Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ट्रैकिंग और इमेजिंग के लिए Correlative लाइट इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (भूखों) क्रायो-मैटीरियल कोशिकाओं में वायरल प्रोटीन संबद्ध संरचनाओं

Published: September 7, 2018 doi: 10.3791/58154
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1, 1, 2,4, 2
1European Molecular Biology Laboratory, 2Department of Infectious Diseases, Molecular Virology, Heidelberg University, 3Central Facility for Electron Microscopy, Ulm University, 4Heidelberg Partner Site, German Center for Infection Research

Summary

एक correlative प्रकाश इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (भूखों) विधि पहले प्रकाश माइक्रोस्कोपी (एल एम) द्वारा चयनित कर रहे हैं कोशिकाओं में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) के माध्यम से छवि वायरस प्रेरित intracellular संरचनाओं के लिए लागू किया जाता है. एल एम और EM एक संकर इमेजिंग दृष्टिकोण के रूप में संयुक्त करने के लिए वायरस की एक एकीकृत दृश्य-मेजबान बातचीत को प्राप्त कर रहे हैं ।

Abstract

अपने उच्च संकल्प के कारण, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) virologists के लिए एक अपरिहार्य उपकरण है । हालांकि, मुख्य कठिनाइयों का विश्लेषण जब उंहें वायरस संक्रमित या transfected कोशिकाओं के माध्यम से उंहें संक्रमण या अभिकर्मक की कम क्षमता है, इन कोशिकाओं की परीक्षा में बाधा । इस कठिनाई को दूर करने के लिए, प्रकाश माइक्रोस्कोपी (एल एम) पहले संक्रमित या transfected कोशिकाओं के उपजनसंख्या आवंटित करने के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है । इस प्रकार, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उपयोग का लाभ लेने (एफपीएस) वायरल प्रोटीन से जुड़े, LM यहां प्रयोग किया जाता है "सकारात्मक-transfected" कोशिकाओं की स्थिति को रिकॉर्ड करने के लिए, एक FP व्यक्त और एक अल्फ़ांयूमेरिक पैटर्न के साथ एक समर्थन पर बढ़ रही है । बाद में, कोशिकाओं को आगे उच्च दबाव ठंड (HPF), फ्रीज प्रतिस्थापन (एफएस) और राल embedding के माध्यम से उंहें के लिए संसाधित कर रहे हैं । अल्ट्रा तेजी से ठंड कदम चयनित कोशिकाओं है कि तब संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) द्वारा ultrastructural स्तर पर विश्लेषण किया जा सकता है की उत्कृष्ट झिल्ली संरक्षण सुनिश्चित करता है । यहाँ, एक कदम दर कदम correlative प्रकाश इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (भूखों) कार्यप्रवाह प्रदान की जाती है, विस्तार में नमूना तैयारी, इमेजिंग और सहसंबंध का वर्णन. प्रायोगिक डिजाइन भी कई सेल जीव विज्ञान के सवालों के समाधान के लिए लागू किया जा सकता है ।

Introduction

एक विशिष्ट जैविक प्रक्रिया की एक बेहतर तस्वीर प्राप्त करने के लिए दो माइक्रोस्कोपी मोडलों के संयोजन के विचार के बजाय पुराना है । इस प्रकार, "correlative माइक्रोस्कोपी" का उपयोग कर वायरस के बारे में बहुत पहले अध्ययन १९६० में दो अलग प्रकाशनों1,2के रूप में प्रकाशित किया गया था । उस अध्ययन में, लेखकों दो माइक्रोस्कोपी तकनीक के माध्यम से एडिनोवायरस द्वारा प्रेरित नाभिक की आकृति विज्ञान में परिवर्तन का विश्लेषण किया. प्रथम प्रकाशन में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) प्रेक्षणों को एडीनोवायरस संक्रमण से जुड़े रूपात्मक विवरण का वर्णन करते हुए1बताया गया. एक दूसरे प्रकाशन में, विभिंन संरचनाओं द्वारा मनाया उंहें प्रकाश माइक्रोस्कोपी (एल एम) histochemical धुंधला पैटर्न के छवियों के साथ संबंधित थे, संरचनाओं की प्रकृति को परिभाषित करने के लिए पहले उंहें2द्वारा मनाया ।

इन प्रारंभिक अध्ययनों में, तथापि, स्वतंत्र प्रयोगों के रूप में तैयार विभिन्न संक्रमित कोशिकाओं का उपयोग करते हुए उनकी टिप्पणियों का प्रदर्शन किया गया. "सहसंबंध" था, वास्तव में, दो इमेजिंग विधियों से आ रही जानकारी के संयोजन के रूप में एक निश्चित घटना को समझने के लिए, सभी निष्कर्षों है कि विभिंन परख के साथ प्राप्त किया गया है क्रम में समझने के लिए एक जैविक दिया तुलना प्रक्रिया.

आजकल, शब्द correlative माइक्रोस्कोपी, भी correlative प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (भूखों) के रूप में जाना जाता है, विधियों की एक बढ़ती हुई संख्या के लिए लागू किया जाता है (संदर्भ में समीक्षित3,4,5), समानता के साथ कि दोनों इमेजिंग तकनीक (LM और उंहें) बाहर बहुत ही नमूना पर किए जाते हैं । दोनों तरीकों के परिणाम के संयोजन, इस प्रकार, एक बहु में, मॉडल, बहु पैमाने पर और उस नमूने3के बहु आयामी विश्लेषण । लाभ कर रहे है कि एल एम कई विभिंन कोशिकाओं का एक व्यापक सिंहावलोकन प्रदान कर सकते हैं, कोशिका उपजनसंख्या एक विषम कोशिका जनसंख्या के भीतर एक प्रोटीन या ब्याज की प्रोटीन व्यक्त की पहचान को सक्षम करने से । EM LM के संकल्प सीमा पर काबू पाता है, एक विशेष intracellular घटना की एक उच्च संकल्प छवि प्रदान करते हैं । इसके अलावा, EM गैर के दृश्य सक्षम बनाता है-फ्लोरोसेंट उपसेलुलर संदर्भ, सभी झिल्ली organelles बाध्य सहित, बड़े macromolecular परिसरों (जैसे, ribosomes, centrioles, आदि) और cytoskeletal तत्वों, जिससे अतिरिक्त स्थानिक जानकारी प्रदान करना, तथाकथित "संदर्भ अंतरिक्ष"6, और फ्लोरोसेंट जगह LM द्वारा पता चला संदर्भ दे रही है ।

पिछले कुछ वर्षों के दौरान, भूखों न केवल सेल जीव5के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है, लेकिन यह भी virologists के लिए (संदर्भ7में समीक्षा की) जटिल वायरस सेल बातचीत है कि एक सफल वायरस के प्रसार के लिए नेतृत्व को समझने के लिए तैयार । इस प्रकार, समझ कैसे वायरस कोशिका झिल्ली को संशोधित करने और अपने स्वयं के लाभ के लिए organelles एंटीवायरल दवाओं के विकास के लिए आवश्यक है रोगजनक वायरस के उंमूलन ।

यहां, एक भूखों विधि वर्णित है कि वायरल प्रोटीन एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफ पी) से जुड़े व्यक्त कोशिकाओं के एल एम द्वारा पता लगाने की अनुमति देता है । इन कोशिकाओं को बाद में क्रायो-मैटीरियल और आगे संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) के माध्यम से ultrastructural विश्लेषण के लिए तैयार है कि कैसे इन प्रोटीन की अभिव्यक्ति intracellular झिल्ली (चित्रा 1) को पुनर्व्यवस्थित में नए अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए । भूखों को दिनांक8,9,10,11,12,13,14 को प्रकाशित वायरोलॉजी अध्ययन के अधिकांश में रासायनिक निर्धारित कक्षों के साथ प्रदर्शन किया गया है ,15,16,17,18,19। यह मुख्य रूप से, क्रायो-2 और-3 (बीएसएल-2 और बीएसएल-3) प्रयोगशालाओं, जहां कोशिकाओं के स्थिरीकरण संभव नहीं है आमतौर पर के लिए सुरक्षा कारणों के लिए संक्रामक सामग्री को निष्क्रिय करने की जरूरत के कारण है । उन सवालों के लिए सेल झिल्ली के एक इष्टतम संरक्षण की आवश्यकता होती है, उच्च दबाव ठंड (HPF) के माध्यम से vitrification है, तथापि, उच्च20की सिफारिश की । इन मामलों में यहां बताए गए भूखों को प्रोटोकॉल लागू किया जा सकता है । दिलचस्प है, खासकर जब संक्रामक नमूनों के साथ काम कर रहे हैं, HPF नमूनों कि पहले रासायनिक निष्क्रिय किया गया है पर किया जा सकता है, उदाहरण के लिए बीएसएल में-2 और बीएसएल-3 प्रयोगशालाओं । HPF के बाद रासायनिक निर्धारण के संयोजन से कम से आंशिक रूप से लाभ क्रायो के लाभ के लिए संभावना है-संरक्षण विधियों21,22.

