Summary
相関光電子顕微鏡 (クレム) メソッドは、以前、光顕 (LM) で選択されているセルの電子顕微鏡検査 (EM) による画像ウイルスによる細胞内構造に適用されます。LM および EM は、ウイルス-宿主間相互作用の統合ビューを達成するためにハイブリッド イメージング手法として結合されます。
Abstract
その高解像度のため電子顕微鏡検査 (EM)、ウイルス学者の不可欠なツールです。ただし、EM を介してウイルスに感染したか transfected セルを分析する際の主な困難の 1 つは、感染症や遺伝子、これらの細胞の検査を妨げる低効率です。この困難を克服するために、感染したまたは transfected セルの亜種を割り当てる最初の光顕 (LM) を実行できます。したがって、ウイルス蛋白質に溶ける蛍光タンパク質 (FPs) の使用の利点を取って、LM は「肯定的な導入」のセルの位置を記録するここで使用される、FP を表現し、英数字パターンのサポートで成長しています。続いて、細胞、em 処理されますさらに高圧 (HPF) を凍結、凍結置換 (FS) と樹脂を埋め込みます。超急速凍結のステップは、優れた膜透過電子顕微鏡 (TEM) による微細構造レベルで分析することができますは、選択したセルの保全を保証します。ここでは、サンプル準備、イメージングおよび相関関係の詳細を記述する段階的な相関光電子顕微鏡 (クレム) ワークフローは提供されます。実験的なデザインは、多くの細胞生物学の質問に対処にも適用できます。
Introduction
特定の生物学的プロセスのより良い画像を取得する 2 つの顕微鏡のモダリティを組み合わせることの考えはかなり古いです。したがって、「相関顕微鏡」を使用してウイルスの非常に最初の研究は、2 つのパブリケーション1,2として 1960 年に出版されました。その研究では、2 つの顕微鏡技術を用いたアデノ ウイルスによる核の形態の変化を分析しました。最初の出版物でアデノ ウイルス感染症に関連付けられている形態学的詳細を説明する電子顕微鏡検査 (EM) 観測報告1通でした。2 番目の文書の EM で観測された異なる構造は以前 EM2によって観測された構造の性質を定義するための組織化学的染色パターンの光学顕微鏡観察 (LM) 画像と相関しました。
ただし、これらの初期の研究は、彼らの観察は、独立した実験として別の感染細胞を使用して行われました。「相互関係」、確かに、意味した 2 つの画像診断装置からの情報の組み合わせとして異なるアッセイは、与えられた生物を理解するために得られているすべての調査結果を比較する特定の現象を理解するにはプロセス。
用語の相関顕微鏡相関光学および電子顕微鏡 (クレム) として知られているに共通性 (参照3,4、5の見直し)、メソッド数の増加に適用この頃は、その両方のイメージング技術 (LM および EM) は非常に同じサンプルで遂行されます。両方の方法を組み合わせて結果、それにより、そのサンプル3のマルチ モーダル、マルチ スケール ・多次元分析。利点は、LM 時にタンパク質または異種細胞集団内の興味の蛋白質を表現する細胞の亜集団の同定を有効にする多くの異なった細胞の広範な概要を提供できることです。EM の LM は、特定の細胞内イベントのより高い解像度の画像を提供する解像度の制限を克服します。さらに、EM はそれによってバインド膜小器官、大きな高分子複合体(例えばリボソーム、由来等)、細胞骨格の要素を含む非蛍光性の細胞内局在コンテキストの可視化を実現にします。いわゆる「リファレンスの空間」6、追加空間情報の提供および LM によって検出された蛍光スポットにコンテキストを与えること。
最後の数年間クレム細胞生物学者5、のみならずウイルス学者 (文献7に見直し) の強力なツールとなっている成功したウイルスの伝搬につながる複雑なウイルス-細胞の相互作用を理解していく所存です。したがって、ウイルスが細胞膜と自分の利益に細胞小器官を変更する方法を理解することは、病原性ウイルスを根絶するために抗ウイルス薬の開発が不可欠です。
検出を可能にするここでは、クレム法、蛍光タンパク質 (FP) に溶けるウイルス蛋白質を発現する細胞の LM で説明します。これらの細胞は、その後低温固定し、さらにこれらの蛋白質の表現が (図 1) の細胞膜に再配置に新たな洞察を得るために透過型電子顕微鏡 (TEM) による微細構造の解析のために準備。クレムの日付8,9,10、11,12,13,14 に公開ウイルス研究のほとんどに化学的に固定細胞を行った ,,1516,17,18,19。これは主にバイオ セーフティ レベル 2 の可能ない細胞の固定化の低温は通常、-3 (BSL-2 および BSL 3) 研究所バイオ セーフティ上の理由から感染物質を不活化の必要性。細胞膜の最適な保全を必要とするものについての質問、ガラス化凍結 (HPF) 高圧を介して、しかし、強くお勧め20。この場合、ここで説明したクレム プロトコルを適用できます。興味深いことに、感染試料を扱う場合に特に、HPF はされている化学的に活性では以前、たとえば BSL-2 および BSL 3 研究所のサンプルで実行できます。HPF 続いて化学固定法の組み合わせは、少なくとも部分的に低温保存方法21,22の利点から利益を得る可能性が。
図 1: を介して細胞の分析用のワークフローの略図クレム。パターン化されたサファイア ディスクに育つセル最初、EM についての処理の前に FPs を発現する細胞をローカライズする LM によって分析されます。見つかったら、細胞はすぐに HPF と FS 後から樹脂に埋め込むことによって固定されています。細胞が成長していたサポート樹脂の重合によって (= サファイアディスク) 樹脂ブロックから削除する必要があります。組み込みのセルを含むブロックは、そこから残りのセルは、FPs を表現するダイヤモンド ナイフで区分である小さな台形にトリミングされます。超薄切片はスロット グリッド上で収集された、さらにこれらの細胞の微細構造の情報を取得する TEM によって調べられました。この図は、適応され、参照29から許可を得て変更します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Protocol
1 細胞培養のためディスクをパターン化されたサファイアの準備
- 15 mL コニカル遠心分離管に彼らの表面の 1 つにエッチングされる英数字のパターンとパターン サファイアディスク (材料の表を参照) を転送します。
