银纳米粒子法改善小鼠胆道闭锁综合征
Summary
本文详细介绍了一种基于银纳米颗粒改善胆道闭锁综合征的实验性胆道闭锁小鼠模型的方法。对试剂制备过程和新生儿小鼠注射技术的深入了解将有助于使研究人员熟悉新生儿模型研究中使用的方法。
Abstract
胆道闭锁 (BA) 是一种严重的胆管炎, 儿童死亡率高, 病因仍未完全了解。病毒感染可能是一个可能的原因。用恒河轮状病毒接种新生鼠, 建立了研究 BA 的典型动物模型。银纳米颗粒已被证明发挥抗菌和抗病毒作用;本研究对其在 BA 小鼠模型中的作用进行了评价。目前, 在 ba 动物实验中, 用于改善 ba 小鼠症状的方法通常是通过食物或其他药物提供的对症治疗。本研究旨在通过腹腔注射银纳米颗粒, 为改善小鼠 BA 综合征提供一种新的方法, 并为制备银纳米颗粒凝胶配方提出详细的方法。该方法简便, 应用广泛, 可用于研究 BA 的机理及临床治疗。基于 BA 小鼠模型, 当小鼠表现出黄疸时, 制备的银纳米颗粒凝胶被注射腹腔到下肝表面。观察了生存状态, 并对生化指标和肝脏组织病理学进行了研究。这种方法可以更直观地了解 ba 模型的建立和新的 ba 处理。
Introduction
BA 是一种以持续性黄疸为特征的胆汁淤积的形式, 在没有肝移植的情况下死亡率较高。病毒感染与 BA 的发病机制密切相关。巨细胞病毒、呼肠病毒和轮状病毒都被认为是 BA1、2、3的病原体。在新生儿期, 未成熟的免疫系统对病毒感染的反应导致免疫失调对肝内胆管的影响, 导致胆道上皮细胞凋亡, 门内炎性细胞浸润区, 肝内和肝外胆管梗阻, 最后, 肝纤维化4,5,6。
BA 研究中常用的动物模型涉及使用恒河轮状病毒 (RRV) 接种新生鼠。小鼠通常在 5-6 天后发展黄疸, 显示低体重和 acholic 凳子。免疫反应在疾病过程中的作用是至关重要的, 特别是对于自然杀伤性细胞;这些细胞与 anti-NKG2D 抗体的耗尽极大地减少了 BA 引起的伤害7。此外, 其他细胞, 包括 CD4+ t 细胞, CD8+ t 细胞, 树突状细胞和调节 T 细胞, 都已被证明在疾病8,9,10,11发挥作用。所有数据都表明了免疫系统在 BA 过程中的不可缺少的性质。
银纳米颗粒 (AgNPs) 已被证明对某些传染性疾病有有益的效果, 包括细菌感染12和病毒感染 13,14,15。然而, 除了皮肤病的使用, 很少有研究使用 AgNPs 在临床治疗, 主要是因为他们的潜在毒性。在动物实验中, 研究人员通常通过口服16或静脉注射方法来研究 AgNPs 的功效17。然而, 没有其他研究人员研究过腹腔 (AgNPs) 注射液对新生儿小鼠实验的疗效, 这是一种简单而快速的方法, 可直接影响肝脏和胆管, 同时减少对其他系统的毒性, 如免疫系统。AgNPs 已显示影响 NK 细胞活性18;因此, 我们测试了 AgNPs 在 BA 小鼠模型中通过ip 注射治疗的效果。
Protocol
所有动物实验规程均已由中山大学动物中心 (#IACUC DB-16-0602) 的机构畜牧护理和使用委员会批准。 1. 建立胆道闭锁小鼠模型 保持怀孕的 BALB 小鼠在一个特定的无病原环境下的12小时黑暗/光循环在25摄氏度下, 使用蒸压的周广告随意。 要准备 RRV 菌株 MMU 18006, 放大 MA104 细胞中的病毒, 并通过斑块测定19测定病毒滴度。注: MA104 细胞在杜尔?…
Representative Results
在建立了 BA 小鼠模型的基础上, 对受感染的新生小鼠进行了 AgNP 胶原蛋白混合物的2x 注射, 显示黄疸。每日检查小鼠存活率, 进行肝功能检查、肝病理学和流式细胞术。与未经治疗的对照 BA 小鼠相比, AgNP 治疗的小鼠黄疸减少, 维持正常体重 (图 3)。胆红素代谢和肝转氨酶水平下降到正常控制值, 表明 AgNPs 大大改善肝功能 (表 1)。肝外胆管?…
Discussion
AgNPs 表现出较强的广谱抗菌性能和强渗透率22;此外, 它们还用于生产一系列抗菌医疗产品23。然而, AgNPs 可能需要很长的时间来清除, 一旦他们积聚在器官, 这种持久性可能导致毒性作用24,25。在一项大鼠实验中, 对 AgNPs 的急性毒性和遗传毒性进行了研究, 结果表明 AgNPs 可引起急性肝肾损伤。AgNPs 在主要免疫系统器官中?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这里使用的 AgNPs 是香港大学化学系 c.m. 的礼物。这项工作由中国国家自然科学基金 (no. 81600399) 和广州科技项目 (no. 201707010014) 资助。
Materials
| BALB/c mouse | Guangdong Medical Experimental Animal Center | SYXK2017-0174 | Animal experiment |
| Rhesus rotavirus (RRV) | ATCC | ATCC VR-1739 | Establish biliary atresia mouse model |
| MA104 cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | For laboratory use only |
