Summary
在这里, 我们描述了一个协议, 以准备和维护主要的垂体细胞培养从鳉 (Oryzias latipes)。该协议中的优化条件是通过模拟鱼类的生理条件来考虑温度、渗透和 pH 等重要参数, 从而使生理上有更有意义的结果。
Abstract
主细胞培养是科学家常用的一种强有力的工具, 用于研究受控环境中孤立细胞的细胞性质和机制。尽管哺乳动物和鱼类之间的生理学存在巨大差异, 但鱼类的初级细胞培养协议往往是以哺乳动物的文化条件为基础的, 通常只进行少量的修饰。环境的差异不仅影响体温, 而且对血清中渗透、ph 值和 ph 值的缓冲能力等指标也有很显著的作用。由于细胞培养培养基和类似的工作解决方案旨在模仿细胞外液和/或血清的特性, 对其进行适应, 关键是这些参数是专门针对所讨论的动物进行调整的。
当前协议描述优化的鳉 (Oryzias latipes) 的主要区域性条件。该议定书提供了有关如何隔离和维持健康的分离垂体细胞超过一周的详细步骤, 包括以下步骤: 1. 渗透压对鳉血浆中发现的值的调节, 2. 调整孵化温度到正常的鳉温度 (这里在水族馆设施), 和3。将 pH 值和碳酸氢盐缓冲量调整到与生活在类似温度下的其他鱼类相比的价值。使用描述的协议的结果促进了生理上有意义的结果为鳉并且可以作为参考指南由科学家做主要细胞文化从其他非哺乳动物种类。
Introduction
细胞培养是分子生物学研究的主要工具之一, 它为回答从正常细胞生理学到药物筛选和致癌1等不同生物学问题提供了一个优秀的模型系统。从动物组织直接分离的主要细胞使用酶法和/或机械方法, 通常被认为比细胞系更具生物学意义, 因为生物反应可能更接近体内的情况。为了模拟细胞适应的特性, 获得生理上有意义的结果, 应针对每个物种和细胞类型对准备初级细胞培养的协议进行优化。
许多协议描述哺乳动物细胞系统的文化条件, 而类似的协议描述鱼类细胞的主要培养条件是相当稀少的比较。细胞容易受到温度、pH 值和渗透压的快速变化, 在离解过程中尤其脆弱。用于哺乳动物细胞培养的商业盐溶液和培养基不适合硬骨鱼类鱼, 特别是在 pH 缓冲系统和渗透压方面。因此, 重要的是要测量和调整这些参数的生理相关水平的解决方案的兴趣品种。
主要的垂体培养由几种硬骨鱼类鱼类组成, 包括鲤鱼 (鲤鱼)2,3, 草鱼 (草鱼艾达拉)4, 金鱼 (鲫鱼)5, 虹鳟 (虹鳟鱼虹鳟鱼)6, 欧洲鳗鲡 (安圭拉)7, 罗非鱼 (罗非鱼)8, 斑马鱼 (斑马斑马)9, 和大西洋鳕鱼 (Gadus morhua)10。除了将孵化温度调整到感兴趣的物种之外, 这些协议中的一些还在哺乳动物样的条件下孵化出细胞, 这种情况对感兴趣的物种可能是不理想的, pH 值从7.2 到7.5 在湿润的大气层中。包含 3-5% CO2。此外, 目前尚不清楚, 在不同的溶液中, 用于制备几种主要细胞培养液的渗透压是否调整和稳定。
目前的议定书是根据以前与大西洋鳕鱼10的初级文化有关的工作, 包括孵化温度、渗透力、ph 值和 ph 值缓冲系统的调整, 包括二氧化碳的分压 (2), 以鳉的生理学 (latipes)。鳉是一种小 (3–4厘米) 淡水鱼, 原产于东亚。这些天, 它被作为一个模型物种在世界各地的许多研究实验室, 因为它是相对容易繁殖和高度抵抗许多常见的鱼类疾病11。使用鳉作为模型有几个优点, 包括温度耐受度从4–40°c11, 短世代时间, 透明胚胎, 性别确定基因12, 和序列化基因组13, 以及许多其他可利用的遗传资源。
