Summary
We beschrijven het gebruik van hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) te beoordelen van de kwaadaardige potentieel van genetisch gemanipuleerde hematopoietische cellen. HSCT is handig voor de evaluatie van verschillende kwaadaardige hematopoietische cellen in vivo , alsmede het genereren van een grote cohort van muizen met myelodysplastic syndromes (MDS) of leukemie ter evaluatie van nieuwe therapieën.
Abstract
Myelodysplastic syndromes (MDS) zijn een diverse groep van hematopoietische stamcellen aandoeningen die zijn gedefinieerd door ineffectieve Haematopoiese, perifeer bloed cytopenias dysplasie en een neiging voor transformatie naar acute leukemie. NUP98-HOXD13 (NHD13)-transgene muizen recapituleren menselijke MDS in termen van perifeer bloed cytopenias, dysplasie en transformatie naar acute leukemie. Wij zijn het er eerder blijk gegeven dat MDS kunnen worden overgebracht van een genetisch gemanipuleerde muis met MDS naar wild-type ontvangers door het transplanteren van MDS nucleated beenmergcellen (BMNC). Om meer duidelijk te begrijpen de MDS-cel van oorsprong, hebben we benaderingen transplantatie specifieke, immunophenotypically gedefinieerd hematopoietische deelverzamelingen. In dit artikel beschrijven we het proces van isoleren en verplanten specifieke populaties van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen. Na transplantatie beschrijven we benaderingen om de efficiëntie van transplantatie en persistentie van de cellen van de MDS donor te beoordelen.
Introduction
Myelodysplastic syndromes (MDS) vertegenwoordigen een gevarieerde set van klonen bloed stoornissen, gekenmerkt door ineffectieve Haematopoiese, morfologische bewijs van dysplasie en een neiging voor transformatie naar acute myeloïde leukemie (AML)1,2 ,3,4. Ineffectieve Haematopoiese is erkend als een arrestatie van de rijping in het beenmerg en resultaten in perifeer bloed cytopenias ondanks een hypercellular beenmerg1,3. De incidentie van MDS meermalen heeft geraamd als 2-12 gevallen per 100.000 personen per jaar in de Verenigde Staten, en de incidentie van MDS toeneemt met de leeftijd, waardoor dit een belangrijke voorwaarde om te begrijpen gezien de veroudering van de Amerikaanse bevolking3, 5. Hoewel de meeste gevallen van MDS geen duidelijke etiologie hebben, worden sommige gevallen van MDS verondersteld te wijten aan de blootstelling aan bekende genotoxische agentia, met inbegrip van oplosmiddelen, zoals benzeen, en kanker chemotherapie6.
MDS-patiënten kunnen mutaties in de MDS cellen7meestal hebben verworven. Hoewel relatief zeldzaam, hebben een aantal MDS-patiënten verworven evenwichtige chromosomale translocaties waarbij genen zoals NUP98, EVI1, RUNX1 en MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman). Ons laboratorium heeft een jarenlange interesse in chromosoom translocaties, waarbij de NUP98 gen8. Transgene muizen dat uitdrukkelijk een transgenic NUP98-HOXD13 (NHD13) geregeld door de promotor van de Vav1 en enhancer elementen alle van de belangrijkste functies van MDS, met inbegrip van perifeer bloed cytopenias, morfologische bewijs van dysplasie en transformatie naar AML9 tonen .
Hoewel MDS voor meer dan 60 jaar10zijn bekroond, en worden beschouwd als een stoornis van de cel van de stam van de klonen, inspanningen om de engraft van menselijke MDS cel in immunodeficiëntie muizen geweest grotendeels mislukte, omdat de MDS cellen slecht11, engraft 12,13,14 en de muizen niet klinische ziekte ontwikkelen. In een poging om te identificeren welke hematopoietische cellen kunnen overbrengen MDS, we wendde zich tot het NHD13-model, en toonde dat we MDS als een ziekte-entiteit die alle kardinaal functies van menselijke MDS engraft konden toonde, met inbegrip van perifeer bloed cytopenias, heupdysplasie, en transformatie naar AML15. In dit rapport presenteren we de technische details van deze experimenten, alsmede risicobeheersingsmethoden naar verdere fractionate van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen (HSPC), in een poging om de MDS-initiëren cellen opsporen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dieren in dit artikel beschreven procedures door het National Cancer Institute in Bethesda Animal Care en gebruik Comité zijn goedgekeurd, en voldoen aan het beleid deel uitmaakt van het beleid op volksgezondheidsgebied Service op Humane zorg en gebruik van proefdieren, de Dierenwelzijn Act, en de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.
