Summary
ここで準備し、メダカ (メダカ) からプライマリ下垂体の細胞培養を維持するためのプロトコルについて述べる。このプロトコルの最適化条件はそれにより生理学的より意味のある結果を有効にする、魚の生理学的条件を模倣して考慮温度、浸透圧、pH などの重要なパラメーターを取る。
Abstract
一次電池文化は、制御された環境で隔離されたセルの携帯電話の特性と機構を研究する科学者によってよく使用強力なツールです。哺乳類と魚の生理学の広大な相違にもかかわらず、魚からの一次電池文化プロトコルはしばしば哺乳類培養条件、頻繁に唯一のマイナーな変更に基づいてください。環境の違い、体温だけでなく、浸透圧、pH、pH 緩衝能など血清パラメーターに影響を与えます。細胞培養媒体と同様の作業ソリューションは、細胞外液や血清をセルが適応の特性を模倣する意味が、それは問題の動物にこれらのパラメーターが調整されることが重要です。
現在のプロトコルには、めだか (メダカ) の最適培養条件がについて説明します。プロトコルが特定し、健康を維持する方法の詳細については、1 週間以上の下垂体細胞を解離を提供し、次の手順が含まれています: 1 めだか血血しょう、2 値に浸透圧の調整が見つかりました。 の調整、。通常メダカ温孵化の温度 (ここの水族館施設で)、および 3。温度変化が同じ他魚種に匹敵する値を pH と炭酸バッファーの調整。記述のプロトコルを使用して示された結果は、めだかの生理学的意味のある結果を促進し、非哺乳類の他の種からの一次電池文化の科学者たちによってリファレンス ガイドとして使用できます。
Introduction
細胞培養は、通常細胞生理学から創薬スクリーニングと発癌の1に至るまでさまざまな生物学的質問に答えるためのエクセレント モデル システムを提供する分子の生物学的研究で使用される主なツールの 1 つです。初代培養細胞、酵素および/または機械的方法を使用して動物の組織から直接分離はしばしば生物学的反応は生体内での状況に近いかもしれません、細胞よりもっと生物学的関連と見なされます。一次電池文化の準備のためのプロトコルはセルが適応する特性を模倣し、生理学的意味のある結果を取得するために関心の種とセルの種類に対して最適化必要があります。
多数のプロトコルは、魚類細胞の培養条件を記述する類似したプロトコルは比較ではなく希少哺乳類細胞用培養条件を説明します。細胞、浸透圧、pH、温度の急激な変化に弱い、特に壊れやすい解離している最中です。市販の塩溶液と哺乳類の細胞培養用培地は pH バッファー システムと浸透圧の面で特に、魚類の最適化されていません。したがって、測定し、関心の種でこれらのパラメーターの関連する生理学的レベルの解決策を調整することが重要です。
初代の下垂体培養は、コイを含む複数の魚類の種から作られている (コイ)2,3草鯉 (ソウギョ idella)4金魚 (キンギョ)5レインボー ・ トラウト (オンコルヒュンクス)6、ヨーロッパのウナギ (アンギラ)7ティラピア (外部 mossambicus)8ゼブラフィッシュ (動脈分布)9と大西洋タラ (ガドゥス モルア)10。興味の種に孵化の温度を調整する、離れて加湿雰囲気で 7.5 7.2 から pH を有する興味の種の最適ではないことができる哺乳類のような条件下で細胞を培養がこれらのプロトコルのいくつか3-5% CO2を含みます。さらに、それは明白でなくこれらの一次電池文化のいくつかを準備するために使用されるソリューションの浸透圧が調整された場合、異なるソリューション間では安定です。
現在のプロトコル大西洋タラ10から初代培養前の仕事に基づいておりに孵化の温度、浸透圧、pH、および (pCO2) の二酸化炭素の分圧を含む pH バッファー システムの調整を含むめだか (O. 学) の生理。めだかは小さい (3-4 cm) の淡水魚、東アジア原産です。これらの日、それは比較的簡単に繁殖と多くの共通の魚の病気11に強いと、世界中の多くの研究所のモデル種として使用されます。ある 4-40 ° C11短い世代時間、透明な胚、性決定遺伝子12、および配列されたゲノムの13と同様、多くの温度許容値を含むモデルとしてめだかを使用していくつかの利点他利用可能な遺伝資源。