本协议中的主要养殖条件被优化, 以符合 medakas 在鱼设施中保存的26摄氏度的温度。此外, 渗透压从生活在盐水中的大西洋鳕鱼的 320 mOsm/千克减少到 290 mOsm/千克, 鳉生活在淡水中, 并符合鳉等离子14的正常渗透压。相比之下, 哺乳动物血浆的典型渗透压在 275–295 mOsm15的范围内。鱼类生活在各种温度下, 鳃与水直接接触, 使鱼的血液和胞外液的 pH 值和缓冲能力与哺乳动物不同。哺乳动物的文化媒介通常包括缓冲系统, 导致 pH 值约 7.4, 当媒体被平衡到标准大气 5% CO2在湿润空气在37摄氏度。ph 值是温度依赖性的, 中性酸碱度 (水中) 的价值随温度的降低而增加16。典型的硬骨鱼类鱼血浆 pH 值从7.7 到 7.917不等。该协议的优化包括减少从 ph 值为7.85 的 cod 保持在12°c, ph 为7.75 的鳉保持在26°c 通过增加 CO2从0.5% 到1%。
此外, 在鱼类和哺乳动物中, 碳酸氢盐的缓冲能力是相当不同的。CO2容易地被交换在鳃在鱼和2在水中是仅一小部分的2在肺18。改变温度或2会改变介质的 pH 值和缓冲度。因此, 对于孵化哺乳动物细胞的 pH 值和2的不均, 都不是最佳的鱼细胞, 因此, 培养基应优化与含有生理相关的鱼类价值的缓冲系统和特殊种类的兴趣。该协议描述了如何从鳉垂体中制备主细胞培养, 包括孵化温度、渗透、ph 和 ph 缓冲系统的调整, 以及在准备主细胞时需要考虑的其他重要参数。非哺乳动物物种的文化。
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Protocol
在这项研究中进行的动物实验得到了挪威生命科学大学的批准, 遵循了研究动物护理和福利的指导方针。
1. 解决方案的准备工作
- 根据制造商的指示, 校准 osmometer 和 pH 计仪器, 以确保正确的测量。
-
准备500毫升的 Ca2 +和毫克2 +免费 Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (dPBS), 调整 pH 值 7.75 (步骤 1.2.1) 和渗透到 290 mOsm/千克 (步骤 1.2.2) 之前, 无菌过滤 (步骤 1.2.3)。
- 在仔细搅拌溶液的同时, 仔细添加1米氢氧化钠溶液的水滴, 将 ph 值调整为7.75。
- 使用校准的 osmometer 测量溶液的渗透性, 并计算增加渗透压至 290 mOsm/千克所需的甘露醇量。添加所需量的甘露醇, 然后再次测量溶液的渗透, 以确保正确的调整。
注: 所需的甘露醇量取决于渗透压测量, 这通常是不同批次之间的差异。甘露醇的一个分子等于1渗透粒子。 - 无菌-用0.2 µm 过滤器过滤 dPBS 溶液。
注: 该溶液可储存在4摄氏度, 至少3月。
- 准备500毫升的莱博维茨 (L-15) 培养基没有 l-谷氨酰胺和碳酸氢盐, 并补充它与10毫米 NaHCO3 (步 1.3.1), 4.5 毫米葡萄糖 (步 1.3.2) 和2毫米商业上可利用的谷氨酰胺 (步 1.3.3)。调整解决方案, 以 290 mOsm/千克 (步骤 1.3.4), 无菌过滤 (步骤 1.3.5), 并添加2.5 毫升的青霉素-链霉素溶液 (步骤 1.3.6)。
注: 该溶液可储存在4摄氏度, 至少4周。- 添加420毫克的 NaHCO3每500毫升培养基, 以达到10毫米溶液。
- 每500毫升培养基中添加405毫克葡萄糖以达到4.5 毫米溶液。
- 在500毫升培养基中加入5毫升的谷氨酰胺溶液 100x, 达到2毫米溶液。搅拌直到所有溶质溶解。
