Summary
Les auteurs décrivent l’utilisation de greffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) pour évaluer le potentiel maligne de cellules hématopoïétiques génétiquement. TCSH est utile pour évaluer les diverses cellules hématopoïétiques malignes in vivo comme générant une grande cohorte de souris atteintes de leucémie ou de syndromes myélodysplasiques (SMD) afin d’évaluer de nouveaux traitements.
Abstract
Syndromes myélodysplasiques (SMD) forment un groupe diversifié de troubles de cellules souches hématopoïétiques qui sont définies par l’hématopoïèse inefficace, sang périphérique cytopénies, dysplasie et une propension à la transformation en leucémie aiguë. NUP98-HOXD13 (NHD13) de souris transgéniques récapitulent MDS humaine en termes de sang périphérique cytopénies, dysplasie et transformation en leucémie aiguë. Nous avons démontré précédemment que MDS pouvaient être transférés d’une souris génétiquement modifiée avec MDS aux destinataires sauvage par la transplantation de cellules de la moelle osseuse nucléée MDS (BMNC). Pour mieux comprendre la cellule MDS d’origine, nous avons développé des approches spécifiques de transplantation, immunophenotypically défini sous-ensembles hématopoïétiques. Dans cet article, nous décrivons le processus d’isolement et le repiquage des populations spécifiques de souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices. Après transplantation, nous décrivons les approches pour évaluer l’efficacité de la transplantation et la persistance des cellules donneur MDS.
Introduction
Syndromes myélodysplasiques (SMD) représentent un ensemble diversifié de clonale hémopathie caractérisée par l’hématopoïèse inefficace, les preuves morphologiques de la dysplasie et une propension à la transformation de la leucémie myéloïde aiguë (AML)1,2 ,3,4. Hématopoïèse inefficace est reconnu comme un arrêt de la maturation dans la moelle osseuse et les résultats dans le sang périphérique des cytopénies malgré une hypercellulaire moelle1,3. L’incidence du MDS a été diversement estimée comme 2-12 cas pour 100 000 personnes chaque année aux Etats-Unis, et l’incidence de la MDS augmente avec l’âge, ce qui en fait une condition importante à comprendre étant donné le vieillissement de la population des États-Unis3, 5. Bien que la plupart des cas de MDS n’ont aucune étiologie clair, certains cas de MDS sont censés être en raison de l’exposition à des agents génotoxiques connues, y compris les solvants comme le benzène et le cancer chimiothérapie6.
Les patients MDS en général ont acquis des mutations dans les cellules de SDM7. Bien que relativement rare, un certain nombre de patients de SDM ont acquis équilibrée des translocations chromosomiques impliquant des gènes tels que NUP98, EVI1, RUNX1 et MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman). Notre laboratoire s’intéresse depuis longtemps à des translocations chromosomiques, qui impliquent la de gène NUP988. Souris transgéniques qu’exprimer un transgène NUP98-HOXD13 (NHD13) réglementés par le promoteur Vav1 et éléments activateurs affichent toutes les fonctionnalités clées de SDM, y compris les cytopénies périphériques de sang, des preuves morphologiques de dysplasie et transformation d’AML9 .
Bien que MDS ont été reconnus pour les plus de 60 ans10et sont considérés comme une maladie clonale de cellules souches, efforts pour greffer des cellules humaines de MDS dans des souris immunodéficientes ont été en grande partie échoués, parce que les cellules MDS greffer mal11, 12,13,14 et les souris ne développent pas la maladie clinique. Dans le but d’identifier les cellules hématopoïétiques peuvent transmettre MDS, nous s’est tourné vers le modèle de NHD13 et a montré que nous pourrions greffer SDM comme une entité pathologique qui a montré toutes les fonctionnalités de cardinales de MDS humaine, y compris le sang périphérique cytopénies, dysplasie, et transformation d’AML15. Dans ce rapport, nous présentons les détails techniques de ces expériences, mais aussi des approches de fractionner davantage les souches hématopoïétiques et cellules précurseurs (CSPH), dans un effort pour identifier les cellules qui lance MDS.