1. cel voorbereiding
- Oogsten beenmerg genucleëerde cel (BMNC)
- Gebruik alleen steriele materialen. Herbruikbare instrumenten met behulp van een stoom-autoclaaf steriliseren. Aankoop naalden, spuiten, en plastic consumptieaardappelen in steriele recipiënten eenpersoonsgebruik. Alle dieren en cel manipulaties uitvoeren in een klasse II, Type A2 biologische veiligheid kabinet.
- BMNCs bereiden in een 14 mL ronde onderkant buis met 3 mL HF2 (Henks uitgebalanceerd zout oplossing aangevuld met 2% foetale runderserum).
- Euthanaseren C57Bl6 donor muizen (positief voor CD45-allel CD45.2), leeftijd meestal 2-6 maanden, met behulp van een CO2 -kamer.
- Steriliseren de muis karkas in 70% ethanol over het hele lichaam te spuiten met een spray fles. Schil de huid van de benen, uit het bekken naar de enkel.
- Verwijder de dijbenen en tibiae van het karkas met behulp van steriele schaar (rechte, scherp/sharp, 11,5 cm) en pincet (Graefe, gekarteld, 0.8 mm tip breedte). Trim bijgevoegde spieren duidelijk.
- Snij de proximale en distale uiteinden van de tibia met de schaar. Houd het onderbeen met een tang en plaats een 27-gauge 3 mL injectiespuit met 2,5 mL HF2 in de holte van de tibiale beenmerg DISTAAL eind van de tibia (enkel). Spoel de beenmergcellen van de tibia met zachte druk in de 14 mL ronde onderkant buis.
- Herhaal voor de andere tibia.
- Snijd de proximale en distale uiteinden van het dijbeen met een schaar. Flush de dijbeen beenmerg holte door het invoegen van een 20-gauge-naald gekoppeld aan een 3 mL spuit die 2,5 mL HF2 in het distale einde van de dijbeen beenmerg Holte en zachte druk uit te oefenen op de spuit.
- Herhaal voor de andere dijbeen, verzamelen van alle beenmerg van beide tibiae en dijbenen in de dezelfde 14 mL ronde onderkant buis.
- De massa van het beenmerg verspreiden door zuigen op en neer meerdere malen met de dezelfde 20-gauge-naald, gekoppeld aan de 3 mL spuit.
- Antilichaam kleuring van BMNC
- Graaf BMNC. Voeg toe 20 µL van een azijnzuur-oplossing van 3% aan 20 µL van de ophanging van de BMNC gegenereerd in stap 1.1.8. Dan rekenen met behulp van een hemocytometer en een omgekeerde Microscoop.
- De BMNC pellet door zachte centrifugeren bij 450 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet met HF2 met behulp van 90 µL per 107 cellen en voeg 10 µL van biotinyleerd anti-bloedlijn antilichaam cocktail aan de celsuspensie.
- Wassen na incubatie gedurende 20 minuten bij 4 ° C, de gekleurde cellen met 3 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Resuspendeer de BMNC met 100 µL van HF2 per 107 cellen. Voeg 2 µL van allophycocyanin (APC) geconjugeerd anti-Biotine antilichaam aan de celsuspensie, gevolgd door incubatie bij 4 ° C gedurende 20 minuten.
- Spoel de gekleurde BMNC met 3 mL PBS en resuspendeer de BMNC met HF2 aangevuld met 0,2 µg/mL propidium jodide (PI) voor het sorteren van stroom cytometry cel.