| DMEM | Thermo Fisher | 10569010 | Mammalian Cell Culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10099141 | Mammalian Cell Culture |
| collagen Type I | CORNING | 354236 | For research use only |
| PBS buffer | OXOID | BR0014G | For washing |
| NaOH | Sigma | 1310-73-2 | Adjust the PH value |
| AgNP | Antibacterial Note: The AgNps was a gift from Prof CM Che. in the Department of Chemistry, the University of Hong Kong. |
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| Insulin syringe with integrated needle | BD | 9161635S | For medical use |
| 15-mL Centrifuge Tube | Corning | 430791 | For laboratory use only |
| 1.5-mL Microcentrifuge Tube | GEB | CT0200-B-N | For laboratory use only |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE-Ci | For laboratory use |
| Dissecting/Intravital microscope | Nikon | SMZ 1000 | For laboratory use |
| anti-Mouse NKp46 FITC | eBioscience | 11-3351 | For research use only |
| anti-Mouse CD4 PE-Cyanine5 | eBioscience | 15-0041 | For research use only |
| Monoclonal Mouse Anti-Human CD4 | DAKO | 20001673 | For research use only |
| anti-NKG2D | RD | MAB1547 | For research use only |
| BD FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Canto Plus | For laboratory use only |
References
- Szavay, P. O., Leonhardt, J., Czechschmidt, G., Petersen, C. The role of reovirus type 3 infection in an established murine model for biliary atresia. European Journal of Pediatric Surgery. 12 (04), 248-250 (2002).
- Coots, A., et al. Rotavirus infection of human cholangiocytes parallels the murine model of biliary atresia. Journal of Surgical Research. 177 (2), 275-281 (2012).
- Shanmugam, N. P., Jayanthi, V. Biliary atresia with cytomegalovirus. Indian Pediatrics. 49 (2), 157 (2012).
- Mack, C. L., Feldman, A. G., Sokol, R. J. Clues to the Etiology of Bile Duct Injuryin Biliary Atresia. Seminars in Liver Disease. 32, 307-316 (2012).
- Muraji, T., Suskind, D. L., Irie, N. Biliary atresia: a new immunological insight into etiopathogenesis. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 3 (6), 599-606 (2009).
- Sokol, R. J., Mack, C. Etiopathogenesis of Biliary Artesia. Seminars in Liver Disease. 21, 517-524 (2001).