Figure 1
चित्रा 1 : कार्यप्रवाह के माध्यम से कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व भूखों । पैटर्न नीलमणि डिस्क पर बढ़ रही कोशिकाओं को पहले एल एम द्वारा विश्लेषण कर रहे है उंहें EM के लिए अपने प्रसंस्करण से पहले एफपीएस व्यक्त कोशिकाओं स्थानीयकृत । एक बार स्थित है, कोशिकाओं को तुरंत HPF और एफएस द्वारा तय कर रहे है बाद में राल में एंबेडेड हो । राल के बहुलकीकरण पर, समर्थन जहां कोशिकाओं (= नीलमणि डिस्क) बढ़ रहे थे राल ब्लॉक से हटा दिया जाना चाहिए । ब्लॉक एंबेडेड कोशिकाओं से युक्त एक छोटे trapezium जिसमें से शेष कोशिकाओं, एफपीएस व्यक्त करने के लिए छंटनी की है, एक हीरे चाकू के साथ खोदी हैं । Ultrathin वर्गों स्लॉट ग्रिड पर एकत्र कर रहे है और आगे उनि द्वारा जांच के लिए इन कोशिकाओं के ultrastructural जानकारी प्राप्त करते हैं । यह आंकड़ा अनुकूलित और29संदर्भ से अनुमति के साथ संशोधित किया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Protocol

1. सेल संस्कृति के लिए नमूनों नीलमणि डिस्क की तैयारी

  1. पैटर्न नीलमणि डिस्क स्थानांतरण ( सामग्री की तालिकादेखें), एक अल्फ़ांयूमेरिक पैटर्न के साथ उनकी सतहों में से एक पर धंसा, एक 15 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, अल्फ़ांयूमेरिक पैटर्न के बिना पारंपरिक ०.०५ mm मोटी नीलम डिस्क का इस्तेमाल किया जा सकता है जिसमें एक संदर्भ पैटर्न कार्बन कोटिंग के द्वारा उंहें शीर्ष पर एक खोजक ग्रिड के साथ बनाया गया है । इस उद्देश्य के लिए, वे इथेनॉल के साथ साफ किया जाना चाहिए इससे पहले कि कार्बन पैटर्न लागू है ।
  2. उंहें इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से धो लें । उंहें फिल्टर कागज के साथ एक पेट्री डिश में बाहर फैला है और उंहें सूखी । एक गिलास स्लाइड पर उन्हें स्लिम लंबी चिमटी का उपयोग कर एक दूसरे से अलग रखें ।
  3. एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ की जाँच करें (4x इज़ाफ़ा) निर्देशांक के पैटर्न हर नीलमणि डिस्क पर पठनीय है या नहीं.
    नोट: यदि यह मामला नहीं है, तो चिमटी की मदद से नीलमणि डिस्क फ्लिप ।
  4. एक पेट्री डिश में नीलमणि डिस्क की दुकान ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है ।

2. पैटर्न नीलमणि डिस्क के साथ सेल संस्कृति

  1. 5 मिनट के लिए एक पराबैंगनी (यूवी) crosslinker के साथ नमूनों नीलमणि डिस्क निष्फल ।
  2. नीलम डिस्क को सेल कल्चरल सेफ्टी कैबिनेट में लें । लंबे चिमटी के साथ इथेनॉल के लिए सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ ।
  3. सेल संस्कृति माध्यम के आधे जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) एक सेल संस्कृति डिश के लिए । सेल संस्कृति डिश में लंबी चिमटी के साथ ध्यान से नीलमणि डिस्क स्थानांतरण ।
  4. बीज 1 x 105 Huh7-Lunet कोशिकाओं, छुरा सेल संस्कृति माध्यम के दूसरे आधे में T7 पोलीमरेज़ resuspend, संस्कृति पकवान पर व्यक्त ।
    नोट: इस तरह से सीडिंग किए जाने वाले कक्षों की संख्या परिकलित करें जो प्रयोग के अंतिम बिंदु पर सेल को प्रभावित करने के लिए 20-30% से अधिक नहीं होना चाहिए. उच्च कोशिका घनत्व उंहें बाद के चरणों में कोशिकाओं के स्थानांतरण में बाधा होगी । इसके अलावा, पर-प्रवाह नीलमणि डिस्क से कोशिकाओं की टुकड़ी में परिणाम हो सकता है ।
  5. जांच करें कि नीलमणि डिस्क संस्कृति पकवान के तल पर रहते है और कि अल्फ़ांयूमेरिक निर्देशांक अभी भी उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ पठनीय हैं ।
    नोट: डिस्क सेल संस्कृति माध्यम में फ्लोट, लंबी चिमटी का उपयोग करने के लिए नीचे करने के लिए डिस्क धक्का और अंततः सही अभिविन्यास के लिए उन्हें वापस फ्लिप करने के लिए.
  6. Transfect अगले दिन के रूप में पहले संदर्भ में बताया21,23 अभिकर्मक एजेंट के निर्माता निर्देशों का पालन करें ।

3. पैटर्न नीलमणि डिस्क पर बढ़ रही कोशिकाओं के LM इमेजिंग

  1. एक धातु इमेजिंग प्लेट को प्रयोग के अंत बिंदु पर नीलमणि डिस्क स्थानांतरण 30 से युक्त-50 µ एल/पीएच संकेतक-मुक्त माध्यम की स्थिति गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को कम करने के लिए ।
    नोट: धातु प्लेट यहां वर्णित (चित्रा 2) यूरोपीय आणविक जीवविज्ञान प्रयोगशाला (EMBL) कार्यशाला में डिजाइन किया गया है । इस थाली या एक समान एक के अभाव में, ग्लास नीचे सेल संस्कृति व्यंजन भी इस्तेमाल किया जा सकता है के बजाय एल एम के लिए । यह पीएच संकेतक के बिना मध्यम के लिए सामांय कोशिका संस्कृति माध्यम बदलने के लिए महत्वपूर्ण है । नोट भी है कि लंबे समय जोखिम समय से बचा जाना चाहिए क्योंकि वे photobleaching कारण हो सकता है, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) संचय और कोशिकाओं की शारीरिक क्षति24,25के लिए अग्रणी ।
  2. छवि एक औंधा widefield प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं.
    नोट: एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करते समय (GFP)-टैग प्रोटीन, के रूप में प्रतिनिधि परिणाम में दिखाया गया है, 450-490 एनएम और 500 – 550 एनएम उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर, क्रमशः इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
  3. पहले एक कम आवर्धन छवि (10-20X) कोशिकाओं का अधिग्रहण एफपीएस एक्सप्रेस कोशिकाओं आवंटित करने के लिए । नमूनों नीलमणि डिस्क के निर्देशांक जहां ब्याज की कोशिकाओं विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डिक) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके स्थित हैं ।
    नोट: कई क्षेत्रों सिलाई के लिए सेल के स्थान का एक बेहतर सिंहावलोकन है मदद कर सकता है/ यह भी ध्यान दें कि चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी वैकल्पिक रूप से यहां इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  4. उच्च आवर्धन प्राप्त (प्रतिदीप्ति और उद्योग) छवियां (63-100X, तेल-विसर्जन उद्देश्यों) एक ही सेल के बेहतर intracellular अंतरिक्ष के भीतर ब्याज की उपसेलुलर स्थानीयकरण विचार ।
    नोट:-शब्दकोश छवियां प्रासंगिक जानकारी प्रदान करते हैं । इस जानकारी को अक्सर बाद में एम माइक्रोग्राफ के साथ LM छवियों सहसंबंधी करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि अंतिम सहसंबंध सेल के "संरचनात्मक" स्थलों के साथ और अधिक सटीक है । के रूप में कुछ नीलमणि डिस्क क्रायो-स्थिरीकरण के दौरान टूट सकता है, यह अत्यधिक शर्त प्रति triplicates तैयार करने की सिफारिश की है । इसके अलावा, कुछ कोशिकाओं HPF और इस प्रोटोकॉल के बाद के चरणों के दौरान डिस्क से अलग है, जबकि अंय कोशिकाओं के ultrastructure ठंड नुकसान का एक परिणाम के रूप में कलाकृतियों को शामिल हो सकता है । इसलिए, कम से डिस्क के दो क्षेत्रों LM के माध्यम से imaged होना चाहिए सुनिश्चित करने के लिए कि अंत में पर्याप्त कोशिकाओं का विश्लेषण किया जाएगा । महत्वपूर्ण बात, इन दोनों क्षेत्रों डिस्क के विपरीत पक्षों पर होना चाहिए । इस तरह राल ब्लॉक जहां कोशिकाओं एंबेडेड है दो हिस्सों और इन क्षेत्रों के वर्गों में काटा जा सकता है प्राप्त किया जा सकता है ।