- Stroom cytometry cel sorteren van BMNC
- Stroom cytometry cel sorter kalibreren. Optimaliseer alle fotomultiplicator buizen (PMTs), spreidings- en fluorescentie parameters onbevlekt cuvetten en ingesteld binnen het lineaire bereik van elke detector.
- Bereiden onbevlekt, PI-gekleurd en APC Label lineage cocktail cellen parallel geschakeld vanaf stap 1.2. Analyseren spectrale schadevergoeding.
- Doublet cellen discrimineren door sequentiële gating van FSC-H vs. SSC-H 640-WS-A vs. 640-WS-H en 640-WS-S vs. 640-WS-W.
- Nonviable cellen met behulp van PI opgewonden op 561 nm en emissie verzameld met een 614/20 band pass filter uit te sluiten. Excite lineage APC cellen op 640 nm en verzamelen emissie aangeduid met een 671/30 band pass filter.
- Fluorescentie waarden als spanning hoogte registreren en verzamelen van ten minste 100.000 gebeurtenissen in lijst modus gegevensbestanden te visualiseren van de bevolking moeten worden gesorteerd.
- Berekenen van de spectrale compensatie na het verwerven van drie monsters van 10.000 cellen voor het volgende: ongelabelde cellen, PI label cellen en anti-bloedlijn antilichaam cocktail geconjugeerd met APC label cellen.
- Drie regio's te sorteren Lineage negatieve (LN), Lineage positief (LP) met dim fluorescentie intensiteit (LP1) en LP bevolking met heldere fluorescentie (LP2) in 5 mL buisjes met 0,5 mL 10% FBS media instellen
- Soort cellen een één druppel omhullen en zuiveren afbreken modus.
- Post sorteren analyses uitvoeren met 1.000 totaal aantal cellen op elk gesorteerde monster te bevestigen de zuiverheid en de levensvatbaarheid van de gesorteerde cellen.
- Gesorteerde cellen verzamelen door centrifugeren bij 450 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en resuspendeer de pellet van de cel met 0,5 mL HF2.
- Bevestigen gesorteerde cel nummer met hemocytometer en Trypan blauw. Aanpassen van het aantal cellen met HF2 voor transplantatie.
Opmerking: Een breed spectrum van BMNC bevolking kan worden geïsoleerd voor transplantatie met behulp van extra combinaties van fluorescerende-geconjugeerde antilichamen in stap 1.2.2 hierboven.
2. ontvangende muizen voorbereiding en hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT)
- Voorbereiding van transplantatie ontvangers
- Diergeneeskunde en veehouderij verzorging congenisch ontvangende muizen (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) in een specifieke pathogene vrije (SPF) dier faciliteit handhaven.
- Verstrekken van steriel water met 100 mg/L ciprofloxacine naar de geadresseerden voor 7 dagen vóór de letale dosis (9 Gy) bestraling voor profylactische saneren van de gastro-intestinale track, en gedurende 14 dagen na bestraling.
- Bieden een dodelijke dosis (9 Gy) bestraling van een Cs-bron als volgt. Een opgeleide, gecertificeerde Cs-operator gebruiken. Stel het Cs source instrument te leveren 70 cGy/min totale lichaam gamma bestraling. 10 muizen plaats in een speciaal ontworpen houder en de houder aansluit op de irradiator-zaal. Leveren van bestraling van de gehele lichaam 9 Gy in 13 minuten en de muizen terug te keren naar hun kooien.
- Hematopoietische stamceltransplantatie
- Meng wild type (WT) BMNC van een congenisch ontvanger muis (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) in een dosis van de cel van 2 x 10,5 cellen per muis met 2 tot 5 x 104 cellen van gezuiverde detest die BMNC bereid met stroom cytometry sorteren als beschreven in 1.3 hierboven. Meng cellen in dezelfde spuit.