このプロトコルでは初代培養条件は、medakas は、魚の施設内に保管されている 26 の ° C の温度に合わせて最適化されています。さらに、浸透圧は 290 mOsm/kg 新鮮な水に住んでいるメダカのために食塩水に住んでいる大西洋タラから 320 mOsm/kg からは減り、めだかプラズマ14正常浸透圧に従っています。比較では、哺乳類のプラズマの代表的な浸透圧は 275-295 mOsm15の範囲内です。いろいろな温度で生活を魚し、哺乳類のものとは異なる魚の血液と細胞外液の pH とバッファー容量を作り、水との直接接触は、エラがあります。哺乳類の文化メディアには通常メディアが 37 ° C で加湿空気中 5% CO2の標準的な雰囲気に包まれた平衡時の pH は 7.4 前後の結果バッファー システムが含まれますPH は温度に依存し、減少温度16(水) で中性の pH 増加の値です。典型的な魚類 7.9177.7 から血漿 pH の範囲です。このプロトコルの最適化には、cod pH 7.75 めだか 0.5% から 1% に CO2を増やすことによって 26 の ° C で保管用に 12 ° C で保管のため pH 7.85 から削減が含まれています。
さらに、重炭酸塩の緩衝能が違う魚や哺乳類の。魚の鰓上 CO2の交換が簡単に水で pCO2肺18pCO2の小さい一部分だけです。温度または pCO2のいずれかを変更すると、pH および媒体のバッファーが変更されます。その結果、pH も哺乳動物細胞の培養に適して pCO2魚類細胞に最適です、したがって、文化メディアは魚の生理学的に関連する値を含むバッファー システム最適化必要があり、興味の特定の種。このプロトコルはメダカの脳下垂体からの一次電池文化の準備、培養温度、浸透圧、pH、および pH バッファー システムの一次電池を準備する際に考慮すべきその他の重要なパラメーターに加えて調整を含める方法をについて説明します非哺乳類の種からの文化。
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Protocol
本研究では動物実験は生命科学、研究動物の福祉と介護に関する次のガイドラインのノルウェーの大学によって承認されました。
1. 溶液の調製
- 正しく測定するための製造元の指示に従って osmometer および pH の計器を調整します。
-
Ca2 +・ Mg2 +の 500 mL を準備-無料ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (dPBS) 7.75 (ステップ 1.2.1) を pH と 290 mOsm/kg (ステップ 1.2.2) 生殖不能のろ過 (ステップ 1.2.3) 前に浸透圧を調整します。
- 慎重に慎重にソリューションを攪拌しながら 1 M 水酸化ナトリウム溶液の滴を追加することによって校正された pH 計を 7.75 に pH を調整します。
- 校正 osmometer を使用して、ソリューションの浸透圧を測定し、マンニトール 290 mOsm/kg まで浸透圧を高めるために必要量を計算します。マンニトールの必要量を追加し、正しい調整のように、再び溶液の浸透圧を測定します。
注: マンニトールの必要量は通常異なります異なるバッチ間測定、浸透圧に依存します。マンニトールの 1 つの分子は、1 浸透粒子を等しくなります。 - 無菌フィルター 0.2 μ m フィルターを用いた dPBS ソリューション。
注: ソリューションは、少なくとも 3 ヶ月間の 4 ° C で保存することがあります。
- L-グルタミンと重炭酸塩、なし・ リーボヴィッツ (L-15) 培養液 500 mL を準備し、サプリメント (ステップ 1.3.1) 10 mm NaHCO3それ、4.5 mM グルコース (ステップ 1.3.2) および 2 mM 市販グルタミン (1.3.3 のステップ)。290 mOsm/kg (ステップ 1.3.4) への解決策を調整する滅菌フィルター (手順 1.3.5) ペニシリン ストレプトマイシン溶液 (ステップ 1.3.6) 2.5 mL を追加。
注: ソリューションは、最低 4 週間は 4 ° C で保存する可能性があります。- NaHCO3 10 ミリメートルのソリューションを達成するために培養液 500 mL あたり 420 mg を追加します。
- 4.5 ミリメートルのソリューションを達成するために培養液 500 mL あたりのブドウ糖の 405 mg を追加します。
- 2 ミリメートルのソリューションを達成するために培養液 500 mL のグルタミン溶液の 100 x の在庫の 5 mL を追加します。すべての溶質を溶解するまで攪拌します。
- マンニトール、osmometer (1.2.2 のステップで実行されます) を使用してで 290 mOsm/kg にソリューションを調整します。
- 0.2 μ m フィルターを用いた L-15 媒体の生殖不能のろ過を実行します。