注: また、英数字のパターンがない従来の 0.05 mm 厚サファイアディスク使用できます炭素上のファインダーのグリッドでコーティングすることによって参照パターンを作成します。カーボン パターンを適用する前に、この目的にエタノールでそれらを洗浄する必要があります。 - エタノールで徹底的に洗ってください。ろ紙をペトリ皿に敷くし、乾燥させます。スリムな長いピンセットを使用して互いから独立したスライド グラス上を置きます。
- 倒立顕微鏡 (4 倍) と座標のパターンがすべてのサファイアのディスク上で読めるかどうか確認してください。
注: そうでない場合は、ピンセットの助けを借りてサファイアディスクを反転します。 - ペトリ皿にサファイアのディスクを格納します。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。
2 パターン化されたサファイア ディスクと細胞培養
- 5 分間の紫外線 (UV) 架橋剤とパターン化されたサファイア ディスクを滅菌します。
- 細胞培養バイオ セーフティ キャビネットにサファイアのディスクを取る。キャビネットのバイオセイフティにおいてエタノールと長いピンセットを消毒します。
- 細胞培養液の半分を加え (材料表参照) 細胞培養ディッシュに。細胞の培養皿に、長いピンセットで慎重にサファイアのディスクを転送します。
- 種子 1 x 10 の5 Huh7 Lunet セル、細胞培養液、培養皿の上の他の半分で再停止される T7 ポリメラーゼを安定に発現します。
注: 計算結果は実験の終了時点で細胞密度がする必要がありますこのような方法でシード処理する細胞数ではない以上 20-30%。細胞密度の高いセルの EM による後の段階で再配置の妨げになります。さらに、サファイアのディスクからの細胞の剥離の confluency 可能性があります。 - サファイアのディスクが培養皿の底に残ることと英数字の座標が倒立顕微鏡と読めることを確認します。
注: ディスクをフローティング セル培地の場合は、下部にディスクをプッシュする、最終的にそれらを正しい方向にフリップに長いピンセットを使用します。 - Transfect セル参照21,23でトランスフェクション エージェントの製造元の指示に従って、以前報告した次の日。
3 LM パターン サファイアディスクに成長している細胞のイメージング
- 実験の終了時点でサファイアのディスクを 30-50 μ L を含む金属イメージング プレートに転送/非特異的なバック グラウンド蛍光を抑える pH インジケーター自由な媒体の位置します。
注: ここで説明した金属プレート (図 2) は、欧州分子生物学研究所 (EMBL) のワーク ショップで設計されています。この板または類似のもののない場合は、ガラス底細胞培養皿も使える代わりに lm。PH インジケーターせず中の正常な細胞培養培地を変更することが重要です。彼らは退色、活性酸素種 (ROS) 蓄積と細胞24,25の生理学的な損傷につながる可能性があるので、長い露出時間を避けるべきことにも注意してください。 - 広視野倒立蛍光顕微鏡下で細胞をイメージします。
注: 緑色蛍光タンパク質 (GFP) を使用する場合-、それぞれ代表的な結果、450-490 nm と 500-550 nm 励起と発光フィルターのようタグ付きタンパク質が使用する必要があります。 - まず興味のセルが差動干渉の対照 (DIC) の顕微鏡を使用してある FPs。 レコードを発現する細胞のパターン サファイアディスクの座標を割り当てるセルの低倍率イメージ (10-20 X) を取得します。
注: は、興味の細胞の場所のよりよい概観を持っているを助けるかもしれないいくつかの領域をステッチします。また、位相差顕微鏡オプションで使用できるここに注意してください。 - 良い細胞内空間内で興味の蛋白質の細胞内局在を識別する細胞が同じの高倍率 (蛍光と DIC) 画像 (63-100 X、油浸漬の目的) を取得します。
注: DIC 画像は、コンテキスト情報を提供します。この情報は後に、EM 顕微鏡 LM 画像に関連付ける重要な最終的な相関はセルの「解剖」ランドマークとより正確なので。クライオ固定いくつかのサファイアのディスクを壊すかもしれないと強くお勧め 1 つの条件をトリプリケートを準備します。さらに、いくつかの細胞からデタッチ ディスク HPF とこのプロトコルの後続のステップの間に、他の細胞の微細構造には可能性があります凍結損傷の結果としての成果物が含まれます。したがって、ディスクの少なくとも 2 つの最後に十分な細胞分析をされるように LM 経由でイメージを作成する必要があります。重要なは、これらの 2 つの領域は、ディスクの反対側にする必要があります。この方法で細胞が埋め込まれている樹脂ブロックは、2 つの半分にカットすることができ、これらの領域のセクションを取得ことができます。
図 2: LM イメージング育つセルのためスキーマ パターン サファイアディスク。(A)サファイアのディスクは高級ピンセットの助けを借りてイメージング プレートに転送されます。(B ・ C)このプレートを光学顕微鏡、pH インジケーターせず細胞培養液中でサファイアのディスクのイメージを作成する場所に合わせてハイデルベルクの EMBL のワーク ショップで特別に設計されています。金属のスライド、サファイアのディスクのサイズに合うように 3 mm のドリルの刃とそれに粉砕 4 5 穴 mm × 25 mm × 1 mm、75 で構成されています。また、小さな溝は 90 ° の角度で穴の両側に粉砕されました。これらの穴を操作するときに鉗子でディスクにアクセスしやすくなります。最適な撮影条件を許可するには、ガラス coverslips 0 番 (0.085 を 0.13 mm 厚) は UV 接着剤で接着、穴の下され硬化する紫外線の下で置かれました。その表面に刻まれた、英数字の座標を描いたパターン化されたサファイア ディスクの(D)高倍率画像。パターン化されたサファイアのディスクが市販 (材料の表を参照してください) です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
4 HPF を介してディスクをパターン化されたサファイア基板上成長細胞の低温固定化
- HPF の"A"と"B"のアルミ キャリアを配置 (材料の表を参照) 1 hexadecene を浸したろ紙をペトリ皿に。1 hexadecene とシャーレで細胞を含むパターン サファイアディスクを浸します。
注: ディスクにビットを移動する細胞培養液を洗い流します。 - "A"と"B"アルミ キャリア HPF ホルダー (図 3B) を次のようにサファイアのディスクを組み立てます。下に上向き、平らな側面と"B"のキャリアを配置します。この平らな面に上向き細胞とサファイアのディスクを配置します。セルに直面して 0.1 mm 深さ""キャリアを追加します。
