Summary
Endringer i kynurenine sti (KP) neuroactive metabolitter er innblandet i psykiske sykdommer. Undersøker funksjonelle utfallet av en endret kynurenine sti stoffskiftet i vivo i gnagere kan bidra til å belyse romanen terapeutiske metoder. Gjeldende protokollen kombinerer biokjemiske og atferdsmessige tilnærminger for å undersøke virkningen av en akutt kynurenine utfordring i rotter.
Abstract
Den kynurenine sti (KP) av tryptofan fornedrelse har vært involvert i psykiske lidelser. Spesielt astrocytter-avledet metabolitten kynurenic syre (KYNA), opptrer på begge N-methyl-d-aspartate (NMDA) og α7 nikotinsyre acetylkolin (α7nACh) reseptorer, har vært innblandet i kognitive prosesser i helse og sykdom. Som KYNA nivåene er opphøyet i hjernen til pasienter med schizofreni, er en feil på glutamatergic og cholinergic reseptorer antatt å skyldes causally kognitive dysfunksjon, en kjerne domenet psykopatologi av sykdommen. KYNA kan spille en pathophysiologically betydelig rolle i personer med schizofreni. Det er mulig å heve endogene KYNA i gnager hjernen ved å behandle dyr med direkte bioprecursor kynurenine prekliniske studier i rotter har vist at akutt høyder i KYNA kan påvirke prosessene læring og hukommelse. Gjeldende protokollen beskriver denne eksperimentelle tilnærming i detalj og kombinerer en) en biokjemiske analyse av kynurenine blodet og hjernen KYNA formasjon (med høy ytelse flytende kromatografi), b) atferdsmessige testing for å undersøke den hippocampus-avhengige innholdsrettet minne (passiv unngåelse paradigme) og c) en vurdering av sove-våkne [telemetrisk opptak EEG (EEG) og eletromyografi (EMG) signaler] i rotter. Sammen et forhold mellom forhøyet KYNA, søvn og kognisjon er studert, og denne protokollen beskriver i detalj en eksperimentell tilnærming til å forstå funksjonen resultatene av kynurenine høyde og KYNA formasjon i vivo i rotter. Resultatene som oppnås gjennom varianter av denne protokollen tester hypotesen at KP og KYNA tjene avgjørende roller i modulerende søvn og kognisjon i helse og sykdom stater.
Introduction
KP er ansvarlig for nedverdigende nesten 95% av essensielle aminosyren tryptofan1. I pattedyr hjernen metaboliseres kynurenine tatt astrocyttene i neuroactive små molekyl KYNA hovedsakelig av enzymet kynurenine aminotransferase (KAT) II2. KYNA fungerer som opptrer på NMDA og α7nACh reseptorer i hjernen2,3,4, og også mål signalering reseptorer inkludert aryl hydrokarbon reseptoren (AHR) og G-protein kombinert reseptor 35 (GPR35)5 ,6. I forsøksdyr, har forhøyninger i hjerne KYNA vist seg å svekke kognitiv ytelsen i en rekke atferdsmessige analyser,2,,7,,8,,9,,10 . En nye hypotese antyder at KYNA spiller en viktig rolle i modulerende kognitive funksjoner ved å påvirke sove-våkne atferd11, dermed ytterligere støtte rollen astrocytter-avledet molekyler i modulerende nevrobiologi søvn og kognisjon12.
Klinisk har høyder i KYNA blitt funnet i Cerebrospinalvæske og evaluering av hjernevevet fra pasienter med schizofreni13,14,15,16, en ødeleggende psykisk lidelse preget av kognitive hemninger. Pasienter med schizofreni er ofte plaget av søvnforstyrrelser som kan forverre sykdommen17. Forståelsen av KP metabolisme og KYNA i modulerende en relasjon mellom søvn og erkjennelse, særlig mellom læring og hukommelse, kan føre til utviklingen av romanen terapi for behandling av disse dårlige resultater i schizofreni og andre psykiske sykdommer.
En pålitelig og konsekvent metode for måling av KP metabolitter er viktig å sikre at forskningen fremvoksende fra ulike institusjoner kan integreres i vitenskapelig forståelse av KP biologi. For tiden beskriver vi metodene for å måle kynurenine i rotte plasma og KYNA i rotte hjernen av høy ytelse flytende kromatografi (HPLC). Den nåværende protokollen, som gjør bruk av en fluorimetric i nærvær av Zn2 +, ble først utviklet av Shibata18 og mer nylig tilpasset og optimert for å derivatize med 500 mM sink acetate som etter kolonnen reagens, slik at gjenkjenning av endogen, nanomolar mengder av KYNA i hjernen11.
For å stimulere de novo endogene KYNA produksjon som beskrevet i stede protokollen, direkte bioprecursor kynurenine injiseres intraperitoneally (IP) i rotter. I kombinasjon med biokjemiske evalueringer å fastslå graden av KYNA produksjon, virkninger av en kynurenine utfordrer hippocampus-avhengige minne (passiv unngåelse paradigme) og sove-våkne arkitektur (EEG og EMG signaler) er også undersøkte11. En kombinasjon av disse teknikkene tillater studiet av biokjemiske og funksjonelle virkningen av en kynurenine utfordring i vivo i rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vår eksperimentelle protokoller ble godkjent av University of Maryland institusjonelle dyr omsorg og bruk komité og fulgte National Institutes of Health Guide og bruk av forsøksdyr.
Merk: Voksen Wistar hannrotter (250-350 g) ble brukt i alle eksperimentene. Separat kohorter av dyrene ble brukt for biokjemiske analyse, atferdsmessige eksperimenter og sove-våkne innspillinger. Dyrene ble plassert i et temperaturkontrollert anlegg ved Maryland psykiatriske Research Center. De ble holdt på en 12/12 h lys og mørke syklus, med lys gangen zeitgeber (ZT) 0 og lysene av på ZT 12. Dyrene fikk ad lib tilgang på mat og vann under forsøkene. Anlegget var fullt akkreditert av American Association for akkreditering av laboratoriet Animal Care.