Figure 2
चित्रा 2 : पैटर्न नीलमणि डिस्क पर बढ़ रही कोशिकाओं के LM इमेजिंग के लिए स्कीमा । (क) नीलमणि डिस्क एक इमेजिंग प्लेट के लिए ठीक चिमटी की मदद से स्थानांतरित कर रहे हैं । (बी-सी) इस प्लेट विशेष हीडलबर्ग में EMBL कार्यशाला में डिजाइन किया गया है प्रकाश माइक्रोस्कोप में फिट है, जहां नीलम डिस्क पीएच संकेतक के बिना सेल संस्कृति माध्यम के साथ imaged किया जा सकता है । यह एक धातु स्लाइड, ७५ मिमी x 25 मिमी x 1 मिमी के होते हैं, चार पांच छेद के साथ इसे में मिल गया एक 3 मिमी ड्रिल बिट के साथ नीलमणि डिस्क के आकार फिट । इसके अलावा, छोटे खांचे एक ९० डिग्री के कोण पर छेद के प्रत्येक पक्ष पर मिल रहे थे । ये छेद संदंश के साथ डिस्क का उपयोग करने के लिए जब उंहें जोड़ तोड़ आसान बनाते हैं । इष्टतम इमेजिंग शर्तों ग्लास coverslips 0 (०.०८५ ०.१३ मिमी मोटी) के लिए अनुमति देने के लिए यूवी गोंद के साथ छेद नीचे चिपके हुए थे और यूवी प्रकाश के तहत कठोर करने के लिए रखा । (घ) इसकी सतह पर धंसा हुआ अल्फ़ांयूमेरिक निर्देशांकों का चित्रण करने वाली नमूनों की नीलमणि डिस्क की उच्च आवर्धन छवि । पैटर्न नीलमणि डिस्क व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है ( सामग्री की तालिकादेखें) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

4. क्रायो-HPF के माध्यम से नमूनों नीलमणि डिस्क पर बढ़ रही कोशिकाओं के स्थिरीकरण

  1. HPF के लिए "एक" और "बी" एल्यूमीनियम वाहक प्लेस ( सामग्री की तालिकादेखें) फ़िल्टर 1-hexadecene के साथ लथपथ कागज के साथ एक पेट्री डिश में । 1-hexadecene के साथ एक पेट्री डिश में कोशिकाओं से युक्त पैटर्न नीलमणि डिस्क विसर्जित कर दिया ।
    नोट: डिस्क थोड़ा सेल संस्कृति मध्यम दूर धोने के लिए ले जाएं ।
  2. इस प्रकार (चित्रा 3बी) के रूप में HPF धारक में एक "एक" और एक "बी" एल्यूमीनियम वाहक के बीच नीलमणि डिस्क इकट्ठा । तल पर, एक "बी वाहक" अपने फ्लैट ऊपर की ओर का सामना करना पड़ पक्ष के साथ जगह है । ऊपर की ओर का सामना करना पड़ कोशिकाओं के साथ इस फ्लैट साइड पर नीलमणि डिस्क रखें । अपने ०.१-mm गहराई के साथ एक "एक" वाहक कोशिकाओं का सामना करना पड़ जोड़ें ।
    नोट: पैटर्न नीलमणि डिस्क पारंपरिक नीलमणि डिस्क से अधिक मोटा है क्योंकि, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध "एक" वाहक (गैर नमूनों ०.०५ मिमी नीलमणि डिस्क के साथ इस्तेमाल किया जा करने के लिए डिज़ाइन किया गया) EMBL पर इस ०.२ mm गहराई पक्ष में ०.०५ mm से नीचे काटा जा करने के लिए था कार्यशाला में आदेश HPF धारक में फिट करने के लिए (चित्रा 3ए) । इस उद्देश्य के लिए, "एक" वाहक एक धातु ट्यूब के अंत में डाला जाता है ताकि इसके ०.२ मिमी पक्ष उजागर है और अभी भी रहता है, जबकि इसे काटने नीचे. कट डाउन साइड तो रेत हो गई है जिससे यह फ्लैट है । वैकल्पिक रूप से, एक विशेष एल्यूमीनियम वाहक पैटर्न नीलमणि डिस्क के शीर्ष पर इस्तेमाल किया जा सकता है (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, सामग्री की तालिकादेखें), इस मामले में जा रहा है HPF "सैंडविच" केवल नीलमणि डिस्क और इस वाहक की रचना ।
  3. HPF मशीन के धारक बंद करो और कोशिकाओं को फ्रीज ।
    नोट: यह प्रोटोकॉल किसी विशेष HPF मशीन के लिए विशिष्ट है । अंय HPF मशीनों वैकल्पिक रूप से6,26इस्तेमाल किया जा सकता है । किसी भी मामले में, आपूर्तिकर्ताओं से नई पीढ़ी मशीनों के अस्तित्व के बारे में पता होना कृपया ।
    चेतावनी: सुरक्षा चश्मे और हियरिंग प्रोटेक्शन हेडसेट का उपयोग करें ।
  4. अस्थाई भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन के साथ एक polystyrene बॉक्स में जमे हुए "सैंडविच" प्लेस ।
    चेतावनी: उपयोग काले चश्मे और स्थानीय सुरक्षा अधिकारियों के साथ संपर्क में पाने के संभावित खतरों के बारे में सूचित किया जब तरल नाइट्रोजन हैंडलिंग ।
    1. भ्रम से बचने के लिए, एक अलग ०.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब (polystyrene बॉक्स के अंदर) एक नंबर के साथ चिह्नित में प्रत्येक "सैंडविच" जगह है ।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है । फ्रीज प्रतिस्थापन (FS) तुरंत प्रदर्शन नहीं किया जा सकता है, नमूनों क्रायो-ट्यूबों में संग्रहीत किया जा सकता है (शीर्ष में छिद्रित छेद के साथ) बक्से के अंदर, कि एक क्रायोजेनिक तरल नाइट्रोजन देवर में एक रैक में आयोजित कर रहे हैं ( सामग्री की तालिकादेखें). यह तरल नाइट्रोजन कंटेनर ऑक्सीजन गैस सेंसर के साथ एक कमरे में स्थित होना चाहिए, एक ऑक्सीजन की कमी के मामले में घुटन से बचने के लिए ।
      चेतावनी: सभी प्रक्रियाओं नीचे वर्णित (5 और 6 कदम) एक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए । इसके अलावा, इस्तेमाल किया एजेंट के सबसे खतरनाक हैं । इनका उपयोग करने से पहले, निर्माताओं द्वारा प्रदत्त सामग्री सुरक्षा डेटा पत्रकों को सावधानीपूर्वक पढ़ना अनिवार्य है, साथ ही सुरक्षा अधिकारियों से सुरक्षित हैंडलिंग सुनिश्चित करने के लिए स्थानीय नियमों के बारे में पूछें. इन प्रयुक्त सामग्रियों के सही निपटान के लिए, साथ ही नीचे वर्णित उपकरणों के समुचित उपयोग के लिए भी स्थानीय संस्थान के स्वास्थ्य और सुरक्षा प्रक्रियाओं की सलाह लेना आवश्यक है ।

Figure 3
चित्रा 3 : HPF के लिए दो एल्यूमिनियम वाहकों के बीच नमूनों नीलमणि डिस्क की असेंबली की स्कीमा । (क) एक पारंपरिक "एक वाहक" की कटौती दूर विचार है, कि ०.२ mm से ०.०५ mm करने के लिए अपने गहरे पक्ष पर कटौती की है । (ख) अल्फ़ांयूमेरिक प्रतिमान के साथ ०.१६ mm मोटी नीलमणि डिस्क सतह पर धंसा हुआ HPF के लिए दो एल्यूमिनियम वाहकों में इकट्ठी की जाती है , इस प्रकार है: नीलमणि डिस्क ऊपर की ओर का सामना करना पड़ कोशिकाओं के साथ एक "बी" वाहक के फ्लैट पक्ष पर रखा गया है । एक कटा "एक वाहक" अपनी ०.१ मिमी गहराई के साथ कोशिकाओं का सामना करना पड़ शीर्ष पर रखा गया है "HPF सैंडविच" बंद । एल्यूमीनियम वाहक और नमूनों नीलमणि डिस्क व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है ( सामग्री की तालिकादेखें) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