- 生殖不能のろ過後 50 U/mL のペニシリンとストレプトマイシンの 50 μ g/mL に対応する、ペニシリン ストレプトマイシン溶液 2.5 mL を追加します。
- 1 mg/ml II S (1.2 の手順で準備) 変更された dPBS に溶解 (0.1%) のトリプシン型のトリプシン溶液 50 mL を準備します。2 mL の因数は、滅菌プラスチック チューブ、-20 ° C で使用するまで保管します。
注: 2 mL の因数は-20 ° C で少なくとも 3 ヶ月間保存できます。 - 1 mg/ml (0.1%) トリプシン阻害剤型私-S、トリプシン阻害剤溶液 50 mL を準備し、2 μ g/mL (1.2 の手順で準備) 変更された dPBS で溶かした DNase でそれを補います。2 mL の因数は、滅菌プラスチック チューブ、-20 ° C で使用するまで保管します。
注: 2 mL の因数は-20 ° C で少なくとも 3 ヶ月間保存できます。
2. 機器の準備
- 火細胞解離の先端を研磨ガラス ピペットを準備します。ヒントは 2 つの異なるサイズのカテゴリを作る (中オープニング 0.6-0.8 μ m と 0.4 – 0.6 の小さな開口部 μ m)、ピペットを同時に回しながら炎からの距離と時間でやって。(45 分の 105 ° C で固体モードを使用) して清潔なガラス容器、オートクレーブにガラス ピペットを配置します。
- スチロールの箱に氷を準備します。
- 解剖中に脳下垂体を転送し、氷の上 1.5 ml (1.2 の手順で準備) 変更された dPBS のプラスチック製のチューブを準備します。
- 準備 (準備手順 1.2 で) 変更された dPBS 10 mL で 15 mL チューブ細胞解離まで氷の上保管してください。
- 新鮮な準備やトリプシン、トリプシン阻害剤ソリューション (1.4 と 1.5 の手順で準備) の因数を解凍し、使用するまで氷のそれらを保ちます。
- 風呂の水を 26 ° C へ、脳下垂体の化学分解する前に必要な温度に達するまで水を許可する郭清を開始する前に設定します。
- 解剖と微細な針とワックス プレート魚を固定するため使用する微細鉗子を含め、使用中、前後は、70% エタノールですべて解剖ツールをきれいに。清潔な手袋を使用 (変更および頻繁にきれい) 細胞の潜在的な汚染を避けるために全体の手順中に。
3. 下垂体解剖と細胞解離
- 氷のスラッシュ (0 ° C) でそれを浸すことによって魚を安楽死させます。不可逆的な低体温症ショックを確保するため、少なくとも 1 分の氷のスラッシュに魚を残します。
注: 数秒後の固定化と均衡の損失が発生します。魚は完全に氷の水で浸漬と後者は窒息につながる潜在的な皮膚火傷迅速かつ人道的な低体温のショックではなく、氷の上にないことを確認します。 - すぐに網で魚を解剖顕微鏡の下でワックス プレートに転送し、首をニードル パンチで脊椎を破壊します。
- (口の中) の上フロントと頭 (脳) の後ろの各側に 1 つの解剖の前に頭を安定させる 1 つの針を挿入することによって、微細な針を使用してワックス プレートに魚の頭を固定します。
- 解剖顕微鏡の下で魚を見るし、軽く斜め先端微細鉗子を使用して頭の上でスケールをこすり落とします。
- 慎重に頭の側から皮膚の下微細鉗子の斜めの先端を挿入し、頭骨の屋根を囲む鉗子にしっかりしたグリップを保持しながら、口の中の方向に鉗子をゆっくり移動によって頭蓋骨屋根を取り出します。
- 脊髄を完全にカット斜め先端に鉗子を使用して。
注: 時間は重要な要因で動作するように効率的に、正確に時間を制限する過ごした、脳下垂体の解剖から皿にメッキパーツをセルまで。いくつかの練習後下垂体解離する 10 のまわりでだけの魚、あたり約 2-3 分を取る必要があります脳が既にさらされて下垂体を選ぶには s が必要があります。 - 慎重に下垂体を公開し、クリーンな鉗子先端部がストレートと口に向かって脳を裏返します。変更 1.5 mL dPBS を含むプラスチック製のチューブに下垂体を転送 (詳細については、手順 2.3 を参照してください) 氷の上に配置します。チューブに下垂体が正常に追加し、鉗子には何も残らないようにする顕微鏡下で鉗子の先端を確認します。
注: を同時に準備している培養皿の数によっては、必要に応じて多くの脳下垂体を解剖します。親指のルールとして (これは下流のアプリケーションによって異なります) 細胞の適切な密度を持っている皿あたり成魚から少なくとも 10 の脳下垂体を計算します。 - 室温で 1-2 s の卓上遠心分離機で脳下垂体をスピンダウンします。慎重に dPBS ガラス ピペットを使用してを削除して、脳下垂体が削除されないように注意してください。