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Protocol
Les procédures animaux décrits dans cet article ont été approuvés par le National Cancer Institute à Bethesda animalier et le Comité de l’emploi et sont conformes aux politiques contenues dans la politique de Service de santé publique sur la santé humaine et de Use of Laboratory Animals, le Loi sur le bien-être des animaux et le Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
1. préparation de la cellule
- Récolte cellules nucléées de moelle osseuse (BMNC)
- Utilisez uniquement des matériaux stériles. Stérilisation des instruments réutilisables à l’aide d’un autoclave à vapeur. Acheter des aiguilles, des seringues et vaisselle en plastique dans des contenants stériles à usage unique. Effectuer toutes les manipulations animales et cellulaires en classe II, Type A2 enceinte de sécurité biologique.
- Préparer les BMNCs dans un rond tube inférieur contenant 3 mL de HF2 de 14 mL (Hank équilibré de solution saline additionnée de sérum de veau fœtal 2 %).
- Euthanasier C57Bl6 souris donneur (positifs pour CD45 allèle CD45.2), l’âge généralement de 2 à 6 mois, à l’aide d’une chambre de CO2 .
- Stérilisez la carcasse de la souris en pulvérisant de l’éthanol à 70 % sur tout le corps avec un vaporisateur. Peler la peau des pieds, du bassin jusqu'à la cheville.
- Retirez les fémurs et les tibias de la carcasse à l’aide de ciseaux stériles (droite, pointue/pointue, 11.5 cm) et forceps (Graefe, dentelé, largeur de pointe 0,8 mm). Couper les muscles attenants clairement.
- Couper les extrémités proximales et distales du tibia avec les ciseaux. Tenant le tibia avec une pince, insérez une seringue de 3 mL de calibre 27 contenant 2,5 mL de HF2 dans la cavité de moelle osseuse tibiale à l’extrémité distale du tibia (cheville). Rincer les cellules de la moelle osseuse du tibia à l’aide d’une légère pression dans le rond bas tube de 14 mL.
- Répéter pour l’autre tibia.
- Couper les extrémités proximales et distales du fémur avec des ciseaux. Rincer la cavité de moelle osseuse du fémur en insérant une aiguille de calibre 20 attaché à une seringue de 3 mL contenant 2,5 mL de HF2 dans l’extrémité distale de la cavité de moelle osseuse du fémur et exerçant une pression modérée sur la seringue.
- Répétez pour l’autre fémur, percevoir toute la moelle osseuse des deux tibias et fémurs dans le même 14 mL rond tube inférieur.
- Disperser la masse de la moelle osseuse en aspirant de haut en bas plusieurs fois avec la même aiguille de calibre 20, attachée à la seringue de 3 mL.
- Souillure de BMNC anticorps
- Comte BMNC. Ajouter 20 µL d’une solution d’acide acétique 3 % à 20 µL de la suspension BMNC générée à l’étape 1.1.8. Ensuite, compter à l’aide d’un hémocytomètre et un microscope inversé.
- Granule le BMNC par centrifugation douce à 450 x g pendant 5 min à 4 ° C. Resuspendre le culot avec HF2 chaque 107 cellules avec 90 µL et 10 µL de biotinylé anti-lignée cocktail s’ajoute la suspension cellulaire.
- Après incubation pendant 20 min à 4 ° C, laver les cellules colorées avec 3 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Resuspendre le BMNC avec 100 µL de HF2 par 107 cellules. Ajouter 2 µL d’allophycocyanin (APC) conjugués d’anticorps anti-biotine de la suspension cellulaire, suivie d’une incubation à 4 ° C pendant 20 min.
- Rincez le BMNC teinté avec 3 mL de PBS et remettre en suspension le BMNC avec HF2 additionné de 0,2 µg/mL d’iodure de propidium (PI) pour écoulement cytometry cellule Tri.
- Flow cytometry cellule Tri des BMNC
- Calibrer le trieur de cellules de cytométrie en flux. Optimiser tous les tubes photomultiplicateurs (PMT), nuages de points XY et paramètres de fluorescence à l’aide de cellules colorées ou non et la valeur dans la gamme linéaire de chaque détecteur.