5. FS of क्रायो-फिक्स्ड सेल

  1. एफएस मशीन को भरने ( सामग्री की तालिकादेखें) तरल नाइट्रोजन के साथ । ९० डिग्री सेल्सियस के लिए तापमान सेट और मशीन इस तापमान तक पहुँच जाता है जब तक इंतजार ।
  2. fs मीडियम को तैयार करें जिसमें ०.२% आज़मियम tetroxide (OsO4) (v/v), ०.१% uranyl एसीटेट (यूए) (डब्ल्यू/वी) ग्लास-आसुत एसीटोन में है जबकि एफएस मशीन नीचे ठंडा है ।
    नोट: तैयार करने के लिए, (उदाहरण के लिए) एफएस मध्यम के 12 मिलीलीटर, एक छोटे गिलास कंटेनर में UA के ०.०१२ जी के साथ 4% OsO4के ६०० µ एल मिश्रण । 5 मिनट के लिए एक अल्ट्रासोनिक स्नान डिवाइस में इस मिश्रण को भंग. एक पिपेट के साथ गिलास आसुत एसीटोन के ११.४ मिलीलीटर जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण ।
  3. एफएस माध्यम के 200-500 µ एल के साथ १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों भरें, ढक्कन बंद करें और उंहें एफएस मशीन के लिए स्थानांतरण । FS मध्यम शांत करने के लिए 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें ।
  4. जमे हुए "सैंडविच" तरल नाइट्रोजन में कोशिकाओं के साथ नीलमणि डिस्क युक्त हस्तांतरण FS माध्यम युक्त ट्यूबों के लिए ठंडा लंबी चिमटी का उपयोग कर ।
    चेतावनी: उपयोग क्रायो-सुरक्षात्मक दस्ताने और काले चश्मे ।
    नोट: HPF "सैंडविच" अनायास उनके हैंडलिंग के दौरान जुदा हो सकता है । इस स्थिति में, सुनिश्चित करें कि जमे हुए नीलमणि डिस्क microcentrifuge ट्यूबों को हस्तांतरित कर रहे हैं । एल्यूमिनियम वाहकों को छोड़ दिया जा सकता है ।
  5. एफएस के रूप में चलाने के अगले दिन तक27:-९० ° c करने के लिए-८० ° c 8 ज के लिए; से-८० ° c करने के लिए-५० ° c 8 ज के लिए; से-५० डिग्री सेल्सियस के लिए-20 ° c 2 ज के लिए; से-20 ° c 2 ज के लिए 0 ° c

6. फ्रीज के प्रतिस्थापन नमूनों की राल embedding

चेतावनी: नीचे वर्णित सभी प्रक्रियाओं को एक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए । इसके अलावा, इस्तेमाल किया एजेंट के सबसे खतरनाक हैं । इनका उपयोग करने से पहले, निर्माताओं द्वारा प्रदत्त सामग्री सुरक्षा डेटा पत्रकों को सावधानीपूर्वक पढ़ना अनिवार्य है, साथ ही सुरक्षा अधिकारियों से सुरक्षित हैंडलिंग सुनिश्चित करने के लिए स्थानीय नियमों के बारे में पूछें. इन प्रयुक्त सामग्रियों के सही निपटान के लिए, साथ ही नीचे वर्णित उपकरणों के समुचित उपयोग के लिए भी स्थानीय संस्थान के स्वास्थ्य और सुरक्षा प्रक्रियाओं की सलाह लेना आवश्यक है ।

  1. बाहर एफएस मशीन से प्रतिस्थापित नमूनों ले लो और उंहें बर्फ पर 20 मिनट के लिए जगह है ।
  2. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूने रखें और उंहें अच्छी तरह से धोने (3 बार, 10 मिनट प्रत्येक) कांच के साथ आसुत एसीटोन । लंबे समय चिमटी के साथ एल्यूमीनियम वाहक त्यागें यदि वे एफएस के बाद microcentrifuge ट्यूबों में अब भी कर रहे हैं ।
  3. कोशिकाओं घुसपैठ (शेष नीलमणि डिस्क पर) में एक चार कदम epoxy राल श्रृंखला 25%, ५०% में 1 एच की गर्मी का उपयोग कर, और ग्लास में ७५% राल-आसुत एसीटोन, १००% राल के साथ रात भर की मशीन द्वारा पीछा किया । एक्सचेंज १००% $ एक के लिए अगले दिन राल ।
  4. ध्यान से प्रवाह के माध्यम से में नीलमणि डिस्क प्लेस-एजेंट १००% राल से भरा स्नान में घुड़सवार के माध्यम से छल्ले । ये रिंगों 10 नीलमणि डिस्क के लिए बहुलकीकरण मोल्ड के रूप में उपयोग किया जाता है ।
    नोट: नीलमणि डिस्क पूरी तरह से एक पठनीय तरीके से ऊपर की ओर का सामना करना पड़ निर्देशांक के साथ नीचे करने के लिए धक्का दिया जाना चाहिए । यह एक एक धुएं चिमटा से जुड़ी दूरबीन की मदद से जांच की जा सकती है । वैकल्पिक रूप से, एक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर एक दूरबीन के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है । महत्वपूर्ण बात यह है कि नमूनों की पहचान करने में मदद करने वाले रिएजेंटों के तल पर उत्कीर्ण संख्या (1-10) हैं ।  इसके अलावा, नमूनों की पहचान के लिए एक कागज टैग राल ब्लॉक में शामिल किया जा सकता है ।
  5. Polymerize के नमूनों को ओवन में ६० डिग्री सेल्सियस पर ४८ एच.

7. बहुलक राल ब्लॉकों से नमूनों नीलमणि डिस्क को हटाने

  1. ओवन से कोशिकाओं युक्त हार्ड राल ब्लॉकों को हटा दें ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है । यदि नहीं, तो ब्लॉक उन्हें काटने से पहले कमरे के तापमान को शांत करते हैं ।
  2. राल ब्लॉकों के लिए उपयोग करने के लिए एक उस्तरा ब्लेड के साथ embedding molds काटें । चिमटी का उपयोग कर बेलनाकार राल ब्लॉकों निकालें ।
    नोट: यदि एक कागज टैग बहुलकीकरण से पहले राल ब्लॉक में शामिल नहीं किया गया है, एक स्थाई मार्कर के साथ ब्लॉक संख्या और उंहें १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में दुकान । प्रोटोकॉल यहां ठहर सकता है ।
  3. एक polystyrene तरल नाइट्रोजन युक्त बॉक्स में नीलमणि डिस्क युक्त राल ब्लॉक की नोक विसर्जित जब तक यह बंद हो जाता है "bubbling" । फिर, उबलते एच2ओ में राल ब्लॉक की नोक विसर्जित कर दिया ।
  4. दो पिछले कदम के रूप में कई बार जब तक नीलमणि डिस्क राल ब्लॉक के बंद हो जाता जरूरत के रूप में दोहराएं ।
    चेतावनी: उपयोग काले चश्मे और क्रायो सुरक्षात्मक दस्ताने ।
    नोट: यदि यह काम नहीं करता है, एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग करने के लिए फिर से कोशिश कर रहा से पहले डिस्क के आसपास बहुलक राल का एक सा हटा दें । प्रोटोकॉल यहां ठहर सकता है ।

8. लक्षित ट्रिमिंग और Ultrathin के लिए अनुभाग

  1. राल ब्लॉक चेहरे पर क्षेत्र की पहचान जहां ब्याज की कोशिकाओं को एक ultramicrotome के दूरबीन के साथ ब्लॉक चेहरा जांच द्वारा मौजूद हैं ।
    नोट: पैटर्न वाली नीलमणि डिस्क से समंवय पैटर्न की नकारात्मक छाप ब्लॉक चेहरे पर बनाए रखा है । यह उस क्षेत्र की पहचान की अनुमति देता है जहां ब्याज की कोशिकाएं लक्षित ट्रिमिंग के लिए स्थित होती हैं । ब्लॉक चेहरे की एक ही स्थिति की खोज को सुविधाजनक बनाने के क्रम में LM छवियों को अनुलंब रूप से फ़्लिप किया जाना चाहिए ।
  2. एक स्वच्छ उस्तरा ब्लेड के साथ एक trapezium (~ २०० µm × २५० µm औसत आकार) के आकार के साथ एक छोटे फ्लैट पिरामिड के लिए ब्याज की सेल/कक्ष युक्त एंबेडेड सेल monolayer ट्रिम ।
  3. एक ३५ ° हीरे चाकू के साथ एंबेडेड कोशिकाओं के ७०-एनएम ultrathin वर्गों प्राप्त करें ।
  4. अल्ट्रा ठीक चिमटी की मदद से EM स्लॉट ग्रिड पर वर्गों प्लेस ।
    नोट:: मेष ग्रिड के उपयोग से बचा जाना चाहिए क्योंकि वर्गों ग्रिड सलाखों के द्वारा नकाबपोश किया जा सकता है ।
  5. ग्रिडों को एक ग्रीड बॉक्स में संग्रहीत करें ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है ।

9. Ultrathin वर्गों के उनि विश्लेषण

  1. संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के धारक में स्लॉट ग्रिड रखें । कम आवर्धन (अवलोकन) छवियां प्राप्त करें, जहां रुचि के कक्ष का पूरा कक्ष प्रोफ़ाइल दृश्यमान है ।
    नोट:: सेल/ब्याज की कोशिकाओं सेल प्रोफाइल और कोशिकाओं के स्थानों का उपयोग करके वापस पाया जा सकता है संदर्भ के रूप में एक दूसरे के लिए, एल एम द्वारा पहले अधिग्रहीत किए गए विचारों की तुलना ।
  2. सेल के उच्च आवर्धन छवियां प्राप्त करें/ब्याज की कोशिकाओं, कोशिश करते है और खोजने के लिए, ultrastructural स्तर पर, विशेषताएं है कि फ्लोरोसेंट संकेतों के अनुरूप LM द्वारा पहले मनाया ।
    नोट: असेंबल छवियों उच्च आवर्धन पर प्राप्त किया जा सकता है सेल के उच्च संकल्प पर एक सिंहावलोकन है/ इसके अलावा, यह अक्सर प्रतिदीप्ति छवियों की तुलना करने से पहले 3 डी में सेल पुनर्निर्माण करने में सक्षम होने के लिए लगातार धारावाहिक वर्गों में एक ही सेल की छवियों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है ।

