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Developmental Biology

Myelodysplastic सिंड्रोम की उत्पत्ति का आकलन करने के लिए टेम स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण का उपयोग

Published: October 3, 2018 doi: 10.3791/58140
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Genetics Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2LGI Flow Cytometry Core Facility, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

Summary

हम आनुवंशिक रूप से इंजीनियर टेम कोशिकाओं की घातक क्षमता का आकलन करने के लिए टेम स्टेम सेल ट्रांसप्लांटेशन (HSCT) के उपयोग का वर्णन । HSCT vivo में विभिंन घातक टेम कोशिकाओं के मूल्यांकन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से myelodysplastic सिंड्रोम के साथ चूहों का एक बड़ा पलटन पैदा करने के लिए उपयोगी है (MDS) या के लिए उपंयास चिकित्सा का मूल्यांकन ल्यूकेमिया ।

Abstract

Myelodysplastic सिंड्रोम (MDS) टेम कोशिका विकारों कि अप्रभावी hematopoiesis, परिधीय रक्त cytopenias, dysplasia द्वारा परिभाषित कर रहे हैं, और तीव्र ल्यूकेमिया के लिए परिवर्तन के लिए एक प्रवृत्ति के एक विविध समूह हैं । NUP98-HOXD13 (NHD13) ट्रांसजेनिक चूहों परिधीय रक्त दोहराऊंगा, cytopenias, और तीव्र ल्यूकेमिया के लिए परिवर्तन के मामले में मानव MDS dysplasia । हम पहले से प्रदर्शन किया है कि mds mds अस्थि मज्जा nucleated कोशिकाओं (BMNC) के प्रत्यारोपण से जंगली प्रकार के प्राप्तकर्ताओं के लिए एमडीए के साथ एक आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस से स्थानांतरित हो सकता है । अधिक स्पष्ट रूप से मूल के MDS सेल समझने के लिए, हम विशिष्ट प्रत्यारोपण के दृष्टिकोण विकसित किया है, immunophenotypically टेम उपसमुच्चय परिभाषित. इस अनुच्छेद में, हम अलग और टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं की विशिष्ट आबादी प्रत्यारोपण की प्रक्रिया का वर्णन । प्रत्यारोपण के बाद, हम प्रत्यारोपण और दाता MDS कोशिकाओं के हठ की दक्षता का आकलन करने के दृष्टिकोण का वर्णन ।

Introduction

Myelodysplastic सिंड्रोम (MDS) अप्रभावी hematopoiesis, dysplasia के सुघड़ सबूत, और तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल)1,2 के लिए परिवर्तन के लिए एक प्रवृत्ति के द्वारा विशेषता क्लोनल रक्त विकारों के एक विविध सेट का प्रतिनिधित्व ,3,4. अप्रभावी hematopoiesis अस्थि मज्जा में एक परिपक्वता गिरफ्तारी के रूप में मांयता प्राप्त है, और परिधीय रक्त cytopenias में एक hypercellular अस्थि मज्जा1,3के बावजूद परिणाम । mds की घटना को विभिंन १००,००० प्रति वर्ष संयुक्त राज्य अमेरिका में व्यक्तियों के रूप में 2-12 मामलों के रूप में अनुमानित किया गया है, और mds की घटनाओं उंर के साथ बढ़ जाती है, यह एक महत्वपूर्ण शर्त बनाने के लिए उंर बढ़ने अमेरिका की आबादी3दिया समझ बना, 5. हालांकि mds के अधिकांश मामलों में कोई स्पष्ट एटियलजि है, mds के कुछ मामलों में ज्ञात genotoxic एजेंटों के लिए जोखिम के कारण होने लगा रहे हैं, जैसे बेंजीन, और कैंसर कीमोथेरेपी6के रूप में सॉल्वैंट्स सहित ।

mds रोगियों आमतौर पर mds कोशिकाओं7में उत्परिवर्तनों का अधिग्रहण किया है । हालांकि अपेक्षाकृत असामांय, MDS रोगियों की संख्या संतुलित गुणसूत्र जैसे NUP98, EVI1, RUNX1, और MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman) के रूप में जीन शामिल अनुवादन प्राप्त कर लिया है । हमारी प्रयोगशाला गुणसूत्र अनुवादन, जो NUP98 जीन8शामिल में एक लंबे समय से रुचि है । ट्रांसजेनिक चूहों कि एक NUP98-HOXD13 (NHD13) transgene प्रवर्तक और बढ़ाने के तत्वों द्वारा विनियमित Vav1 एक्सप्रेस MDS की प्रमुख विशेषताओं के सभी प्रदर्शित परिधीय रक्त cytopenias, सुघड़ के dysplasia सबूत, और परिवर्तन एएमएल 9 के लिए शामिल .