- Shivakumar, P., Sabla, G. E., Whitington, P., Chougnet, C. A., Bezerra, J. A. Neonatal NK cells target the mouse duct epithelium via Nkg2d and drive tissue-specific injury in experimental biliary atresia. Journal of Clinical Investigation. 119 (8), 2281-2290 (2009).
- Mack, C. L., et al. Oligoclonal expansions of CD4+ and CD8+ T-cells in the target organ of patients with biliary atresia. Gastroenterology. 133 (1), 278-287 (2007).
- Shivakumar, P., et al. Effector Role of Neonatal Hepatic CD8 + Lymphocytes in Epithelial Injury and Autoimmunity in Experimental Biliary Atresia. Gastroenterology. 133 (1), 268-277 (2007).
- Saxena, V., et al. Dendritic Cells Regulate Natural Killer Cell Activation and Epithelial Injury in Experimental Biliary Atresia. Science Translational Medicine. 3 (102), (2011).
- Miethke, A. G., et al. Post-natal paucity of regulatory T cells and control of NK cell activation in experimental biliary atresia. Journal of Hepatology. 52 (5), 718-726 (2010).
- Tian, J., et al. Topical delivery of silver nanoparticles promotes wound healing. ChemMedChem. 2 (1), 129-136 (2010).
- Lu, L., et al. Silver nanoparticles inhibit hepatitis B virus replication. Antiviral Therapy. 13 (2), 253-262 (2008).
- Xiang, D., et al. Inhibition of A/Human/Hubei/3/2005 (H3N2) influenza virus infection by silver nanoparticles in vitro and in vivo. International Journal of Nanomedicine. 8 (Issue 1), 4103-4114 (2013).
- Elechiguerra, J. L., et al. Interaction of silver nanoparticles with HIV-1. Journal of Nanobiotechnology. 3 (1), 1-10 (2005).
- Nallanthighal, S., et al. Differential effects of silver nanoparticles on DNA damage and DNA repair gene expression in Ogg1-deficient and wild type mice. Nanotoxicology. 11 (8), 1-16 (2017).
- Wen, H., et al. Acute toxicity and genotoxicity of silver nanoparticle in rats. PLoS One. 12 (9), e0185554 (2017).
- Zhang, R., et al. Silver nanoparticle treatment ameliorates biliary atresia syndrome in rhesus rotavirus inoculated mice. Nanomedicine. 13 (3), 1041-1050 (2017).
- Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, Storage, and Quantification of Rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. , (2009).
- Liu, X., et al. Silver nanoparticles mediate differential responses in keratinocytes and fibroblasts during skin wound healing. ChemMedChem. 5 (3), 468-475 (2010).
- Zhang, R., et al. Silver nanoparticles promote osteogenesis of mesenchymal stem cells and improve bone fracture healing in osteogenesis mechanism mouse model. Nanomedicine. 11 (8), 1949-1959 (2015).
- Wu, J., Hou, S., Ren, D., Mather, P. T. Antimicrobial properties of nanostructured hydrogel webs containing silver. Biomacromolecules. 10 (9), 2686-2693 (2009).
- Xu, L. Genotoxicity and molecular response of silver nanoparticle (NP)-based hydrogel. Journal of Nanobiotechnology. 10 (1), 16 (2012).
- Dobrzyńska, M. M., et al. Genotoxicity of silver and titanium dioxide nanoparticles in bone marrow cells of rats in vivo. Toxicology. 315 (1), 86-91 (2014).
- Mohamed, H. R. H. Estimation of TiO 2 nanoparticle-induced genotoxicity persistence and possible chronic gastritis-induction in mice. Food & Chemical Toxicology. 83 (9), 76-83 (2015).
Cite This Article
Fu, M., Lin, Z., Lin, H., Tong, Y., Wang, H., Chen, H., Chen, Y., Zhang, R. A Silver Nanoparticle Method for Ameliorating Biliary Atresia Syndrome in Mice. J. Vis. Exp. (140), e58158, doi:10.3791/58158 (2018).