Representative Results

यहां प्रस्तुत प्रक्रिया का उपयोग करना (चित्रा 1), Huh7-Lunet की कोशिकाओं को छुरा T7-आरएनए पोलीमरेज़ व्यक्त पैटर्न नीलमणि डिस्क पर वरीयता प्राप्त थे और बाद में एक transfected के साथ प्लाज्मिड हेपेटाइटिस सी वायरस (HCV) के दो डोमेन व्यक्त गैर संरचनात्मक प्रोटीन NS5A, GFP के साथ टैग (pTM_AH-D1-GFP) (चित्रा 4) । अगले दिन, नमूनों नीलमणि डिस्क, जहां कोशिकाओं बढ़ रहे थे, सेल संस्कृति व्यंजन से बाहर ले जाया गया और एल एम के माध्यम से imaged (4 चित्रा, चित्रा 2) । उन कोशिकाओं को व्यक्त आह-D1-GFP cytosol में हरे प्रतिदीप्ति की उपस्थिति द्वारा की पहचान की और समंवय-नीलमणि डिस्क (आंकड़े 5, 5B) के पैटर्न के भीतर अपनी स्थिति को बचाने के लिए दर्ज किया गया । तुरंत उनके LM परीक्षा के बाद, नीलमणि डिस्क ब्याज की कोशिकाओं से युक्त दो एल्यूमीनियम वाहक (चित्रा 3) और HPF द्वारा क्रायो-स्थिरीकरण के अधीन इकट्ठे हुए थे । कोशिकाओं तो प्रतिस्थापित और बाद में एक epoxy राल में एंबेडेड फ्रीज थे ।

बहुलक राल ब्लॉकों से नीलमणि डिस्क को हटाने पर, अल्फ़ांयूमेरिक पैटर्न की छाप ब्लॉक चेहरे पर दिखाई दे रहा था, जो उन क्षेत्रों को पुनः प्राप्त करने की अनुमति देता है जहां ब्याज की कोशिकाएं स्थित थीं । राल ब्लॉक के बाकी दूर छंटनी के लिए एक छोटे से ब्याज की कोशिकाओं बंदरगाह trapezium उत्पंन किया गया । धारावाहिक ultrathin वर्गों इस trapezium से प्राप्त किया गया था, EM स्लॉट ग्रिड पर एकत्र और आगे उनि द्वारा विश्लेषण (चित्रा 5सी). ध्यान दें कि मैंयुअल रूप से क्रमिक वर्गों प्राप्त करने हालांकि संभव28 श्रम गहन है और अच्छी तरह से प्रशिक्षित और कुशल कर्मियों की आवश्यकता है । यह भी महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को एक कम प्रवाह है जब इस भूखों प्रोटोकॉल (चित्रा 5ए) के अधीन आदेश में एक ही सेल पहले LM द्वारा की पहचान की एक त्वरित मांयता की गारंटी है । अंयथा, उच्च कोशिका प्रवाह होने नाटकीय रूप से नीचे EM स्तर पर कोशिकाओं का पता लगाने के सफल धीमा हो सकता है ।

हित के सेल के कई ultrathin वर्गों के उनि विश्लेषण (आंकड़े 5d, 5E), आह-D1-GFP व्यक्त, चर आकृति विज्ञान के बुलबुले के बड़े संचय के अपने intracellular अंतरिक्ष में उपस्थिति से पता चला एक एकल लिपिड bilayer द्वारा cytosol आसपास (चित्रा 5ई).

Figure 4
चित्र 4 : कार्यप्रवाह के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व भूखों में चित्रित उदाहरण प्रदर्शन करने के लिए पीछा किया चित्रा 5 . Huh7-Lunet कोशिकाओं T7-आरएनए पोलीमरेज़ व्यक्त डीएनए transfected प्लाज्मिड (amphipathic-d1-HCV) के साथ अपने C-टर्मिनल पर टैग (आह) और NS5A प्रोटीन का डोमेन 1 (D1) एंकोडिंग GFP के साथ pTM_AH थे । NS5A प्रोटीन के इस भाग की अभिव्यक्ति एक T7 प्रवर्तक द्वारा transcriptionally नियंत्रित किया जाता है (T7 प्रधानमंत्री) और एक encephalomyocarditis वायरस (EMCV) आयरेस (आंतरिक ribosome प्रविष्टि साइट) तत्व द्वारा अनुवाद, एक द्वितीयक संरचना द्वारा संकेत दिया । चौबीस एच पोस्ट-अभिकर्मक (24 hpt) पैटर्न नीलमणि डिस्क पर बढ़ रही कोशिकाओं और आह-D1-GFP एक्सप्रेस LM द्वारा पता लगाया गया और तुरंत HPF-FS के अधीन थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : एक भूखों की प्रक्रिया का उदाहरण । (क) Huh7-Lunet कोशिकाओं को छुरा प्रतिदीप्ति GFP-D1-अभिकर्मक के साथ प्लाज्मिड के बाद pTM_AH-सकारात्मक कोशिकाओं patterned नीलमणि डिस्क पर उगाए आबंटित करने के लिए, T7 पोलीमरेज़ द्वारा विश्लेषण किया है । (ख) भूखों द्वारा विश्लेषण किए जाने के लिए सफ़ेद डैश्ड आयत के भीतर चयनित एकल कक्ष की उच्चतर आवर्धन छवि । (ग) HPF, एफएस और राल embedding के बाद एक ही सेल के एक ultrathin अनुभाग के उनि छवि । (घ) धारावाहिक ७० के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व-एनएम ultrathin वर्गों एक स्लॉट EM ब्याज की कोशिका युक्त ग्रिड पर । (ङ) बाईं ओर: उनि हित के प्रकोष्ठ के दो वर्गों का अवलोकन. दाईं ओर: बाईं तरफ पीले आयतों में चयनित intracellular क्षेत्रों के उच्च आवर्धन उनि छवियों, एक एकल झिल्ली के माध्यम से cytosol से सीमांकित बुलबुले की उच्च संख्या का खुलासा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

यहां प्रस्तुत भूखों की कार्यप्रणाली के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक वायरल प्रोटीन अभिव्यक्ति कोशिका झिल्ली पर सफलतापूर्वक किया गया है स्पष्ट करने से पहले HCV प्रतिकृति-संबद्ध संरचनाओं, मुख्य रूप से डबल झिल्ली बुलबुले (DMVs)21, के रूप में अच्छी तरह के रूप में करने के लिए इन HCV-प्रेरित संरचनाओं को बनाने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण बिल्डिंग ब्लॉकों का निर्धारण23. ध्यान दें कि हमारी पहली काम में भूखों का उपयोग करने के लिए HCV प्रतिकृति21अध्ययन, प्रोटोकॉल का एक थोड़ा संशोधित संस्करण यहां लागू किया गया था । उस अध्ययन में, पारंपरिक ०.०५ mm मोटी नीलमणि डिस्क, अल्फ़ांयूमेरिक पैटर्न के बिना, उपयोग किया गया जिसमें एक संदर्भ पैटर्न कार्बन कोटिंग के द्वारा उंहें शीर्ष पर एक खोजक ग्रिड के साथ बनाया गया था ( सामग्री की तालिकादेखें) । वर्तमान प्रोटोकॉल के इस संस्करण को अंततः लागू किया जा सकता है, लाभ के साथ कि "HPF के लिए एक वाहक" सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है, इसे काटने के नीचे की जरूरत के रूप में चित्रा 3एके बिना । वैकल्पिक रूप से, के रूप में प्रोटोकॉल में उल्लेख किया है, एक मोटा "एक वाहक" का उपयोग किया जा सकता है ( सामग्री की तालिकादेखें) नमूनों नीलमणि डिस्क के साथ, एक "बी" वाहक की आवश्यकता के बिना ।

दिलचस्प है, इस प्रोटोकॉल को न केवल बीएसएल-1 नमूनों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे वायरल प्रोटीन के साथ transfected कोशिकाओं के रूप में यहां और कहीं और19,23, लेकिन यह भी वायरस संक्रमित कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए । हालांकि मानव रोगजनकों के साथ काम करना आमतौर पर बीएसएल-2 और बीएसएल-3 प्रयोगशालाओं के लिए प्रतिबंधित है, कुछ देशों में यह अभी भी इन सुरक्षा शर्तों के तहत क्रायो-स्थिरीकरण करने के लिए संभव है । उन बीएसएल-2 और बीएसएल-3 प्रयोगशालाओं में जहां vitrification संभव नहीं है, स्थानीय विनियमों या एक HPF मशीन के अभाव के कारण, वायरस संक्रमित कोशिकाओं को अभी भी इस पद्धति का उपयोग करके तैयार किया जा सकता है यदि aldehydes के साथ रासायनिक निर्धारण अग्रिम रूप से किया जाता है, अर्थात् बीएसएल-2 या बीएसएल-3 सुविधाओं को छोड़ने से पहले । इसके अलावा, aldehydes को प्रतिदीप्ति रखने के लिए निर्धारण के तुरंत बाद बुझती है, जबकि प्रोटोकॉल के बाकी एक यहां वर्णित के समान है की जरूरत है । इस तकनीक को निरर्थक माना जा सकता है क्योंकि कोशिकाएँ दो बार, रासायनिक रूप से और vitrification के जरिए तय होती हैं. हालांकि, इस दोहरे निर्धारण प्रोटोकॉल वास्तव में21HCV रासायनिक निर्धारण के अधीन कोशिकाओं में पाया DMVs की तुलना में प्रेरित DMVs के एक बहुत बेहतर संरक्षण करने के लिए सुराग ।