- Préparer sans coloration, coloration PI et APC libellé lignée cocktails cellules en parallèle à l’étape 1.2. Analyse spectrale indemnisation.
- Cellules de doublet de discrimination par déclenchement séquentiel de FSC-H vs ASC-H, 640-SSC-A vs 640-SSC-H et SSC-640-S vs 640-SSC-W.
- Exclure les cellules non viables à l’aide de PI excité à 561 nm et d’émission recueillies avec un filtre passe bande 614/20. Exciter la lignée APC étiqueté à 640 emission nm et de recueillir les cellules avec un filtre passe bande 671/30.
- Enregistrer les valeurs de fluorescence comme hauteur de tension et recueillir au moins 100 000 événements dans les fichiers de données de mode de liste pour visualiser les populations à trier.
- Calculer les compensations spectrale après l’acquisition de trois échantillons de 10 000 cellules ce qui suit : non cellules PI étiquetés cellules et cocktail d’anticorps anti-lignée conjugué avec APC étiqueté des cellules.
- Set de trois régions pour trier lignée négative (LN), lignée positive (LP) avec l’intensité de la fluorescence dim (LP1) et de la population de LP avec fluorescence brillante (LP2) dans des tubes de 5 mL contenant 0,5 mL de médias FBS de 10 %.
- Cellules de tri à l’aide d’une goutte d’eau un enveloppent et purifient abort mode.
- Effectuer une analyse de type post avec 1 000 cellules totales sur chaque échantillon trié pour confirmer la pureté et la viabilité des cellules triées.
- Prélever des cellules triées par centrifugation à 450 x g pendant 5 min à 4 ° C et Resuspendre le culot cellulaire avec 0,5 mL de HF2.
- Confirmer trié cellule numéro hémocytomètre et le bleu Trypan. Ajuster le nombre de cellules avec HF2 destinés à la transplantation.
Remarque : Un large éventail de populations BMNC peut être isolé à la transplantation à l’aide de combinaisons supplémentaires d’anticorps fluorochrome-conjuguées dans temps 1.2.2 ci-dessus.
2. destinataire souris préparation et Transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH)
- Préparation des receveurs
- Maintenir les vétérinaires et élevage soin souris bénéficiaires congéniques (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) dans une usine animale (SPF) sans agent pathogène spécifique.
- Pour décontaminer les prophylactique de la voie gastro-intestinale, fournir de l’eau stérile contenant 100 mg/L de la ciprofloxacine aux bénéficiaires pendant 7 jours avant l’irradiation de la dose létale (9 Gy) et maintenir pendant 14 jours après l’irradiation.
- Fournir une irradiation de la dose létale (9 Gy) provenant d’une source de Cs comme suit. Utiliser un opérateur formé et certifié de Cs. Valeur de l’instrument de source Cs pour livrer 70 irradiation gamma corporelle totale de cGy/min. Placer 10 souris dans un support conçu et insérez le support dans la chambre de l’irradiateur. Livrer 9 irradiation corporelle totale de Gy en 13 min et retourner les souris de leur cage.
- Cellules souches hématopoïétiques
- Mélanger le type sauvage (WT) BMNC d’une souris congéniques destinataire (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) à la dose de cellules de cellules de 2 x 105 / souris avec 2 à 5 x 104 cellules du test purifié que BMNC préparé avec écoulement cytometry tri comme décrit dans 1.3 ci-dessus. Mélanger les cellules dans la même seringue.
Remarque : Le BMNC WT fournissent un épargnant-effet de rayonnement à la souris destinataire et permettre la survie de souris bénéficiaire si les hématies-tests ne supportent pas l’hématopoïèse. Le WT BMNC utilisés dans ce type d’expérience express l’allèle CD45.1 et ainsi peuvent être distinguée des cellules test utilisant des anticorps qui discrimine entre CD45.1 et CD45.2. Les cellules WT BM sont appelés « cellules d’assistance », « cellules de rayonnement d’épargne » ou « cellules concurrent ». - Ajuster le volume de mélange de cellule à 200 µL par destinataire utilisant HF2 stérile pour faciliter l’injection.
- Transplanter des mélanges de cellules à la mortellement irradiés souris destinataire via intraveineuse queue injection dans la veine à l’aide d’une seringue de 1 mL et une aiguille de calibre 28, moins de 24 h de l’irradiation. Placer la queue de la souris sous une lampe chauffante, comme chaleur mène à la queue des veines dilatées.
NOTE : Euthanasier toutes les souris bénéficiaires à la fin de l’étude et d’évaluer la progression de la maladie par l’autopsie, histologie et cytométrie en flux.
- Mélanger le type sauvage (WT) BMNC d’une souris congéniques destinataire (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) à la dose de cellules de cellules de 2 x 105 / souris avec 2 à 5 x 104 cellules du test purifié que BMNC préparé avec écoulement cytometry tri comme décrit dans 1.3 ci-dessus. Mélanger les cellules dans la même seringue.
3. greffe dosage utilisant l’écoulement Cytometry
- Pour évaluer la greffe de cellules de donneur, recueillir du sang périphérique (PB) des souris bénéficiaires au 6e, 12e semaine et 16 semaines après la transplantation.
- Réchauffer les destinataires dans la cage avec lampe chauffante pendant environ 1 min et placez la souris sur une drisse.
- Couper la veine caudale avec un scalpel (lame 10, manche de bistouri #3) et prélever 100 µL de PB par destinataire à l’aide d’un tube microcapillaire contenant de l’EDTA comme anticoagulant.
- Diviser le PB recueillie en deux portions égales en plaçant 50 µL dans un tube stérile microcentrifugeuse. Utiliser une aliquote pour une numération formule sanguine complète automatisée (CBC) (effectuée à la base de l’histopathologie de NCI) et utiliser la deuxième portion d’anticorps et cytométrie en flux.
- Pour détecter la prise de greffe de donneur par cytométrie en flux, lyser les globules rouges (RBC) en ajoutant 1 mL de tampon de lyse hypotonique RBC (8,29 g/L de NH4Cl, 1 g/L de KHCO3, 0,037 g/L de Na2EDTA, pH 7,2) à 50 µL de la PB collectée. Vortex de l’échantillon à mélanger et incuber 10 min à température ambiante.
- Centrifuger le PB lysé à 4 600 x g pour 1,5 min. doucement aspirer le surnageant et jetez-le.
- Partiellement perturber le culot cellulaire en douceur touchant ou « pichenette » le fond du tube. Ajouter 1,3 mL de PBS dans le culot est situé dans le tube et centrifuger à 4 600 x g pendant 1,5 min, soigneusement aspirer et jeter le surnageant.
- Perturber le culot cellulaire en touchant ou en effleurant et ajouter 200 µL de HF2 additionnée de 5 % de sérum de rat au culot cellulaire.
- Ajouter des anticorps anti-CD45.2 (1 µL) avec allophycocyanin (APC) à la suspension cellulaire. Incuber à 4 ° C pendant au moins 30 min et brièvement vortex le mélange.
- Après la coloration, laver les cellules deux fois comme décrit ci-dessus et remettre en suspension avec 400 µL du HF2 additionné de 1 µg/mL de PI.
- Détecter la prise de greffe à l’aide d’un cytomètre en flux de 4 couleurs. Obtenir des informations supplémentaires sur les types de cellules dans le sang périphérique en ajoutant d’autres anticorps pour détecter les types de cellules spécifiques, telles que les lymphocytes B ou T.
- Enregistrer des données de série prise de greffe à l’aide d’un tableur pour permettre une analyse plus approfondie des données.