1. intraperitoneal Kynurenine administrasjon rotter
Merk: I denne protokollen, kynurenine ble administrert på ZT 0 (begynnelsen av lys fase) og vev var samlet på ZT 2 og ZT 4 for å avgjøre en gang kurs for kynurenine metabolismen. Saline-injisert dyrene ble brukt som en kontroll. For eksempel, hvis en rotten veier 500 g og ønsket dosen er 100 mg/kg, skal rotta motta en 5 mL injeksjon av en 10 mg/mL løsning av kynurenine.
- Veie ut L-kynurenine sulfate ("kynurenine") og legg den i en 20 mL hetteglass. Sørg for å holde kynurenine på is til alle tider.
-
Legg saline for å oppnå ønsket konsentrasjonen og justere pH til 7,6 bruker 1 N natriumhydroksid (NaOH). Vortex og sonicate løsningen til kynurenine har oppløst helt.
Advarsel: Følg alle anbefaling forholdsregler ved håndtering NaOH.- For eksempel for å oppnå en 10 mg/mL løsning, veier ut 200 mg kynurenine og plassere den i et hetteglass. Legge til 15 mL av saltvann og vortex og sonicate (20 kHz 5-10 r, 1/8-tommers diameter microtip) det til å oppløse. Bruke NaOH, justere pH av løsningen. Til slutt, bruk saline lydstyrken til 20 mL.
- Veie hver eksperimentelle rotten og beregne volumet av hver injeksjon basert på dyrets kroppsvekt og ønsket behandling dose. Nøye fjerne dyret fra buret sitt hjem, injisere løsningen intraperitoneally og returnere dyret til buret sitt.
2. Kynurenine målinger ved hjelp av høy ytelse flytende kromatografi
- Vev samling
Merk: I denne protokollen, kynurenine ble administrert på ZT 0 (begynnelsen av lys fase) og vev var samlet på ZT 2 og ZT 4 for å avgjøre en gang kurs for kynurenine metabolismen. Saline-injisert dyrene ble brukt som en kontroll.- Bruke karbondioksid til å euthanize dyret. Etter tegn på åndedrett har opphørt for 1 min, utføre en sekundær euthanasia metode ved halshogging.
- For å samle hele stammen blod, plassere en engangs trakt i en 15 mL tube som inneholder 20 μL K3-EDTA (0,5 M). Tillat blodet renne fra kroppen inn i røret. Inverter røret å sikre EDTA er blandet i.
- Med saks, kutt huden på hodet ned midtlinjen å avsløre skallen. Fjerne noen overflødige halsen muskler på baksiden av skallen og åpningen ryggmargen, skjære gjennom skallen fra tilbake til forsiden.
- Trekk de to sidene av skallen åpne hjernen, og deretter Fjern forsiktig hjernen med tang for ikke å skade den. Fjern olfactory pærene med et barberblad og skjære hjernen i halvparten ned midtlinjen. Ved hjelp av pinsett, dissekere hemibrain i områder av interesse (dvs., hippocampus og cortex).
- Plassere alle dissekert hjernen brikker på aluminiumsfolie på tørris. Etter at vevet er helt frosset, overføre det til en 20 mL plast flaske og lagre den på-80 ° C.
- Sentrifuge hele stammen blod på 300 x g for 10 min. fjerne nedbryting (plasma) og overføre den til nye sentrifuger rør før du lagrer dem på-80 ° C.
- Eksempel forberedelse
- Plasma: samlet fra behandlede dyr
- Tine frossen røret med plasma (se trinn 2.1 for samlingen vev) på våt is.
- I en nye sentrifuger tube, fortynne prøven med ultrapure vann (1:2 for kynurenine, 1:10 for KYNA). Legge til 25 μL 6% perchloric acid 100 μL utvannet prøven.
Advarsel: Følg alle anbefaling forholdsregler ved håndtering perchloric syre. - Vortex alle prøver, deretter sentrifuge dem på 12.000 x g i 10 min. Når ferdig, Fjern 100 μL nedbryting (fra hver tube) og plassere dem i en liten 0,25 mL microcentrifuge rør for kynurenine eller KYNA vilje.
- Brain: samlet fra behandlede dyr
- Plasser rør med frosne hjernen prøver (se trinn 2.1 for samlingen vev) på tørris. Individuelt veie hver hjernen prøve på en presis analytical balanse. Gå tilbake til røret og sett den tilbake på tørris.
- Når alle prøvene har blitt veid, flytte rørene på våt is. Fortynn hver eksempel 1:10 w/v med ultrapure vann og homogenize dem ved hjelp av en sonicator (20 kHz 5-10 r, 1/8-tommers diameter microtip). For eksempel for 100 mg av hjernevevet, legge 900 μL ultrapure vann.
- Aliquot 100 μL av hver utvannet smak til en ny tube og surheten det med 25 μL 25% perchloric acid. Virvelen, deretter sentrifuge det 12 000 x g i 10 min.
- Etter sentrifugering, fjerne 100 μL nedbryting og legg den i små 0,25 mL microcentrifuge rør for KYNA vilje.
- Plasma: samlet fra behandlede dyr
- HPLC oppsett og kjøre
- Forberede 50 mM natrium acetate mobile fase. Oppløse 6.81 g av natrium acetate trihydrate i 1 L ultrapure vann. Justere pH til 6.2 bruker iseddik og deretter vakuum filter i ren glass. Overføre natrium acetate mobile fasen til en ren 1 L glassflaske.
- Forberede 500 mM sink acetate. Oppløse 54.88 g av sink acetate på 500 mL ultrapure vann, deretter vakuum filtrere den. Overføre det til en ren 500 mL glassflaske. Fyll en 1 L flaske med ultrapure vann og en 500 mL flaske med HPLC klasse acetonitrile.
- Plass inntak slangen HPLC maskinen separat i den mobile fasen, ultrapure vannet og 100% acetonitrile. Pumpen sink acetate løsningen separat gjennom en peristaltiske pumpe som kombinerer med mobile fasen etter kolonnen, og før derivatization.