आगे संशोधनों के लिए और समस्या निवारण पाठक इस पांडुलिपि के प्रोटोकॉल हिस्सा भर में नोटों को भेजा जाता है । इन नोटों नुकसान का वर्णन से बचने के लिए, साथ ही साथ विकल्प ख्यात कठिनाइयों है कि पैदा हो सकता है जब इस विधि प्रदर्शन पर काबू पाने के लिए ।

इस तकनीक को लागू करने के लिए मुख्य अपेक्षित एक HPF मशीन है । जब क्रायो-HPF के माध्यम से कोशिकाओं को स्थिर (एक HPF मशीन के अभाव के कारण) संभव नहीं है या आवश्यक नहीं है (जब झिल्ली संरक्षण इष्टतम होने की जरूरत नहीं है), कोशिकाओं को रासायनिक तय किया जा सकता है और बाद में तैयार और उंहें8द्वारा विश्लेषण, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19. यह विकल्प नीलमणि डिस्क के उपयोग की आवश्यकता नहीं है, लेकिन कक्ष या सेल समूहों को स्थानांतरित करने के लिए gridded पैटर्न के साथ सेल संस्कृति व्यंजन । इन व्यंजनों के उपयोग का मुख्य लाभ नीलमणि डिस्क की तुलना में उनके बड़े व्यास है, बड़े सतह क्षेत्रों की स्क्रीनिंग की अनुमति । इस प्रकार, इस भूखों प्रोटोकॉल के आवेदन सफलतापूर्वक HCV15 के खिलाफ एक एंटीवायरल यौगिक के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए या noroviruses19के संरचनात्मक प्रोटीन द्वारा प्रेरित झिल्ली पुनर्व्यवस्थाओं कल्पना करने के लिए लागू किया गया है । एक वाणिज्यिक FS डिवाइस की अनुपस्थिति इस विधि के प्रदर्शन को सीमित कर सकते है जो किसी अंय समस्या है । इस मामले में, बुनियादी घर का बना एफएस प्रणालियों के बजाय उपयोग किया जा सकता है । हालांकि स्वत: FS उपकरणों से निपटने की दुर्घटनाओं को कम कर सकते हैं, घर का बना उपकरणों सफलतापूर्वक उदाहरण के लिए केंट मैकडॉनल्ड्स30 और पॉल वाल्थर लैब्स में इस्तेमाल कर रहे हैं ।

रासायनिक निर्धारण के संबंध में, यहां वर्णित प्रोटोकॉल intracellular संरचनाओं20के एक इष्टतम संरक्षण सुनिश्चित करता है । इसलिए, मामले में उपर्युक्त HPF और FS उपकरणों उपलब्ध हैं, vitrifying ब्याज की कोशिकाओं को पसंद किया जाएगा ।

इस भूखों दृष्टिकोण के लिए भविष्य के विकल्प न केवल ultrastructural स्तर पर 2d जानकारी प्राप्त करने के लिए इस विधि का उपयोग करने की संभावना शामिल हैं, लेकिन यह भी झिल्ली और organelle परिवर्तन वायरस की वजह से वास्तुकला के बारे में 3 डी जानकारी हासिल करने के लिए । 3 डी EM तरीके, इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (एट) और केंद्रित आयन बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मिथ्या-SEM) (बड़े पैमाने पर29में वर्णित), भी कोशिकाओं है कि इस मौजूदा प्रोटोकॉल के बाद तैयार किया गया है पर लागू किया जा सकता है21, 31. इसके अलावा, 3 डी जानकारी भी LM स्तर पर प्राप्त किया जा सकता है, जब एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, जो जेड के अधिग्रहण के ढेर की अनुमति देता है । वास्तव में, यह विकल्प अत्यधिक अनुशंसित है जब LM और EM डेटासेट के बीच एक सटीक सहसंबंध वांछित है (उदाहरण के लिए17देखें) । जानकारी 3 डी में शामिल z-पोट एड्स 2d उनि छवियों के साथ संबंध में सुधार होगा । इस प्रकार, इस तरह के एक परिदृश्य में, सबसे अच्छा फिटिंग LM और EM छवियों का चयन किया जा सकता है और फिर इस तरह के चुनाव आयोग के रूप में उपलब्ध सहसंबंध सॉफ्टवेयर में से एक के अधीन, बर्फीले के भूखों प्लगइन (http://icy.bioimageanalysis.org/)३२ या मील का पत्थर पत्राचार प्लगइन छवि जंमू (http://imagej.net/Landmark_Correspondences), अतिव्यापी LM-EM छवियों की पीढ़ी में जिसके परिणामस्वरूप ।

जब लौकिक जानकारी के लिए एक निश्चित घटना के कैनेटीक्स समझने की जरूरत है, समय चूक इमेजिंग के संयोजन में उंहें जीवित कोशिकाओं की गतिशीलता की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । ब्याज की घटना के दौरान, कोशिकाओं को तुरंत तय कर रहे हैं, एक "जमे हुए स्नैपशॉट" है कि बाद में उंहें के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है सृजन, स्थिरीकरण के समय उस विशेष क्षण के बारे में विस्तृत ultrastructural जानकारी प्रदान । "जमे हुए स्नैपशॉट" प्राप्त करने के लिए, वास्तविक समय में अवलोकन के बाद, कोशिकाओं को या तो रासायनिक३३ या क्रायो-मैटीरियल6तय किया जा सकता है । चूंकि कई सेलुलर प्रक्रियाओं रासायनिक निर्धारण की प्रसार प्रक्रियाओं की तुलना में तेजी से होते हैं, यदि संभव हो तो, अल्ट्रा तेजी से ठंड प्रदर्शन किया जाना चाहिए । हालांकि, यह HPF मशीनों उनके प्रभावी समय समाधान३४में अलग खाते में लेने के लिए महत्वपूर्ण है ।

इसके अलावा, हालांकि इस प्रोटोकॉल एक epoxy राल में कोशिकाओं की embedding के लिए डिजाइन किया गया है, कोशिकाओं को भी कम चिपचिपापन रेजिन में एंबेडेड किया जा सकता है, ऐसे Lowicryls, lr सफेद या lr सोने के रूप में । इन एंबेडिंग मीडिया के उपयोग के लिए antigenicity३५,३६, साथ ही साथ प्रतिदीप्ति३७,३८ और, इसलिए, ज्यादातर पद के लिए इस्तेमाल किया जाता है-embedding पर धारा immunolabeling३९ के संरक्षण के लिए सक्षम बनाता है , ४० और पर धारा भूखों४१,४२,४३,४४, जहां एल एम एंबेडिंग के बाद किया जाता है । दोनों दृष्टिकोण (इंयूनो और पर धारा भूखों) उन प्रयोगों जिसमें गैर विशेषता संरचनाओं के माध्यम से आसानी से पाया जा सकता है और/या LM और EM संकेतों के बीच संबंध के खिलाफ एक नियंत्रण के रूप में के लिए महत्वपूर्ण होना चाहिए । इसी तरह, एंटीबॉडी के साथ लेबल है कि दोनों इमेजिंग तरीके से visualized किया जा सकता है (lm और उंहें)४५ बाहर किया जा सकता है क्रम में करने के लिए, उदाहरण के लिए, LM में transfected कोशिकाओं की पहचान (पूर्व embedding चरण) और एक बहुत अधिक सटीक स्थानीयकरण प्राप्त इंयूनो द्वारा अपनी विशिष्ट लेबलिंग के द्वारा GFP संकेत-EM (पोस्ट embedding चरण) । यह ध्यान में रखा जाना चाहिए, तथापि, कि permeabilization एल एम से पहले आयोजित किया जाता है intracellular अंतरिक्ष के लिए एंटीबॉडी के उपयोग की अनुमति है, जो एक उप में परिणाम हो सकता है, EM स्तर पर सेल वास्तुकला के इष्टतम संरक्षण । दिलचस्प है, इस प्रोटोकॉल भी अच्छी तरह से बहु के लिए अनुकूल रंग प्रयोगों कि अंय फ्लोरोसेंट टैग के उपयोग के साथ प्राप्त किया जा सकता है, GFP के अलावा अंय (के रूप में यहां दिखाया गया है) । अंत में, वहां इस प्रोटोकॉल, दोनों LM पर और/या EM पक्षों पर, कि सवालों को संबोधित किया जा रहा है पर निर्भर करता है अनुकूलन के कई ख्यात संभावनाएं हैं । अंय वैकल्पिक प्रोटोकॉल के एक व्यापक विवरण के लिए पाठक5,४६को संदर्भित किया जाता है । कैसे माइक्रोस्कोप मोडलों संयुक्त कर रहे हैं की परवाह किए बिना, एक साथ परिणाम जानकारी का एक लाभ है, हमें बेहतर कैसे वायरस और उनके प्रोटीन वास्तविक जीवन में उनके मेजबान के साथ बातचीत को समझने के लिए अनुमति देता है ।