Opmerking: De WT-BMNC bieden een straling sparen-effect aan de ontvangende muis en ondersteuning voor het voortbestaan van de ontvangende muis als de test cellen ondersteunen geen Haematopoiese. De WT-BMNC gebruikt in dit type experiment uitdrukkelijke de CD45.1-allel, en dus kan worden onderscheiden van de cellen van de test met behulp van antilichamen die onderscheid tussen CD45.1 en CD45.2 maken. De WT BM cellen worden aangeduid als "helper cellen", "straling-sparend cellen" of "concurrent cellen". - Stel het volume mengsel cel naar 200 µL per geadresseerde met steriele HF2 voor het vergemakkelijken van de injectie.
- Overplanten de mengsels van de cel aan de dodelijk bestraalde ontvangende muizen via intraveneuze staart veneuze injectie met 1 mL spuit en naald 28-gauge, binnen de 24u van bestraling. Plaats de muis staart onder een warmte lamp, zoals warmte leidt tot staart veneuze dilatatie.
Opmerking: Euthanaseren van alle de ontvangende muizen aan het einde van de studie en de progressie van de ziekte door necropsie, histologie en stroom cytometry te evalueren.
- Meng wild type (WT) BMNC van een congenisch ontvanger muis (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) in een dosis van de cel van 2 x 10,5 cellen per muis met 2 tot 5 x 104 cellen van gezuiverde detest die BMNC bereid met stroom cytometry sorteren als beschreven in 1.3 hierboven. Meng cellen in dezelfde spuit.
3. engraftment-Assay met behulp van Stroom Cytometry
- Verzamelen om te beoordelen donor cel engraftment, perifeer bloed (PB) van de ontvangende muizen op 6de week, 12e week en 16e week na de transplantatie.
- Warm de geadresseerden in de kooi met warmte lamp voor ongeveer 1 minuut en plaats van de muis in een afdekking.
- Snijd de ader van de staart met een scalpel (mes 10, #3 scalpel handvat) en het verzamelen van 100 µL van PB per geadresseerde met een microcapillary-buis met EDTA als een antistollingsmiddel.
- De verzamelde PB in twee gelijke aliquots verdelen door het plaatsen van 50 µL in een steriele microcentrifuge buis. Gebruik één aliquot voor een geautomatiseerde complete blood count (CBC) (uitgevoerd de NCI histopathologie kern) en gebruik het tweede monster voor antilichaam kleuring en stroom cytometry.
- U wilt opsporen donor engraftment door stroom cytometry, lyse de rode bloedcellen (RBC) door toevoeging van 1 mL hypotone RBC lysis-buffermengsel (8.29 g/L van NH4Cl, 1 g/L KHCO3, 0.037 g/L Na2EDTA, pH 7,2) aan 50 µL van de verzamelde PB. Vortex het monster te mengen en laat 10 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
- Centrifugeer het lysed PB bij 4.600 x g voor 1,5 min. zorgvuldig gecombineerd het supernatant en gooi deze weg.
- Gedeeltelijk de cel pellet te verstoren door zachtjes te tikken of "flicking" de onderkant van de buis. Voeg in de pellet 1.3 mL PBS gelegen in buis en centrifugeer bij 4.600 x g gedurende 1,5 min. zorgvuldig aspirate en gooi het supernatant.
- De cel pellet te verstoren door te tikken of flicking, en voeg 200 µL van HF2 aangevuld met 5% rat serum om de cel-pellet.
- Toevoegen van anti-CD45.2 antistof (1 µL) geconjugeerd met allophycocyanin (APC) naar de celsuspensie. Incubeer bij 4 ° C gedurende ten minste 30 minuten, en kort vortex het mengsel.
- Na de kleuring, wassen van de cellen tweemaal zoals hierboven beschreven en resuspendeer met 400 µL van HF2 aangevuld met 1 µg/mL PI.
- Engraftment met behulp van een 4-kleurige stroom cytometer detecteren. Het verkrijgen van aanvullende informatie over de soorten van de cellen in het perifere bloed door toevoeging van extra antilichamen op te sporen specifieke celtypen, zoals B of T-lymfocyten.
- Seriële engraftment gegevens met behulp van een spreadsheet voor verdere analyse van de gegevens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wij tonen de representatieve cijfers voor resultaten van verschillende experimenten. Figuur 1 toont een representatieve stroom cytometry sorteren experiment. Tijdens normale hematopoietische differentiatie, cellen naarmate zet zich in voor een specifieke hematopoietische bloedlijn, ze verwerven lineage-definiëren cel oppervlakte markeringen en verliezen van de mogelijkheden voor zelf-vernieuwing. Daarom, in wild-type muizen, zelf-vernieuwing van stamcellen is beperkt tot lineage-negatieve BMNC. In dit experiment gesorteerd we BMNC van NHD13 het beenmerg in bloedlijn-negatief, lage afkomst positieve en hoge afkomst-positieve cellen. Deze gesorteerd op cellen werden vervolgens in WT geadresseerden om te bepalen van de capaciteit van de zelf-vernieuwing getransplanteerd.
Figuur 2 geeft resultaten van een afzonderlijk experiment, in welke afkomst negatieve cellen of ongesorteerde cellen uit NHD13 donors met MDS in dodelijk bestraalde WT ontvangers waren getransplanteerd. De cellen van de donor NHD13 uitgedrukt de CD45.2 cel oppervlakte marker, overwegende dat de cellen van de concurrent WT de CD45.1 cel oppervlakte marker (zie punt 2.2.1 hierboven) uitgedrukt. Figuur 3 toont seriële engraftment analyse van niet-gesorteerde NHD13 BMNC of afstamming-negatieve NHD13 BMNC. Na ongeveer 16 weken outcompete de NHD13 cellen de WT-cellen, zoals blijkt uit het toenemende aantal CD45.2 + cellen in het perifere bloed. Figuur 4 geeft een voorbeeld van leukemische transformatie van een muis met NHD13 MDS cellen getransplanteerd.
Figuur 1: stroom cytometry sorteren strategie van BMNC gekleurd met lineage antilichaam cocktail. Elke rechthoekige doos op het perceel van de stip vertegenwoordigt de bevolking van de mobiele gesorteerd voor HSCT cel functie moet worden geëvalueerd. R4, lineage negatief; R5, lage afkomst positief zijn; R6, hoge afkomst positief. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: vertegenwoordiger FACS profielen voor engraftment assay met behulp van donor specifieke anti-CD45.2 antistof. BMNC ontvanger was getransplanteerd met 1 X 106 NHD13 BMNC (CD45.2 +) en LNBM ontvanger met 5 X 104 NHD13 lineage negatieve BM cellen (CD45.2 +). In elk geval werden 2 x 105 WT de BMNC (CD45.1 +) gebruikt als concurrent cellen. Getallen in de bovenste en onderste vakken vertegenwoordigen CD45.2 positieve (afgeleid van NHD13 donor) en negatieve CD45.2 (afgeleid van WT concurrent cellen), respectievelijk aan na transplantatie 24 en 6 week. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Engraftment kinetiek van afzonderlijke geadresseerden na de transplantatie. Elke lijn op de grafiek toont seriële engraftment testen van een individuele geadresseerden muis. BMNC ontvangers waren getransplanteerde met 1 X 106 cellen van de hele BMNC NHD13 en LNBM ontvangers waren getransplanteerde met 5 X 10,4 van NHD13 afkomst negatieve BM na sortering. NHD geeft NHD13 donor. BM, BMNC ontvangende muizen; LNBM, lineage negatieve BM afnemer; PBMC, perifere bloedcellen mononucleated. In alle gevallen outcompete de NHD13 donor cellen geleidelijk de WT-cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: mei-Grünwald-Giemsa (MGG) kleuring van het beenmerg (BM) van MDS-ontvanger die stapte over naar de AML. Let op de aanwezigheid van talrijke ontploffingen en onvolwassen vormen. Pijlen geven ontploffing, en pijlpunten geven onvolwassen vormen. Oorspronkelijke 400 X. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MDS weliswaar een stoornis klonale hematopoietische stamcellen, de MDS "stammen" of initiatiefnemende cellen, hebben nog niet gekenmerkt. Wij eerder aangetoond dat MDS kunt transplanteerbaar aan WT muizen met behulp van het beenmerg van NHD13 muizen door HSCT, gekenmerkt door macrocytische anemie, leukopenie, neutropenie en morfologische bewijs van dysplasie15. Bovendien, concurrerende herbevolking tests geïdentificeerd een voordeel van de groei van cellen uit het beenmerg van NHD13 MDS. Deze bevindingen impliceert tezamen, het bestaan van een stam van de MDS of de initiatiefnemende cel. Extra experimenten zijn nu aan de gang, gericht op het verfijnen van de immunophenotypic kenmerken van een inleiding van de MDS cel15 met meer gedefinieerde stuurpen en progenitor cel markeringen (CD150, CD48, c-Kit en Sca-1)16 gecombineerd met de afkomst marker kleuring in dit protocol beschreven methode.
Identificeren van MDS werkt initiëren van cellen met behulp van NHD13 muizen uitgebreide stroom cytometry sorteren. De ex vivo manipulatie van primaire BMNCs plaatst stress op de cellen, mogelijk resulterend in celdood of functioneel verlies. Daarom moet worden gestreefd naar het verminderen van de tijd van ex vivo manipulatie met inbegrip van de tijd van stroom cytometry sorteren. De maker en het model van stroom cytometry instrumenten en flow dynamics zijn aanvullende variabelen die levensvatbaarheid van de cellen na sortering kunnen beïnvloeden. De HSCT procedure moet cel infusie via een bloedvat. Hoewel staart veneuze injectie een meer uitdagende techniek dan retro-orbitaal injectie, in onze ervaring wellicht, kan staart veneuze injectie sneller dan retro-orbitaal injectie worden uitgevoerd, zoals de ontvangende muizen zijn niet verdoofd voor de staart ader injecties. Beperking van de geïnjecteerde volume (maximaal 150 µL) is een andere kwestie in retro-orbitaal injectie17, omdat een hogere concentratie van de cel tot extra verlies van cellen in de loop van cel voorbereiding leiden kan, zoals het scheren van cellen op de muur van spuiten en naalden.
Hoewel deze experimenten zijn gericht op het NHD13-model voor MDS, kunnen de HSCT sorteren en transplantatie benaderingen die hier beschreven worden gebruikt voor alle genetisch gemanipuleerde muis. Naast het bepalen van de kenmerken van zichzelf vernieuwende hematopoietische cellen, kan deze transplantatie benadering worden gebruikt voor andere doeleinden. Bijvoorbeeld, indien men wenst te verkrijgen een grote cohort van muizen met MDS beenmerg om te beoordelen van de effectiviteit van behandeling met een klein molecuul, een grote cohort (30 + muizen) kan worden gegenereerd door het transplanteren van WT muizen met MDS BM. als alternatief, de HSCT strategie kan worden teruggedraaid. In een poging om te genezen van muizen van MDS, NHD13 muizen met MDS kunnen worden getransplanteerd met WT BM en het succes van de transplantatie kan worden gecontroleerd door de beoordeling van het aandeel van hematopoietische cellen die uitdrukking geven aan CD45.1 (die markeert WT BM) in tegenstelling tot CD45.2 (die markeert MDS BM) 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de intramurale programma van het onderzoek van het National Cancer Institute, National Institutes of Health (verlenen nummers ZIA SC 010378 en BC 010983).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL round bottom tube | Falcon | 352057 | |
| Hank's balanced salt solution | Lonza | 10-527F | |
| Anti-CD45.2 antibody | Southern Biotech | 1800-15 | LOT# A077-T044O |
| 3 mL Syringe | Monoject | 8881513934 | |
| 27-G needle | BD | 305109 | |
| 20-G needle | BD | 305176 | |
| Lineage Cocktail | Miltenyi | 130-090-858 | LOT# 5170418221 |
| Anti-Biotin antibodies | Miltenyi | 130-113-288 | LOT# 5171109046 |
| 1 mL Syringe | Excelint | 26027 | Insulin Syringe |
| Heating Lamp | Thermo Fisher Scientific | E70001901 | |
| FACS machine | Cytec | FACScan | 2 lasers, 5 color detectors |
| FACS sorting instrument | Beckman Coulter | MOFLO ASTRIOS | 5 lasers, 23 parameters, 6 population sorting simulteneously |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Gamma Irradiator | Best Theratronics | Gammacell 40 | |
| Blood collection tube | RAM scientific | 76011 | |
| Recipient mice | Charles River | B6-LY5.1/Cr, CD45.1 | |
| NUP98-HOXD13 mice | n/a | C57Bl/6, CD45.2 | Colony maintained at NIH |
| 5 mL round bottom tube | Falcon | 352058 |
References
- Corey, S. J., et al. Myelodysplastic syndromes: the complexity of stem-cell diseases. Nature Reviews Cancer. 7 (2), 118-129 (2007).