- 脳下垂体を洗浄し、1-2 s の卓上遠心分離機でそれらをスピンダウンすると追加の 1 mL のトリプシン溶液を追加する前にガラス ピペットを使用する液体の大部分を削除 (1.4 の手順で準備) トリプシン溶液 1 mL を追加します。
- できれば穏やかな揺れでの 30 分の 26 ° C の水浴中でチューブを孵化させなさいまたははじくを潜伏期間中に何度かも。
- 室温で 1-2 s の卓上遠心分離機で脳下垂体スピンダウン、すべて脳下垂体が管の下部にあるかどうかを確認します。ガラス ピペットのトリプシン溶液の大部分を除去し、トリプシンを不活化し、脳下垂体を洗う (1.5 の手順で準備) トリプシン阻害剤溶液の 1 mL を追加します。
- 室温で 1-2 s の卓上遠心分離機でダウンそれらを回して管の下部に脳下垂体を収集します。ガラス ピペットと液体の大部分を除去し、(手順 1.5 で準備) トリプシン阻害剤溶液の 1 mL を追加します。20 分間、できれば穏やかな揺れ、26 ° c の水浴にチューブを配置またははじくをトリプシンを不活化する潜伏期間中に何度かも。
- L-15 培地 2 mL を追加し、それは細胞をメッキする前に適切な温度と pH をアクセスできるように、1% の CO2と 26 の ° C で少なくとも 10 分間インキュベートする中央ガラス底の 35 mm ポリ d リジン コーティングされた細胞培養皿を準備します。
注: プラスチック製細胞培養皿を使用もできます。集中ガラス底の皿を使用しての主な利点は、セルがメッキパーツ領域が小さく、したがって、下垂体細胞の数が少ない、皿ごとに必要です。いくつかのダウン ストリーム アプリケーションは、ガラス底 (すなわち、いくつかのイメージング技術) をも必要があります。 - 15 mL チューブの冷却遠心分離機を機械的解離を開始する前に目的の温度に到達することを許可する 4 ° C に設定します。
- 収集回して管の下部に脳下垂体卓上遠心室温で 1-2 秒のために (ステップ 3.11) からトリプシン阻害剤溶液にチューブをダウン、すべて脳下垂体が前にチューブの下部に位置して確認慎重にガラス ピペットを使用してトリプシン阻害剤溶液のほとんどを削除します。
注: 次の手順すべて層流ベンチ (LAF) のプロトコルのセル セルの汚染を避けるために仕事のため認定。 - 下垂体組織の部分に冷たい変更 dPBS (2.4 の手順で準備) の 1 つの mL を追加し、(手順 2.1 の準備) 火磨かれたガラス ピペットで (6-7 x) 上下組織部分を優しく吸います。
注: 温度は重要な側面、4 ° C ですべてのソリューションをおくこれ以降、氷が可能なすべての手順を実行します。 - 室温で 1-2 s の卓上遠心分離機の組織部分をスピンし、慎重に解離細胞 (約 1 mL) を含む dPBS の上部を氷上に置いた新しい 15 mL チューブに転送します。組織の部分が残っているチューブの下部に向かってピペットを移動しないでください。
- 手順 3.16-3.17 dPBS のすべての 10 mL が使用されるまで、一度に冷たい dPBS の 1 mL の細胞を分離します。解離の (追加 dPBS の最後の 3-4 mL) の中型の開始と終わりに向かって開口部が小さいとガラス製ピペットに切り替えるガラス ピペットを使用して開始します。まだ目に見えるがある場合、解離プロシージャの終わりに向かって組織部分はピペッティング解離の dPBS 2 の最後の手順の方の約 10 倍に増加、最終的に残存組織の部分を残します。優しく、細胞を再懸濁し、セルを泡の表面に添付するとき、それは細胞の損傷を引き起こす可能性があります泡を作成しないようにします。
注: これはこのプロトコルの重要なステップであり、良い結果を達成するためにいくつかのトレーニングが必要です。 - 遠心分離機 (4 ° C に冷却済み) とスピン ・ ダウン 4 ° c. で 10 分の 200 x gで細胞の管をバランスします。細胞ペレットをされるチューブの側面をマークすることを確認します。
- 遠心分離機からチューブを慎重に取り外し、軽く遠心分離後直接空 15 mL プラスチック チューブにガラス ピペットで上澄みを転送します。必ず上澄みの大部分を削除するが、小さな (よく見えない) 細胞ペレットを失うことを避けるために注意してください。
- 慎重に L-15 培地の 50-100 μ L の細胞ペレットを再懸濁します。
注: この段階でそれはセルをカウントおよび/または (セル診断トリパン ブルーの存在下でカウント) などの生存試験を実行しますが、この目的のための細胞懸濁液の一部を使用しては、収量を下げることに注意してくださいすることが可能。皿の中心から外れた拡散セルのリスクが増えると大きなサスペンション ボリュームを使用しないでください。 - 慎重に (3.13 の手順で調製した) L-15 培地 2 mL を含む細胞培養皿の真ん中に解離細胞を点滴します。ガラス底のくぼんだ部分の外に広がる細胞を持っていることを避けるために、インキュベーターに移動する前に約 5 分の皿の底に沈むのセルを許可します。
- すべてのセルの徹底的にシンクし、皿の底を付けるように CO2を 26 ° C と 1% で皿を孵化させなさい。
- 30 分後に彼らが培養皿に接続されていることを確認するために顕微鏡で細胞を見てごらん。
- 26 ° C および 1% の CO2で細胞をインキュベートし続けます。
- 慎重に変更のほとんど (しかしすべてではない)、媒体ごとに 3-4 日。
メモ: は、セルを邪魔し、ガラスの船底からデタッチそれらがより頻繁に媒体を変更しないでください。種まき後 1 週間以内、実験用セルを使用します。
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Representative Results
このプロトコルはメダカの脳下垂体からの一次電池文化の準備を記述する、少なくとも 1 週間の文化で維持できる健康な細胞を提供しています。プロトコルは、めだか14生理関連値に基づいており、さらにメッキに組織採取から全体の手順中に 7.75 の pH, 290 mOsm/kg の浸透圧を使って大人の魚で下垂体組織に最適化されて細胞の培養 (図 1および図 2)。
このプロトコルによって生成される一次電池文化の実験から代表的な結果は、図 3図 4、および図 5で表示されます。ここで示された結果、遺伝子組換えメダカ ライン、黄体ホルモン (Lh)、-gonadotrope 細胞利用19は、緑色蛍光タンパク質 (GFP) を表現。両方の明視野と蛍光顕微鏡画像を含む図 3 , 播種後 7 日目に 0 日目からの一次電池文化の料理で代表的なフィールドを示しています gfp 発現する Lh gonadotrope セルを表示します。約 5 × 104 -の密度で播種後皿あたり 1 x 10 の5セル結果通常皿あたり約 10 の大人のメダカの脳下垂体を使用しています。培養下垂体の細胞の生存率は日 1、3、およびめっき後, 7 日 0 (図 4) と比較して文化の GFP 発現細胞の総数に基づいて計算されます。図 4に示すようなグラフは、死細胞の数はほぼ 1 日後に生きている細胞の 95% 以上で、時間をかけて一定以上 90% が 3 日後にまだ生きていることを示します。時間と細胞生存率のわずかな減少がありますが、ほとんどの細胞 (約 75%) は文化の週後でまだ生きています。(らStrandabø で説明したように実行されます) gfp 発現する Lh gonadotrope 細胞の電気生理学的記録20表示セルが (図 5 a) の文化で 4 日後に自発的に活動電位を発生させることがあります。さらに、性腺刺激ホルモン放出ホルモンの刺激によって細胞膜の初期過渡の過分極が続きます発火併用脱分極とアクションの期間の増加は、周波数の劇的な増加電位 (図 5 b)。
図 1: 下垂体の一次電池文化技術の概要。脳下垂体を微細鉗子で切除し、26 ° c (手順 2)、トリプシン、トリプシン阻害剤による不活化に続いて脳下垂体の酵素消化まで氷上 (プロトコルの手順 1) 変更された dPBS を含むプラスチック製のチューブに転送26 ° c (表示されていません)。ガラス ピペットで消化酵素によって脳下垂体の機械的解離が慎重に 4 ° c (ステップ 4) 遠心分離によって続いて dPBS (ステップ 3)、氷の上で実行されます。最後に、培養液中や細胞培養ディッシュ (手順 5) をメッキ細胞で細胞ペレットを溶解します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: めだかの下垂体解剖の詳細。(A) 固定化めだか (背面) の頭がワックス プレートに固定されているし、頭蓋骨の屋根の上は脳の先端が露出する微細鉗子で除去。(B)、脊髄を切断すると、下垂体がさらされているような頭の前面に向かって以上脳反転.(C) 下垂体がきれいで、微細鉗子で収集されます。矢印は、 BとCパネルで下垂体を指します。スケール バー = 1,000 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: めだか下垂体の一次電池文化。これらのパネルは、0 日、3 日、播種後 7 日目で代表的なめだか下垂体の一次電池文化の高分解能共焦点画像を表示します。上部のパネルは、中央のパネルは蛍光顕微鏡画像 gfp 発現する Lh gonadotrope セルを表示するビューの同じフィールドを示すし、下のパネルは 2 つのオーバーレイの皿には、明視野顕微鏡画像の代表的なフィールドを示しています。スケール バー = 20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: めだかの下垂体の生存細胞文化。この図では、播種後 0、1、3、および 7 日に測定した下垂体の一次電池文化の生存率を示しています。番号は、オープン ソース ・ ソフトウェア CellProfiler V2 を使用して計算、時間 0 と比較して異なる時点で皿ごとの gfp 発現する Lh gonadotrope セルの合計数に基づいています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 下垂体細胞の電気生理学的記録。これらのパネルは、(B) でシード、(A)、自発的な活動電位の代表的なトレースを表示後 4 日目公演一次電池文化の gfp 発現する Lh gonadotrope 細胞から電気生理学的記録を表示します。10 の性腺刺激ホルモン-放出ホルモン Gnrh1 刺激 s。Gnrh1 刺激を誘発する分極防止作用および活動電位 (50% のピークで測定) の増加期間に続いて、細胞膜の過分極と二相性反応 8.9 ± から刺激する前に 3.0 ms 29.2 ± 9.9 ms 後、刺激。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
In vitro細胞培養システムは、右の方法1で使用する場合異なる生物学的質問の茄多に答える研究者のための強力なツールを提供します。彼らはもともとの体内よりも、隣接セルへの接続を失っている解離細胞が異なる機能特性に取得したことを覚えていることが重要です。危険を冒しての in vitroの実験から得られた結果を誤って解釈されているように、興味の種および細胞の種類に一次電池文化のプロシージャの調整を検討することが重要です。標準培養プロシージャと使用されるソリューションも適度な調整が深く特定のセルタイプの培養条件を変えるに十分多い。
このプロトコルは準備し、温度、浸透圧、pH、および pCO2ソリューションの使用のようにパラメーターを調整することによって達成することができます大人のメダカ脳下垂体からの一次電池文化を維持するための最適条件を記述します。この種の生理的条件に一致します。PH は温度に依存を異なる温度17在宅魚類の種の間で調整する必要がありますもしたがって。細胞解離、培養中に使用されるすべてのソリューションの浸透圧は、セルの条件を改善するためにも調整する必要があります。特に、分離のプロシージャの間に使用されるさまざまなソリューション間の浸透圧で食い違いがある場合は、減少した生存率 (作者自身の未発表の結果) につながる文化の品質に壊滅的な影響があることがあります。液は、細胞を縮小する (その逆)、膜の完全性と膜タンパク質機能21により干渉することになります。このコンテキストで重要なポイントは、浸透圧や pH などパラメーターが通常測定できなかったり商業バッファーの別のバッチと哺乳類培養条件で使用される文化メディア間安定です。すべての回で避けるべきである分離のプロシージャの間に使用されるさまざまなソリューション間の浸透圧や pH の違い。
このプロトコルの成功率はトレーニングによって改善、研究手法の異なる手順で知り合いに時間が必要そうです。例えば、セルを皿のめっきまでの脳下垂体の解剖から時間反比例細胞の健康に関連します。ガラス ピペットを使用して脳下垂体の機械的解離プロトコルの特に重要なステップは、良い結果を達成するためにいくつかのトレーニングが必要です。解離の手順は、細胞に有害である浸透圧、機械的ストレスを導入できます。機械的解離の繰り返し手順で変更された dPBS の少量の添加により、研究を続けながら、すでに解離細胞を転送し新しいチューブとそのまま、左に穏やかな分解手順dPBS の新しいボリュームの組織からの他のセルを切り離して考えます。