注: パターン サファイアディスク サファイアディスク従来よりも厚いので、(非パターン化 0.05 mm サファイア ディスクで使用される設計) 市販"A"キャリアあった、EMBL のこの深さ 0.2 mm 側で 0.05 mm までカットするにはHPF ホルダー (図 3A) に適合するためのワーク ショップ。この目的に"A"のキャリアは、その 0.2 mm 側は公開され、それを伐採しながら、まだ残っているので、金属の管の端に挿入されます。下側カットはフラットだし、紙やすりで磨かれます。パターン化されたサファイア ディスク上に特殊アルミ キャリアを使用できますまた、(市販、材料表を参照してください)、サファイア製のディスクとこのキャリアだけ構成されてこの場合 HPF「サンドイッチ」。 - HPF マシンのホルダーを閉じてセルをフリーズします。
注: このプロトコルは、特定の HPF マシンの特定です。HPF の他のマシンには、代わりに使用される6,26可能性があります。いずれの場合も、仕入先から新世代機の存在を認識してあらかじめご了承ください。
注意: は、安全メガネおよび聴覚保護ヘッドセットを使用します。 -
ポリスチレンのボックスに一時記憶域のための液体窒素冷凍の「サンドイッチ」を配置します。
注意: は、ゴーグルを使用して、液体窒素を処理するときに潜在的な危険について知らされるローカル公安警察と接触して得る。- 混乱を避けるためには、各「サンドイッチ」別の 0.5 mL 遠心チューブに (スチロール箱) 数とマークを配置します。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。凍結置換 (FS) をすぐに実行できない場合サンプルに格納できるクライオ チューブ (上部にパンチ穴) と低温の液体窒素でラックに保持されているボックス内デュワー (材料の表を参照してください)。この液体窒素容器は、酸素センサー、酸素欠乏の場合窒息を避けるために部屋に配置必要があります。
注意: (手順 5 および 6) 以下に述べるすべての手続は、バイオ セーフティ キャビネットの実行する必要があります。さらに、使用する試薬のほとんどは有害です。それらを使用する前に、安全な取扱いを確保するためローカル ルールについての安全の役員を求めると同様に、製造業者によって提供される材料の安全データ用紙をよくお読みに必須です。これらの使用された材料の正しい処分のためだけでなく、以下の機器の適切な使用のため、また地元の研究所の健康と安全の手順を参照してください必要がありますです。
- 混乱を避けるためには、各「サンドイッチ」別の 0.5 mL 遠心チューブに (スチロール箱) 数とマークを配置します。
図 3: パターン化されたサファイアのアセンブリのスキーマは、HPF のアルミ キャリアに 2 つのディスクします。(A) -カットの深い側に 0.05 mm. (B)表面に刻まれた英数字のパターンを持つサファイア ディスクの厚さ 0.16 mm 0.2 mm からカットしている従来の"A"のキャリア観は HPF のアルミ キャリアに 2 組み立て式、次のように: サファイアのディスク、上向きのセルと"B"キャリアの平らな面に配置されています。刻んだセルに直面して 0.1 mm 深さとの"A"のキャリアは「HPF のサンドイッチ」を閉じるする上に配置します。アルミ キャリア パターン化されたサファイア ディスクは、市販 (材料の表を参照してください)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
5. 低温固定セルの FS
- FS マシンがいっぱい (材料の表を参照してください) に液体窒素。-90 ° C に温度を設定し、マシンがこの温度に達するまで待ちます。
- 0.2% 四酸化オスミウム (OsO4) を含む FS メディアの準備 (v/v)、FS マシンながらガラス蒸留アセトン 0.1 %005. (UA) (w/v)、冷却します。
注: FS 媒体の (例えば) 12 mL ミックスを準備するには、小さなガラス容器に UA の 0.012 g 4% OsO4600 μ L。5 分追加 11.4 ml ピペットでガラス蒸留アセトンの超音波浴装置にこの混合物を溶かし、よく混ぜます。 - FS 中の 200-500 μ L で 1.5 mL 遠心管を埋める、蓋を閉めるし、FS のマシンにそれらを転送します。FS 媒体を冷却するための 10 分を待ちます。
- サファイアディスク FS 媒体を含んでいるチューブに冷却の長いピンセットを使用して液体窒素で細胞を含む冷凍の「サンドイッチ」を転送します。
注意: 低温保護手袋とゴーグルを使用します。
注: HPF「サンドイッチ」は、その処理中に自発的に分解可能性があります。この場合、遠心管に冷凍サファイア ディスクが転送されることを確認します。アルミ キャリアは破棄することができます。 - 次の日27まで FS を次のように実行:-80 ° C、8 h;-90 ° C から-50 ° C、8 h;-80 ° C から-20 ° C 2 時間;-50 ° C から2 h の 0 ° C に-20 ° c。
6. 樹脂埋め込み凍結置換サンプル
注意: 次のすべての手順は、バイオ セーフティ キャビネットの実行する必要があります。さらに、使用する試薬のほとんどは有害です。それらを使用する前に、安全な取扱いを確保するためローカル ルールについての安全の役員を求めると同様に、製造業者によって提供される材料の安全データ用紙をよくお読みに必須です。これらの使用された材料の正しい処分のためだけでなく、以下の機器の適切な使用のため、また地元の研究所の健康と安全の手順を参照してください必要がありますです。
- FS マシンから置換試験片を取り出し、20 分間氷の上に置きます。
- 20 分間室温でサンプルを維持し、それらを徹底的に洗浄 (3 回 10 分ずつ) ガラス蒸留アセトンで。FS 後マイクロ遠心チューブ用にまだある場合、長いピンセットでアルミ キャリアを破棄します。
- 100% 樹脂で一晩インキュベート続くガラス蒸留のアセトンで 25%、50%、75% の樹脂で 1 h の孵化を使用して 4 つのステップのエポキシ樹脂シリーズの (残りサファイアディスク) にあるセルに潜入します。交換 100% 樹脂 1 h の次の日。
- 慎重に通過リング 100% 樹脂充填試薬お風呂でマウントにサファイアのディスクを配置します。これらのリングは、10 サファイアディスクの重合型として使用されます。
注: サファイア ディスク プッシュする必要が完全に下に座標読み取り可能な方法で上向きに。これは双眼鏡の発煙の抽出器に添付の助けを借りてチェックでした。また、バイオ セーフティ キャビネット内部の双眼鏡を代わりに使用できます。重要なは、数値 (1-10) サンプルを識別するための試薬の底部に刻印があります。 さらに、サンプルの識別の紙タグがレジン ブロックに含めることが。 - 48 h の 60 ° C のオーブンでサンプルを重合します。
7. パターン サファイアディスク重合樹脂ブロックからの除去
- オーブンから細胞を含む硬質レジン ブロックを削除します。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。そうでない場合を冷ますブロック室温にそれらを切断する前に。 - 樹脂ブロックへのアクセスを持っているかみそりの刃を使用した埋め込み鋳型をカットします。ピンセットを用いた円筒形の樹脂ブロックを削除します。
注: の紙タグが含まれていない場合、樹脂は重合数永久的なマーカーをブロックする前にブロック、1.5 mL 遠心チューブに保管します。プロトコルはここで一時停止することができます。 - ポリスチレンのボックス「バブル」を停止するまで液体窒素を含むサファイアのディスクを含む樹脂ブロックの先端を浸します。その後、H2o. を沸騰の樹脂ブロックの先端を浸す
- 樹脂ブロックからサファイアのディスクになるまでに必要な回数として 2 つの手順を繰り返します。
注意: は、ゴーグルと低温保護手袋を使用します。
注: これが機能しない場合は、再試行する前に、ディスクの周り重合樹脂のビットを削除するかみそりの刃を使用します。プロトコルはここで一時停止することができます。
8. トリミングと透過電子顕微鏡用超薄切片をターゲットに
- 樹脂ブロックの顔に、ウルトラミクロトームの両眼とブロック面を調べることによって興味のセルが存在する領域を識別します。
注: ブロックの顔にパターン化されたサファイア ディスクから座標のパターンの否定的な出版社が保持されます。これは興味のセルが対象となるトリミングの地域の識別を許します。LM 画像は、ブロック面の同じ位置の検索を容易にするため垂直方向に反転する必要があります。 - 台形の形をした小さなフラット ピラミッドに興味のセル/セルを含む埋め込まれた細胞単層をトリム (~ 200 μ m × 250 μ m 平均サイズ) きれいなかみそりの刃を持つ。
- 35 ° のダイヤモンド ナイフで埋め込まれた細胞の超薄切片を 70 nm を取得します。
- 極細ピンセットの助けを借りて EM スロット グリッドのセクションに配置します。
注: セクションがグリッド線によってマスクされるためグリッド:のメッシュの使用は避けてください。 - グリッド ボックスのグリッドを保存します。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。
9. 超薄切片の TEM 分析
- 透過型電子顕微鏡のホルダーにスロット グリッドを配置します。興味のセルの完全な細胞のプロフィールが目に見える低倍率 (概要) 画像を取得します。
注::興味のセル/セルになれます LM によって前に取得した DIC ビューと比較する参照としてセル プロファイルと互いにセルの位置を使って。 - LM でこれまで観測された蛍光信号に対応する機能を超微細構造レベルで見つけようとする興味のセル/セルの高倍率画像を取得します。
注: 概要を持っている興味のセル/セルの高解像度で高倍率でモンタージュ画像が得られます。さらに、それは蛍光画像を比較する前に 3 D でセルを再構築することができる連続したシリアル セクションで同じセルの画像を取得する必要があります。
Representative Results
Lunet Huh7 細胞 T7 RNA ポリメラーゼを安定に発現するパターン化されたサファイア ディスクでシードされ、その後 C 型肝炎ウイルス (HCV) の 2 つのドメインの発現プラスミドをトランスフェクトした (図 1)、ここに示す手順を使用してください。非構造タンパク質 GFP (pTM_AH-D1-GFP) (図 4) が付いた NS5A。次の日どこのセルが増加している模様サファイアディスクに細胞培養皿から撮影され LM (図 4図 2) によるイメージします。AH D1 GFP を発現するそれらの細胞は細胞質の蛍光グリーンの存在によって識別され、サファイアディスク (図 5 a、 5 b) の座標パターン内の彼らの位置を保存する記録。2 つのアルミ キャリア (図 3) の組み立て、HPF による低温固定を受ける LM 審査、興味のセルを含むサファイアディスクの直後します。細胞は置換とその後エポキシ系樹脂に埋め込まれた、凍結されました。
重合樹脂ブロックからサファイアディスクの除去は、英数字のパターンの出版社は興味のセルが置かれたエリアを取得する許可されるブロックの顔に目に見える。樹脂ブロックの残りの部分は興味のセルをかくまっている小さな台形を生成する離れてトリミングでした。連続超薄切片がこの台形から得られる、EM スロット グリッド上で収集された、さらに、TEM (図 5C) によって分析します。注可能な28は手動で連続切片を得る労働集約的なよく訓練され熟練した人材が求められます。また、セルが以前 LM によって識別される同じセルの迅速な認識を保証するためにこのクレム プロトコル (図 5A) に服従するとき低密度を持つことが重要です。そうでなければ、高い細胞密度が劇的に遅くなる EM レベルで細胞の正常な検索します。
TEM 分析から区切られた変数の形態の小胞の蓄積の細胞内空間に存在を明らかに AH D1 GFP を発現した関心 (図 5、 5 e) の細胞の超薄切片をいくつかの単一の脂質 (図 5E) によって細胞質を囲みます。
図 4: ワークフローの模式図に描かれているクレムの例を実行する後図 5.エンコード両親媒性ヘリックス (AH) とドメイン 1 (D1) HCV NS5A タンパク質の DNA プラスミドをトランスフェクトしたされた T7 RNA ポリメラーゼを安定に発現する Lunet Huh7 細胞が GFP (pTM_AH-D1-GFP) とその C 末端タグ付き。NS5A タンパク質の発現は T7 プロモーター (T7 Pm)、並進二次構造によって示された、脳心筋炎ウイルス (EMCV) IRES (内部リボゾームのエントリ サイト) 要素転写制御されます。24 h 後トランスフェクション (24 hpt) 細胞成長パターン サファイアディスクと AH D1 GFP を表現する LM によって検出されすぐに HPF FS を受けます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: クレム プロシージャの例です。(A) Lunet Huh7 細胞成長パターン サファイアディスク、プラスミッドのトランスフェクション後 24 h pTM_AH D1 GFP GFP 陽性細胞を割り当てる蛍光顕微鏡による分析 T7 ポリメラーゼを安定に発現します。(B)クレムによって分析される白の破線の四角形内で選択した単一細胞の高倍率画像。(C) HPF、FS と樹脂埋め込み後同じ細胞の超薄切片の TEM 画像。目的のセルを含むスロット EM グリッド上シリアル 70 nm の超薄切片の模式図(D) 。左側の(E) : 興味のセルの 2 つのセクションの TEM の概要。右上: 単一膜を介して細胞質から区切られた小胞の高い数字を明らかに左側の黄色い四角形で選択した細胞内領域の高倍率 TEM 画像。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
C 型肝炎ウイルス複製関連を明らかにする構造、主に二重膜小胞 (Dmv)21日前に、と同様に、細胞膜上のウイルス蛋白質の表現の影響を研究するここで紹介するクレム方法は、正常に使用されていますこれらの HCV 誘起構造23を形成するために必要な重要なビルディング ブロックを決定します。クレムを使用して c 型肝炎ウイルス複製21を研究する私たちの最初の仕事で、ここで説明したプロトコルのわずかに変更されたバージョンが適用されたことに注意してください。参照パターンが炭素上のファインダーのグリッドでコーティングすることによって作成された、研究、英数字のパターンがない従来の 0.05 mm 厚サファイアディスクで使用されていた (材料の表を参照してください)。現在のプロトコルのこのバージョン最終的に適用できます、利点は HPF の"A"のキャリアが図 3Aのように伐採を必要とせず、直接に使用できます。また、前述のプロトコルでは、"A"キャリアより厚い利用できる (材料の表を参照してください)"B"キャリアを必要とせず、パターン化されたサファイア ディスクと。
興味深いことに、このプロトコルは細胞トランスフェクションとして記述されていたウイルス蛋白質とここと他19、23の BSL 1 サンプルを学習するのみならず、ウイルス感染細胞を研究にも適用できます。人間の病原体の操作が BSL-2 および BSL 3 の所に通常制限されている一部の国でがこれらのバイオ セーフティの条件の下で低温固定化を実行することも可能。それらの BSL 2 および BSL 3 研究所ガラスが HPF マシンのローカル規制有無のために、可能ではない、ウイルス感染細胞まだアルデヒド化学固定は、事前に行われている場合、このメソッドを使用して準備することができます。すなわち BSL 2 または BSL 3 施設前に残しています。また、アルデヒドは、プロトコルの残りの部分はここで説明したものと同じ、蛍光性を保つために固定後すぐに急冷する必要があります。この手法は冗長と 2 回、化学、ガラスを介してセルが固定されているため。しかし、この二重固定プロトコルは細胞化学固定だけで21を受ける Dmv と比較して c 型肝炎ウイルスによる Dmv の多くより良い保全に確かに します。
さらなる変更と読者をトラブルシューティングのためノートこの原稿のプロトコルの部分全体をいいます。これらのノートには、このメソッドを実行するときに発生する可能性が推定上の困難を克服する選択肢と同様、落とし穴を避けるため、について説明します。
この手法を適用するための主な前提条件は、HPF マシンです。とき HPF を介して細胞 (HPF マシンの不在) のために現実的ではないか (とき膜保全を最適化する必要はありません) が不要、低温固定化細胞化学的に固定、その後準備および分析できる EM8、 9,10、11,12,13,14,15,16,17,18 ,19。このオプションには、セルまたはセルのクラスターを再配置するためのグリッド パターンで細胞培養皿が、サファイアのディスクの使用は不要です。これらの料理の使用の主な利点は、大きい表面領域のスクリーニングを許可するサファイアのディスクと比較してより大きな直径です。したがって、このクレム プロトコルのアプリケーションが正常に適用されて15 HCV に対する抗ウイルス化合物の影響を研究するかをノロウイルス19の非構造タンパク質による膜の再編成を視覚化します。このメソッドの性能を制限することができます別の問題商業 FS デバイスの不在であります。この場合、基本的な自家製 FS システムは代わりに利用できます。FS 自動処理事故を低減できますが、自家製のデバイスに使用されます正常に例えばケント マクドナルド30とポール ヴァルターのラボ。
化学固定法に関しては、ここで説明されているプロトコルは、細胞内構造を20の最適な保全を保証します。したがって、上記の HPF と FS デバイスが利用可能な興味のセルを vitrifying 好ましいででしょう。
このクレム アプローチに将来の選択肢には、超微細構造レベルで 2 D の情報を取得するだけでなくウイルスによって引き起こされる膜と細胞小器官の変化のアーキテクチャについては 3 D を得るためにこのメソッドを使用する可能性が含まれます。電子線トモグラフィー (ET) と集束イオンビーム ビーム走査電子顕微鏡 (SEM FIB) (広範囲に記載されている29) などを含む、3 D 電子顕微鏡法は、次のこの現在プロトコル21、用意されているセルにも適用できます。 31。さらに、z スタックの取得を可能にする共焦点の顕微鏡を使用する場合は、LM レベルで 3 D 情報をまた取得でした。実際には、LM と EM のデータセット間の相互関係が目的 (たとえば17を参照) の場合、このオプションはお勧め高い。3D z スタックに含まれる情報は 2D の TEM 像との相関関係を改善するために役立ちます。したがって、このようなシナリオでは、最高のフィッティング LM と EM の画像選択でき相関ソフトウェアの利用、氷 (http://icy.bioimageanalysis.org/)32の ec クレム プラグインなどのランドマーク対応プラグインの 1 つにさらされてイメージ J (http://imagej.net/Landmark_Correspondences) LM EM 画像を重複の生成に終って。
時系列情報は特定のイベントの動態を理解する必要があるときは、EM との組み合わせで生きている細胞の動態を監視するタイムラプス イメージングを使用できます。興味のイベント中に、細胞は EM を介してその後分析することができます「凍結スナップショット」を生成する、固定の時にその特定の瞬間についての詳細な微細構造を提供する、すぐに固定されています。リアルタイムで観察した後、その「凍結スナップショット」を得るために細胞は化学的固定33またはクライオ固定6をすることができます。以来、多くの細胞プロセスが化学固定の拡散プロセスより速く発生する「超急速凍結可能であれば、実行していますください。しかし、その効果的な時間解像度34で HPF マシンは異なることを考慮する重要です。
さらに、このプロトコルはエポキシ樹脂でセルの埋め込みをしていますが低粘度樹脂、Lowicryls、白 LR や LR 金などで、細胞をまた埋め込むことが。これらの埋め込みメディアの使用抗原性35,36, として蛍光37,38を保つことができるし、したがって、セクションに反応39を埋め込み後の大抵使用されます。,40とセクションにクレム41,42,43,44LM は、埋め込み後に行われます。(免疫 EM、セクションにクレム) 両方のアプローチは、非特性構造見つけることができます簡単に TEM 経由もしくは LM と EM の miscorrelation に対する制御信号それらの実験のために重要である必要があります。同様に、両方なイメージ投射様相 (LM および EM) で目視できる抗体を標識することができます実施される45たとえば、LM (ステージを埋め込み済み) で transfected セルを識別しのより正確な局在化を達成するため、GFP 信号を介して免疫 EM (ポスト埋め込みステージ) によってその特定のラベリングします。それを考慮して計算する必要があります、LM EM レベルで細胞アーキテクチャの最適保全があります細胞内領域に対する抗体のアクセスを許可する前に、透過を実施するただし、します。興味深いことに、このプロトコルは、また適してマルチカラー実験では, (下図) GFP 以外、他の蛍光タグを使って実現できます。結論としては、このプロトコルでは、LM や取り上げられる質問によって、EM 側の両方の適応の多くの推定される可能性があります。他の代わりとなる議定書の包括的な説明、リーダーと5,46が呼ばれます。顕微鏡様式を結合する方法に関係なく一緒に結果は良いウイルス、そのタンパク質が実生活で彼らのホストと対話する方法を理解すること、情報のゲインです。
このメソッド内で最も重要なステップは、興味のセルからシリアルのセクションのコレクションです。代表の結果セクションで強調表示されている専門スタッフとして多くの忍耐力が必要です。重要なは、この手順は、2 つの理由のための EM のレベルで細胞を見つけるために不可欠です。まず、あらかじめ LM を埋め込みを用いたクレム プロトコルのこの種の座標は、のみ表示 LM レベル、樹脂ブロックの顔に埋め込み後。しかし、彼らが見えません TEM による断面に。したがって、興味 (ROIs) の領域にダウン ブロックの顔にターゲットを絞ったトリミングはその後得られたセクションが指定された FP を発現している細胞を含むようにかみそりの刃で慎重に達成されなければなりません。第二に、いくつかのセクションを「スキャン」は LM と EM 買収の間最高のオーバーレイを見つけるために必要。この場合、LM を埋め込み後の段階で実行するメソッドとは対照的は LM EM オーバーレイは非常に正確なないです。低オーバーレイ精度は LM と EM、EM のサンプル処理中に収縮と42を断面中に圧縮の軸方向の解像度の違いによるものです。それにもかかわらず、ランドマークの使用などの効率的な管理方法は、戻ってセルを見つけるのに役立ちます。これには、別の 1 つのセルの位置と同様、彼らの核と細胞の形状が含まれます。この点で、プロトコルで説明したように、DIC 画像は相関関係を改善するために重要な細胞の「解剖学的」情報を提供します。また、核または他のよく認識細胞小器官 (ミトコンドリアや脂質など水滴) LM 前にステンド グラスし、目印として使用することができます。
最後に、この原稿はウイルス学研究のためこのテクニックの使用に焦点を当ててより一般的な生物学的質問に対処するこの実験的なデザインのスコープを拡張できます特筆です。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
EMBL (ハイデルベルク)、ハイデルベルク大学の電子顕微鏡によるコア設備 (後頭) スタッフに大変感謝しております。我々 も感謝したいウルリケ ・ Herian ・ ステファニー カリス ・ アンドレア ・ ヘルウィッグ (ハイデルベルク大学)、および Eberhardt シュミット、専門家の技術援助のレナーテ ・ クンツ (ウルム大学)。R. b. によって仕事と彼のチームは、(U.H. と先住民保留地 B) は、ドイツ研究振興協会、SFB1129、TP11、TRR83、TP13 によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UV Crosslinker | Stratagene | 400072 | Stratalinker 1800, 230 Vac, equipped with 254-nm UV light bulbs, 8 Watts/each. |
| Patterned sapphire discs | Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland | 627 | They have a 0.3 mm diameter and are 0.16 mm thick, as well as an an etched alphanumeric pattern to allow for re-location of the cells. They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch. |
| Slim and long tweezers | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 72919-SS | "Style SS", for handling sapphire discs. |
| Cell culture medium | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 41965-062 | Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 2 mM L-glutamine, nonessential amino acids, 100 units penicillin per ml, 100 µg streptomycin per ml and 10% fetal calf serum (DMEM complete, see below). Package containing 10 bottles, 500 mL/each. |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 25030-123 | Package containing 20 bottles of 100 mL/each. |
| Nonessential amino acids | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11140-068 | Package containing 20 bottles of 100 mL/each. |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15140-163 | Package containing 20 bottles of 100 mL/each. |
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA | F7524 | Bottle of 50 mL |
| Inverted microscope | Olympus Deutschland, Hamburg, Germany | CKX41 | It is an inverted microscope with trinocular head options and fluorescence upgrade capability. |
| Huh7-Lunet cells stably expressing the T7 RNA-polymerase | Avaliable at Prof. Dr. Ralf Bartenschlager laboratory | Not available | Contact Prof. Bartenschlager at: ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de. |
| Mirus TransIT-LT1 Transfection Reagent | Mirus Bio LLC, Madison, USA | MIR 2304 | Broad spectrum, low toxicity, DNA transfection reagent. Vial of 0.4 mL |
| Inverted widefield fluorescence microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany | Zeiss Observer.Z1 | Inverted fluorescence microscope for experiments involving living cell cultures. |
| 1-hexadecene | Merck, Darmstadt, Germany | 8220640100 | Bottle of 100 mL |
| "A" aluminium holders for high pressure frezing (HPF) | Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland | 241 | This is the holder that has been used for this protocol and has 2 different depths of 0.1 and 0.2 mm. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch. |
| "B" aluminium holders for HPF | Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland | 242 | This is the holder that has been used for this protocol.It is 0.3 mm thick.They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch. |
| "A" aluminium holder for HPF (special for working with patterned sapphire discs) | Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland | 737 | This is the holder than can be used alone with the patterned sapphire disc (as an alternative to the current protocol), without the need of a "B" holder or the edition of the "A" holder. It is 0.84 mm thick. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch. |
| Sapphire discs | Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland | 405 | These sapphires discs are the "conventional" one, with a 0.3 mm diameter and a thickness of 0.05 mm . They can be also used for CLEM as an alternative instead of patterned sapphire discs. |
| Finder grids | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Philadelphia, USA | LF135-Cu | These 135 mesh grids are used to create an alphanumeric pattern on "conventional" sapphire discs (described above) via carbon coating, so that they can be used for CLEM. 100 grids/vial. |
| HPF machine | ABRA Fluid AG, Widnau, Switzerland | HPM 010 | This HPF machine has been used for this protocol. |
| HPF machine | Leica Microsystems, Vienna, Austria | EMPACT 2 | "EMPACT 2", as an alternative to the use of the HPM machine that it has been used in this protocol (described above). |
| Cryo-tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Z763667-500EA | For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen. Package containing 500 cryovials. |
| Liquid nitrogen dewar | Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany | GZ-05094-60 | For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen, equipped with cryo-racks with a capacity of 1600 cryo-tubes. |
| Automatic freeze substitution (AFS) machine | Leica Microsystems, Vienna, Austria | EM AFS2 | This machine performs freeze substitution and progressive lowering of temperature (PLT) techniques and allows low temperature embedding and polymerization of resins. |
| Osmium tetroxide (OsO4) | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 19150 | 4% aqueous solution, one box containing 10 x 2 mL ampules. |
| Uranyl-Acetate (UA) | Serva, Heidelberg, Germany | 77879.01 | Bottle containing 25 grs of (UA)-2 H2O. |
| Sonicator | Bandelin Electronic, Berlin, Germany | 329 | "Sonorex Super RK 31" is a high-power ultrasonic cleaning bath for aqueous cleaning solution that is used in this protocol to mix OsO4 and Ua when preparing the FS medium. |
| Glass-distilled acetone | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 10015 | Bottle of 100 mL |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica M80 | Routine stereomicroscope for daily inspections, equipped with a camera for capturing images. |
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 14120 | Embed 812 is a kit containing several components that must be mix together in the proportions given by the manufacturers. |
| Flow through rings | Leica Microsystems, Vienna, Austria | 16707157 | Package containing 100 pieces. |
| Reagent baths | Leica Microsystems, Vienna, Austria | 16707154 | Package containing 100 pieces. |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica EM UC7 | Ultramicrotome for preparation of semi- and ultrathin sections at room temperature. |
| Ultra 35 ° diamond knife | Diatome Ltd., Nidau Switzerland |
AGG339-735 | This knife have an edge length of 3 mm. |
| Ultra fine tweezers | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | E78318 | "Style 3X", for handling EM grids. |
| EM slot grids | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | G2010-Cu | 100 grids/vial. |
| EM grid storage box | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 71155 | It has capacity for 100 grids. |
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