- Bruke kontrollpanelet på maskinen, programmet kjøre 5% acetonitrile og 95% ultrapure vann på 0,5 mL/min. tillate den å løpe i 20-30 minutter å oppnå en stabil press og planlagt.
- Ved å etablere et stabilt startpunkt, endre løsning komposisjon 5% acetonitrile og 95% natrium acetate mobile fase. Equilibrate i 30 min.
- Slå på lampen på fluorescens detektoren og tillate det å varme opp.
- I mellomtiden kan også aktivere etter kolonnen pumpen til en strømningshastighet på 0,1 mL/min. det til nå stabilt trykk av ca 500 psi etter ca 20 min.
- Klargjør standarder.
- For KYNA, begynner med en 1 mM lagerløsning og fortynne det til å forberede 5 standard konsentrasjoner (dvs, 10 nM, 5 nM, 2.5 nM, 1 nM og 500 pM).
Merk: Dette vil gi en standard kurve mellom 200 fmoles 10 fmoles per 20 μL injeksjon. - For kynurenine, begynner med en 1 mM lagerløsning og fortynne det til å forberede 5 standard konsentrasjoner (dvs, 10 μM, 5 μM, 2,5 μM, 1 μM og 500 nM).
Merk: Dette vil gi en standard kurve mellom 200 pmoles 10 pmoles per 20 μL injeksjon.
- For KYNA, begynner med en 1 mM lagerløsning og fortynne det til å forberede 5 standard konsentrasjoner (dvs, 10 nM, 5 nM, 2.5 nM, 1 nM og 500 pM).
- Definere HPLC systemprogramvaren å kontrollere parameterne for eksempel sekvens og tillater autoinjections av flere prøver.
- På skjermbildet "Kjør Sample" Klikk "Fil" og dra til "Opprett nytt utvalg sett". Når det nye vinduet åpnes, velg "Tomt". Individuelt liste alle standarder (se trinn 2.3.8) eller prøver i rekkefølgen de skal kjøres.
- I kolonnen "Funksjon" Angi standarder og eksempler. Standardene bør være assayed i begynnelsen og slutten av sekvensen. Injisere vann mellom hver 5 prøvene.
- Angi operasjonstiden for hvert utvalg 15 min. injisere 20 μL prøven fra standardene og plasma utarbeidelse eller injisere 30 μL prøven fra hjernen homogenate forberedelse.
- Angi eksitasjon og utslipp bølgelengdene (avhengig av sammensatt blir vurdert) for kynurenine til eksitasjon: 365 nm, utslipp: 480 nm og tiden: ~ 6 min, og KYNA til eksitasjon: 344 nm, utslipp: 398 nm og tiden: ~ 11 min.
- Når alle parametere er definert og maskinen har equilibrated, kjøre sekvensen.
- For å måle data, gå til "Bla gjennom Project" skjermen. Dobbeltklikk på prøven satt til kvantifiseres under kategorien "Prøvesett". Fra listen over alle injeksjoner, markere alle standarder og høyreklikk. I det nye vinduet, velg "Prosess" og bruke drop-down menyen til å velge "Kalibrere og Quantitate" ved siden av "Hvordan":.
- Merk alle standarder igjen, høyreklikk og velg "Vurdering". Når chromatograms åpner, bruke knappene øverst "Integrere" og deretter "kalibrere" hver standard; Dette vil automatisk opprette standardkurven.
- "Prøvesett" kategorien og dobbeltklikk på eksempelsettet. Deretter Merk alle standarder. Gjenta prosessen nevnt ovenfor, men i stedet, velge "Quantitate" fra det miste-ned menyen. Markere alle prøver igjen, høyreklikk og velg "Vurdering". Når chromatograms åpner, bruke knappene øverst "Integrere" og deretter "Quantitate" hver prøve.
Merk: Dette vil produksjonen konsentrasjonen av hvert utvalg basert på tidligere opprettet standardkurven.
3. passiv unngåelse paradigme
Merk: Disse atferdsmessige eksperimenter ble designet basert på våre biokjemiske funn med akutt kynurenine utfordringen. For å maksimere en økning i hjernen KYNA, ble kynurenine (100 mg/kg) administrert på ZT 0, 2 timer før treningsøkten i passiv unngåelse paradigmet å teste hippocampus-mediert læring, som skjedde på ZT 2. Apparatet består av 2 like store rom (21,3 cm høy, 20,3 cm bred og 15.9 cm dyp) atskilt med en giljotinen dør og innenfor en lydisolerte boks. De to avdelinger av testing apparater kalles "lys side" og "mørke siden". Veggene i den lyse siden er klare, og under forsøkene, et lys vil slå på ytterligere belyse dette rommet. Veggene i det mørke rommet er helt dekket for å opprettholde en svart ut tilstand.
-
Dag 1: trening prøveversjon
- Før testing, Rengjør apparatet med 70% etanol.
- Ta dyrene til testing rom.
- Forsiktig plassere eksperimentelle dyr i den lyse siden av apparatet og Lukk og klinke døren apparater og boksen lydisolerte.
- Ved hjelp av den tilknyttede programvaren, starte rettssaken. Fra Hjem-skjermen, velg "File" og deretter "Åpne Session" fra det miste-ned menyen. I det nye vinduet, sikre riktig prosedyre og apparatet er valgt og klikk på "Close". Neste, velg "Konfigurer" og deretter "Signaler". I det nye vinduet, Velg riktig apparatet og klikk "Problemet".
Merk: Programvaren vil starte et lys aktivere i den lyse siden av apparatet og åpne giljotinen mellom de to avdelinger. En tidtaker initieres. - Når Dyret fullt går inn den mørke siden av apparatet og giljotinen døren vil stenge en uunngåelig foten sjokk (0,56 mA for 1 s) vil bli levert.
- Post tiden som har gått før dyret angitt mørke rommet.
- Etter dyret har mottatt sjokk, tillate 30 s utvinning tid før fjerne dyret fra apparatet.