- 使用 osmometer (如在步骤1.2.2 中执行), 用甘露醇将解决方案调整为 290 mOsm/千克。
- 使用0.2 µm 过滤器对 L-15 介质进行无菌过滤。
- 在无菌过滤后, 加入2.5 毫升青霉素-链霉素溶液, 对应于50毫升的青霉素和50µg/毫升链霉素。
- 50毫升的胰蛋白酶溶液, 使用1毫克/毫升 (0.1%) 胰蛋白酶 ii 型 S 溶解在修改后的 dPBS (在步骤1.2 中制备)。使整除数2毫升的无菌塑料管, 并储存在-20 °c, 直到使用。
注: 2 毫升的整除数可以储存在-20 摄氏度, 至少3月。 - 用1毫克/毫升 (0.1%) 胰蛋白酶抑制剂类型的 i 型, 制备50毫升胰蛋白酶抑制剂溶液, 并辅以2µg/毫升 DNase i 溶解在修改后的 dPBS 中 (在步骤1.2 中制备)。使整除数2毫升的无菌塑料管, 并储存在-20 °c, 直到使用。
注: 2 毫升的整除数可以储存在-20 摄氏度, 至少3月。
2. 设备的准备
- 用火抛光玻璃吸管细胞离解的尖端。使用2种不同尺寸的小贴士 (0.6–0.8 µm 的中间开口和0.4–0.6 µm 的小开口), 在同时转动吸管的同时, 与火焰的时间和距离进行播放。将玻璃吸管放在一个干净的玻璃容器中, 然后用高压釜 (用105摄氏度的固态模式45分钟)。
- 准备一个带冰块的聚苯乙烯盒子。
- 用1.5 毫升的改性 dPBS (在步骤1.2 中准备) 将垂体转移到解剖过程中, 并将其放在冰上。
- 准备一个15毫升管与10毫升的修改 dPBS (准备在步骤 1.2), 并保持在冰, 直到细胞离解。
- 准备新鲜或解冻整除数的胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂溶液 (准备在步骤1.4 和 1.5), 并保持在冰上, 直到使用。
- 在开始解剖前, 将水浴设置为26摄氏度, 使水在垂体化学离解之前达到所需的温度。
- 在使用前、期间和之后, 用70% 乙醇清洁所有的解剖工具, 包括用于解剖和细针的细钳和用于钉住鱼的蜡板。在整个过程中使用干净的手套 (经常更换和清洗), 以避免细胞的潜在污染。
3. 垂体解剖和细胞离解
- 弄死将鱼浸泡在冰层中 (0 摄氏度)。将鱼放在冰层中至少1分钟, 以确保不可逆的低温休克。
注意: 固定化和平衡损失将在几秒钟后发生。确保鱼完全淹没在冰水中, 不躺在冰上, 因为后者会导致窒息和潜在的皮肤烧伤, 而不是快速和人性化的低温休克。 - 在解剖显微镜下快速将鱼放在网中的蜡板上, 通过颈部的针刺来破坏脊柱。
- 用细针将鱼头钉在蜡板上, 通过在前面 (嘴上) 插入一根针, 在头部的两侧 (脑后) 将头部固定在解剖前。
- 查看解剖显微镜下的鱼, 并轻轻地刮掉头上的鳞片使用细钳与角度提示。
- 小心地插入从头部一侧皮肤下的细钳的角度尖端, 并删除头骨屋顶, 慢慢地移动钳在嘴的方向, 同时牢牢抓住包围头骨屋顶的镊子。
- 用有角尖的镊子完全切断脊髓。
注意: 时间是一个重要的因素, 所以工作有效和准确, 以限制从解剖垂体的时间, 直到细胞被镀在盘子里。经过一定的实践, 垂体解剖应该采取周围2–3分钟每条鱼, 其中只有大约十年代是需要采摘垂体时, 大脑已经暴露。 - 小心翻转的大脑朝口, 以暴露垂体和解剖它与清洁钳与一个直接的提示。将脑垂体转移到含有1.5 毫升改性 dPBS 的塑料管上 (详情见步骤 2.3) 放在冰上。检查钳在显微镜下的尖端, 以确保垂体成功地添加到管, 并没有留在镊子。
注: 根据需要, 解剖尽可能多的垂体, 这取决于要同时准备的培养皿的数量。作为一个经验法则, 计算至少10垂体从成年鱼每碟有一个适当的密度细胞 (这取决于下游的应用)。 - 在室温下将垂体在台式离心机中旋转。小心地删除 dPBS 使用玻璃吸管, 并注意避免删除任何垂体。
- 加入1毫升的胰蛋白酶溶液 (在步骤1.4 中准备), 以洗涤垂体, 将其在台式离心机中旋转, 用玻璃吸管除去大部分液体, 然后再加入1毫升的胰蛋白酶溶液。
- 在26摄氏度的水浴中孵化出30分钟的管子, 最好是轻轻摇动, 或者在潜伏期的时候轻拍一下管子。
- 在室温下将垂体在台式离心机上旋转, 确保所有垂体都位于管的底部。用玻璃吸管除去大多数胰蛋白酶溶液, 加入1毫升的胰蛋白酶抑制剂溶液 (在步骤1.5 中制备), 以使胰蛋白酶失效并洗涤垂体。
- 在室温下用台式离心机将垂体在管子底部收集。用玻璃吸管除去大部分液体, 加入1毫升的胰蛋白酶抑制剂溶液 (在步骤1.5 中制备)。将管子放在26摄氏度的水浴中20分钟, 最好是轻轻摇动, 或者交替地在潜伏期内轻轻地轻摇管子以使胰蛋白酶失效。
- 通过加入2毫升的 L-15 培养基, 在26摄氏度和 1% CO2的情况下, 用35毫米的聚 d-赖氨酸包膜细胞培养皿, 在镀细胞之前, 将其孵化为至少10分钟。
注: 还可以使用塑料细胞培养皿。使用一个集中的玻璃底部的菜的主要好处是, 细胞被镀的区域是小的, 因此, 每道菜需要的垂体细胞较少。一些下游应用可能还需要一个玻璃底部 (即一些成像技术)。 - 将15毫升管的冷却离心机设置为4摄氏度, 使其达到所需的温度, 然后开始机械分离。
- 在室温下, 用胰蛋白酶抑制剂溶液 (从步骤 3.11) 在台式离心机上的垂体, 收集管子底部的管状物, 确保所有的垂体都位于管子的底部, 然后仔细地使用玻璃吸管去除大多数胰蛋白酶抑制剂溶液。
注: 在经核证的层流工作台 (黎巴嫩武装部队) 中, 执行协议的所有以下步骤, 以避免细胞污染。 - 将1毫升的冰冷改良 dPBS (在步骤2.4 中制备) 到垂体组织片中, 并轻轻地吮吸在火焰抛光玻璃吸管 (在步骤2.1 中准备) 的组织件上下 (6–7x)。
注: 温度是一个基本的方面, 所以保持所有的解决方案在4摄氏度。从这一点开始, 尽可能在冰上执行所有步骤。 - 在室温下在台式离心机上旋转组织件, 并仔细将含有分离细胞 (大约1毫升) 的 dPBS 的上部转移到放置在冰上的新的15毫升管上。避免将吸管移向管子底部, 使其在组织部分留下。
- 重复步骤 3.16–3.17, 游离1毫升冰冷 dPBS 的细胞, 直到所有10毫升的 dPBS 使用。开始使用一个中型开口的玻璃吸管, 并切换到一个较小的开口朝向末端的玻璃吸管 (为最后的3–4毫升 dPBS 添加) 的离解。如果还有可见的组织片接近分离过程的末尾, 增加吹打到大约10x 的 2 dPBS 的最后步骤, 以分离, 最后留下残余的组织块后面。并用重悬的细胞, 并避免产生气泡, 因为它可能会导致细胞损伤时, 细胞附着在气泡表面。
注意: 这是该协议的关键步骤, 需要一些培训才能取得良好的效果。 - 平衡管在离心机 (预冷到4°c) 和旋转向下的细胞在 200 x g 10 分钟在4摄氏度。一定要标记的管道的一侧, 细胞颗粒将。
- 小心地从离心机上取出管子, 用玻璃吸管轻轻地将上清液转移到空的15毫升塑料管, 然后直接离心。一定要去除大部分上清, 但要注意避免丢失小 (通常是隐形的) 细胞小球。
- 仔细并用重悬 L-15 培养基中50–100µL 细胞颗粒。
注意: 在这一步, 有可能计算细胞和/或执行生存能力测试 (如一个细胞计数的存在的台盼蓝使用 hemocytometer), 但请注意, 使用部分细胞悬浮为此目的将降低产量。避免使用大的悬浮体积, 因为它会增加细胞在盘子中心外扩散的风险。 - 仔细滴下细胞培养皿中含有2毫升 L-15 培养基的离解细胞 (在步骤3.13 中制备)。允许细胞下沉到盘子的底部大约5分钟, 然后将它们移动到孵化器, 以避免细胞扩散到玻璃底部的凹陷部分外。
- 孵化的菜在26摄氏度和 1% CO2 , 让所有的细胞彻底下沉, 并附着在盘子的底部。
- 30分钟后, 看看显微镜中的细胞, 确保它们附着在培养皿上。
- 继续孵化细胞在26°c 和 1% CO2。
- 每3–4天小心地改变大部分 (但不是全部) 媒介。
注意: 避免更频繁地更改介质, 因为它可能会干扰细胞并使其与玻璃底部分离。在播种后一周内使用细胞进行实验。
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Representative Results
该协议描述了从鳉垂体的主细胞培养的制备, 并提供了在至少一个星期的文化中可以保持的健康细胞。该协议的基础上的生理相关值为鳉14 , 并进一步优化到垂体组织在成年鱼, 使用 pH 值7.75 和渗透 290 mOsm/千克在整个过程中从组织收获到电镀区域性中的单元格 (图 1和图 2)。
此协议生成的主要细胞培养实验的代表性结果显示在图3、图 4和图 5中。在这里提出的结果, 一个转基因鳉线, 其中促黄体素 (Lh)-gonadotrope 细胞表达绿色荧光蛋白 (GFP), 被利用19。图 3显示了在播种后的第一个细胞培养皿中的一个代表性领域, 包括明亮场和荧光显微图像, 显示了 GFP 表达的 Lh-gonadotrope 细胞。使用大约10成人鳉垂体每盘通常导致密度大约 5 x 104 -1 x 10 5 个细胞每盘在播种以后。在培养基中, 垂体细胞的存活能力是根据1、3、7天的培养基中 GFP 表达细胞总数和0天 (图 4) 来计算的。图 4所示的图表明, 随着时间的推移, 死亡细胞的数量几乎是恒定的, 95% 的细胞在1天后存活, 而90% 在3天后仍然活着。虽然细胞存活时间有小的下降, 但大多数细胞 (大约 75%) 在培养一周后仍然存活。GFP 表达 Lh-gonadotrope 细胞的电生理记录 (如 Strandabø中所述) 20表明细胞在培养4天后能够自发地发射动作电位 (图 5A)。此外, 在促性腺激素释放荷尔蒙的刺激下, 细胞膜的初始瞬态极化后, 发射频率急剧增加, 伴随着退极化和行动持续时间的增加电位 (图 5B)。
图 1: 垂体原细胞培养技术概述.垂体的解剖与细钳和转移到一个塑料管包含修改 dPBS 冰 (步骤1的协议), 直到酶消化的垂体与胰蛋白酶在26°c (步骤 2), 其次是失活与胰蛋白酶抑制剂26摄氏度 (不显示)。酶消化垂体与玻璃吸管的机械离解是小心地执行在 dPBS 在冰 (步骤 3), 其次是离心在4°c (步 4)。最后, 细胞颗粒被溶解在培养基中, 细胞培养皿中的细胞膜 (步骤 5)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 鳉垂体解剖的细节.(A) 固定化鳉 (背观) 的头部固定在蜡板上, 颅骨顶部用细钳取出, 露出大脑的顶端。(B) 脊髓被切断, 大脑翻转向头部前方, 使脑垂体暴露。(C) 垂体被收集干净, 细钳。箭头指向B和C组的脑垂体。刻度条 = 1000 µm.请点击这里查看这个数字的大版本.