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Representative Results
Nous montrons des chiffres représentatifs des résultats de plusieurs expériences. La figure 1 montre une cytométrie de flux représentant tri experiment. Au cours de la différenciation hématopoïétique normale, comme cellules de sont engager à une lignée hématopoïétique spécifique, ils acquièrent des marqueurs définissant le lignage de surface cellulaire et perdent le potentiel de l’auto-renouvellement. Par conséquent, chez les souris de type sauvage, autorenouvellement des cellules souches se limite aux BMNC lignée négatif. Dans cette expérience, nous avons trié BMNC de NHD13 la moelle osseuse en cellules de lignée positive positive et haute lignée lignée négatif, faible. Ce tri des cellules ont été ensuite transplantées dans destinataires WT pour déterminer la capacité d’autorenouvellement.
La figure 2 montre les résultats d’une expérience distincte, dans quelle lignée cellules négatives ou des cellules non triées de NHD13 donneurs atteints de SMD ont été transplantées dans mortellement irradiés bénéficiaires WT. Les cellules du donneur NHD13 expriment le marqueur de surface de cellules CD45.2, alors que les cellules de concurrent WT (voir la section 2.2.1 ci-dessus) a exprimé le marqueur de surface de cellules CD45.1. La figure 3 montre analyse série greffe de Lees NHD13 BMNC soit négatif lignée NHD13 BMNC. Après environ 16 semaines, les cellules NHD13 supplanter les cellules WT, comme en témoigne le nombre croissant de cellules CD45.2 + dans le sang périphérique. Figure 4 montre un exemple de transformation leucémique d’une souris transplantée avec des cellules NHD13 MDS.
Figure 1 : cytométrie tri stratégie de BMNC colorées avec les anticorps de la lignée cocktail. Chaque boîte rectangulaire sur le terrain point représente la population des cellules triée pour tcsh évaluer la fonction des cellules. R4, lignée négative ; R5, basse lignée positive ; R6, positif de haute lignée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : profils de FACS représentatif pour l’analyse de la prise de greffe à l’aide d’anticorps anti-CD45.2 spécifique de donateurs. Bénéficiaire BMNC a été transplanté avec 1 X 106 NHD13 BMNC (CD45.2 +) et récipiendaire de la LNBM avec 5 X 104 NHD13 lignée négative BM cellules (CD45.2 +). Dans chaque cas, 2 x 105 WT BMNC (CD45.1 +) servaient de cellules concurrent. Le nombre dans le positif CD45.2 représentent les zones supérieure et inférieure (dérivé de NHD13 donneur) et CD45.2 négatif (dérivé de cellules concurrent WT), respectivement, 6 et 24 semaines après la transplantation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : cinétique de la prise de greffe de destinataires individuels après la transplantation. Chaque ligne du graphique montre des essais de série prise de greffe d’une souris de destinataires individuelle. Destinataires BMNC ont été transplantées avec 1 X 106 cellules de NHD13 BMNC ensemble et bénéficiaires LNBM ont été transplantées avec 5 X 104 de NHD13 lignée BM négatif après le tri. NHD indique NHD13 donneur. BM, BMNC destinataires souris ; LNBM, receveur de BM négatif lignée ; PBMC, cellules mononuclées du sang périphérique. Dans tous les cas, les cellules du donneur NHD13 supplanter progressivement les cellules WT. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : May-Grünwald Giemsa (MGG) souillure de moelle osseuse (BM) du destinataire MDS qui a progressé à AML. Noter la présence de nombreuses explosions et les formes immatures. Les flèches indiquent les explosions, et pointes de flèches indiquent les formes immatures. Original 400 X. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Bien que MDS sont une maladie clonale de cellules souches hématopoïétiques, le MDS « stem », ou initiatrice des cellules, n’ont pas encore été caractérisées. Nous avons démontré précédemment que SDM peut être transplantables à souris WT à l’aide de la moelle osseuse de souris NHD13 par tcsh, caractérisée par une anémie macrocytaire, leucopénie, neutropénie et des preuves morphologiques de dysplasie15. En outre, des essais de repeuplement concurrentiel identifié un avantage de croissance des cellules de la moelle osseuse de NHD13 MDS. Pris ensemble, ces résultats impliquent l’existence d’une tige de SDM ou cellule initiatrice. Des expériences additionnelles sont maintenant en cours, visant à raffiner les immunophénotypiques caractéristiques d’un MDS initier cellulaire15 marqueurs plus défini souches et progénitrices cellulaire (CD150, CD48, c-Kit et Sca-1)16 combiné avec la lignée marqueur de coloration méthode décrite dans le présent protocole.
Identifiant MDS initiant des cellules à l’aide de la souris NHD13 implique la procédure tri de cytométrie en flux vaste. La manipulation ex vivo de BMNCs primaires met l’accent sur les cellules, pouvant provoquer la mort cellulaire ou une perte fonctionnelle. Par conséquent, devraient s’efforcer de réduire le temps de manipulation d’ex vivo y compris le temps d’écoulement cytometry tri. Le fabricant et le modèle d’écoulement cytometry instruments et dynamique de l’écoulement sont des variables supplémentaires qui peuvent affecter la viabilité des cellules après le tri. La procédure de tcsh nécessite infusion de cellule dans un vaisseau sanguin. Bien que l’injection dans la veine queue peut être une technique plus difficile que l’injection rétro-orbitaire, selon notre expérience, queue injection dans la veine peut être effectuée plus rapidement que l’injection rétro-orbitaire, car les souris bénéficiaires ne sont pas anesthésiés pour la veine caudale injections. Limitation du volume d’injection (maximum 150 µL) est un autre problème dans l’injection rétro-orbitaire17, car une concentration plus élevée de la cellule pourrait conduire à une perte supplémentaire de cellules dans le cadre de la préparation de cellules, telles que la tonte des cellules sur la paroi des seringues et aiguilles.
Bien que ces expériences sont concentrent sur le modèle de NHD13 pour les DMS, les approches de tri et greffe de CSH décrites ici peuvent être utilisés pour une souris génétiquement modifiée. En plus de déterminer les caractéristiques de l’autorenouvellement des cellules hématopoïétiques, cette approche de la greffe peut être utilisée à d’autres fins. Par exemple, si l'on veut obtenir une grande cohorte des souris avec moelle osseuse MDS pour évaluer l’efficacité du traitement avec une petite molécule, une vaste cohorte (30 + souris) peut être générée en transplantant des souris WT avec MDS BM. alternativement, la stratégie de CSH peut être inversée. Pour tenter de guérir les souris de MDS, souris NHD13 avec MDS peuvent être transplantés avec WT BM, et le succès de la greffe peut être surveillé en évaluant la proportion de cellules hématopoïétiques qui expriment des CD45.1 (qui marque WT BM) par opposition à CD45.2 (qui marque BM MDS) 18.
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Disclosures
Nous n’avons rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros du National Cancer Institute, National Institutes of Health (numéros ZIA SC 010378 et BC 010983 de subventions).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL round bottom tube | Falcon | 352057 | |
| Hank's balanced salt solution | Lonza | 10-527F | |
| Anti-CD45.2 antibody | Southern Biotech | 1800-15 | LOT# A077-T044O |
| 3 mL Syringe | Monoject | 8881513934 | |
| 27-G needle | BD | 305109 | |
| 20-G needle | BD | 305176 | |
| Lineage Cocktail | Miltenyi | 130-090-858 | LOT# 5170418221 |
| Anti-Biotin antibodies | Miltenyi | 130-113-288 | LOT# 5171109046 |
| 1 mL Syringe | Excelint | 26027 | Insulin Syringe |
| Heating Lamp | Thermo Fisher Scientific | E70001901 | |
| FACS machine | Cytec | FACScan | 2 lasers, 5 color detectors |
| FACS sorting instrument | Beckman Coulter | MOFLO ASTRIOS | 5 lasers, 23 parameters, 6 population sorting simulteneously |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Gamma Irradiator | Best Theratronics | Gammacell 40 | |
| Blood collection tube | RAM scientific | 76011 | |
| Recipient mice | Charles River | B6-LY5.1/Cr, CD45.1 | |
| NUP98-HOXD13 mice | n/a | C57Bl/6, CD45.2 | Colony maintained at NIH |
| 5 mL round bottom tube | Falcon | 352058 |
References
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