- Sted dyr tilbake i buret sitt hjem.
- Før du starter rettssaken til neste dyret, tørk apparatet rent med et vått håndkle og kast noen fecal pellets.
- Etter at alle dyr har vært trent, returnere dem til dyr anlegget.
-
Dag 2: testing prøveversjon
- Bringe dyr tilbake inn i testing rommet 24 timer etter trening rettssaken. Starte testing rettssaken for første dyret ved å plassere det i den lyse siden av apparatet, lukking og låsingen døren og boksen lydisolerte.
- Starte testing rettssaken ved hjelp av kommandoene for samme programvare som dagen; lampen slås i den lyse siden av apparatet og giljotinen døren mellom de to avdelinger åpnes. En tidtaker initieres.
- Når Dyret går inn i det mørke rommet, lukkes giljotinen døren. Registrere tiden utløpt.
Merk: Rettssaken vil bli avsluttet via programvaren etter maksimalt 300 s Hvis dyret fortsatt på den lyse siden av testing apparater. - Plasser dyr baksiden inne deres hjem bur og Rengjør apparatet (som beskrevet i trinn 3.1.9) før du starter rettssaken til neste dyret.
4. sove analyse
- Kirurgisk implantering av en trådløs EEG/EMG sender
Merk: Telemetrisk senderne skal steriliseres og forberedt før kirurgi.- Bruker et barberblad, forsiktig fjerne en liten mengde i plastbelegg å avsløre ledningen fører. Plasser senderne i et 50 mL konisk rør fylt med sterilisering løsning [f.eksWavecide (2,65% glutaraldehyde)].
- La senderne i desinfiserende løsningen for minst 12 h. Deretter før kirurgi, overføre løsningen til en avfallsbeholderen. Skyll senderen med sterilt saltvann.
- På dagen for kirurgi, veie dyret før plassere det i en bedøvelse kammer. Indusere 3-5% isoflurane med 100% O2.
- Etter en vellykket anestesi, fjerne dyret og nøye barbering, bruke en elektrisk barberhøvel, toppen av hodet og nakke, samt en liten oppdatering av hår på baksiden av kroppen, bare litt til venstre og under brystkasse.
- Administrere carprofen (5 mg/kg) subcutaneously for postoperativ analgesi.
- Plass en termostatstyrt varmt-vann varmeputen satt på 37 ° C dyr å opprettholde dyrets kroppstemperatur under operasjonen.
- I en stereotaxic ramme, plassere dyret på en nesen kjegle å opprettholde bedøvende tilstand og plassere øret barer å stabilisere hodet. Sterilisere barbert huden av vekslende vattpinner av betadine scrub og 70% etanol. Opthalamic salve gjelde øynene for å smøre dem.
- For å sikre tilstrekkelig anestesi før den første snittet, bruk tå-klype testen.
- Bruke sterilt skalpell, lage et snitt fra like bak øynene til baksiden av halsen. Skallen og dorsal cervical hals muskelen må utsettes.
- Om nødvendig å avsløre skallen bruk bomull-tipped påføring for å fjerne noen membraner. Mikro-bulldog klemmer kan brukes til å holde huden fra skallen. Finne og markere posisjonen til bregma. Bore 2 burr-hull og sette metall skruer 2.0 mm fremre / + 1,5 mm laterale og 7.0 mm bakre /-1,5 mm lateral i forhold til bregma. Komplett 2 omdreininger å stramme skruene. Dekk eksponert skallen med et stykke gasbind.
- Bruke sterilt kirurgisk saks, lage et snitt i kroppens hulrom, like nedenfor ribbeina.
- På kirurgisk arket, sørg for å spille inn serienummeret til senderen til bli implantert.
- Sett inn sterilt senderen i kroppens hulrom. Wire kundeemnene skal fremdeles være utenfor kroppen.
- Bruk absorberbare suturer for å sy muskel veggen, sikre at alle ledningene er samlet til den ene enden av innsnitt.
- Fjern gasbind fra hodet og løft opp huden rett under innsnitt. Kjøre et par lange sterilt hemostats under huden fra hodet innsnitt til innsnitt i siden. Holde presset på huden for å redusere skade.
- Når hemostats vises nær kroppen innsnitt, klippet noen membran som kan dekke dem med kirurgisk saks og ta fire senderen leder med hemostats. Sakte trekke ut hemostats, slik at ledningene lå under huden og kjøre opp til skallen.
- Angi avledninger 2 vil bli koblet til skallen. Ved hjelp av pinsett, forstå slutten av en ledning med en hånd og bare under slutten av plast slire med den andre. Trekk på ledningen til enkelte looper kan bare gjøres.
- Tett skruer wrap eksponert ledningen rundt en av metall 3-4 x. Når sikker, skru for å hindre at ledningen rakne og klippe av eventuelle ekstra kabel. Gjenta dette med de andre bly og skruen.
- Trekk både EEG leder fra kroppens hulrom slik at de sitter tettsittende mot skallen.
- Bruk dental sement for å dekke skruene og kortikale fører, skape en cap over utsatte skallen. Kontroller at ingen dental sement stikker på huden eller muskel og at ingen skarpe kanter opprettes. Tillate dental sementen tørke.
Merk: Hetten bør være så lite at huden kan være sutured over toppen. - For EMG fører, forstå slutten av ledningen og plast slire som beskrevet i trinn 4.1.15. Strekke ledningen til de enkelte looper er klart synlig.
- Kjøre en 22 G nål under hals muskelen til høyre for 2-3 mm før slik at det å komme ut. Bruker er skjærende suturer, plassere en enkelt, løs Sutur rundt innebygde nålen.
- Tråden EMG ledningen inn nålen og trekk nålen ut, slik at EMG ledningen til tråden under muskelen. Stram suture ledningen beholdes og klipp ekstra wire som kan komme ut av muskelen.
- Gjenta trinn 4.1.20 og 4.1.21 for andre EMG ledelsen, ca 1 mm ned fra første leder.