हालांकि mds ६० से अधिक वर्षों के लिए मांयता प्राप्त किया गया है10, और एक क्लोनिंग स्टेम सेल विकार माना जाता है, immunodeficient चूहों में मानव mds सेल engraft करने के प्रयास काफी हद तक असफल रहे हैं, क्योंकि mds कोशिकाओं engraft खराब11, 12,13,14 और चूहों में नैदानिक रोग का विकास नहीं होता है । एक जो टेम कोशिकाओं MDS संचारित कर सकते है की पहचान करने के प्रयास में, हम NHD13 मॉडल में बदल गया, और पता चला है कि हम एक रोग इकाई है कि मानव mds के कार्डिनल सुविधाओं के सभी दिखाया परिधीय रक्त cytopenias, dysplasia सहित, के रूप में engraft mds सकता है और परिवर्तन एएमएल15। इस रिपोर्ट में, हम इन प्रयोगों की तकनीकी जानकारी के साथ ही आगे fractionate टेम स्टेम और अग्रदूत कोशिकाओं (HSPC) के दृष्टिकोण, MDS-प्रारंभिक कोशिकाओं की पहचान करने के प्रयास में प्रस्तुत करते हैं ।

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Protocol

पशु इस लेख में वर्णित प्रक्रियाओं बेथेस्डा पशु देखभाल और उपयोग समिति में राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा अनुमोदित किया गया है, और मानवीय देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग पर सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा नीति के भीतर निहित नीतियों के अनुरूप, पशु कल्याण अधिनियम, और प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए मार्गदर्शिका ।