このプロトコルは、下垂体細胞のメダカ成魚に最適です。種、組織、または同じ組織内の動物の生活もさまざまな段階培養条件の最適化が必要です。例えば、未熟な動物から得られた細胞はより壊れやすいかもしれないし、したがって、アポトーシスへ影響を受けやすい細胞死と、したがって、特に穏やかな解離プロシージャへのプロトコルを調整する必要性が生じます。ガラス ピペットを使用して機械的解離は、あまりにもラフの 1 つは、アポトーシスおよび細胞死を引き起こす可能性がありますしながら用心機械的解離が低いゲインにつながるプロシージャの非常に重要なステップです。解離過程の異なる酵素が考慮される場合は、別の消化時間と酵素濃度を使用する必要があります。メダカ脳下垂体は、非常に小さいと説明したプロトコルを使用して分離する比較的簡単です。しかし、他の種のための最適化は、残骸を削除する解離後メッシュ フィルターの使用を必要があります。このプロトコルの成功は、主細胞が汚れないように無菌条件下での手順によっても異なります。
種子皿あたりのセル数は、解離のプロシージャの成功と同様、開始時に、脳下垂体の数に依存します。ほぼそのまま大人のめだかの下垂体で約 15,000 の細胞があります。しかし、細胞が解離処理中に失われます、これは脳下垂体の実験に必要な数を計算するときは考慮必要があります。皿あたり少なくとも 10 の脳下垂体を使用して、通常の周りの密度になります皿あたり 50,000-100,000 細胞。この密度で凝集形成していませんでもかなりの量で 7 日間培養後も。著しく、集計と思われる密度依存、セルがシードされ、密度の高い、そうより集計。高密度培養を必要があります特定の手順と、下流のアプリケーションに応じて最適な播種密度を考慮必要がありますそのため。考慮する脳下垂体の数を計画するとき皿ごとに使用する重要なポイントです。
下流の最も一般的なアプリケーションは、播種後最初の数日以内に一次電池文化を使用します。電気生理学的記録に細胞生存率から、ここで示された結果を示す播種後 1 週間まで説明したプロトコルを使用した一次電池文化から良い結果を得ることが可能です。しかし、文化は長く保たれることが、健康な細胞は文化 (作者自身の未発表の結果) に 2 週間以上後も存在。このプロトコルで最適化された条件は、生理学的意味のある結果を容易に、非哺乳類セルからの一次電池文化を準備する他の科学者のために有益かもしれません。
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Disclosures
著者申告するものがあります。
Acknowledgments
このプロジェクトはノルウェー大学生命科学許可番号 243811 と 244461 (養殖プログラム)、ノルウェーの研究評議会によって賄われていた。魚施設を維持するため生命科学のノルウェー大学ルルド ・ キャリオン タンに感謝しております。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D8537 | Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol. |
| L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | L5520 | Supplement 500 ml culture medium with 10 mM NaHCO3, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 µm PES sterile filter, before adding 2.5 mL Penicillin-Streptomycin solution (see below for details). |
| NaOH | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5881 | Add drops of 1 M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75. |
| NaHCO3 | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5761 | 10 mM NaHCO3 equals 420 mg per 500 mL culture medium. |
| D-mannitol | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | 63565 | Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm. |
| D-glucose | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | G5400 | 4.5 mM D-glucose equals 405 mg per 500 mL culture medium. |