- Trekk både EMG leder fra kroppens hulrom slik at de sitter tettsittende mot muskelen.
- Bruk er skjærende sting for å lukke i hodet og nakken snitt. Kaste alle ekstra kabel under huden av kroppen og bruke såret klipp lukke kroppen innsnitt.
- Lidocaine salve gjelde begge snitt steder å hjelpe dyret med postoperativ smerte.
- Tilbake dyret til buret sitt hjem, som tillater byrået å sitte på varmeputen til dyret er gjenopprettet av bedøvelsen.
Merk: Dyret skal gjenopprette for 7-10 dager før du starter opptakene.
- Bruker et barberblad, forsiktig fjerne en liten mengde i plastbelegg å avsløre ledningen fører. Plasser senderne i et 50 mL konisk rør fylt med sterilisering løsning [f.eksWavecide (2,65% glutaraldehyde)].
- EEG/EMG opptak
Merk: Denne protokollen, vi administrert saltvann eller kynurenine på ZT 0 og deretter registreres dyrets sove-våkne mønstre for 24 timer.- Fullføre alle sove opptak i et eget rom der dyrene ikke blir avbrutt for varigheten av innspillingen.
- Plass hjem buret av dyret (bærer implantert EEG/EMG senderen) på en mottaker-enhet. Aktivere kirurgisk implantert senderen bruker en magnet.
Merk: Et lys skal vises på mottakeren enhet når senderen er aktivert. - Sette opp innspillingen av EEG/EMG dataene ved hjelp av den tilknyttede programvaren.
- Velg "Eksperiment" og deretter "Opprett" fra det miste-ned menyen. Navnet eksperimentet, og deretter lagre den. Deretter Velg "Hardware" og deretter "Rediger MX2 Configuration".
- I det nye vinduet, Velg alle sendere brukes i eksperimentet og angi hvilke mottak pad hver er sammenkoblet med. Når du er klar, kan du starte innspillingen ved å trykke på "Start alle kontinuerlig".
- Ved oppsigelse av eksperimenter, Merk "Stoppe alle kontinuerlig" i den tilknyttede programvaren og slå av sendere bruker magneten.
- Avlive dyrene av CO2 kvelning etterfulgt av en hjertestans punktering. Fjerne senderen nøye ved gjenåpnet i snitt langs toppen av hodet med kirurgisk saks og kutte fører uten tannlege sement og hals muskelen.
- Deretter åpner kroppens hulrom, finne senderen og sakte fjerne det fra kroppen.
- EEG/EMG analyse
- Bruk den tilknyttede programvaren dataanalyse sove-våkne. Åpne programmet og velg "Legg til ny lokasjon". I det nye vinduet, Velg data å importere den til scoring programvaren.
Merk: Dette vil opprette en ny fil i programvaren inneholder alle rå bølgeformer samlet under eksperimentet. - Manuelt score årvåkenhet USA for de ønskede eksperimentene. Etter scoring, analysere parameterne som den totale varigheten, antall kamper og gjennomsnittlig bout varigheten av de ulike årvåkenhet statene [REM (REM), ikke - REM NREM og kjølvannet].
Merk: Analyse kan utført over hele opptaket eller forkortet til bestemt interessepunkter. Her ble analyse utført for opptak perioden ZT 0 ZT 2.
- Bruk den tilknyttede programvaren dataanalyse sove-våkne. Åpne programmet og velg "Legg til ny lokasjon". I det nye vinduet, Velg data å importere den til scoring programvaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å validere bruken av intraperitoneal kynurenine injeksjon som metode for å heve hjernen KYNA, ble en såkalt HPLC-analyse av vev utført. Standard kurver (figur 1) ble bygget ved hjelp av den tilknyttede programvaren og tillatt for kvantifisering av de. Representant chromatograms for kynurenine og KYNA presenteres i figur 2. Kynurenine ble observert samtidig oppbevaring av 6 min, og KYNA hadde en oppbevaring 11 min. For å observere KP dynamikken, 100 mg/kg av kynurenine ble gitt i denne protokollen, og vev ble samlet inn umiddelbart etter injeksjon eller 2 eller 4 h etter injeksjon (figur 3a). Plasma kynurenine (figur 3b) og hippocampus KYNA (Figur 3 c) kvantifisert. De spesifikke parameterne HPLC fastsettelsen av kynurenine metabolitter er beskrevet i tabell 1. Dose-respons kurven produsert av denne protokollen støtter beskrivelsen av en akutt kynurenine injeksjon som metode for å øke hjernen KYNA nivåer, med en topp oppnås ved 2t etter injeksjon og nivåer av KYNA tilbake til sine opprinnelige 4T etter injeksjon.
Basert på nevnte biokjemiske funnene, ble opplæring i passiv unngåelse paradigmet utført 2t etter kynurenine injeksjon (figur 4a). Ingen gruppe forskjeller ble observert under trening rettssaken (figur 4b). Under testing rettssaken vises kontroll dyrene en betydelig økning i ventetid til å angi den mørke siden, indikerer innholdsrettet læring. Dyr injisert med kynurenine på gårsdagen fremviste ikke samme økningen i ventetid, demonstrere et underskudd i læring. Basert på disse resultatene, kan vi konkludere med at akutt kynurenine høyde, i løpet av minne oppkjøp og konsolidering, resulterer i en nedsatt ytelse i en hippocampus-mediert oppgave.
Undersøke virkningen av en akutt kynurenine høyde i lys fasen på sove-våkne arkitektur, ble dyr injisert med saltvann på dag 1 og kynurenine på dag 2 på ZT 0 (figur 5a). EEG/EMG signaler ble registrert telemetrically for hele 48t perioden. Sammenligninger ble gjort mellom saltvann injeksjon (vehicle) på dag 1 og kynurenine injeksjon på dag 2. Resultatene indikerte en reduksjon i total REM søvn varighet (presentert som en prosentvis endring fra opprinnelige) under første 2 h (figur 5b) etter en injeksjon. Dette ble motsatt av en økning i kjølvannet varighet disse tidsperioder og en liten reduksjon i NREM sove. Disse resultatene viser at en akutt kynurenine høyde forårsaker forstyrrelser i sove-våkne dynamics.
Figur 1: Standard kurver for kynurenine og KYNA injeksjon. 20 µL av hver standard ble injisert åopprette standardkurven for (A) kynurenine og (B) KYNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representative chromatograms for kynurenine og KYNA. Standardene ble kjørt før en prøve å bekrefte deres tid. Disse skjermbildene viser representative utvalg for (A) serum kynurenine og (B) hjernen KYNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: analyse av serum og hippocampus vev av HPLC etter en kynurenine utfordring. (A) Kynurenine (100 mg/kg) eller saltvann ble administrert av en intraperitoneal injeksjon på zeitgeber tid (ZT) 0. Vev ble samlet enten 2 eller 4 h etter injeksjon. Følgende paneler Vis eksponering (B) kynurenine-opphøyet serum kynurenine og (C) hippocampus KYNA nivåer 2t etter injeksjon. P < 0,001 angir betydningen av en toveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av en Bonferroni t-test korreksjon. N = 4-5 per gruppe. Alle data er gjennomsnittlig ± SEM. Dette tallet har blitt endret fra Pocivavsek et al. 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: effekten av en kynurenine heving hippocampus-avhengige minne i passiv unngåelse paradigmet. (A) Kynurenine (100 mg/kg) eller saltvann ble administrert av intraperitoneal injeksjon på zeitgeber tid (ZT) 0. Dyrene ble trent på aktiviteten på ZT 2. 24 timer etter trening, dyrene ble testet for minne formasjon. (B) en eksponering mot kynurenine før treningskonferansen redusert ventetid for å unngå aversive mørke rommet ved testing. P < 0,01, *** P < 0,001 Angi betydningen av en toveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av en Bonferroni t-test korreksjon. N = 8 – 14 per gruppe. Alle data er gjennomsnittlig ± SEM. Dette tallet har blitt endret fra Pocivavsek et al. 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: effekten av en kynurenine høyde på sove-våkne arkitektur. (A) Saline (dag 1) og kynurenine (100 mg/kg, dag 2) ble administrert av en intraperitoneal injeksjon på zeitgeber tid (ZT) 0. Sove-våkne virkemåten ble registrert for den påfølgende 24 h. (B) hele REM (REM)-søvn ble redusert og hele kjølvannet ble økt i første 2 h etter kynurenine injeksjon. P < 0,05 angir betydningen av en toveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av en Bonferroni t-test korreksjon. N = 6 – 8 per gruppe. Alle data er gjennomsnittlig ± SEM. Dette tallet har blitt endret fra Pocivavsek et al. 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Mobile fase sammensetning | 50 mM natrium acetate, pH 6.2 |
| 5% acetonitrile | |
| Mobile fase strømningshastighet | 0,5 mL/min |
| Etter kolonnen derivatization reagens | 500 mM sink acetate |
| Etter kolonnen derivatization strømningshastighet | 0,1 ml/min |
| Kolonnetypen | ReproSil-Pur C18 |
| Kolonnedimensjoner | 4 x 150 mm2 |
| Detektor temperatur | 4.0 ºC |
| Kynurenine bølgelengde | Ex: 365 Em: 480 |
| Kynurenine tiden | ~ 6 min |
| KYNA bølgelengde | Ex: 344, Em: 398 |
| KYNA tiden | ~ 11 min |
Tabell 1: Parametere for en såkalt HPLC bestemmelse av kynurenine sti metabolitter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For en pålitelig vurdering av KYNA i hjernen etter en ekstern kynurenine administrasjon er det avgjørende å kombinere og tolke biokjemiske og funksjonelle eksperimenter. Her presenterer vi en detaljert protokoll som tillater at nye brukere å etablere effektive metoder for å måle plasma kynurenine og hjernen KYNA rotter. Måling av kynurenine i plasma bekreftet nøyaktig injeksjon og måling av metabolitten KYNA bekrefter de novo syntese i hjernen. Det er flere fordeler av beskrevet fluorometric HPLC metoden, tilpasset Shibata18, derivatize KYNA i nærvær av Zn2 +, inkludert muligheten for å nøyaktig oppdage endogene mengder KYNA i hjernen i området nanomolar . I tillegg er metoden tilpasset til å oppdage den bioprecursor kynurenine i plasma i micromolar området ved å justere fluorometric bølgelengdene eksitasjon og utslipp, som beskrevet i protokollen.
Avgjørende skritt i protokollen, for eksempel bestemte tider mellom behandling og dødshjelp, er beskrevet å nøyaktig bestemme time course of KYNA dannelse i hjernen og guide design og analyse av det opptreden og sove-våkne overvåke eksperimenter. Hippocampus-mediert læring ble vurdert bruker passiv unngåelse paradigmet og en sove-våkne analyse ble gjennomført med telemetrisk innspillinger av EEG/EMG data. Som vi bestemt at hjernen KYNA nivåene var høyeste 2t etter injeksjon, tidsbestemte vi treningsøkten atferdsmessige paradigme tilsvarende, slik at oppkjøpet i passiv unngåelse oppgaven oppstod når KYNA nivåene var høyest, ZT 2. Dessuten, fokusert vi også analyse av sove-våkne på den kritiske ZT 0 ZT 2 tid rammen der KYNA nivåene var høyest i hjernen. Sammen har gjennomtenkt eksperimentell design tillatt oss å bygge bro sammen funn fra biokjemiske og funksjonelle eksperimenter, innføring av KYNA som en modulator både kognisjon og sove-våkne atferd11.
Flere begrensninger bør vurderes i beskrevet protokollen. For å stimulere endogene produksjon av KYNA, ble direkte bioprecursor kynurenine injisert perifert i rotter. Kynurenine krysser lett blod - hjerne barrieren og stimulert KP stoffskiftet forekommer i en rekke hjernen regioner2. For tiden fokuserer vi på høyden i astrocytter-avledet KYNA prefiks; Det er imidlertid viktig å vurdere at systemisk injeksjoner av kynurenine også heve metabolitter av nevrotoksiske grenen i KP, inkludert 3-hydroxykynurenine (3-HK) og quinolinic syre. For å erte hverandre effekten forårsaket av høyder i 3-HK sammenlignet med de forårsaket av KYNA høyder, skal metodikken justeres. Dessuten gir perfuse høyde i KP metabolisme gjennom hjernen11 en begrenset innsikt i spesifikke hjernens regionene som er megling endringer i virkemåten.
Når du utformer atferdsmessige eksperimentet beskrevet her, optimalisert vi passiv unngåelse paradigmet forhold til eksisterende metoder, som beskrevet i detalj, å engasjere hippocampus-mediert sammenhengende minne. Minne består av tre store delprosesser: koding, konsolidering og henting. Optimale forhold for minne konsolidering prosesser oppstå under søvn nylig kodet minne er integrert i langsiktig lagring19,20. Studier i Red har fokusert på smale tidsvinduer minne konsolidering og identifisert at minnet vises mest sensitive når søvn er forsinket etter oppkjøpet, valgte vi å heve kynurenine og KYNA formasjon i hjernen under denne sensitive tidsvinduet, påvirker anskaffelsen og konsolidering, teste hypotesen om denne artikkelen. Vi ikke, men tiden test hvis henting av minnet ble påvirket av kynurenine høyder, som tidligere vist21. Er det kritisk viktig å likeledes betenke hjernen regioner engasjert i gnagere å utføre en oppgave. For denne studien, vi var hovedsakelig interessert i rollen som hippocampus i modulerende kognisjon, modifikasjoner til protokollen kan være nyttig å teste dyr i alternative opptreden paradigmer som har vist seg å være påvirket av en akutt kynurenine utfordring, som frykt condition og arbeider minne oppgaver2,7,8,9,10.
I tillegg, i stedet for systemisk injeksjoner av kynurenine å heve hjernen KYNA, inkludere alternativ strategi å direkte tilførsel av KYNA i et område av interesse eller målrettet hemming av synthesizing enzym KAT II av farmakologiske verktøy eller molekylær sammenleggbare tilnærminger i bestemte hjernen regioner, for å teste mekanistisk hypoteser. Mens disse metodene kan også introdusere potensielt invasiv prosedyrer som uavhengig funksjonelle resultatene målt, er det avgjørende å design eksperimenter med optimal kontroll forhold.
Til slutt, søvnen opptak EEG/EMG protokoll beskrevet her har fordelen av å telemetrisk stedet tjoret, eliminere elektrisk støy, bevegelse gjenstander og risikoen for skade i et dyr som har trukket bundet kablene. Den fysiske størrelsen og vekten av telemetrisk enheten og plasseringen subcutaneously enn intraperitoneally i rotta å optimalisere post-kirurgisk utvinning, gir trådløs innspillinger som fange naturalistiske sove-våkne opptreden med en gratis utvalg av bevegelse. En viktig faktor når du bruker telemetrisk systemet er imidlertid den begrensede evnen til opptak fra flere kanaler samtidig. Gjeldende paradigmet par EEG kanal og en EMG kanal, og tillater scoring av REM, NREM og kjølvannet virkemåten.
Kombinasjonen av metodene beskrevet dag gir innsikt i atferd og biokjemiske analyser å belyse de funksjonelle resultatene av en kynurenine høyde. Disse protokollene viser en relasjon mellom KP, kognisjon og søvn, et tidligere uutforsket dynamisk. Bruker detaljert eksperimentelle metodene her vil forbedre vitenskapelig forståelse av funksjonelle virkningene av kynurenine og KYNA nevrobiologi i dyr. Til slutt, videre arbeid i dette feltet kan føre til nye behandlingsmetoder å lindre resultater i individer bekjempe psykiske lidelser og forstyrrelser i søvne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Studien ble finansiert delvis av National Institutes of Health (R01 NS102209) og en donasjon fra Clare E. Forbes Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wistar rats | Charles River Laboratories | adult male, 250-350 g | |
| L-kynurenine sulfate | Sai Advantium | ||
| ReproSil-Pur C18 column (4 mm x 150 mm) | Dr. Maisch GmbH | ||
| EZ Clips | Stoelting Co. | 59022 | |
| Mounting materials screws | PlasticsOne | 00-96 X 1/16 | |
| Nonabsorbable Sutures | MedRep Express | 699B | CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOX of 12 |
| Absorbable Sutures | Ethicon | J310H | 4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1 |
| Dental Cement | Stoelting Co. | 51458 | |
| Drill Bit | Stoelting Co. | 514551 | 0.45 mm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alliance HPLC system | |||
| E2695 separation module | Waters | 176269503 | |
| 2475 fluorescence detector | Waters | 186247500 | |
| post-column reagent manager | Waters | 725000556 | |
| Lenovo computer | Waters | 668000249 | |
| Empower software | Waters | 176706100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Passive avoidance box for rat | |||
| Extra tall MDF sound attenuating cubicle | MedAssociates | ENV-018MD | Interior: 22" (W) x 22" (H) x 16" (D) |
| Center channel modulator shuttle box chamber | MedAssociates | ENV-010MC | |
| Stainless steel grid floor for rat | MedAssociates | ENV-010MB-GF | |
| Auto guillotine door | MedAssociates | ENV-010B-S | |
| Quick disconnect shuttle grid floor harness for rat | MedAssociates | ENV-010MB-QD | |
| Stimulus light, 1" white lens, mounted on modular panel | MedAssociates | ENV-221M | |
| Sonalert module with volume control for rat chamber | MedAssociates | ENV-223AM | |
| SmartCtrl 8 input/16 output package | MedAssociates | DIG-716P2 | |
| 8 Channel IR control for shuttle boxes | MedAssociates | ENV-253C | |