- Garcia-Manero, G. Myelodysplastic syndromes: 2015 Update on diagnosis, risk-stratification and management. American Journal of Hematology. 90 (9), 831-841 (2015).
- Heaney, M. L., Golde, D. W. Myelodysplasia. The New England Journal of Medicine. 340 (21), 1649-1660 (1999).
- Nimer, S. D. Myelodysplastic syndromes. Blood. 111 (10), 4841-4851 (2008).
- Aul, C., Giagounidis, A., Germing, U. Epidemiological features of myelodysplastic syndromes: results from regional cancer surveys and hospital-based statistics. International Journal of Hematology. 73 (4), 405-410 (2001).
- Pedersen-Bjergaard, J., Christiansen, D. H., Desta, F., Andersen, M. K. Alternative genetic pathways and cooperating genetic abnormalities in the pathogenesis of therapy-related myelodysplasia and acute myeloid leukemia. Leukemia. 20 (11), 1943-1949 (2006).
- Uy, G. L., et al. Dynamic changes in the clonal structure of MDS and AML in response to epigenetic therapy. Leukemia. 31 (4), 872-881 (2017).
- Gough, S. M., Slape, C. I., Aplan, P. D. NUP98 gene fusions and hematopoietic malignancies: common themes and new biologic insights. Blood. 118 (24), 6247-6257 (2011).
- Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. NUP98-HOXD13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia. Blood. 106 (1), 287-295 (2005).
- Block, M., Jacobson, L. O., Bethard, W. F. Preleukemic acute human leukemia. Journal of the American Medical Association. 152 (11), 1018-1028 (1953).
- Thanopoulou, E., et al. Engraftment of NOD/SCID-beta2 microglobulin null mice with multilineage neoplastic cells from patients with myelodysplastic syndrome. Blood. 103 (11), 4285-4293 (2004).
- Kerbauy, D. M., Lesnikov, V., Torok-Storb, B., Bryant, E., Deeg, H. J. Engraftment of distinct clonal MDS-derived hematopoietic precursors in NOD/SCID-beta2-microglobulin-deficient mice after intramedullary transplantation of hematopoietic and stromal cells. Blood. 104 (7), 2202-2203 (2004).
- Benito, A. I., et al. NOD/SCID mice transplanted with marrow from patients with myelodysplastic syndrome (MDS) show long-term propagation of normal but not clonal human precursors. Leukemia Research. 27 (5), 425-436 (2003).
- Medyouf, H., et al. Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit. Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).
- Chung, Y. J., Choi, C. W., Slape, C., Fry, T., Aplan, P. D. Transplantation of a myelodysplastic syndrome by a long-term repopulating hematopoietic cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14088-14093 (2008).
- Pietras, E. M., et al. Functionally Distinct Subsets of Lineage-Biased Multipotent Progenitors Control Blood Production in Normal and Regenerative Conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Chung, Y. J., Fry, T. J., Aplan, P. D. Myeloablative hematopoietic stem cell transplantation improves survival but is not curative in a pre-clinical model of myelodysplastic syndrome. PLoS One. 12 (9), e0185219 (2017).