| GlutaMAX Supplement | Gibco (Life Technologies, Paisley, UK) | 35050-061 | Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100x stock in 500 mL culture medium. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | P0781 | Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 mL of stock solution in 500 mL L-15 medium (equivalent of 50 U/mL Penicillin and 50 µg/mL Streptomycin). |
| Trypsin type II-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T7409 | Prepare 1 mg/mL in dPBS solution. |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T6522 | Prepare 1 mg/mL in dPBS solution, supplement with 2 µg/ml Dnase I (see details below). |
| Dnase I | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D5025 | Use in trypsin inhibitor solution (see above). |
| 0.2 µm Polyethersulfone (PES) sterile filter system | Corning Inc. (Corning, NY) | 431097 | Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments. |
| 35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-10-C | Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application. |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11254-20 | Straight tip |
| Dumont #5/45 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11253-25 | Angled 45° tip |
| Stereo microscope SZ61 | Olympus Corp. (Tokyo, Japan) | Use for dissection of pituitaries. | |
| Alegra X-22R Centrufuge | Beckman Coulter Inc. (Brea, CA) | With cooling option (similar to current model XR-30). | |
| Water bath | Techne (Staffordshire, UK) | Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do. | |
| Pasteur glass pipettes | VWR (NY) | 612-1701 | Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use. |
| Galaxy MiniStar table centrifuge | VWR (NY) | 521-2844 | Any small table centrigue will do. |
| Fine needles/insect pins | Fine Science Tools (CA) | 26001-40 | Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead. |
| Wax plate | Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish. |
References
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