| Infrared source and dectector array strips | MedAssociates | ENV-256 | |
| Tabletop interface cabinet, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080C | |
| Dual range constant current aversive stimulation module | MedAssociates | ENV-410B | |
| Solid state grid floor scrambler module | MedAssociates | ENV-412 | |
| Dual A/B shock control module | MedAssociates | ENV-415 | |
| 2' 3-Pin mini-molex extension | MedAssociates | SG-216A-2 | |
| 10' Shock output cable, DB-9 M/F | MedAssociates | SG-219G-10 | |
| Shuttle shock control cable 15', 6 | MedAssociates | SG-219SA | |
| Small tabletop cabinet and power supply, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080D | |
| PCI interface package | MedAssociates | DIG-700P2-R2 | |
| Shuttle box avoidance utility package | MedAssociates | SOF-700RA-7 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sleep-Wake Monitoring Equipment | |||
| Ponehmah software | Data Sciences International (DSI) | PNP-P3P-610 | |
| MX2 8 Source Acquisition interface | Data Sciences International (DSI) | PNM-P3P-MX204 | |
| Dell computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bit | Data Sciences International (DSI) | 271-0112-013 | |
| Dell 19" computer monitor | Data Sciences International (DSI) | 271-0113-001 | |
| Receivers for plastic cages, 8x | Data Sciences International (DSI) | 272-6001-001 | |
| Cisco RV130 VPN router | Data Sciences International (DSI) | RV130 | |
| Matrix 2.0 | Data Sciences International (DSI) | 271-0119-001 | |
| Network switch | Data Sciences International (DSI) | SG200-08P | |
| Neuroscore software | Data Sciences International (DSI) | 271-0171-CFG | |
| Two biopotential channels transmitter, model TL11M2-F40-EET | Data Sciences International (DSI) | 270-0134-001 |
References
- Leklem, J. E. Quantitative aspects of tryptophan metabolism in humans and other species: a review. The American Journal of Clinical Nutrition. 24 (6), 659-672 (1971).
- Pocivavsek, A., Notarangelo, F. M., Wu, H. Q., Bruno, J. P., Schwarcz, R. Astrocytes as Pharmacological Targets in the Treatment of Schizophrenia: Focus on Kynurenic Acid. Modeling the Psychophathological Dimensions of Schizophrenia - From Molecules to Behavior. Pletnikov, M. V., Waddington, J. L. , Elsevier, Academic Press. London, San Diego, Waltham, Oxford. 423-443 (2016).
- Hilmas, C., et al. The brain metabolite kynurenic acid inhibits alpha7 nicotinic receptor activity and increases non-alpha7 nicotinic receptor expression: physiopathological implications. Journal of Neuroscience. 21 (19), 7463-7473 (2001).
- Perkins, M. N., Stone, T. W. An iontophoretic investigation of the actions of convulsant kynurenines and their interaction with the endogenous excitant quinolinic acid. Brain Research. 247 (1), 184-187 (1982).
- DiNatale, B. C., et al. Kynurenic acid is a potent endogenous aryl hydrocarbon receptor ligand that synergistically induces interleukin-6 in the presence of inflammatory signaling. Toxicological Sciences. 115 (1), 89-97 (2010).
- Wang, J., et al. Kynurenic acid as a ligand for orphan G protein-coupled receptor GPR35. The Journal of Biological Chemistry. 281 (31), 22021-22028 (2006).
- Alexander, K. S., Wu, H. Q., Schwarcz, R., Bruno, J. P. Acute elevations of brain kynurenic acid impair cognitive flexibility: normalization by the alpha7 positive modulator galantamine. Psychopharmacology (Berlin). 220 (3), 627-637 (2012).
- Chess, A. C., Landers, A. M., Bucci, D. J. L-kynurenine treatment alters contextual fear conditioning and context discrimination but not cue-specific fear conditioning. Behavioural Brain Research. 201 (2), 325-331 (2009).
- Chess, A. C., Simoni, M. K., Alling, T. E., Bucci, D. J. Elevations of endogenous kynurenic acid produce spatial working memory deficits. Schizophrenia Bulletin. 33 (3), 797-804 (2007).
- Pocivavsek, A., et al. Fluctuations in endogenous kynurenic acid control hippocampal glutamate and memory. Neuropsychopharmacology. 36 (11), 2357-2367 (2011).
- Pocivavsek, A., Baratta, A. M., Mong, J. A., Viechweg, S. S. Acute Kynurenine Challenge Disrupts Sleep-Wake Architecture and Impairs Contextual Memory in Adult Rats. Sleep. 40 (11), (2017).
- Halassa, M. M., et al. Astrocytic modulation of sleep homeostasis and cognitive consequences of sleep loss. Neuron. 61 (2), 213-219 (2009).
- Erhardt, S., et al. Kynurenic acid levels are elevated in the cerebrospinal fluid of patients with schizophrenia. Neuroscience Letters. 313 (1-2), 96-98 (2001).
- Linderholm, K. R., et al. Increased levels of kynurenine and kynurenic acid in the CSF of patients with schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 38 (3), 426-432 (2012).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Impaired kynurenine pathway metabolism in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 37 (6), 1147-1156 (2011).
- Schwarcz, R., et al. Increased cortical kynurenate content in schizophrenia. Biological Psychiatry. 50 (7), 521-530 (2001).
- Pocivavsek, A., Rowland, L. M. Basic Neuroscience Illuminates Causal Relationship Between Sleep and Memory: Translating to Schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 44 (1), 7-14 (2018).
- Shibata, K. Fluorimetric micro-determination of kynurenic acid, an endogenous blocker of neurotoxicity, by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography. 430 (2), 376-380 (1988).
- Buzsaki, G. Memory consolidation during sleep: a neurophysiological perspective. Journal of Sleep Research. 7, 17-23 (1998).
- Graves, L. A., Heller, E. A., Pack, A. I., Abel, T. Sleep deprivation selectively impairs memory consolidation for contextual fear conditioning. Learning & Memory. 10 (3), 168-176 (2003).
- Yamashita, M., Yamamoto, T. Tryptophan circuit in fatigue: From blood to brain and cognition. Brain Research. 1675, 116-126 (2017).