图 3: 鳉垂体原细胞培养.这些面板显示的高分辨率共焦图像的代表性鳉垂体原细胞培养在0天, 3 天, 和7天后播种。上面的面板显示了在盘子中有代表性的领域的光明场显微图像, 中间的面板显示了荧光显微图像的相同的视野显示 GFP-gonadotrope 细胞, 下板是一个叠加的两个。刻度条 = 20 µm.请点击这里查看这个数字的大版本.
图 4: 鳉垂体细胞在培养中的生存能力.该图显示了在播种后0、1、3和7天测量的垂体原细胞培养的可行性。这些数字是使用开放源码软件 CellProfiler V2 计算的, 并且是根据在不同时间点上每道菜的 GFP-gonadotrope 细胞的总数量, 与时间0相比较。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 垂体细胞的电生理记录.这些面板显示的电生理记录从 GFP 表达的 Lh-gonadotrope 细胞在主细胞培养在4天进行播种后, 显示 (a) 有代表性的自发动作电位的痕迹, 其次是 (B)刺激与促性腺激素释放荷尔蒙 Gnrh1 十年代。Gnrh1 刺激诱导双相反应与细胞膜的极化, 其次是极化和增加行动电位的持续时间 (测量在50% 峰值) 从 8.9 3.0 ms 在刺激之前到 29.2 @ 9.9 ms 在刺激。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
体外细胞培养系统为研究人员提供了强有力的工具, 如果使用正确的方式1, 就可以回答过多的不同的生物学问题。重要的是要记住, 失去了与邻近细胞的连接的分离细胞可能已经获得了不同的功能性质比他们原来在体内。为了避免有误解从体外实验获得的结果的风险, 重要的是考虑调整原细胞培养过程的物种和细胞类型的兴趣。即使是对标准的文化程序和解决方案进行适度的调整, 也常常足以深刻地改变特定细胞类型的文化条件。
本协议描述了从成人鳉垂体中制备和维护原细胞培养的最佳条件, 可通过调整参数, 如温度、渗透系数、pH 值和2的解决方案来实现, 以匹配这个物种的生理条件。pH 值是温度依赖性的, 因此, 也应调整不同种类的硬骨鱼类鱼生活在不同的温度17。在细胞离解和培养过程中使用的所有溶液的渗透性也应进行调整, 以改善细胞的条件。特别是, 如果在隔离过程中使用的不同解决方案之间存在渗透率差异, 则会对培养质量产生破坏性影响, 从而降低生存能力 (作者自己未公布的结果)。高渗性溶液会导致细胞收缩 (反之亦然), 从而干扰膜的完整性和膜蛋白功能21。在这种情况下, 重要的一点是, 诸如渗透和 pH 等参数通常不被测量, 也不稳定在哺乳动物培养条件中使用的不同批次的商业缓冲器和培养基。在隔离过程中使用的不同溶液之间的渗透和 pH 值的差异应始终避免。
通过训练提高了该协议的成功率, 预计研究人员需要一些时间来了解该技术的不同步骤。例如, 垂体的解剖时间直到盘子里的细胞被镀成与细胞健康呈反比关系。用玻璃吸管垂体机械离解是该协议的一个特别关键步骤, 需要一些训练才能取得良好的效果。离解过程可以引入对细胞有害的渗透和机械应力。在机械离解的重复步骤中增加小体积的修改后的 dPBS 确保了一个温和的离解过程, 在那里已经分离的细胞转移到一个新的管和左未触及, 而研究员继续在新体积的 dPBS 中分离出组织中的额外细胞。
该协议为成人鳉垂体细胞进行了优化。不同的物种, 组织, 甚至不同的生命阶段的动物在同一组织需要优化的文化条件。例如, 从未成熟的动物获得的细胞可能更脆弱, 因此更容易受到细胞凋亡和细胞死亡的影响, 因此, 可能需要调整该议定书, 特别是对更温和的离解程序。机械离解使用玻璃吸管是一个非常关键的步骤的过程, 因为过于仔细的机械分离将导致较低的增益, 而过于粗糙的一个可能导致细胞凋亡和/或细胞死亡。如果认为不同的酶分离, 可能需要使用不同的消化时间和酶浓度。鳉垂体是非常小的, 相对容易离解使用描述的协议。然而, 对其他物种的优化可能需要在离解后使用网格过滤器来去除碎片。该议定书的成功还主要取决于在无菌条件下执行步骤, 以避免污染细胞。
每道菜的细胞数量取决于开始时垂体的数量, 以及分离过程的成功。有大约1.5万细胞在一个完整的成人鳉垂体。然而, 细胞在离解过程中丢失, 在计算实验所需的垂体数量时应加以说明。每道菜至少使用10垂体通常会导致每道菜的密度约为 5万-10万细胞。在这种密度下, 即使在7天的文化中, 聚合也不会形成任何重要的数量。引人注目的是, 聚合似乎是密度依赖性的, 因为密集的细胞被播种, 它们似乎聚集得越多。某些程序可能需要更密集的养殖, 因此, 应考虑下游应用的最佳播种密度。在规划垂体的数量时, 必须考虑到每道菜的使用量。
大多数常见的下游应用程序在播种后的头几天内使用主细胞培养。从细胞活力到电生理记录的结果显示, 在播种后的1周内, 使用所述的协议制备的主要细胞培养物可以获得良好的结果。然而, 文化可能保持更长的时间, 健康的细胞仍然存在, 在2周的文化 (作者自己未发表的结果)。在本议定书中提出的优化条件有利于生理上有意义的结果, 并可能有利于其他科学家准备从非哺乳动物细胞的主要细胞培养。
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Disclosures
作者没有什么要申报的。
Acknowledgments
这一项目由挪威生命科学大学和挪威研究理事会资助, 拨款243811和 244461 (水产养殖项目)。我们感谢挪威生命科学大学的卢尔德卡伦谭维持鱼类设施。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D8537 | Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol. |
| L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | L5520 | Supplement 500 ml culture medium with 10 mM NaHCO3, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 µm PES sterile filter, before adding 2.5 mL Penicillin-Streptomycin solution (see below for details). |
| NaOH | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5881 | Add drops of 1 M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75. |
| NaHCO3 | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5761 | 10 mM NaHCO3 equals 420 mg per 500 mL culture medium. |
| D-mannitol | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | 63565 | Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm. |
| D-glucose | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | G5400 | 4.5 mM D-glucose equals 405 mg per 500 mL culture medium. |
| GlutaMAX Supplement | Gibco (Life Technologies, Paisley, UK) | 35050-061 | Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100x stock in 500 mL culture medium. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | P0781 | Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 mL of stock solution in 500 mL L-15 medium (equivalent of 50 U/mL Penicillin and 50 µg/mL Streptomycin). |
| Trypsin type II-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T7409 | Prepare 1 mg/mL in dPBS solution. |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T6522 | Prepare 1 mg/mL in dPBS solution, supplement with 2 µg/ml Dnase I (see details below). |
| Dnase I | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D5025 | Use in trypsin inhibitor solution (see above). |
| 0.2 µm Polyethersulfone (PES) sterile filter system | Corning Inc. (Corning, NY) | 431097 | Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments. |
| 35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-10-C | Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application. |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11254-20 | Straight tip |
| Dumont #5/45 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11253-25 | Angled 45° tip |
| Stereo microscope SZ61 | Olympus Corp. (Tokyo, Japan) | Use for dissection of pituitaries. | |
| Alegra X-22R Centrufuge | Beckman Coulter Inc. (Brea, CA) | With cooling option (similar to current model XR-30). | |
| Water bath | Techne (Staffordshire, UK) | Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do. | |
| Pasteur glass pipettes | VWR (NY) | 612-1701 | Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use. |
| Galaxy MiniStar table centrifuge | VWR (NY) | 521-2844 | Any small table centrigue will do. |
| Fine needles/insect pins | Fine Science Tools (CA) | 26001-40 | Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead. |
| Wax plate | Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish. |
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