la paroi musculaire, en veillant à ce que tous les fils sont réunis à une extrémité de l’incision.
- Retirez la gaze de la tête et soulevez la peau juste en dessous de l’incision. Exécutez une paire de longues stérile hémostatique sous la peau de l’incision, tête à l’incision dans le côté. Maintenir la pression sur la peau afin de minimiser toute blessure.
- Une fois les hémostatiques sont visibles près de l’incision de corps, clip toute membrane qui peut recouvrir avec des ciseaux chirurgicaux et saisir que l’émetteur quatre mène avec les hémostatiques. Tirez lentement la hémostatique, afin que les fils sous la peau et courent vers le haut sur le crâne.
- Désigner qui 2 conduit sera relié au crâne. À l’aide de pinces, saisir l’extrémité d’un fil d’une main et juste en dessous de l’extrémité de la gaine en plastique avec l’autre. Tirez sur le fil jusqu'à ce que les boucles individuelles peuvent seulement être discernés.
- Attacher fermement le fil dénudé autour des vis métalliques 3 – 4 x. Une fois c’est sûr, serrer la vis pour empêcher le fil de démêler et clip large de n’importe quel fil supplémentaire. Répétez cette procédure avec la deuxième avance et la vis.
- Tirer les deux fils d’EEG de la cavité du corps jusqu'à ce qu’ils sont assis serré contre le crâne.
- Ciment dentaire permet de couvrir les vis et les cordons corticaux, créant une casquette sur le crâne exposé. S’assurer qu’aucun ciment dentaire ne colle à la peau ou les muscles et qu’aucun des arêtes ne sont créés. Laisser le ciment dentaire sécher.
Remarque : La PAC devrait être assez petite pour que la peau peut être suturée au-dessus. - Pour les fils de l’EMG, saisir l’extrémité du fil et gaine en plastique tel que décrit à l’étape 4.1.15. Étirer le fil jusqu'à ce que les boucles individuelles soient clairement discernables.
- Exécuter une aiguille de 22 G sous le muscle du cou sur le côté droit pour 2 – 3 mm avant lui permettant d’émerger. À l’aide de sutures non résorbables, placez une suture simple, lâche autour de l’aiguille incorporé.
- Fil l’EMG fil dans l’aiguille et tirez l’aiguille, ce qui permet de l’EMG fil à fil sous le muscle. Serrer la suture afin de s’assurer que le fil reste en place et le clip le plus de fil qui peut émerger du muscle.
- Répétez les étapes 4.1.20 et 4.1.21 pour la deuxième tête de EMG, environ 1 mm vers le bas de l’interprète principal.
- Tirer les deux fils d’EMG de la cavité du corps jusqu'à ce qu’ils sont assis serré contre le muscle.
- Points de suture non résorbables permet de refermer l’incision de la tête et du cou. Rangez tous les fil supplémentaire sous la peau du corps et pinces de plaie pour refermer l’incision du corps.
- Pommade de lidocaïne pour les deux sites d’incision pour aider l’animal avec la douleur postopératoire.
- Regagner sa cage maison, ce qui permet de la cage de s’asseoir sur le coussin chauffant jusqu'à ce que l’animal a récupéré de l’anesthésie de l’animal.
Remarque : L’animal doit récupérer pendant 7 à 10 jours avant de commencer les enregistrements.
- À l’aide d’une lame de rasoir, retirez doucement une petite longueur du revêtement en plastique pour révéler que le fils. Placer les émetteurs dans un tube conique de 50 mL, rempli de solution stérilisante [par exemple, Wavecide (2,65 %, glutaraldéhyde)].
- Enregistrement de l’EEG/EMG
NOTE : Dans ce protocole, nous avons administré une solution saline ou kynurénine à ZT 0 et enregistre ensuite les habitudes de sommeil-éveil de l’animal pendant 24 h.- Terminer tous les enregistrements de sommeil dans la pièce désignée où les animaux ne seront pas interrompus pendant la durée de l’enregistrement.
- Placez la cage de l’animal (portant l’émetteur implanté d’EEG/EMG) sur un récepteur. Allumez l’émetteur implanté chirurgicalement à l’aide d’un aimant.
Remarque : Une lumière devrait apparaître sur le récepteur lorsque l’émetteur est activé. - Configurer l’enregistrement des données EEG/EMG en utilisant le logiciel associé.
- Dans le menu déroulant, sélectionnez « Experiment », puis « Créer ». Nommez l’expérience et puis enregistrez-le. Ensuite, sélectionnez « Matériel », puis « Modifier la Configuration MX2 ».
- Dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez tous les émetteurs utilisés dans l’expérience et indiquer quel bloc récepteur chaque est jumelé avec. Lorsque vous êtes prêt, lancez l’enregistrement en appuyant sur « Start tous continue ».
- À la fin des expériences, sélectionnez « Arrêter tous continue » dans le logiciel associé et éteindre les émetteurs à l’aide de l’aimant.
- Euthanasier les animaux de CO2 asphyxie suivie d’une ponction cardiaque. Retirez délicatement l’émetteur en rouvrant l’incision le long du dessus de la tête avec des ciseaux chirurgicaux et couper les fils libres du muscle dentaire du ciment et du cou.
- Ensuite, ouvrez la cavité corporelle, localiser l’émetteur et retirer lentement de l’organisme.
- Analyse de l’EEG/EMG
- Le logiciel associé permet d’analyser les données de la veille-sommeil. Ouvrez le programme et sélectionnez « Ajouter un nouvel emplacement ». Dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez les données à importer dans le logiciel de notation.
Remarque : Cela créera un nouveau fichier dans le logiciel contenant toutes les formes d’onde brutes recueillies lors de l’expérience. - Marquer manuellement les États de vigilance pour les expériences souhaitées. Après avoir marqué, analyser les paramètres tels que la durée totale, le nombre d’épisodes et la durée moyenne de bout des différents États de vigilance [paradoxal (REM), non - REM NREM et sillage].
Remarque : L’analyse peut être effectuée sur tout l’enregistrement ou raccourcie à des moments spécifiques d’intérêt. Ici, l’analyse a été effectuée pour la période d’enregistrement entre ZT 0 ZT 2.
- Le logiciel associé permet d’analyser les données de la veille-sommeil. Ouvrez le programme et sélectionnez « Ajouter un nouvel emplacement ». Dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez les données à importer dans le logiciel de notation.
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Representative Results
Pour valider l’utilisation d’une injection intrapéritonéale de kynurénine comme méthode d’élever le cerveau cristano, une analyse par CLHP de tissu a été réalisée. Les courbes standard (Figure 1) ont été construits en utilisant le logiciel associé et a permis la quantification des échantillons de tissus. Des chromatogrammes représentatifs pour kynurénine et frederic sont présentés dans la Figure 2. Kynurénine a été observée à un temps de rétention de 6 min et frederic avait un temps de rétention de 11 minutes. Afin d’observer la dynamique de la KP, 100 mg/kg de kynurénine a été administré dans le présent protocole, et les tissus ont été recueillis immédiatement après l’injection, ou 2 ou 4 h après l’injection (Figure 3 a). Plasma kynurénine (Figure 3 b) et l’hippocampe KYNA (Figure 3C) ont été quantifiées. Les paramètres spécifiques utilisés dans la détermination par CLHP des métabolites de kynurénine sont décrites dans le tableau 1. La courbe dose-effet produite par ce protocole prend en charge sa description d’une injection de kynurénine aiguë comme une méthode pour augmenter les niveaux de cerveau de frederic, avec un pic atteint à injection après 2 h et les niveaux de KYNA retournés à leur base 4 h après l’injection.
Basé sur les conclusions susmentionnées biochimiques, la formation dans le paradigme de l’évitement passif a été réalisée 2 h après l’injection de kynurénine (Figure 4 a). Aucune différence de groupe ont été observés au cours du procès de formation (Figure 4 b). Au cours du procès de l’essai, les animaux témoins affichent une augmentation significative de latence pour entrer dans le côté obscur, indiquant l’apprentissage contextuel. Animaux injectés avec kynurénine le jour précédent ne manifestaient pas de la même augmentation de latence, ce qui démontre un déficit dans l’apprentissage. Basé sur ces résultats, nous pouvons conclure qu’élévation aiguë kynurénine, pendant la période d’acquisition de la mémoire et de consolidation, se traduit par une performance réduite dans une tâche induite par l’hippocampe.
Afin d’étudier l’impact d’une élévation de kynurénine aiguë durant la phase éclairée sur l’architecture du sommeil-éveil, les animaux ont été injectés avec une solution saline au jour 1 et kynurénine jour 2 à ZT 0 (Figure 5 a). Signaux EEG/EMG ont été enregistrées, telemetrically, pour la période entière de 48 h. Des comparaisons ont été faites entre l’injection saline (véhicule) le jour 1 et l’injection de kynurénine au jour 2. Les résultats indiquent une réduction de la durée totale du sommeil REM (présentée comme un changement de pourcentage de la base) pendant les 2 premières heures (Figure 5 b) après l’injection. Cela a été reflétée par une augmentation de durée de sillage durant ces périodes de temps et une légère réduction de sommeil NREM. Ces résultats démontrent qu’une élévation aiguë kynurénine provoque des perturbations dans la dynamique de la veille-sommeil.
Figure 1 : courbes d’étalonnage pour un kynurénine et injection cristano. 20 µL de chaque étalon a été injectée pour créer la courbe d’étalonnage pour kynurénine (A) et (B) frederic. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : chromatogrammes représentatifs pour kynurénine et cristano. Les normes ont été exécutés avant un échantillon pour confirmer leurs temps de rétention. Ces panneaux montrent des échantillons représentatifs pour kynurénine sérum (A) et (B) cerveau cristano. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : analyse de sérum et de tissus hippocampiques par HPLC suite à un tacle de kynurénine. (A) kynurénine (100 mg/kg) ou solution saline ont été administrés par injection intrapéritonéale en temps zeitgeber (ZT) 0. Les tissus ont été prélevés 2 ou 4 h après l’injection. Les panneaux suivants montrent l’exposition de kynurénine sérum kynurénine élevée (B) et (C) hippocampe cristano niveaux 2 h après l’injection. P < 0,001 indique la signification par une double sens analyse de variance (ANOVA) suivie d’un Bonferroni t-test de correction. N = 4 à 5 par groupe. Toutes les données sont moyenne ± SEM Ce chiffre a été modifié par Pocivavsek et al. 11. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : effet d’une élévation de kynurénine sur mémoire hippocampe-dépendantes dans le paradigme de l’évitement passif. Kynurénine (A) (100 mg/kg) ou solution saline ont été administrés par injection intrapéritonéale zeitgeber temps (ZT) 0. Les animaux ont été formés sur la tâche à ZT 2. 24h après l’entraînement, les animaux ont été testés pour la formation de la mémoire. (B), une exposition à kynurénine avant l’entraînement réduit la latence pour éviter le compartiment sombre aversif le jour du test. P < 0,01, *** P < 0,001 indiquent l’importance par une bidirectionnelle analyse de variance (ANOVA), suivie d’un Bonferroni t-test de correction. N = 8 – 14 par groupe. Toutes les données sont moyenne ± SEM Ce chiffre a été modifié par Pocivavsek et al. 11. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : effet d’une élévation de kynurénine sur l’architecture du sommeil-éveil. (A) une solution Saline (jour 1) et kynurénine (100 mg/kg ; 2e jour) ont été administrés par injection intrapéritonéale en temps zeitgeber (ZT) 0. Le comportement de sommeil-éveil a été enregistré pour le subséquent 24 h. (B) la durée du sommeil paradoxal (REM) a été réduite et la durée de la foulée a été augmentée dans les 2 premières heures après l’injection de kynurénine. P < 0,05 indique la signification par une double sens analyse de variance (ANOVA) suivie d’un Bonferroni t-test de correction. N = 6 à 8 par groupe. Toutes les données sont moyenne ± SEM Ce chiffre a été modifié par Pocivavsek et al. 11. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Composition de la phase mobile | acétate de sodium de 50 mM, pH 6.2 |
| 5 % d’acétonitrile | |
| Débit de la phase mobile | 0,5 mL/min |
| Réactif de dérivation postcolonne | acétate de zinc de 500 mM |
| Débit de dérivation postcolonne | 0,1 ml/min |
| Type de colonne | ReproSil-Pur C18 |
| Dimensions de la colonne | 4 x 150 mm2 |
| Température du détecteur | 4.0 ° C |
| Longueur d’onde de kynurénine | Ex : 365, Em : 480 |
| Temps de rétention de kynurénine | ~ 6 min |
| Longueur d’onde de frederic | Ex : 344, Em : 398 |
| Temps de rétention de frederic | ~ 11 min |
Tableau 1 : Paramètres pour une détermination par CLHP des métabolites de voie kynurénine.
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Discussion
Pour une évaluation fiable de KYNA dans le cerveau après une administration périphérique kynurénine, il est essentiel de combiner et d’interpréter les expériences biochimiques et fonctionnelles. Nous présentons ici un protocole détaillé qui permet aux nouveaux utilisateurs de mettre en place des méthodes efficaces pour mesurer la kynurénine de plasma et le cerveau cristano de rats. La mesure de kynurénine dans le plasma a confirmé l’injection précise et la mesure du métabolite cristano confirme la synthèse de novo dans le cerveau. Il y a plusieurs avantages de la méthode décrite par fluorométrie HPLC, adapté de Shibata18, pour derivatize cristano en présence de Zn2 +, y compris la capacité de détecter précisément les quantités endogènes de KYNA dans le cerveau dans la gamme nanomolar . En outre, la méthode a été adaptée pour détecter la kynurénine bioprecursor dans le plasma dans la gamme micromolaire en ajustant les dosage fluorimétrique longueurs d’onde d’excitation et d’émission, comme décrit dans le protocole.
Étapes critiques au sein du protocole, telles que des moments précis entre le traitement et l’euthanasie, sont décrits avec précision déterminer l’évolution temporelle de la formation de KYNA dans le cerveau et orienter la conception et l’analyse de la comportementale et veille-sommeil surveillance des expériences. Hippocampal-mediated learning a été évaluée en utilisant le paradigme de l’évitement passif et a effectué une analyse de la veille-sommeil avec des enregistrements télémétriques de données EEG/EMG. Comme nous avons déterminé que les niveaux de cristano de cerveau étaient plus élevées après l’injection 2 h, nous chronométré en conséquence, la séance d’entraînement de paradigme comportemental afin que l’acquisition dans la tâche d’évitement passif s’est produite lorsque les niveaux KYNA ont été enregistrées, dans la ZT 2. En outre, nous nous sommes concentrés aussi l’analyse du comportement-sommeil sur la critique ZT 0 à ZT 2 laps de temps durant laquelle les niveaux KYNA étaient les plus élevées dans le cerveau. Pris ensemble, le dispositif expérimental mûrement réfléchi nous a permis de combler ensemble de résultats d’expériences biochimiques et fonctionnelles, introduisant cristano comme modulateur de la cognition et veille-sommeil comportement11.
Un certain nombre de limitations devrait considérer le protocole décrit. Pour stimuler la production endogène de frederic, la kynurénine bioprecursor direct a été injectée en périphérie à des rats. Kynurénine traverse facilement la barrière hémato - encéphalique et le métabolisme de KP stimulé se produit dans diverses régions de cerveau2. Nous nous concentrons actuellement sur l’élévation de KYNA astrocyte dérivées dans l’hippocampe ; Toutefois, il est important de considérer que les injections systémiques de kynurénine élever aussi métabolites de la branche neurotoxique de la KP, y compris 3-hydroxykynurénine (3-HK) et l’acide quinolinique. Pour distinguer les effets causés par la topographie de la 3-HK par rapport à ceux causés par des élévations de frederic, la méthodologie doit être ajustée. En outre, l’élévation de perfuse dans le métabolisme de KP dans tout le cerveau11 jette un regard limité sur les régions spécifiques du cerveau qui sont médiant les changements de comportement.
Lorsque vous concevez l’expérience comportementale décrite ici, nous avons optimisé le paradigme de l’évitement passif en ce qui concerne les méthodes existantes, tel que décrit dans le détail, pour engager la mémoire contextuelle hippocampe induite. Mémoire se compose de trois grandes sous-processus : encodage, consolidation et extraction. Conditions optimales pour le processus de consolidation de mémoire se produisent pendant le sommeil quand nouvellement codée de mémoire est intégré à19,20de l’entreposage à long terme. Comme les études chez les rongeurs ont porté sur les fenêtres de temps étroit de consolidation de la mémoire et la mention que la mémoire apparaît plus sensible lorsque le sommeil est différé après l’acquisition, nous avons choisi d’élever la kynurénine et la formation de KYNA dans le cerveau durant cette sensible fenêtre de temps, ayant une incidence sur l’acquisition et la consolidation, pour vérifier l’hypothèse de cet article. Nous n’ai pas, cependant, actuellement tester si la récupération de la mémoire a été impactée par des élévations de kynurénine, comme précédemment indiqué21. Il est crucial d’examiner également les régions du cerveau engagées chez les rongeurs pour effectuer une tâche. Alors que pour cette étude, nous nous intéressions surtout dans le rôle de l’hippocampe dans la modulation de cognition, modifications au protocole peuvent être utiles pour tester les animaux dans des paradigmes comportements alternatifs qui sont sont révélées être touché par un kynurénine aiguë défi, comme la peur, de conditionnement et de travail mémoire tâches2,7,8,9,10.
En outre, au lieu d’injections systémiques de kynurénine pour élever le cerveau cristano, des stratégies alternatives à envisager incluent l’infusion directe de cristano dans un domaine d’intérêt ou l’inhibition ciblée de l’enzyme synthétisant KAT II par pharmacologique outils ou approches moléculaires de précipitation dans des régions précises du cerveau, afin de vérifier les hypothèses mécanistiques. Bien que ces approches peuvent aussi prévoir des procédures potentiellement envahissantes qui influent sur les résultats fonctionnels mesurées indépendamment, il est essentiel d’expériences de conception avec des conditions de contrôle optimal.
Enfin, le sommeil enregistrement protocole EEG/EMG décrit ici présente l’avantage d’être télémétrique et non attachés, éliminant le bruit électrique, des artefacts de mouvement et le risque de blessure chez un animal qui a tiré les câbles attachés. La taille physique et le poids léger de l’émetteur-récepteur sans fil et son placement sous la peau plutôt que par voie intrapéritonéale chez le rat pour optimiser la récupération après une chirurgie, permet des enregistrements sans fil qui captent naturaliste-sommeil comportement avec une libre amplitude des mouvements. Cependant, un facteur important lorsque vous utilisez le système télémétrique est la capacité limitée d’enregistrement de canaux multiples simultanées. Le paradigme actuel apparie un EEG canal et un canal de EMG et permet la cotation de REM, NREM et le comportement de la suite.
La combinaison des méthodes décrites actuellement donne un aperçu des épreuves biochimiques et comportementales pour élucider les résultats fonctionnels d’une élévation de kynurénine. Ces protocoles de démontrent une relation entre la KP, cognition et le sommeil, une dynamique précédemment inexplorée. Utilisant les méthodes expérimentales détaillées fournies ici permettra d’améliorer la compréhension scientifique des impacts fonctionnels de kynurénine et neurobiologie cristano chez les animaux. En fin de compte, poursuivre les travaux dans ce domaine peuvent conduire à de nouvelles approches thérapeutiques pour soulager les résultats chez les individus de lutter contre les troubles psychiatriques et des perturbations dans le sommeil.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
La présente étude a été financée en partie par le National Institutes of Health (R01 NS102209) et un don du Clare E. Forbes Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wistar rats | Charles River Laboratories | adult male, 250-350 g | |
| L-kynurenine sulfate | Sai Advantium | ||
| ReproSil-Pur C18 column (4 mm x 150 mm) | Dr. Maisch GmbH | ||
| EZ Clips | Stoelting Co. | 59022 | |
| Mounting materials screws | PlasticsOne | 00-96 X 1/16 | |
| Nonabsorbable Sutures | MedRep Express | 699B | CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOX of 12 |
| Absorbable Sutures | Ethicon | J310H | 4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1 |
| Dental Cement | Stoelting Co. | 51458 | |
| Drill Bit | Stoelting Co. | 514551 | 0.45 mm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alliance HPLC system | |||
| E2695 separation module | Waters | 176269503 | |
| 2475 fluorescence detector | Waters | 186247500 | |
| post-column reagent manager | Waters | 725000556 | |
| Lenovo computer | Waters | 668000249 | |
| Empower software | Waters | 176706100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Passive avoidance box for rat | |||
| Extra tall MDF sound attenuating cubicle | MedAssociates | ENV-018MD | Interior: 22" (W) x 22" (H) x 16" (D) |
| Center channel modulator shuttle box chamber | MedAssociates | ENV-010MC | |
| Stainless steel grid floor for rat | MedAssociates | ENV-010MB-GF | |
| Auto guillotine door | MedAssociates | ENV-010B-S | |
| Quick disconnect shuttle grid floor harness for rat | MedAssociates | ENV-010MB-QD | |
| Stimulus light, 1" white lens, mounted on modular panel | MedAssociates | ENV-221M | |
| Sonalert module with volume control for rat chamber | MedAssociates | ENV-223AM | |
| SmartCtrl 8 input/16 output package | MedAssociates | DIG-716P2 | |
| 8 Channel IR control for shuttle boxes | MedAssociates | ENV-253C | |
| Infrared source and dectector array strips | MedAssociates | ENV-256 | |
| Tabletop interface cabinet, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080C | |
| Dual range constant current aversive stimulation module | MedAssociates | ENV-410B | |
| Solid state grid floor scrambler module | MedAssociates | ENV-412 | |
| Dual A/B shock control module | MedAssociates | ENV-415 | |
| 2' 3-Pin mini-molex extension | MedAssociates | SG-216A-2 | |
| 10' Shock output cable, DB-9 M/F | MedAssociates | SG-219G-10 | |
| Shuttle shock control cable 15', 6 | MedAssociates | SG-219SA | |
| Small tabletop cabinet and power supply, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080D | |
| PCI interface package | MedAssociates | DIG-700P2-R2 | |
| Shuttle box avoidance utility package | MedAssociates | SOF-700RA-7 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sleep-Wake Monitoring Equipment | |||
| Ponehmah software | Data Sciences International (DSI) | PNP-P3P-610 | |
| MX2 8 Source Acquisition interface | Data Sciences International (DSI) | PNM-P3P-MX204 | |
| Dell computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bit | Data Sciences International (DSI) | 271-0112-013 | |
| Dell 19" computer monitor | Data Sciences International (DSI) | 271-0113-001 | |
| Receivers for plastic cages, 8x | Data Sciences International (DSI) | 272-6001-001 | |
| Cisco RV130 VPN router | Data Sciences International (DSI) | RV130 | |
| Matrix 2.0 | Data Sciences International (DSI) | 271-0119-001 | |
| Network switch | Data Sciences International (DSI) | SG200-08P | |
| Neuroscore software | Data Sciences International (DSI) | 271-0171-CFG | |
| Two biopotential channels transmitter, model TL11M2-F40-EET | Data Sciences International (DSI) | 270-0134-001 |
References
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