1. सेल की तैयारी

  1. संचयन अस्थि मज्जा nucleated सेल (BMNC)
    1. केवल बाँझ सामग्री का उपयोग करें । एक भाप आटोक्लेव का उपयोग कर पुन: प्रयोज्य उपकरणों निष्फल । खरीद सुई, सीरिंज, और एक उपयोग बाँझ कंटेनरों में प्लास्टिक के बर्तन । एक वर्ग द्वितीय में सभी पशु और सेल जोड़तोड़ प्रदर्शन, प्रकार A2 जैविक सुरक्षा कैबिनेट ।
    2. HF2 के 3 मिलीलीटर (हांक संतुलित नमक 2% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक समाधान) युक्त एक 14 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूब में BMNCs तैयार करें ।
    3. Euthanize C57Bl6 दाता चूहों (CD45 एलील सीडी 45.2 के लिए सकारात्मक), उंर आमतौर पर 2-6 महीने, एक सह2 चैंबर का उपयोग कर ।
    4. एक स्प्रे बोतल के साथ पूरे शरीर पर ७०% इथेनॉल छिड़काव द्वारा माउस लोथ निष्फल । पैरों से त्वचा छील, श्रोणि से नीचे टखने के लिए ।
    5. बाँझ कैंची (सीधे, शार्प/तेज, ११.५ सेमी) और संदंश (Graefe, दांतेदार, ०.८-mm टिप चौड़ाई) का उपयोग कर लोथ से femora और tibiae निकालें । ट्रिम संलग्न मांसपेशियों स्पष्ट रूप से ।
    6. टिबिया के समीपस्थ और बाहर के सिरों को कैंची से काट लें । संदंश के साथ टिबिया होल्डिंग, एक 27 गेज 3 मिलीलीटर HF2 के टिबिया (टखने) के बाहर के छोर पर टिबियल मज्जा गुहा में २.५ मिलीलीटर युक्त सिरिंज डालें । 14 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूब में कोमल दबाव का उपयोग कर टिबिया से अस्थि मज्जा कोशिकाओं फ्लश ।
      1. अंय टिबिया के लिए दोहराएं ।
    7. फीमर के समीपस्थ और बाहर के सिरों को कैंची से काट लें । फीमर मज्जा गुहा के बाहर के अंत में HF2 की २.५ मिलीलीटर युक्त एक 20-गेज सुई एक 3 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी और सिरिंज के लिए कोमल दबाव लागू करने से फीमर मज्जा गुहा फ्लश ।
      1. अंय फीमर के लिए दोहराएं, दोनों tibiae और femora से एक ही 14 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूब में सभी अस्थि मज्जा इकट्ठा ।
    8. 3 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी एक ही 20 गेज सुई के साथ ऊपर और नीचे कई बार aspirating द्वारा मज्जा द्रव्यमान फैलाने.
  2. BMNC के एंटीबॉडी दाग
    1. गिन BMNC । चरण 1.1.8 में उत्पन्न BMNC निलंबन के 20 µ l के लिए एक 3% एसिटिक अम्ल समाधान के 20 µ l जोड़ें. फिर, एक hemocytometer और एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर गिनती ।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४५० x g पर कोमल केंद्रापसारक द्वारा BMNC गोली । 107 कोशिकाओं के प्रति ९० µ एल का उपयोग कर HF2 के साथ गोली resuspend और सेल निलंबन के लिए biotinylated विरोधी वंश एंटीबॉडी कॉकटेल के 10 µ एल जोड़ें ।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए मशीन के बाद, फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के 3 मिलीलीटर के साथ सना हुआ कोशिकाओं को धो लें ।
    4. 107 कोशिकाओं के प्रति HF2 के १०० µ l के साथ BMNC को फिर से सस्पेंड कर दीजिये. allophycocyanin के 2 µ एल जोड़ें (APC) संयुग्मित विरोधी बायोटिन एंटीबॉडी सेल निलंबन, 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन द्वारा पीछा किया ।
    5. पंजाब के 3 मिलीलीटर के साथ सना हुआ BMNC कुल्ला और प्रवाह propidium सेल छंटाई के लिए ०.२ µ जी/एमएल के आयोडाइड cytometry (PI) के साथ पूरक HF2 के साथ BMNC resuspend ।
  3. फ्लो cytometry सेल छँटाई BMNC की
    1. जांचना फ्लो cytometry सेल सॉर्टर. सभी photomultiplier ट्यूबों (PMTs), तितर बितर, और प्रतिदीप्ति मापदंडों का उपयोग कर unstain हुआ कोशिकाओं का अनुकूलन और प्रत्येक डिटेक्टर के रैखिक रेंज के भीतर सेट.
    2. तैयार दाग, PI-सना हुआ, और APC चरण १.२ से समानांतर में वंश कॉकटेल कोशिकाओं लेबल । वर्णक्रमीय क्षतिपूर्ति के लिए विश्लेषण ।
    3. FSC-h बनाम ssc-h, ६४०-ssc-A बनाम ६४०-ssc-h, और ६४०-ssc-S बनाम ६४०-एसएससी-नक़ल के अनुक्रमिक गेटिंग द्वारा भेदभावपूर्ण कोशिकाओं-ssc-W.
    4. एक 614/20 बैंड पास फिल्टर के साथ एकत्र ५६१ एनएम और उत्सर्जन पर उत्तेजित PI का उपयोग कर व्यावहारिक कोशिकाओं को बाहर निकालें । ६४० एनएम पर वंश APC लेबल कोशिकाओं को उत्तेजित और एक 671/30 बैंड पास फिल्टर के साथ उत्सर्जन इकट्ठा ।
    5. रिकार्ड वोल्टेज ऊंचाई के रूप में प्रतिदीप्ति मूल्यों और इकट्ठा सूची मोड डेटा फ़ाइलों में कम से १००,००० घटनाओं को हल किया जा आबादी कल्पना ।
    6. निम्नलिखित के लिए १०,००० कोशिकाओं के तीन नमूने प्राप्त करने के बाद वर्णक्रमीय क्षतिपूर्ति की गणना: unlabel्ड कोशिकाओं, PI लेबल कोशिकाओं, और विरोधी वंश एंटीबॉडी कॉकटेल संयुग्मित के साथ.
    7. वंश ऋणात्मक (LN), वंश धनात्मक (LP), मंद प्रतिदीप्ति तीव्रता (LP1) के साथ सॉर्ट करने के लिए तीन क्षेत्रों को सेट करें और 5 मिलीलीटर ट्यूब में ब्राइट प्रतिदीप्ति (LP2) के साथ lp जनसंख्या 10% FBS मीडिया की ०.५ मिलीलीटर युक्त ।
    8. एक एक ड्रॉप ढंक और शुद्ध निरस्त मोड का उपयोग करते हुए कक्षों को सॉर्ट करें ।
    9. सॉर्ट किए गए कक्षों की शुद्धता और व्यवहार्यता की पुष्टि करने के लिए प्रत्येक सॉर्ट किए गए नमूने पर १,००० कुल कक्षों के साथ पोस्ट सॉर्ट विश्लेषण निष्पादित करें ।
    10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४५० x g पर केंद्रापसारक द्वारा क्रमबद्ध कोशिकाओं को इकट्ठा करने और HF2 के ०.५ मिलीलीटर के साथ सेल गोली resuspend ।
    11. hemocytometer और Trypan नीला के साथ क्रमबद्ध कक्ष संख्या की पुष्टि करें । प्रत्यारोपण के लिए HF2 के साथ सेल संख्या समायोजित करें ।
      नोट: BMNC आबादी की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के ऊपर कदम 1.2.2 में fluorochrome-संयुग्मित एंटीबॉडी के अतिरिक्त संयोजन का उपयोग कर प्रत्यारोपण के लिए अलग किया जा सकता है ।

2. प्राप्तकर्ता चूहों तैयारी और टेम स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण (HSCT)

  1. प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं की तैयारी
    1. पशु चिकित्सा और पशुपालन की देखभाल congenic प्राप्तकर्ता चूहों (B6-5.1/Cr, cd 45.1) में एक विशिष्ट रोगज़नक़ नि: शुल्क (SPF) पशु सुविधा का ध्यान रखें ।
    2. जठरांत्र संबंधी ट्रैक के नियत्रंण संदूषण के लिए, ciprofloxacin के 7 दिनों के लिए घातक खुराक (9 Gy) विकिरण से पहले के लिए प्राप्तकर्ताओं को १०० मिलीग्राम/L युक्त बाँझ पानी प्रदान करते हैं, और 14 दिनों के लिए विकिरण के बाद बनाए रखने.
    3. इस प्रकार के रूप में एक सीएस स्रोत से एक घातक खुराक (9 Gy) विकिरण प्रदान करें । एक प्रशिक्षित, प्रमाणित सीएस ऑपरेटर का प्रयोग करें । ७० cGy/मिनट कुल शरीर गामा विकिरण उद्धार करने के लिए सीएस स्रोत साधन सेट करें । एक कस्टम डिजाइन धारक में 10 चूहों प्लेस और धारक irradiator चैंबर में डालें । 13 मिनट में 9 Gy कुल शरीर विकिरण उद्धार और चूहों उनके पिंजरों को वापस ।
  2. टेम स्टेम सेल ट्रांसप्लांटेशन
    1. मिश्रण जंगली प्रकार (WT) BMNC एक congenic प्राप्तकर्ता माउस से (बी-6, 5.1/Cr, सीडी 45.1) 2 एक्स 105 शुद्ध परीक्षण के4 कोशिकाओं के साथ प्रति माउस कोशिकाओं की एक सेल खुराक पर 2 से 5 x 10 के लिए BMNC प्रवाह के साथ तैयार cytometry छंटाई के रूप में ऊपर १.३ में वर्णित है । एक ही सिरिंज में मिक्स कोशिकाओं ।
      नोट: WT BMNC प्राप्तकर्ता माउस को एक विकिरण छोड़ प्रभाव प्रदान करते है और प्राप्तकर्ता माउस के अस्तित्व के लिए अनुमति देते है यदि परीक्षण कोशिकाओं hematopoiesis का समर्थन नहीं करते । प्रयोग के इस प्रकार में इस्तेमाल किया WT BMNC सीडी 45.1 एलील व्यक्त करते हैं, और इस प्रकार का परीक्षण एंटीबॉडी जो सीडी 45.1 और सीडी 45.2 के बीच भेदभाव का उपयोग कोशिकाओं से प्रतिष्ठित किया जा सकता है । WT बीएम कोशिकाओं "सहायक कोशिकाओं", "विकिरण कोशिकाओं को छोड़", या "प्रतियोगी कोशिकाओं" के रूप में संदर्भित कर रहे हैं ।
    2. इंजेक्शन को सुविधाजनक बनाने के लिए बाँझ HF2 का उपयोग कर प्रति प्राप्तकर्ता २०० µ एल के लिए सेल मिश्रण मात्रा समायोजित करें ।
    3. विकिरण के 24 घंटे के भीतर एक 1 मिलीलीटर सिरिंज और 28 गेज सुई का उपयोग कर नसों में पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से घातक रूप से विकिरणित प्राप्तकर्ता चूहों के लिए सेल मिश्रण प्रत्यारोपण । एक गर्मी चिराग के तहत माउस पूंछ प्लेस, के रूप में गर्मी पूंछ नस फैलाव की ओर जाता है ।
      नोट: अध्ययन के अंत में सभी प्राप्तकर्ता चूहों Euthanize और necropsy, प्रोटोकॉल, और प्रवाह cytometry द्वारा रोग प्रगति का मूल्यांकन ।

3. Engraftment का उपयोग कर परख प्रवाह Cytometry

  1. दाता सेल engraftment का मूल्यांकन करने के लिए, 6 सप्ताह में प्राप्तकर्ता चूहों से परिधीय रक्त (पंजाब), 12 वें सप्ताह, और 16 वें सप्ताह प्रत्यारोपण के बाद इकट्ठा ।
  2. के बारे में 1 मिनट और एक निरोधक में जगह माउस के लिए गर्मी चिराग के साथ पिंजरे में प्राप्तकर्ताओं गर्म ।
  3. एक स्केलपेल (ब्लेड 10, #3 स्केलपेल संभाल) और एक EDTA के रूप में थक्कारोधी युक्त एक microcapillary ट्यूब का उपयोग कर प्राप्तकर्ता प्रति पंजाब के १०० µ एल इकट्ठा के साथ पूंछ नस काटा ।
  4. एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में ५० µ एल रखकर दो बराबर aliquots में एकत्र पंजाब विभाजित । एक स्वचालित पूर्ण रक्त गणना (सीबीसी) (NCI Histopathology कोर पर प्रदर्शन) के लिए एक aliquot का प्रयोग करें और एंटीबॉडी धुंधला और प्रवाह cytometry के लिए दूसरा aliquot का उपयोग करें ।
  5. प्रवाह cytometry द्वारा दाता engraftment का पता लगाने के लिए, लाइसे लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) के 1 मिलीलीटर जोड़कर hypotonic आरबीसी lysis बफर (८.२९ जी/एल के NH4सीएल, 1 जी/l के KHCO3, ०.०३७ g/l के एल ना2EDTA, पीएच ७.२) के ५० µ l के लिए एकत्र पंजाब. भंवर मिश्रण और कमरे के तापमान पर 10 मिनट की गर्मी के लिए नमूना ।
  6. ४,६०० एक्स जी में १.५ मिनट के लिए लीजड ड पंजाब केंद्रापसारक । ध्यान से महाप्राण को supernatant और त्यागें.
  7. आंशिक रूप से धीरे दोहन या ट्यूब के नीचे "झाड़ू" द्वारा सेल गोली बाधित । गोली में १.३ पंजाबियों की एमएल जोड़ें ट्यूब में स्थित है और १.५ मिनट के लिए ४,६०० x g पर केंद्रापसारक । ध्यान से महाप्राण और supernatant को त्यागें ।
  8. दोहन या झाड़ू से सेल गोली बाधित है, और सेल गोली के लिए 5% चूहे सीरम के साथ पूरक HF2 के २०० µ एल जोड़ें ।
  9. सेल सस्पेंशन के लिए एंटी-सीडी 45.2 एंटीबॉडी (1 µ l) संयुग्मित को allophycocyanin (APC) के साथ जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस से कम 30 मिनट के लिए मशीन, और संक्षेप में मिश्रण भंवर ।
  10. दाग के बाद, ऊपर वर्णित के रूप में दो बार कोशिकाओं को धोने, और HF2 के ४०० µ एल के साथ resuspend 1 µ जी के साथ पूरक/
  11. 4-रंग प्रवाह cytometer का उपयोग करके engraftment का पता लगाएं । विशिष्ट कक्ष प्रकारों, जैसे B या T लिम्फोसाइटों का पता लगाने के लिए अतिरिक्त एंटीबॉडी जोड़कर परिधीय रक्त के भीतर सेल प्रकारों पर अतिरिक्त जानकारी प्राप्त करें ।
  12. डेटा के आगे विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए एक स्प्रेड शीट का उपयोग करके सीरियल engraftment डेटा रिकॉर्ड करें ।

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Representative Results

हम कई प्रयोगों के परिणामों के लिए प्रतिनिधि आंकड़े दिखाते हैं । चित्रा 1 एक प्रतिनिधि प्रवाह cytometry छँटाई प्रयोग से पता चलता है. सामांय टेम भेदभाव के दौरान, के रूप में कोशिकाओं को एक विशिष्ट टेम वंश के लिए प्रतिबद्ध हो जाते हैं, वे वंश प्राप्त सेल सतह मार्करों को परिभाषित करने और आत्म नवीकरण के लिए क्षमता खो देते हैं । इसलिए, जंगली प्रकार के चूहों में, स्टेम सेल स्व-नवीकरण वंश-नकारात्मक BMNC तक ही सीमित है । इस प्रयोग में, हम NHD13 अस्थि मज्जा से वंश में BMNC हल-नकारात्मक, कम वंश सकारात्मक, और उच्च वंश-सकारात्मक कोशिकाओं । ये सॉर्ट की गई कक्ष तब स्व-नवीनीकरण क्षमता निर्धारित करने के लिए WT प्राप्तकर्ताओं में प्रत्यारोपित किए गए ।

चित्रा 2 एक अलग प्रयोग है, जो में वंश नकारात्मक कोशिकाओं या MDS के साथ NHD13 दाताओं से unsort कोशिकाओं को घातक विकिरणित WT प्राप्तकर्ताओं में प्रत्यारोपित किया गया से परिणाम दिखाता है । NHD13 दाता कोशिकाओं सीडी 45.2 सेल भूतल मार्कर व्यक्त की है, जबकि WT प्रतियोगी कोशिकाओं (ऊपर खंड 2.2.1 देखें) सीडी 45.1 सेल सतह मार्कर व्यक्त किया । चित्रा 3 या तो unsort NHD13 BMNC, या वंश-नकारात्मक NHD13 BMNC के धारावाहिक engraftment विश्लेषण से पता चलता है । लगभग 16 सप्ताह के बाद, NHD13 कोशिकाओं WT कोशिकाओं का मुकाबला, के रूप में परिधीय रक्त में सीडी 45.2 + कोशिकाओं के बढ़ते प्रतिशत से दिखाया गया है । चित्रा 4 NHD13 MDS कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित माउस से ल्यूकेमिया से प्रभावित परिवर्तन का एक उदाहरण से पता चलता है ।

Figure 1
चित्रा 1: वंश एंटीबॉडी कॉकटेल के साथ सना हुआ BMNC के प्रवाह cytometry छंटाई रणनीति । डॉट प्लॉट पर प्रत्येक आयताकार बॉक्स सेल फंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए HSCT के लिए क्रमबद्ध कोशिका जनसंख्या का प्रतिनिधित्व करता है । R4, वंश ऋणात्मक; R5, कम वंश सकारात्मक; R6, उच्च वंश सकारात्मक । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: engraftment परख के लिए प्रतिनिधि FACS प्रोफाइल दाता विशिष्ट विरोधी सीडी 45.2 एंटीबॉडी का उपयोग कर । BMNC प्राप्तकर्ता 1 x 106 NHD13 BMNC (सीडी 45.2 +) और 5 x 104 LNBM वंश नकारात्मक बीएम कोशिकाओं (सीडी NHD13 +) के साथ 45.2 प्राप्तकर्ता के साथ प्रत्यारोपित किया गया । प्रत्येक मामले में, 2 x 105 WT BMNC (cd 45.1 +) को प्रतिस्पर्धी कक्षों के रूप में उपयोग किया गया था । ऊपरी और निचले बक्सों में संख्याएँ cd 45.2 धनात्मक (NHD13 दाता से व्युत्पंन) और cd 45.2 ऋणात्मक (WT प्रतिस्पर्धी कक्षों से व्युत्पंन), क्रमशः, बाद में प्रत्यारोपण 6 सप्ताह और 24 सप्ताह का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रत्यारोपण के बाद व्यक्तिगत प्राप्तकर्ताओं के Engraftment कैनेटीक्स । ग्राफ पर प्रत्येक पंक्ति एक व्यक्ति प्राप्तकर्ता माउस के धारावाहिक engraftment परख से पता चलता है । BMNC प्राप्तकर्ताओं NHD13 पूरे BMNC के 1 x 106 कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित किया गया, और LNBM प्राप्तकर्ताओं छंटाई के बाद 5 x 104 NHD13 वंश नकारात्मक बीएम के साथ प्रत्यारोपित किया गया । NHD NHD13 दाता को इंगित करता है । बीएम, BMNC प्राप्तकर्ता चूहों; LNBM, वंश नकारात्मक बीएम प्राप्तकर्ता; PBMC, परिधीय रक्त mononucleated कोशिका. सभी मामलों में, NHD13 दाता कोशिकाओं को धीरे से WT कोशिकाओं का मुकाबला । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: मई Grünwald Giemsa (MGG) अस्थि मज्जा के धुंधला (बीएम) MDS प्राप्तकर्ता से एएमएल करने के लिए प्रगति की है । कई विस्फोटों और अपरिपक्व रूपों की उपस्थिति पर ध्यान दें । तीर विस्फोटों का संकेत है, और ऐरोहेड अपरिपक्व रूपों से संकेत मिलता है । मूल 400X । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हालांकि mds एक क्लोन टेम स्टेम कोशिका विकार हैं, mds "स्टेम", या कोशिकाओं की शुरुआत, अभी तक विशेषता नहीं किया गया है । हम पहले दिखा दिया है कि MDS WT चूहों NHD13 चूहों से HSCT द्वारा अस्थि मज्जा का उपयोग करने के लिए प्रत्यारोपण किया जा सकता है, macrocytic एनीमिया, leukopenia, न्यूट्रोपेनिया, और सुघड़15के dysplasia सबूत की विशेषता. इसके अलावा, प्रतिस्पर्धी पुनर्जनसंख्या परख NHD13 MDS अस्थि मज्जा से कोशिकाओं के विकास लाभ की पहचान की । एक साथ ले लिया, इन निष्कर्षों एक MDS स्टेम या सेल की शुरुआत के अस्तित्व का मतलब है । अतिरिक्त प्रयोग अब प्रगति में हैं, एक MDS सेल15 की शुरुआत और अधिक परिभाषित स्टेम और जनक सेल मार्कर का उपयोग कर के immunophenotypic विशेषताओं को परिष्कृत करने के उद्देश्य से (CD150, CD48, सी किट और Sca-1)16 वंश के साथ संयुक्त मार्कर धुंधला इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि ।

की पहचान MDS NHD13 चूहों का उपयोग कर कोशिकाओं की शुरुआत व्यापक प्रवाह cytometry प्रक्रिया छंटाई शामिल है । प्राथमिक BMNCs के पूर्व vivo हेरफेर कोशिकाओं पर तनाव स्थानों, संभावित कोशिका मृत्यु या कार्यात्मक नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप । इसलिए, प्रयास प्रवाह cytometry छंटाई के समय सहित पूर्व vivo हेरफेर के समय को कम करने के लिए किया जाना चाहिए । निर्माता और प्रवाह cytometry उपकरणों और प्रवाह गतिशीलता के मॉडल छंटाई के बाद सेल व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकते है कि अतिरिक्त चर रहे हैं । HSCT प्रक्रिया एक रक्त वाहिका के माध्यम से सेल अर्क की आवश्यकता है । हालांकि पूंछ नस इंजेक्शन रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन से एक अधिक चुनौतीपूर्ण तकनीक हो सकता है, हमारे अनुभव में, पूंछ नस इंजेक्शन अधिक तेजी से रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन से किया जा सकता है के रूप में प्राप्तकर्ता चूहों पूंछ नस के लिए anesthetized नहीं कर रहे है इंजेक्शन. इंजेक्शन की मात्रा की सीमा (अधिकतम १५० µ एल) रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन17में एक और मुद्दा है, एक उच्च कोशिका एकाग्रता के रूप में सेल की तैयारी के दौरान कोशिकाओं के अतिरिक्त नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, इस तरह के सीरिंज की दीवार पर कोशिकाओं की कतरनी के रूप में और सुइयों.

हालांकि इन प्रयोगों MDS के लिए NHD13 मॉडल पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, HSCT छंटाई और प्रत्यारोपण दृष्टिकोण यहां वर्णित किसी भी आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । स्व-नवीनीकरण टेम कोशिकाओं की विशेषताओं का निर्धारण करने के अलावा, इस प्रत्यारोपण दृष्टिकोण अन्य प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, यदि एक इच्छाओं को mds अस्थि मज्जा के साथ चूहों का एक बड़ा पलटना प्राप्त करने के लिए एक छोटे से अणु के साथ इलाज की प्रभावकारिता का आकलन, एक बड़े पलटन (30 + चूहों) mds बीएम के साथ WT चूहों प्रत्यारोपण द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, HSCT रणनीति उलट जा सकता है । mds के चूहों का इलाज करने के प्रयास में, NHD13 चूहों के साथ mds WT बीएम प्रत्यारोपित किया जा सकता, और प्रत्यारोपण की सफलता टेम कोशिकाओं है कि एक्सप्रेस सीडी 45.1 के अनुपात का आकलन करके निगरानी की जा सकती (जो WT बीएम अंक) के रूप में सीडी 45.2 का विरोध किया (जो अंक MDS बीएम) 18.

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Disclosures

हमारे पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस कार्य के लिए राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (अनुदान संख्या जिया अनुसूचित जाति ०१०३७८ और बीसी ०१०९८३) के अंदर अनुसंधान कार्यक्रम का समर्थन किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14 mL round bottom tube Falcon 352057
Hank's balanced salt solution Lonza 10-527F
Anti-CD45.2 antibody Southern Biotech 1800-15 LOT# A077-T044O
3 mL Syringe Monoject 8881513934
27-G needle BD 305109
20-G needle BD 305176
Lineage Cocktail Miltenyi 130-090-858 LOT# 5170418221
Anti-Biotin antibodies Miltenyi 130-113-288 LOT# 5171109046
1 mL Syringe Excelint 26027 Insulin Syringe
Heating Lamp Thermo Fisher Scientific E70001901
FACS machine Cytec FACScan 2 lasers, 5 color detectors
FACS sorting instrument Beckman Coulter MOFLO ASTRIOS 5 lasers, 23 parameters, 6 population sorting simulteneously
Propidium Iodide Thermo Fisher Scientific P3566
Gamma Irradiator Best Theratronics Gammacell 40
Blood collection tube RAM scientific 76011
Recipient mice Charles River B6-LY5.1/Cr, CD45.1
NUP98-HOXD13 mice n/a C57Bl/6, CD45.2 Colony maintained at NIH
5 mL round bottom tube Falcon 352058

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक १४० Myelodysplastic सिंड्रोम टेम स्टेम कोशिका ट्रांसप्लांटेशन प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई अस्थि मज्जा NUP98-HOXD13 गंभीर माइलॉयड ल्यूकेमिया टेम द्रोह
Myelodysplastic सिंड्रोम की उत्पत्ति का आकलन करने के लिए टेम स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण का उपयोग
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Chung, Y. J., Khawaja, G., Wolcott, K. M., Aplan, P. D. Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome. J. Vis. Exp. (140), e58140, doi:10.3791/58140 (2018).

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