इस विधि के भीतर सबसे महत्वपूर्ण कदम ब्याज की कोशिकाओं से धारावाहिक वर्गों का संग्रह है । के रूप में प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में प्रकाश डाला, यह विशेषज्ञ कर्मचारियों की आवश्यकता है, साथ ही धैर्य का एक बहुत । महत्वपूर्ण बात, इस कदम को दो कारणों के लिए EM स्तर पर वापस कोशिकाओं को खोजने के लिए आवश्यक है । पहले, भूखों प्रोटोकॉल के इस प्रकार में पूर्व-embedding lm का उपयोग कर, निर्देशांक केवल lm स्तर पर दिखाई देते हैं और embedding के बाद राल ब्लॉक चेहरे पर. हालांकि, वे उनि द्वारा वर्गों पर दिखाई नहीं होगा । इसलिए, ब्लॉक ब्याज (ROIs) के क्षेत्रों के लिए नीचे चेहरे पर छंटनी लक्षित एक उस्तरा ब्लेड के साथ ध्यान से पूरा किया जाना चाहिए सुनिश्चित करने के लिए कि वर्गों है कि बाद में प्राप्त कर रहे है एक दी FP व्यक्त कोशिकाओं होते हैं । दूसरा, "स्कैनिंग" कई वर्गों के लिए LM और EM अधिग्रहण के बीच सबसे अच्छा ओवरले खोजने के लिए आवश्यक है । तरीके जहां एल एम के बाद में किया जाता है इसके विपरीत-embedding चरण, इस मामले में lm-EM ओवरले इतना सटीक नहीं है । कम ओवरले सटीकता एल एम और em के बीच अक्षीय संकल्प में मतभेदों के कारण है, उंहें के नमूना प्रसंस्करण के दौरान संकोचन, और संपीड़न४२के दौरान । फिर भी, इस तरह के स्थलों के उपयोग के रूप में कुशल ट्रैकिंग तरीकों, कोशिकाओं को वापस खोजने में मदद । यह एक कोशिका की स्थिति को दूसरे में शामिल है, साथ ही साथ कोशिकाओं और उनके नाभिक के आकार । इस संबंध में, के रूप में प्रोटोकॉल में बताया, उद्योग के चित्र "शारीरिक" कोशिकाओं है कि सहसंबंध में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण है की जानकारी प्रदान करते हैं । वैकल्पिक रूप से, नाभिक या अंय अच्छी तरह से पहचानने वाले सेल organelles (जैसे mitochondria या लिपिड बूंदों) LM से पहले दाग और स्थलों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

अंत में, यह उल्लेख करने के लिए उल्लेखनीय है कि यद्यपि इस पांडुलिपि वायरोलॉजी अध्ययन के लिए इस तकनीक के उपयोग पर ध्यान केंद्रित किया है, इस प्रायोगिक डिजाइन की गुंजाइश को और अधिक सामांय जैविक प्रश्नों के पते को विस्तार दिया जा सकता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम EMBL (हीडलबर्ग) में और हीडलबर्ग विश्वविद्यालय में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी कोर सुविधाओं (EMCF) के स्टाफ के सदस्यों के लिए बहुत आभारी हैं । हम भी Ulrike Herian, स्टेफ़नी कैलिस और Andrea Hellwig (हीडलबर्ग विश्वविद्यालय), के रूप में अच्छी तरह के रूप में Eberhardt श्मिट और renate Kunz विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए (उल्म विश्वविद्यालय) शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । R.B. और उनकी टीम (U.H. और I.R.-बी.) द्वारा काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft, SFB1129, TP11 और TRR83, TP13 द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UV Crosslinker Stratagene 400072 Stratalinker 1800, 230 Vac, equipped with 254-nm UV light bulbs, 8 Watts/each.
Patterned sapphire discs Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland 627 They have a 0.3 mm diameter and are 0.16 mm thick, as well as an an etched alphanumeric pattern to allow for re-location of the cells. They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
Slim and long tweezers Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 72919-SS "Style SS", for handling sapphire discs.
Cell culture medium Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 41965-062 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 2 mM L-glutamine, nonessential amino acids, 100 units penicillin per ml, 100 µg streptomycin per ml and 10% fetal calf serum (DMEM complete, see below). Package containing 10 bottles, 500 mL/each.
L-glutamine Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 25030-123 Package containing 20 bottles of 100 mL/each.
Nonessential amino acids Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 11140-068 Package containing 20 bottles of 100 mL/each.
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15140-163 Package containing 20 bottles of 100 mL/each.
Fetal calf serum Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA F7524 Bottle of 50 mL
Inverted microscope Olympus Deutschland, Hamburg, Germany CKX41 It is an inverted microscope with trinocular head options and fluorescence upgrade capability.
Huh7-Lunet cells stably expressing the T7 RNA-polymerase Avaliable at Prof. Dr. Ralf Bartenschlager laboratory Not available Contact Prof. Bartenschlager at: ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de.
Mirus TransIT-LT1 Transfection Reagent Mirus Bio LLC, Madison, USA MIR 2304 Broad spectrum, low toxicity, DNA transfection reagent. Vial of 0.4 mL
Inverted widefield fluorescence microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany Zeiss Observer.Z1 Inverted fluorescence microscope for experiments involving living cell cultures.
1-hexadecene Merck, Darmstadt, Germany 8220640100 Bottle of 100 mL
"A" aluminium holders for high pressure frezing (HPF) Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland 241 This is the holder that has been used for this protocol and has 2 different depths of 0.1 and 0.2 mm. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
"B" aluminium holders for HPF Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland 242 This is the holder that has been used for this protocol.It is 0.3 mm thick.They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
"A" aluminium holder for HPF (special for working with patterned sapphire discs) Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland 737 This is the holder than can be used alone with the patterned sapphire disc (as an alternative to the current protocol), without the need of a "B" holder or the edition of the "A" holder. It is 0.84 mm thick. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
Sapphire discs Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland 405 These sapphires discs are the "conventional" one, with a 0.3 mm diameter and a thickness of 0.05 mm . They can be also used for CLEM as an alternative instead of patterned sapphire discs.
Finder grids Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Philadelphia, USA LF135-Cu These 135 mesh grids are used to create an alphanumeric pattern on "conventional" sapphire discs (described above) via carbon coating, so that they can be used for CLEM. 100 grids/vial.
HPF machine ABRA Fluid AG, Widnau, Switzerland HPM 010 This HPF machine has been used for this protocol.
HPF machine Leica Microsystems, Vienna, Austria EMPACT 2 "EMPACT 2", as an alternative to the use of the HPM machine that it has been used in this protocol (described above).
Cryo-tubes Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Z763667-500EA For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen. Package containing 500 cryovials.
Liquid nitrogen dewar Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany GZ-05094-60 For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen, equipped with cryo-racks with a capacity of 1600 cryo-tubes.
Automatic freeze substitution (AFS) machine Leica Microsystems, Vienna, Austria EM AFS2 This machine performs freeze substitution and progressive lowering of temperature (PLT) techniques and allows low temperature embedding and polymerization of resins.
Osmium tetroxide (OsO4) Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 19150 4% aqueous solution, one box containing 10 x 2 mL ampules.
Uranyl-Acetate (UA) Serva, Heidelberg, Germany 77879.01 Bottle containing 25 grs of (UA)-2 H2O.
Sonicator Bandelin Electronic, Berlin, Germany 329 "Sonorex Super RK 31" is a high-power ultrasonic cleaning bath for aqueous cleaning solution that is used in this protocol to mix OsO4 and Ua when preparing the FS medium.
Glass-distilled acetone Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 10015 Bottle of 100 mL
Stereomicroscope Leica Microsystems, Vienna, Austria Leica M80 Routine stereomicroscope for daily inspections, equipped with a camera for capturing images.
Epoxy resin Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 14120 Embed 812 is a kit containing several components that must be mix together in the proportions given by the manufacturers.
Flow through rings Leica Microsystems, Vienna, Austria 16707157 Package containing 100 pieces.
Reagent baths Leica Microsystems, Vienna, Austria 16707154 Package containing 100 pieces.
Ultramicrotome Leica Microsystems, Vienna, Austria Leica EM UC7 Ultramicrotome for preparation of semi- and ultrathin sections at room temperature.
Ultra 35 ° diamond knife Diatome Ltd., Nidau
Switzerland		 AGG339-735 This knife have an edge length of 3 mm.
Ultra fine tweezers Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA E78318 "Style 3X", for handling EM grids.
EM slot grids Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA G2010-Cu 100 grids/vial.
EM grid storage box Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 71155 It has capacity for 100 grids.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morgan, C., Godman, G. C., Breitenfeld, P. M., Rose, H. M. A correlative study by electron and light microscopy of the development of type 5 adenovirus. I. Electron microscopy. Journal of Experimental Medicine. 112, 373-382 (1960).
  2. Godman, G. C., Morgan, C., Breitenfeld, P. M., Rose, H. M. A correlative study by electron and light microscopy of the development of type 5 adenovirus. II. Light microscopy. Journal of Experimental Medicine. 112, 383-402 (1960).
  3. Caplan, J., Niethammer, M., Taylor, R. M., Czymmek, K. J. The power of correlative microscopy: multi-modal, multi-scale, multi-dimensional. Current Opinion in Structural Biology. 21, 686-693 (2011).
  4. de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nature Methods. 12, 503-513 (2015).
  5. Müller-Reichert, T., Verkade, P. Correlative light and electron microscopy III, First edition. , Elsevier/Academic Press. Cambridge, MA. (2017).
  6. Brown, E., Mantell, J., Carter, D., Tilly, G., Verkade, P. Studying intracellular transport using high-pressure freezing and Correlative Light Electron Microscopy. Seminars in Cell and Developmental Biology. 20, 910-919 (2009).
  7. Bykov, Y. S., Cortese, M., Briggs, J. A., Bartenschlager, R. Correlative light and electron microscopy methods for the study of virus-cell interactions. FEBS Letters. , (2016).
  8. Spuul, P., et al. Assembly of alphavirus replication complexes from RNA and protein components in a novel trans-replication system in mammalian cells. Journal of Virology. 85, 4739-4751 (2011).
  9. Nagel, C. H., Dohner, K., Binz, A., Bauerfeind, R., Sodeik, B. Improper tagging of the non-essential small capsid protein VP26 impairs nuclear capsid egress of herpes simplex virus. PLoS One. 7, 44177 (2012).
  10. Sharma, M., Kamil, J. P., Coughlin, M., Reim, N. I., Coen, D. M. Human cytomegalovirus UL50 and UL53 recruit viral protein kinase UL97, not protein kinase C, for disruption of nuclear lamina and nuclear egress in infected cells. Journal of Virology. 88, 249-262 (2014).
  11. Kallio, K., et al. Template RNA length determines the size of replication complex spherules for Semliki Forest virus. Journal of Virology. 87, 9125-9134 (2013).
  12. Martinez, M. G., Snapp, E. L., Perumal, G. S., Macaluso, F. P., Kielian, M. Imaging the alphavirus exit pathway. Journal of Virology. 88, 6922-6933 (2014).
  13. Lebrun, M., et al. Varicella-zoster virus induces the formation of dynamic nuclear capsid aggregates. Virology. 454-455, 311-327 (2014).
  14. Madela, K., et al. A simple procedure to analyze positions of interest in infectious cell cultures by correlative light and electron microscopy. Methods in Cell Biology. 124, 93-110 (2014).
  15. Berger, C., et al. Daclatasvir-like inhibitors of NS5A block early biogenesis of hepatitis C virus-induced membranous replication factories, independent of RNA replication. Gastroenterology. 147, 1094-1105 (2014).
  16. van der Schaar, H. M., et al. Illuminating the Sites of Enterovirus Replication in Living Cells by Using a Split-GFP-Tagged Viral Protein. mSphere. 1, (2016).
  17. Vale-Costa, S., et al. Influenza A virus ribonucleoproteins modulate host recycling by competing with Rab11 effectors. Journal of Cell Science. 129, 1697-1710 (2016).
  18. Wang, L., et al. Visualization of HIV T Cell Virological Synapses and Virus-Containing Compartments by Three-Dimensional Correlative Light and Electron Microscopy. Journal of Virology. 91, (2017).
  19. Doerflinger, S. Y., et al. Membrane alterations induced by nonstructural proteins of human norovirus. PLOS Pathogens. 13, 1006705 (2017).
  20. Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure freezing for the preservation of biological structure: theory and practice. Journal of Electron Microscopy Technique. 13, 165-174 (1989).
  21. Romero-Brey, I., et al. Three-dimensional architecture and biogenesis of membrane structures associated with hepatitis C virus replication. PLOS Pathogens. 8, 1003056 (2012).
  22. Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161, 359-371 (2008).
  23. Romero-Brey, I., et al. NS5A Domain 1 and Polyprotein Cleavage Kinetics Are Critical for Induction of Double-Membrane Vesicles Associated with Hepatitis C Virus Replication. MBio. 6, 00759 (2015).
  24. Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal. 36, 280-290 (2003).
  25. Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes. Annals of the New York Academy of Sciences. 1011, 45-56 (2004).
  26. McDonald, K. L., Morphew, M., Verkade, P., Muller-Reichert, T. Recent advances in high-pressure freezing: equipment- and specimen-loading methods. Methods in Molecular Biology. 369, 143-173 (2007).
  27. Walther, P., Ziegler, A. Freeze substitution of high-pressure frozen samples: the visibility of biological membranes is improved when the substitution medium contains water. Journal of Microscopy. 208, 3-10 (2002).
  28. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 314, 1-340 (1986).
  29. Romero-Brey, I., Bartenschlager, R. Viral Infection at High Magnification: 3D Electron Microscopy Methods to Analyze the Architecture of Infected Cells. Viruses. 7, 6316-6345 (2015).
  30. McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243, 227-233 (2011).
  31. Villinger, C., Neusser, G., Kranz, C., Walther, P., Mertens, T. 3D Analysis of HCMV Induced-Nuclear Membrane Structures by FIB/SEM Tomography: Insight into an Unprecedented Membrane Morphology. Viruses. 7, 5686-5704 (2015).
  32. Paul-Gilloteaux, P., et al. eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nature Methods. 14, 102-103 (2017).
  33. Polishchuk, R. S., Mironov, A. A. Correlative video light/electron microscopy. Current Protocols in Cell Biology Supplement. , Chapter 4, Unit 4 8 (2001).
  34. McDonald, K. L. A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues. Journal of Microscopy. 235, 273-281 (2009).
  35. Newman, G. R., Jasani, B., Williams, E. D. A simple post-embedding system for the rapid demonstration of tissue antigens under the electron microscope. The Histochemical Journal. 15, 543-555 (1983).
  36. Schwarz, H., Humbel, B. M. Influence of fixatives and embedding media on immunolabelling of freeze-substituted cells. Scanning Microscopy. 3, Supplement. Discussion 63-54 57-63 (1989).
  37. Luby-Phelps, K., Ning, G., Fogerty, J., Besharse, J. C. Visualization of identified GFP-expressing cells by light and electron microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 51, 271-274 (2003).
  38. Nixon, S. J., et al. A single method for cryofixation and correlative light, electron microscopy and tomography of zebrafish embryos. Traffic. 10, 131-136 (2009).
  39. McDonald, K. L. Rapid embedding methods into epoxy and LR White resins for morphological and immunological analysis of cryofixed biological specimens. Microscopy and Microanalysis. 20, 152-163 (2014).
  40. Webster, P., Schwarz, H., Griffiths, G. Preparation of cells and tissues for immuno EM. Methods in Cell Biology. 88, 45-58 (2008).
  41. Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. Journal of Cell Biology. 192, 111-119 (2011).
  42. Peddie, C. J., et al. Correlative and integrated light and electron microscopy of in-resin GFP fluorescence, used to localise diacylglycerol in mammalian cells. Ultramicroscopy. 143, 3-14 (2014).
  43. Hampoelz, B., et al. Pre-assembled Nuclear Pores Insert into the Nuclear Envelope during Early Development. Cell. 166, 664-678 (2016).
  44. Lemercier, N., et al. Microtome-integrated microscope system for high sensitivity tracking of in-resin fluorescence in blocks and ultrathin sections for correlative microscopy. Scientific Reports. 7, 13583 (2017).
  45. Takizawa, T., Powell, R. D., Hainfeld, J. F., Robinson, J. M. FluoroNanogold: an important probe for correlative microscopy. Journal of Biological Chemistry. 8, 129-142 (2015).
  46. Romero-Brey, I. 3D electron microscopy (EM) and correlative light electron microscopy (CLEM) methods to study virus-host interactions. Methods in Molecular Biology: Influenza Virus Methods & Protocols. Yamauchi, Y. , Springer. (2018).

Tags

इंजीनियरिंग अंक १३९ उच्च दाब ठंड फ्रीज प्रतिस्थापन vitrification लक्षित ट्रिमिंग ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी नीलमणि डिस्क सेल संस्कृति वायरस संक्रमण वायरस मेजबान बातचीत ultrastructure वायरस प्रेरित सेलुलर संशोधनों ।
ट्रैकिंग और इमेजिंग के लिए Correlative लाइट इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (भूखों) क्रायो-मैटीरियल कोशिकाओं में वायरल प्रोटीन संबद्ध संरचनाओं
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Santarella-Mellwig, R., Haselmann,… More

Santarella-Mellwig, R., Haselmann, U., Schieber, N. L., Walther, P., Schwab, Y., Antony, C., Bartenschlager, R., Romero-Brey, I. Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells. J. Vis. Exp. (139), e58154, doi:10.3791/58154 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter