Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

השימוש השתלת תא גזע Hematopoietic להעריך את מקורם של התסמונת המיאלודיספלסטית

Published: October 3, 2018 doi: 10.3791/58140
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Genetics Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2LGI Flow Cytometry Core Facility, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

Summary

אנו מתארים את השימוש השתלת תא גזע hematopoietic (HSCT) כדי להעריך את פוטנציאל ממאיר של תאים מהונדסים גנטית hematopoietic. HSCT שימושית לצורך הערכת שונים תאים ממאירים hematopoietic ויוו , כמו גם יצירת קבוצה גדולה של עכברים עם תסמונות myelodysplastic (MDS) או לוקמיה להעריך טיפולים חדשניים.

Abstract

תסמונות Myelodysplastic (MDS) הם קבוצה מגוונת של תא גזע hematopoietic הפרעות המוגדרות על-ידי hematopoiesis לא יעילה, cytopenias דם היקפיים, דיספלסיה, נטייה לשינוי כדי לוקמיה חריפה. העכברים הטרנסגניים NUP98-HOXD13 (NHD13) מסכם את הדברים MDS האנושי במונחים של דם היקפיים cytopenias דיספלזיה, טרנספורמציה כדי לוקמיה חריפה. אנחנו בעבר הראו כי MDS יכול להיות מועבר מן עכבר מהונדסים עם MDS פראי-סוג הנמענים על-ידי משתילים MDS תאים במח העצם nucleated (BMNC). יותר מבין בבירור את התא MDS ממוצא, פותחו גישות להשתיל ספציפי, immunophenotypically מוגדרת hematopoietic קבוצות משנה. במאמר זה, אנו מתארים את תהליך בידוד משתילים אוכלוסיות ספציפיות של גזע hematopoietic, ובתאים. בעקבות ההשתלה, נתאר גישות כדי להעריך את היעילות של השתלת ויכולת ההתמדה של התאים MDS התורם.

Introduction

תסמונות Myelodysplastic (MDS) מייצגים קבוצה מגוונת של הפרעות במחזור הדם המשובטים מאופיין hematopoiesis לא יעילה, ראיות מורפולוגיות של דיספלסיה, נטייה לשינוי לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML)1,2 3, ,4. Hematopoiesis לא יעיל מזוהה כמספר מעצר ההבשלה במח העצם, ותוצאות דם היקפיים cytopenias למרות במקרי מח עצם1,3. השכיחות של MDS הוערך בדרכים שונות כמו 2-12 מקרים לכל 100,000 אנשים מדי שנה בארצות הברית, השכיחות של MDS עולה עם הגיל, שהופך את תנאי חשוב להבין לאור הזדקנות האוכלוסייה בארה ב3, 5. למרות ברוב המקרים של MDS אין אטיולוגיה ברורה, בחלק מהמקרים MDS הם חשבו להיות עקב חשיפה לסוכנים genotoxic ידועים, לרבות ממיסים כמו בנזן, כימותרפיה לסרטן6.

בדרך כלל חולי MDS שרכשו מוטציות בגן התאים MDS7. למרות נדיר יחסית, מספר חולי MDS שרכשו translocations כרומוזומלית מאוזנת המערבים גנים כגון NUP98, EVI1, RUNX1 ו- MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman). המעבדה שלנו יש עניין ארוכת שנים translocations כרומוזום, שכרוכים ג'ין NUP988. העכברים הטרנסגניים כך מפורשת transgene NUP98-HOXD13 (NHD13) מוסדר על ידי האמרגן Vav1, משפר אלמנטים להציג את כל התכונות העיקריות של MDS, כולל cytopenias דם היקפיים, ראיות מורפולוגיות של דיספלסיה, וטרנספורמציה ל AML9 .

למרות MDS זוהו למעלה מ-60 שנה10, נחשבים הפרעה בתאי גזע המשובטים, מאמצים engraft התא האנושי MDS בעכברים immunodeficient לא הצליחו במידה רבה, כי התאים MDS engraft גרוע11, 12,13,14 ו העכברים אינם מפתחים מחלה קלינית. במאמץ לזהות אילו תאים hematopoietic יכול לשדר MDS, אנחנו הפך למודל NHD13, והראה כי אנחנו יכולים engraft MDS כישות המחלה הראה את כל התכונות קרדינל של MDS האנושי, כולל cytopenias דם היקפיים, דיספלסיה, ו טרנספורמציה AML15. בדו ח זה, אנו מציגים את הפרטים הטכניים של ניסויים אלה, כמו גם גישות נוספות fractionate hematopoietic גזע ותאים קודמן (HSPC), בניסיון לזהות תאים ייזום-MDS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

בעלי חיים בהליכים המתוארים במאמר זה אושרו על-ידי המכון הלאומי לסרטן ב Bethesda חיה אכפת והוועדה שימוש ולאחר לציית למדיניות הנכלל מדיניות שירות בריאות הציבור על טיפול אנושי, שימוש של חיות מעבדה, חוק צער בעלי חיים, המדריך עבור טיפול והשתמש של חיות מעבדה.

1. תא הכנה

  1. מח עצם האיסוף nucleated תא (BMNC)
    1. השתמש רק סטרילי חומרים. לחטא כלי שמיש מחדש באמצעות של תא לחץ אדים. לרכוש את מחטי מזרקים, וואר פלסטיק במיכלים סטריליים לשימוש יחיד. ביצוע מניפולציות כל חיה ותא Class II, סוג A2 הקבינט בטיחות ביולוגית.
    2. להכין BMNCs ב mL 14 סיבוב התחתית התחתונה המכיל 3 מ"ל של HF2 (של האנק מאוזנת תמיסת מלח בתוספת 2% סרום שור עוברית).
    3. המתת חסד C57Bl6 בדרך כלל 2-6 חודשים, גיל התורם עכברים (חיובי עבור CD45 אלל CD45.2), באמצעות תא2 CO.
    4. לחטא את הגווייה העכבר ע י ריסוס אתנול 70% על פני הגוף כולו עם בקבוק ספריי. לקלף את העור מן הרגליים, מהאגן עד הקרסול.
    5. הסר את femora ואת tibiae הגווייה באמצעות מספריים סטרילי (ישר, חד/חד, 11.5 ס מ) וחדים (Graefe, משונן, עצה 0.8 מ מ רוחב). חתוך את השרירים המחוברים באופן ברור.
    6. חותכים את הקצוות לקרע, בשוקיים עם המספריים. מחזיקים בשוקיים עם מלקחיים, הכנס מזרק 27-מד 3 מ"ל המכילה 2.5 מ של HF2 לתוך חלל מח הטיביאלי בקצה הדיסטלי של עצם השוקה (קרסול). לרוקן את התאים במח העצם של עצם השוקה באמצעות לחץ עדין לתוך mL 14 סיבוב התחתית התחתונה.
      1. חזור על עצם השוקה אחרים.
    7. חותכים את הקצוות הפרוקסימלית ו דיסטלי של עצם הירך עם מספריים. סומק חלל מח עצם הירך על ידי החדרת מחט 20 גאייג-לצרף מזרק 3 מ"ל המכילה 2.5 מ של HF2 בתוך הסוף דיסטלי של חלל מח עצם הירך והחלת לחץ עדין על המזרק.
      1. חזור על עצם הירך אחרים, איסוף כל מח עצם בשני tibiae, femora ב mL 14 באותו סיבוב התחתית התחתונה.
    8. לפזר את המסה מח על ידי כ רפה בעברית למעלה ולמטה מספר פעמים עם 20 גאייג-באותה המחט מחוברת המזרק 3 מ.
  2. נוגדן מכתים של BMNC
    1. הרוזן BMNC. הוסף 20 µL של פתרון חומצה אצטית 3% µL 20 של ההשעיה BMNC שנוצר בשלב 1.1.8. לאחר מכן, לספור באמצעות hemocytometer של מיקרוסקופ הפוכה.
    2. גלולה של BMNC על ידי צנטריפוגה עדין ב g x 450 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. Resuspend בגדר עם HF2 באמצעות 90 µL לכל 107 תאים ולהוסיף 10 µL של נוגדנים נגד השושלת biotinylated קוקטייל התליה תא.
    3. לאחר המקננת כעשרים דקות ב 4 ° C, לשטוף את התאים ויטראז'ים עם 3 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS).
    4. Resuspend את BMNC עם µL 100 של HF2 לכל 107 תאים. להוסיף 2 µL של allophycocyanin (APC) מצומדת נוגדן אנטי ביוטין כדי התליה תא, ואחריו הדגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    5. לשטוף את BMNC ויטראז'ים עם 3 מ"ל של PBS, resuspend את BMNC עם HF2 בתוספת 0.2 µg/mL של יודיד propidium (PI) עבור מיון תא cytometry זרימה.
  3. Flow cytometry מיון תא של BMNC
    1. כיילו סדרן התא cytometry זרימה. למטב את כל צינורות האופטיקה (PMTs), פיזור ופרמטרים פלורסצנטיות באמצעות תאים וללא רבב ולהגדיר בתוך הטווח. ליניארית של כל גלאי.
    2. להכין וללא רבב, מוכתם PI, APC שכותרתו שושלת התאים קוקטייל במקביל מהשלב 1.2. ניתוח ספקטרלי לפיצוי.
    3. תפלה כפיל תאים על-ידי gating רציפים של FSC-H נגד האס-H, 640-האס-A לעומת 640-האס-H ו- 640-האס-S לעומת 640-האס-וו
    4. הכללת תאים nonviable באמצעות PI נרגש 561 ננומטר, פליטה שנאסף עם מסנן לעבור הלהקה 614/20. לרגש השושלת APC המסומנת תאים על פליטת nm ולאסוף 640 671/30 מסנן.
    5. להקליט פלורסצנטיות ערכים כמו מתח גובה ולאסוף לפחות 100,000 אירועים בקבצי נתונים מצב הרשימה כדי להמחיש את אוכלוסיות ימוין.
    6. חישוב פיצויים ספקטרלי לאחר שרכשה שלוש דוגמאות של 10,000 תאים עבור הגורמים הבאים: ללא תווית תאים PI שכותרתו התאים, נוגדנים נגד השושלת קוקטייל מצומדת עם APC שכותרתו תאים.
    7. להגדיר שלושה אזורים כדי למיין השושלת שלילי (LN), שושלת היוחסין חיובי (LP) עם עוצמת קרינה פלואורסצנטית דים (LP1), והאוכלוסייה LP עם פלורסצנטיות בהיר (LP2) לתוך צינורות 5 מ"ל המכילה 0.5 מיליליטר 10% FBS מדיה.
    8. סוג תאים באמצעות טיפה אחת אופפים ולטהר את מצב הביטול.
    9. מבצע ניתוח מיון פוסט עם תאים סך 1,000 כל מדגם ממוינים כדי לאשר את הטוהר ואת הכדאיות של תאים ממוינים.
    10. איסוף תאים ממוינים על ידי צנטריפוגה-g x 450 עבור 5 דקות ב 4 ° C, resuspend תא גלולה עם 0.5 מ של HF2.
    11. לאשר מספר עם hemocytometer ו- Trypan blue ממוינים התא. התאם מספר תאים עם HF2 עבור השתלת.
      הערה: קשת רחבה של אוכלוסיות BMNC ניתן לבודד עבור השתלת באמצעות שילובים נוספים של נוגדנים fluorochrome מצומדת בשלב 1.2.2 לעיל.

2. הנמען עכברים והכנה השתלת תא גזע Hematopoietic (HSCT)

  1. הכנה של השתלת הנמענים
    1. לשמור על וטרינרי ועל גידול טיפול congenic הנמען עכברים (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) במתקן פתוגן מסוים (SPF) חינם בעלי חיים.
    2. טיהור מניעתי של המסלול במערכת העיכול, מספקים במים סטריליים המכיל 100 מ ג/ליטר של ציפרופלוקסאצין לנמענים עבור 7 ימים לפני מנה קטלנית (9 Gy) הקרנה, לשמור למשך 14 ימים בעקבות הקרנה.
    3. מספקים של הקרנה מנה קטלנית (9 Gy) ממקור מדעי המחשב כדלקמן. השתמש מפעיל מיומן, מוסמך במדעי המחשב. להגדיר את המכשיר מקור Cs לספק 70 cGy/min גמא גופית. מקום 10 עכברים בעל אישית מעוצבת והכנס את המחזיק אל החדר בעוצמה. לספק 9 Gy גופית 13 דקות ולחזור העכברים לכלובים.
  2. השתלת תא גזע hematopoietic
    1. מערבבים פראי סוג (WT) BMNC מ- congenic הנמען עכבר (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) במינון תא של 2 x 105 תאי עכבר עם 2 עד 5 x 104 תאים של הבדיקה מטוהרים ש-BMNC מוכן עם לזרום cytometry מיון כמו שמתואר 1.3 לעיל. מערבבים תאים במזרק אותו.
      הערה: BMNC WT לספק קרינה ממעט-אפקט העכבר הנמען, לאפשר להישרדותה של העכבר הנמען אם התאים הבדיקה אינם תומכים hematopoiesis. BMNC WT השתמשו בסוג זה של הניסוי אקספרס אלל CD45.1, וניתן ובכך מכובד מתאי הבדיקה באמצעות נוגדנים אשר להפלות בין CD45.1 לבין CD45.2. התאים WT מוניטור מכונים "המסייע תאים", "קרינה ממעט תאים" או "המתחרה תאים".
    2. לכוון את עוצמת הקול של התא תערובת כדי µL 200 לכל נמען באמצעות HF2 סטריליות להקלה על הזריקה.
    3. השתלות של תערובות תא ועד לקרינה אולם עכברים נמען באמצעות הזנב תוך ורידי וריד להזרקה באמצעות מזרק 1 מ"ל ואת מחט בקוטר 28, בתוך 24 שעות של הקרנה. מקום זנב העכבר תחת מנורת חימום, כמו חום מוביל אל הזנב התרחבות וריד.
      הערה: המתת חסד כל העכברים הנמען בסוף המחקר ולהעריך את התקדמות המחלה על ידי necropsy, היסטולוגיה cytometry זרימה.

3. engraftment Assay באמצעות Cytometry זרימה

  1. כדי להעריך את התורם תא engraftment, לאסוף דם היקפיים (PB) העכברים הנמען-בשבוע ה-6, בשבוע ה-12, ובשבוע ה-16 לאחר ההשתלה.
  2. לחמם את הנמענים בכלוב עם מנורת החימום עבור 1 דקות והניחו העכבר לתוך restrainer.
  3. לחתוך את וריד הזנב עם איזמל (להב 10, ידית האזמל #3) ולאסוף µL 100 של PB לכל נמען באמצעות צינור microcapillary המכילה EDTA בתור נוגדת קרישה.
  4. לחלק את PB שנאספו aliquots שווה שני על ידי הצבת 50 µL צינור microcentrifuge סטרילי. השתמש aliquot אחד עבור ספירת אוטומטיות דם (CBC) (מתבצעות בתוך ליבת Histopathology NCI) לשימוש נוגדן מכתימה את aliquot השנייה, flow cytometry.
  5. כדי לזהות engraftment התורם cytometry זרימה, lyse בתאי הדם האדומים (RBC) על-ידי הוספת 1 מ"ל של RBC היפוטוניק פירוק מאגר (8.29 g/L של NH4קלרנית, 1 g/L של KHCO3, 0.037 g/L של נה2EDTA, pH 7.2) µL 50 של PB שנאספו. מערבולת הדגימה כדי לערבב דגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. Centrifuge את lysed PB ב 4,600 x g עבור 1.5 מינימלית בקפידה וארוקן את תגובת שיקוע ולמחוק.
  7. חלקית לשבש בגדר תא על-ידי בעדינות הקשה או "מצליף" בתחתית הצינורית. להוסיף מ 1.3 ל- PBS לתוך בגדר הממוקמים צינור צנטריפוגה ב g 4,600 x עבור 1.5 מינימלית בקפידה וביופסיה, להשליך תגובת שיקוע.
  8. לשבש בגדר תא על-ידי הקשה או להכות אותך, וכן להוסיף 200 µL של HF2 בתוספת 5% עכברוש לנסיוב בגדר התא.
  9. מוסיפים נוגדן anti-CD45.2 (1 µL) מצומדת עם allophycocyanin (APC) כדי התליה תא. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס לפחות 30 דקות, בקצרה מערבולת התערובת.
  10. לאחר ההכתמה, לשטוף את התאים פעמיים כמתואר לעיל, resuspend עם µL 400 של HF2 בתוספת 1 µg/mL של פאי.
  11. לאתר את engraftment באמצעות cytometer 4-צבע זרימה. לקבלת מידע נוסף על סוגי תאים בתוך הדם ההיקפיים על-ידי הוספת נוגדנים נוספים כדי לזהות סוגי תאים ספציפיים, כגון B או T לימפוציטים.
  12. רישום נתונים טורי engraftment באמצעות גיליון אלקטרוני כדי לאפשר ניתוח נוסף של נתונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנו מראים דמויות נציג עבור התוצאות של מספר ניסויים. איור 1 מראה של cytometry זרימה נציג מיון הניסוי. במהלך התמיינות hematopoietic נורמלי, כמו התאים להיות מחויבים שושלת hematopoietic ספציפיים, הם רוכשים מגדיר-שושלת היוחסין סמני פני שטח התא, לאבד את פוטנציאל התחדשות עצמית. לכן, בעכברים פראי-סוג, התחדשות עצמית בתאי גזע מוגבל BMNC היוחסין-שלילי. בניסוי זה, אנחנו מיון BMNC ממח העצם NHD13 לתאי שושלת היוחסין-חיובית חיובי וגבוה שושלת היוחסין-שלילי, נמוכה. דייב תאים ואז היו מושתלים לתוך WT הנמענים כדי לקבוע את יכולת התחדשות עצמית.

איור 2 מציג תוצאות של ניסוי נפרדים, אילו היוחסין תאים שלילי או תאי ממוינת מתורמים NHD13 עם MDS היו מושתלים לתוך אולם לקרינה WT נמענים. תאי התורם NHD13 הביע דה מרקר פני שטח התא CD45.2, ואילו תאי המתחרה WT (עיין בסעיף 2.2.1 לעיל) הביע סמן משטח של תאים CD45.1. איור 3 מראה טורי engraftment ניתוח של BMNC NHD13 ממוינת או שלילי השושלת NHD13 BMNC. לאחר כ- 16 שבועות, התאים NHD13 לגבור תאי WT, כפי שהראה את אחוז גדל והולך של CD45.2 + בתאי הדם ההיקפיים. איור 4 מציג דוגמה של טרנספורמציה לוקמיה עכבר מושתלים עם תאים NHD13 MDS.

Figure 1
איור 1: cytometry זרימה מיון אסטרטגיה של BMNC צבעונית עם נוגדן שושלת היוחסין קוקטייל. כל תיבה מלבנית על המגרש נקודה מייצג את האוכלוסייה תא מיינת לשם HSCT להעריך את תפקוד התא. R4, שושלת היוחסין שלילי; R5, שושלת היוחסין נמוך חיובי; R6, שושלת היוחסין גבוהה חיובי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: נציג FACS פרופילים עבור engraftment assay באמצעות נוגדן anti-CD45.2 ספציפי לתורם. BMNC המטופל היה מושתלים עם עונה 1 פרק 106 NHD13 BMNC (CD45.2 +), תאים LNBM המטופל עם מוניטור שלילי של שושלת היוחסין 5 X 104 NHD13 (CD45.2 +). בכל מקרה, 2 x 105 BMNC WT (CD45.1 +) שימשו כתאים המתחרה. המספרים מייצגים תיבות העליונים והתחתונים CD45.2 החיובי (נגזר NHD13 התורם) ואת CD45.2 שלילי (נגזר WT המתחרה תאים), בהתאמה, ב שלאחר השתלת בשבוע 6 ובשבוע 24 שעות ביממה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: Engraftment קינטיקה של נמענים יחידים לאחר ההשתלה. כל שורה על הגרף מראה מבחני engraftment סדרתי עכבר הנמען בודדים. נמענים BMNC היו מושתלים עם עונה 1 פרק 106 תאים של NHD13 BMNC כולו, הנמענים LNBM היו מושתלים עם 5 X 104 של השושלת NHD13 מוניטור שלילי לאחר המיון. NHD מציין NHD13 התורם. מוניטור, עכברים הנמען BMNC; LNBM, שושלת היוחסין שלילי מוניטור הנמען; PBMC, תא mononucleated דם היקפיים. בכל המקרים, תאי התורם NHD13 לגבור בהדרגה את התאים WT. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: צביעת Giemsa מאי-גרונוולד (MGG) של מח העצם (מוניטור) מנמען MDS זה התקדם AML. הערה הנוכחות של פיצוצים רבים וצורות לא בוגר. חיצים מציינים תקיעות, ראשי חצים מצביעות על הטפסים לא בוגר. מקורי 400 X. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות MDS הפרעה בתאי גזע hematopoietic המשובטים, MDS "גזע", או תאים ייזום, לא עוד היה שאפיינו. אנחנו הפגינו בעבר כי MDS ניתן שיפותחו לעכברים WT באמצעות מח העצם של עכברים NHD13 מאת HSCT, המאופיין האנמיה, לויקופניה, נויטרופניה, ראיות מורפולוגיות של דיספלזיה15. בנוסף, מבחני איכלוס תחרותי מזוהה יתרון צמיחה של תאים ממח העצם NHD13 MDS. ממצאים אלה יחדיו, לרמוז קיומו של גזע MDS או תא ייזום. ניסויים נוספים נמצאים כעת בעיצומו, מכוון זיקוק immunophenotypic את המאפיינים של MDS ייזום תא15 באמצעות יותר מוגדרים גזע ו קדמון תא סמנים (CD150, CD48, c-Kit, Sca-1)16 בשילוב עם השושלת סמן מכתים בשיטה המתוארת ב פרוטוקול זה.

זיהוי MDS ייזום תאים באמצעות עכברים NHD13 כרוכה בהליך המיון של cytometry זרימה נרחב. Ex-vivo המניפולציה של BMNCs הראשית ממקם מתח התאים, פוטנציאל והתוצאה היא מוות של תאים או אובדן פונקציונליות. לכן, המאמצים צריכה להיעשות כדי לצמצם את הזמן של ex-vivo מניפולציה כולל הזמן של מיון cytometry זרימה. הבורא ואת הדגם של מכשירים cytometry זרימה, זרימה יחסי משתנים נוספים שעשויים להשפיע על יכולת הקיום תא לאחר המיון. ההליך HSCT דורש תא אינפוזיה דרך כלי הדם. למרות הזרקת וריד הזנב עשוי להיות טכניקה מאתגר יותר מאשר הזרקה רטרו-מסלולית, מניסיוננו, הזרקת וריד הזנב יכול להתבצע במהירות רבה יותר מאשר הזרקת רטרו-מסלולית כפי העכברים הנמענים הם לא מרדימים על הווריד של הזנב זריקות. הגבלת נפח הזרקה (מקסימום 150 µL) הוא בעיה נוספת ברטרו-מסלולית הזרקת17, כמו ריכוז גבוה יותר של התא עשוי להוביל אובדן נוסף של תאים במהלך ההכנה התא, כגון הטיה של תאים על הקיר של מזרקים, מחטים.

למרות ניסויים אלו מתמקדים על המודל NHD13 לרופאים, HSCT מיון של השתלת הגישות המתוארות כאן יכול לשמש עבור כל עכבר מהונדסים גנטית. בנוסף לקביעת מאפייני תאים hematopoietic עצמי המתחדש, גישה זו להשתלות יכול לשמש למטרות אחרות. למשל, אם אחד רצונות לקבל קבוצה גדולה של עכברים עם מח עצם MDS כדי להעריך את היעילות של טיפול עם מולקולה קטנה, עמית גדול (30 + עכברים) יכול להיווצר על ידי משתילים WT עכברים עם MDS BM. לחילופין, האסטרטגיה HSCT יכול להיות הפוך. בניסיון לרפא עכברים של MDS, עכברים NHD13 עם MDS יכול להיות מושתלים עם מוניטור WT, להצלחת ההשתלה יכול להיות במעקב על-ידי הערכת היחס של תאים hematopoietic אקספרס CD45.1 (שמסמן מוניטור WT) בניגוד CD45.2 (שמסמן MDS BM) 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין לנו לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מגזר תוכנית המחקר של המכון הלאומי לסרטן, מכון הבריאות הלאומי (מענק המספרים זיא SC 010378 ו לפנה ס 010983).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14 mL round bottom tube Falcon 352057
Hank's balanced salt solution Lonza 10-527F
Anti-CD45.2 antibody Southern Biotech 1800-15 LOT# A077-T044O
3 mL Syringe Monoject 8881513934
27-G needle BD 305109
20-G needle BD 305176
Lineage Cocktail Miltenyi 130-090-858 LOT# 5170418221
Anti-Biotin antibodies Miltenyi 130-113-288 LOT# 5171109046
1 mL Syringe Excelint 26027 Insulin Syringe
Heating Lamp Thermo Fisher Scientific E70001901
FACS machine Cytec FACScan 2 lasers, 5 color detectors
FACS sorting instrument Beckman Coulter MOFLO ASTRIOS 5 lasers, 23 parameters, 6 population sorting simulteneously
Propidium Iodide Thermo Fisher Scientific P3566
Gamma Irradiator Best Theratronics Gammacell 40
Blood collection tube RAM scientific 76011
Recipient mice Charles River B6-LY5.1/Cr, CD45.1
NUP98-HOXD13 mice n/a C57Bl/6, CD45.2 Colony maintained at NIH
5 mL round bottom tube Falcon 352058

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Corey, S. J., et al. Myelodysplastic syndromes: the complexity of stem-cell diseases. Nature Reviews Cancer. 7 (2), 118-129 (2007).
  2. Garcia-Manero, G. Myelodysplastic syndromes: 2015 Update on diagnosis, risk-stratification and management. American Journal of Hematology. 90 (9), 831-841 (2015).
  3. Heaney, M. L., Golde, D. W. Myelodysplasia. The New England Journal of Medicine. 340 (21), 1649-1660 (1999).
  4. Nimer, S. D. Myelodysplastic syndromes. Blood. 111 (10), 4841-4851 (2008).
  5. Aul, C., Giagounidis, A., Germing, U. Epidemiological features of myelodysplastic syndromes: results from regional cancer surveys and hospital-based statistics. International Journal of Hematology. 73 (4), 405-410 (2001).
  6. Pedersen-Bjergaard, J., Christiansen, D. H., Desta, F., Andersen, M. K. Alternative genetic pathways and cooperating genetic abnormalities in the pathogenesis of therapy-related myelodysplasia and acute myeloid leukemia. Leukemia. 20 (11), 1943-1949 (2006).
  7. Uy, G. L., et al. Dynamic changes in the clonal structure of MDS and AML in response to epigenetic therapy. Leukemia. 31 (4), 872-881 (2017).
  8. Gough, S. M., Slape, C. I., Aplan, P. D. NUP98 gene fusions and hematopoietic malignancies: common themes and new biologic insights. Blood. 118 (24), 6247-6257 (2011).
  9. Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. NUP98-HOXD13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia. Blood. 106 (1), 287-295 (2005).
  10. Block, M., Jacobson, L. O., Bethard, W. F. Preleukemic acute human leukemia. Journal of the American Medical Association. 152 (11), 1018-1028 (1953).
  11. Thanopoulou, E., et al. Engraftment of NOD/SCID-beta2 microglobulin null mice with multilineage neoplastic cells from patients with myelodysplastic syndrome. Blood. 103 (11), 4285-4293 (2004).
  12. Kerbauy, D. M., Lesnikov, V., Torok-Storb, B., Bryant, E., Deeg, H. J. Engraftment of distinct clonal MDS-derived hematopoietic precursors in NOD/SCID-beta2-microglobulin-deficient mice after intramedullary transplantation of hematopoietic and stromal cells. Blood. 104 (7), 2202-2203 (2004).
  13. Benito, A. I., et al. NOD/SCID mice transplanted with marrow from patients with myelodysplastic syndrome (MDS) show long-term propagation of normal but not clonal human precursors. Leukemia Research. 27 (5), 425-436 (2003).
  14. Medyouf, H., et al. Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit. Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).
  15. Chung, Y. J., Choi, C. W., Slape, C., Fry, T., Aplan, P. D. Transplantation of a myelodysplastic syndrome by a long-term repopulating hematopoietic cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14088-14093 (2008).
  16. Pietras, E. M., et al. Functionally Distinct Subsets of Lineage-Biased Multipotent Progenitors Control Blood Production in Normal and Regenerative Conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
  17. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).
  18. Chung, Y. J., Fry, T. J., Aplan, P. D. Myeloablative hematopoietic stem cell transplantation improves survival but is not curative in a pre-clinical model of myelodysplastic syndrome. PLoS One. 12 (9), e0185219 (2017).

Tags

ביולוגיה התפתחותית בעיה 140 תסמונות Myelodysplastic השתלת תא גזע hematopoietic תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון מח העצם NUP98-HOXD13 לוקמיה מיאלואידית חריפה hematopoietic ממאירות
השימוש השתלת תא גזע Hematopoietic להעריך את מקורם של התסמונת המיאלודיספלסטית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chung, Y. J., Khawaja, G., Wolcott,… More

Chung, Y. J., Khawaja, G., Wolcott, K. M., Aplan, P. D. Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome. J. Vis. Exp. (140), e58140, doi:10.3791/58140 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter