Summary
Burada biz hazırlamak ve medaka (Oryzias latipes) birincil hipofiz hücre kültürleri korumak için bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı en iyi duruma getirilmiş koşullarda sıcaklık, osmolalite ve pH gibi önemli parametreleri göz önünde bulundurun fizyolojik şartlarda, böylece fizyolojik olarak daha anlamlı sonuçlar etkinleştirme balık, taklit ederek.
Abstract
Birincil hücre kültürü yaygın hücresel özellikleri ve izole hücreler kontrollü bir ortamda mekanizmaları incelemek için bilim adamları tarafından kullanılan güçlü bir araçtır. Memeliler ve balık arasında Fizyoloji büyük farklılıklara rağmen birincil hücre kültür balık iletişim kurallarından kez kez küçük değişiklikler ile memeli kültür koşulları temel alır. Çevre farklılıklar sadece vücut sıcaklığı, aynı zamanda kan serum parametreleri osmolalite, pH ve pH Tampon kapasitesi gibi etkiler. Hücre kültür medya ve benzer çalışma çözümleri ekstraselüler sıvı ve/veya kan serumu bir hücre adapte olduğu özelliklerini taklit içindir gibi bu parametreler söz konusu hayvan için özel olarak ayarlanır önemlidir.
Geçerli protokol medaka (Oryzias latipes) için en iyi duruma getirilmiş birincil kültür koşulları açıklar. Protokol yalıtmak ve sağlıklı korumak konusunda ayrıntılı adımlar ayrışmış hipofiz hücreleri bir haftadan fazla sağlar ve aşağıdaki adımları içerir: 1. osmolalite değerlere ayarlama bulundu medaka kan plazması, 2. ayarlaması inkübasyon sıcaklığı normal medaka sıcaklığa (burada akvaryum tesiste) ve 3. pH ve bikarbonat arabellek değerlerle karşılaştırılabilir benzer sıcaklıklarda yaşayan diğer balık türleri için uyum. Sonuçları açıklanan protokolü kullanılarak sunulan fizyolojik açıdan anlamlı sonuçlar medaka için teşvik ve bir başvuru kılavuzu olarak birincil hücre kültürleri diğer memeli olmayan tür yapım bilim adamları tarafından kullanılabilir.
Introduction
Hücre kültürü normal Hücresel Fizyoloji uyuşturucu tarama ve karsinojenezis1' e kadar farklı biyolojik sorulara cevap için bir mükemmel model sistemi sağlayan moleküler biyolojik araştırmalarda kullanılan ana araçlardan biridir. Primer hücre, enzimatik ve/veya mekanik yöntemlerle hayvan dokudan doğrudan izole çoğu zaman daha biyolojik olarak çok hücre satır ilgili biyolojik yanıt vivo içinde durumuna yakın olabilir olarak kabul edilir. Birincil hücre kültürleri hazırlanması için protokol faiz bir hücre adapte olduğu özelliklerini taklit ve fizyolojik olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için her tür ve hücre türü için optimize edilmelidir.
Benzer protokoller balık hücreler için birincil kültür koşulları açıklayan karşılaştırmada oldukça kıt olmakla birlikte çok sayıda protokolleri memeli hücre sistemler, kültür koşulları tanımlamak. Hücreleri sıcaklık, pH ve osmolalite hızlı değişikliklere açıktır ve ayrılma işlemi sırasında özellikle kırılgan. Ticari tuz çözümler ve kültür memeli hücre kültürleri için kullanılan ortam pH Tampon sistem (ler) ve osmolalite açısından özellikle teleost balık için uygun değillerdir. Bu, bu nedenle, ölçmek ve bu parametrelerin faiz türlerin fizyolojik ilgili düzeyleri çözümlerinize ayarlamak önemlidir.
Birincil hipofiz kültürleri ortak sazan da dahil olmak üzere birkaç teleost balık türleri yapılan (Cyprinus carpio)2,3, çim sazan (Ctenopharyngodon idella)4, akvaryum balığı (Carassius hava )5, gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss)6, Avrupa yılan balığı (Anguilla anguilla)7, tilapia (Oreochromis mossambicus)8, zebra balığı (Danio rerio)9, ve Atlantik morina (Gadus morhua)10. Faiz tür inkübasyon sıcaklığı ayarlama dışında bu protokoller birkaç senaryo üzerinden 7,2 pH 7.5 oksijen bir atmosferde için ilgi türünün suboptimal olabilir memeli benzeri koşulları Özeti inkübe içeren % 3-5 CO2. Buna ek olarak, belirsiz bu birincil hücre kültürlerinde birkaç hazırlamak için kullanılan çözümler osmolalite ayarlandı ve farklı çözümler arasında istikrarlı.
Geçerli protokol Atlantik morina10 birincil kültürlerle önceki çalışma dayanır ve için ayarlamalar inkübasyon sıcaklığı, osmolalite, pH ve pH Tampon sistemleri, karbon dioksit (pCO2), kısmi basınç oluşur medaka (O. latipes) fizyolojisi. Medaka Doğu Asya'ya yerel, küçük (3-4 cm) tatlı su balığı var. Üremek nispeten kolay ve birçok ortak balık hastalık11son derece dayanıklı olduğu gibi bu gün, bu dünyanın her yerinden birçok araştırma laboratuarında bir modeli tür olarak kullanılır. Sıcaklık toleransı 4 – 40 ° C11, kısa oluşturma süresi, şeffaf embriyolar, cinsiyet belirleme gen12ve sıralı genom13, yanı sıra çok da dahil olmak üzere bir model olarak medaka kullanmanın bir çok avantajı vardır diğer Mevcut genetik kaynakları.
Bu protokolü birincil kültür koşullarda medakas, balık tesiste tutulur 26 ° C sıcaklık eşleşecek şekilde optimize edilmiştir. Ayrıca, osmolalite Atlantik morina 290 mOsm/kg tatlı suda yaşayan medaka için tuzlu su içinde yaşayan 320 mOsm/kg dan azalır ve uygun olarak medaka plazma14osmolalite normal olduğunu. Buna karşılık, memeli plazma tipik osmolalite 275-295 mOsm15içinde aralıktır. Hayat içinde a değişiklik-in sıcaklık derecesi balık ve su, kan ve ekstraselüler sıvı pH ve arabellek kapasitesini balık memeliler farklı yapmak ile doğrudan temas halinde olan Solungaçlarım var. Memeli Kültür medya genellikle medya % 5 CO2 37 ° C'de oksijen havada bir standart atmosferine equilibrated yükleyen pH yaklaşık 7,4 neden tampon sistemleri dahil PH seviyesi sıcaklık bağımlı ve azalan bir sıcaklık16ile nötr pH (suya) artar değeri arasındadır. Tipik teleost balık plazma pH 7.7 7.917' ye aralıkları. Bu protokol optimizasyon pH 7.85 pH 7,75 medaka CO2 den % %0.5 1 artırarak 26 ° C'de muhafaza için 12 ° C'de tutulur COD azalma dahil.
Buna ek olarak, bikarbonat arabelleği kapasitesi balık ve memeliler oldukça farklıdır. CO2 kolayca balık solungaçları üzerinde değiştirilir ve suda pCO2 akciğer18pCO2 yalnızca küçük bir kısmını. Sıcaklık veya pCO2 pH ve tampon orta değiştirilir. Sonuç olarak, pH hem de memeli hücreleri kuluçka için önerilen pCO2 balık hücreler için en uygun olmadığı ve bu nedenle, Kültür medya balık için fizyolojik ilgili değerleri içeren tampon sistemleri ile optimize ve belirli tür ilgi. Bu iletişim kuralı medaka pituitaries birincil hücre kültürleri hazırlamak ve kuluçka sıcaklık, osmolalite, pH ve pH Tampon sistemi, birincil hücre hazırlanırken göz önünde bulundurulacak diğer önemli parametrelere ek ayarlamalar dahil açıklar kültürler memeli olmayan türler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada gerçekleştirilen hayvan deneyleri yaşam bilimleri, bakım ve araştırma hayvan refahı için aşağıdaki yönergeleri Norveççe Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. hazırlanması çözümleri
- Osmometer ve pH metre aletleri doğru ölçümler emin olmak için üreticinin yönergelerine göre kalibre.
-
Ca2 +- ve Mg2 +500 mL hazırlamak-7,75 (adım 1.2.1) için pH ve 290 mOsm/kg (adım 1.2.2) steril filtrasyon (adım 1.2.3) önce osmolalite ayarlama Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz çözeltisi (dPBS), ücretsiz.
- PH 7,75 için kalibre edilmiş pH metre ile dikkatli bir şekilde çözüm dikkatle karıştırarak 1 M NaOH çözüm damla ekleyerek ayarlayın.
- Kalibre edilmiş bir osmometer kullanarak çözüm osmolalite ölçmek ve mannitol osmolalite 290 mOsm/kg artırmak için gerekli miktarı hesaplar. Mannitol gerekli miktarda ekleyin ve sonra yeniden doğru uyum sağlamak için çözüm osmolalite ölçmek.
Not: Genellikle farklı gruplar arasında değişir osmolalite ölçülen, mannitol gerekli miktarı bağlıdır. Bir molekül mannitol 1 ozmotik parçacık eşittir. - Steril-filtre 0.2 µm filtre kullanarak dPBS çözüm.
Not: Çözüm için en az 3 ay 4 ° C'de depolanmış olabilir.
- L-glutamin ve bikarbonat olmadan iyi (L-15) kültür ortamının 500 mL hazırlamak ve bununla 10 mM NaHCO3 (adım 1.3.1), 4.5 mM glikoz (adım 1.3.2) ve 2 mM piyasada bulunan glutamin (adım 1.3.3) ekleyin. 290 mOsm/kg (adım 1.3.4), çözüm ayarlamak steril filtre bu (1.3.5. adım) ve 2.5 mL penisilin-streptomisin çözeltisi (adım 1.3.6) ekleyin.
Not: Çözüm için en az 4 hafta 4 ° C'de depolanmış olabilir.- NaHCO bir 10 mM çözümü elde etmek kültür ortamının 500 mL3 420 mg ekleyin.
- 405 mg glikoz 4.5 mM çözüm elde etmek için kültür ortamının 500 mL başına ekleyin.
- Bir glutamin çözeltinin 100 x stokunun 5 mL 500 mL 2 mM çözüm elde etmek için kültür ortamının ekleyin. Tüm solutes eriyene kadar karıştırın.
- Çözüm 290 mOsm/kg (1.2.2. adımda yapılır gibi) bir osmometer kullanarak mannitol ile ayarlayın.
- Steril bir filtrasyon 0.2 µm filtre kullanarak L-15 orta gerçekleştirin.
- Steril filtrasyonu sonra 2.5 mL 50 U/mL penisilin ve 50 µg/mL streptomisin için karşılık gelen bir penisilin-streptomisin çözeltisi ekleyin.
- 50 mL 1 mg/mL (% 0,1) tripsin tip II-S (1.2 adımda hazırlanan) değiştirilmiş dPBS içinde çözünmüş kullanarak tripsin çözeltisi hazırlamak. Aliquots 2 ml steril plastik tüplerde yapmak ve onları kadar kullanmak-20 ° C'de depolayın.
Not: Aliquots 2 ml-20 ° C'de en az 3 ay süreyle saklanabilir. - 50 mL 1 mg/mL (% 0,1) tripsin inhibitörü türü ben-s kullanarak tripsin inhibitörü çözeltisi hazırlamak ve 2 µg/mL (1.2 adımda hazırlanan) değiştirilmiş dPBS içinde çözünmüş DNaz ile ek. Aliquots 2 ml steril plastik tüplerde yapmak ve onları kadar kullanmak-20 ° C'de depolayın.
Not: Aliquots 2 ml-20 ° C'de en az 3 ay süreyle saklanabilir.
2. ekipman hazırlanması
- Cam pipetler hücre ayrılma için belgili tanımlık uç parlatma yangın hazırlayın. 2 farklı boyutta kategoriler ile keyif yapmak (0,6-0,8 Orta bir açılış µm ve 0.4-0.6 küçük bir açılış µm) oynayarak zaman ve alev olan uzaklığı ile aynı anda pipet dönüm. Cam pipetler bir temiz cam kaba ve Otoklav (katı modu 105 ° C için 45 dk kullanarak) yerleştirin.
- Buz polistren kutusuyla hazırlayın.
- Değiştirilmiş dPBS (1.2 adımda hazırlanan) 1,5 mL plastik bir boru pituitaries için diseksiyon sırasında aktarmak ve buz üzerinde tutmak için hazır olun.
- 15 mL tüp 10 mL (1.2 adımda hazırlanan) değiştirilmiş dPBS ile hazırlamak ve hücre ayrılma kadar buz üzerinde tutun.
- Taze hazırlamak veya aliquots tripsin ve tripsin inhibitörü çözümleri (1.4 ve 1.5 adımlarda hazır) çözülme ve buza kadar kullanmak saklayın.
- Su banyosu 26 ° C-su pituitaries kimyasal ayrışma önce istenilen sıcaklık ulaşmak izin vermek için diseksiyon başlamadan önce ayarlayın.
- Tüm diseksiyon araçları % 70 etanol ile önce sırasında ve sonrasında kullanım, balık yıkmaya diseksiyon ve ince iğneler ve balmumu plaka için kullanılacak iyi forseps dahil olmak üzere temiz. Temiz eldiven kullanın (değiştirmek ve sık sık temiz) hücrelerin bir potansiyel kirlenmesini önlemek için bütün prosedür sırasında.
3. hipofiz diseksiyon ve hücre ayrılma
- Balık Ice slush (0 ° C) çeker tarafından ötenazi. Balık Ice slush geri dönüşü olmayan bir hipotermik şok emin olmak en az 1 dakika bırakın.
Not: Bir kaç saniye sonra immobilizasyon ve denge kaybı ortaya çıkar. Balık buzlu suda tamamen sular altında ve buz üstünde tepe-in ikinci boğulma için yol açacak ve potansiyel cilt yerine hızlı ve insancıl hipotermik şok yakar gibi yalan yok emin olun. - Çabuk, bir balık bir balmumu plakasına diseksiyon mikroskop altında transfer ve boyun ile çelik yerli tarafından omurga yok.
- Bir iğne (ağız) üzerinden açık ve başından (beyin) arkasında her tarafında bir diseksiyon kafasına dengelemeye koyarak ince iğneler, kullanarak balmumu plaka balık başkanı pin.
- Balık diseksiyon mikroskop altında görüntüleyebilir ve yavaşça ölçekler iyi forseps ile açılı bir ipucu kullanarak başın üst kapalı kazımak.
- Dikkatle cilt altında iyi forseps açılı ucu baş taraftan ekleyip yavaşça forseps kafatası çatı kapsayan forseps bir tutuş tutarken agiz cizgisi, yönde hareket ettirerek kafatası çatı kaldırabilirsiniz.
- Omurilik tamamen forseps ile açılı bir ucu kullanarak kesti.
Not: Zaman önemli bir faktör, bu yüzden iş verimli ve hücreleri tabakta kaplama kadar doğru bir şekilde pituitaries diseksiyon süreyi sınırlamak için harcanan. Biraz pratik sonra hipofiz diseksiyon yaklaşık 2-3 dk balık, başına sadece 10 etrafında almalısınız s beyin zaten maruz kaldığında hipofiz almaya ihtiyaç vardır. - Dikkatle beyin hipofiz ortaya çıkarmak ve düz bir ipucu ile temiz forseps ile incelemek için ağız doğru çevirin. Hipofiz değiştirilmiş 1.5 mL dPBS içeren bir plastik tüp transferi (ayrıntılı bilgi için bkz: adım 2.3) buz üzerinde yerleştirilir. Hipofiz başarıyla tüp eklenir ve hiçbir şey üzerinde pensler kaldı emin olmak için mikroskop altında pens ucunu kontrol edin.
Not: aynı anda hazırlıklı olmak için gidiyoruz kültür yemekleri sayısına bağlı olarak gerektiğinde çok pituitaries incelemek. Pratik bir kural olarak, yetişkin balık (hangi aşağı akım uygulamaya bağlıdır) uygun bir yoğunluk hücre için çanak başına en az 10 pituitaries hesaplayın. - Spin aşağı oda sıcaklığında 1-2 s için masa üstü bir santrifüj pituitaries. Dikkatle cam pipet kullanarak dPBS kaldırmak ve herhangi bir pituitaries kaldırma önlemek için dikkat ediniz.
- Pituitaries yıkama, onları 1-2 s için masa üstü bir santrifüj içinde spin aşağı ve ek 1 mL tripsin çözeltisi eklemeden önce bir cam pipet kullanarak sıvı çoğu kaldırmak için 1 mL (1.4 adımda hazırlanan) tripsin çözeltisi ekleyin.
- Bir su banyosu için tercihen ile nazik sallayarak, 30 dk, 26 ° C'de tüpte kuluçkaya veya alternatif olarak, tüp birkaç kez kuluçka süresi boyunca hafifçe vur.
- Spin aşağı oda sıcaklığında 1-2 s için masa üstü bir santrifüj pituitaries ve tüm pituitaries tüp alt kısmında yer olduğundan emin olun. Cam Pipet tripsin çözümle çoğunu kaldırın ve tripsin devre dışı bırakın ve pituitaries yıkamak için 1 mL (1.5 adımda hazırlanan) tripsin inhibitörü çözeltisi ekleyin.
- Tüpün dibinde pituitaries onları aşağı içinde oda sıcaklığında 1-2 s için masa üstü bir santrifüj iplik tarafından toplamak. Cam Pipet ile sıvı çoğu kaldırın ve 1 mL (1.5 adımda hazırlanan) tripsin inhibitörü çözeltisi ekleyin. Bir su banyosu için tercihen nazik sallayarak ile 20 dk, 26 ° C'de tüpü yerleştirin veya alternatif olarak, birkaç kez tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için kuluçka döneminde tüpü hafifçe vur.
- L-15 orta 2 mL ekleyerek ve bunu doğru sıcaklık ve pH hücreleri kaplama önce erişebilmesi için en az 10 dk 26 ° c ve % 1 CO2 kuluçkaya izin Merkez cam alt ile bir 35 mm poli-d-lizin-kaplı hücre kültür yemek hazırlamak.
Not: Bir plastik hücre kültür yemek de kullanılabilir. Bir yemek ile merkezi cam alt kullanarak ana avantajı hücreleri nerede kaplama alanı küçükse ve bu nedenle, daha az hipofiz hücreleri çanak gereklidir olmasıdır. Akış aşağı bazı uygulamalar da bir cam alt (yani, bazı görüntüleme teknikleri) gerektirebilir. - 15 mL tüpler için soğutma santrifüj 4 ° C mekanik ayrışma başlamadan önce istenilen sıcaklık ulaşmak izin vermek için ayarlayın.
- Pituitaries iplik metroyla altındaki aşağı oda sıcaklığında 1-2 s için masa üstü bir santrifüj tripsin inhibitörü çözümde (Kimden adım 3.11) ile tüp ve toplamak tüm pituitaries daha önce tüp dibinde yer olduğundan emin olun dikkatle Cam Pipet kullanarak tripsin inhibitörü çözüm çoğunu kaldırılıyor.
Not: hücreleri kirlenmesini önlemek hücre iş için sertifikalı tüm aşağıdaki adımları bir laminar akış Bank (SMD) protokolü uygulayın. - 1 mL (2.4 adımda hazırlanan) buz gibi değiştirilmiş dPBS hipofiz doku parçaları ekleyin ve hafifçe (2.1 adımda hazırlanan) bir Yangın Cilalı Cam Pipet içinde doku parçaları (6-7 x) yukarı ve aşağı emmek.
Not: Sıcaklık önemli bir yönü, yani tüm çözümler 4 ° C'de tutmak Bu noktadan itibaren buza mümkün olduğunda tüm adımları gerçekleştirin. - Spin aşağı doku parçalar halinde oda sıcaklığında 1-2 s için masa üstü bir santrifüj ve dikkatle buza yerleştirilen yeni bir 15 mL tüp Disosiye hücreleri (hemen hemen 1 mL) içeren dPBS üst kısmındaki aktarın. Doku parçaları bıraktığı pipet tüp alt doğru hareket kaçının.
- Buz gibi dPBS 1 mL hücrelerde dPBS tüm 10 mL kullanılana kadar teker teker dissociating 3,16-3,17, adımları yineleyin. Bir orta ölçekli açılış ve Cam Pipet sonuna doğru daha küçük bir açılış ile geçiş ile Cam Pipet (son 3-4 mL için eklendi dPBS) ayrılma kullanmaya başlamak. Yapıya ait hala görülebilen doku parçaları ayrılma yordam sonuna doğru iseniz, dPBS ayrılma için 2 son adım doğru yaklaşık 10 x pipetting artırmak ve sonunda kalan doku parçaları geride. Hücreleri nazikçe resuspend ve hücreleri kabarcıkları yüzeye iliştirdiğinizde hücre hasarı neden olabilir gibi kabarcıklar oluşturmaktan kaçının.
Not: Bu bir kritik adım bu protokol ve iyi bir sonuç elde etmek için bazı eğitim gerektirir. - Tüp (4 ° C-önceden soğutmalı) santrifüj ve hücreleri 200 x g 4 ° C'de 10 dakika için de aşağı spin denge Nerede cep Pelet olacak tüp tarafında işaretlemek emin olun.
- Dikkatle santrifüj tüpü çıkarması ve yavaşça süpernatant cam pipet ile bir boş 15 mL plastik tüp doğrudan Santrifüjü sonra transfer. Çoğu süpernatant kaldırmak ancak küçük (genellikle görünmez) hücre Pelet kaybetmemek için dikkat çekmek emin olun.
- Dikkatli bir şekilde hücre Pelet L-15 kültür orta 50-100 µL içinde resuspend.
Not: Bu adımda, bu hücreleri saymak ve/veya bir canlılık testi (örneğin sayım varlığı trypan mavi bir hemasitometre kullanarak bir hücreye) gerçekleştirmek ama bu amaç için hücre süspansiyon parçası kullanarak verimi düşürür dikkat mümkündür. Bu çanak merkezi dışında difüzyon hücreleri riskini artıracaktır gibi bir büyük süspansiyon birim kullanmaktan kaçının. - Dikkatle Disosiye hücreleri (3.13 adımda hazırlanan) L-15 orta 2 mL içeren hücre kültür çanak ortasında damla. Cam alt batık parçası dışında yayılmış hücreler zorunda kalmamak için kuluçka makinesi, geçmeden önce yemek için yaklaşık 5 dk altına batmaya hücreleri izin.
- Tüm hücreler iyice lavabo ve çanak alt kısmına eklemek izin vermek için 26 ° C ve % 1 CO2 çanak kuluçkaya.
- 30 dakika sonra kültür yemek için ekli var emin olmak için mikroskop hücrelerde bakın.
- 26 ° C ve % 1 CO2hücreleri kuluçkaya devam'i tıklatın.
- Dikkatli bir şekilde değiştirmek orta her 3-4 günde en çok (ama hepsi değil).
Not: Bu hücreleri rahatsız ve onları cam alt kısmından ayırmak gibi orta daha sık değiştirmekten kaçının. Hücreleri deneyler için onları tohum sonra bir hafta içinde kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu iletişim kuralı bir birincil hücre kültürü medaka pituitaries üzerinden hazırlanması açıklar ve bir kültürde en az bir hafta için korunabilir sağlıklı hücreleri sağlar. Protokol medaka14 için fizyolojik ilgili değerleri temel alarak ve ayrıca hipofiz doku yetişkin balık, doku kaplama için hasat--dan tüm prosedürü sırasında 7,75 pH ve bir osmolalite 290 mOsm/kg kullanarak için optimize edilmiştir hücre kültürü (resim 1 ve Şekil 2).
Bu iletişim kuralı tarafından üretilen birincil hücre kültürleri üzerinde deneyler temsilcisi sonuçları Şekil 3, Şekil 4ve Şekil 5görüntülenir. Burada sunulan sonuçlar için transgenik medaka satır, luteinizing hormon (Lh) nerede-gonadotrope hücreleri yeşil flüoresan protein (GFP) hızlı, çok kullanılan19oldu. Şekil 3 gün 0 tohum sonra 7 gün bir birincil hücre kültüre çanak temsilcisi bir alanda gösterilir her iki alan parlak ve floresan mikroskopi görüntüleri de dahil olmak üzere, GFP ifade Lh-gonadotrope hücreleri gösteren. Genellikle yemek yaklaşık 10 Yetişkin medaka pituitaries kullanarak yaklaşık 5 x 104 -dansitesi tohum sonra çanak başına 1 x 105 hücre oluşur. Kültür hipofiz hücreleri canlılığı GFP ifade hücre kültüründe toplam sayısı 1, 3 ve 7'den sonra kaplama, gün gün 0 (Şekil 4) göre hesaplanır. Şekil 4 ' te gösterilen grafik üzerinde % 90 3 gün sonra hala hayatta iken ölen hücreleri hemen hemen 1 gün sonra canlı hücrelerin % 95'ile zaman içinde sürekli olduğunu gösterir. Hücre canlılığı zamanla küçük bir düşüş olsa da, çoğu (% 75) kültür bir hafta sonra hala hayatta hücrelerdir. Elektrofizyolojik kayıtlar GFP ifade Lh-gonadotrope hücre (Strandabø ve ark.açıklandığı gibi yapılır) 20 i göster hücreler Kültür (5A rakam) 4 gün sonra kendiliğinden Aksiyon potansiyelleri harekete edebiliyoruz. Ayrıca, gonadotropin - releasing hormon uyarılması, hücre zarının bir ilk geçici hyperpolarization atış eşlik eden bir depolarizasyon ve artan çalışma süresi ile frekans dramatik bir artış takip ediyor potansiyelleri (Şekil 5B).
Şekil 1: hipofiz birincil hücre kültür teknik bakış. Pituitaries iyi forseps ile disseke ve tripsin inhibitörü ile bir inactivation ardından pituitaries ile 26 ° c (adım 2), tripsin enzimatik sindirim kadar buz (adım 1 protokol) değiştirilmiş dPBS içeren bir plastik tüp transfer (gösterilmez) 26 ° C'de. Cam Pipet ile enzimatik sindirilmiş pituitaries mekanik ayrışma dikkatle buz (adım 3), dPBS 4 ° c (adım 4) Santrifüjü ardından gerçekleştirilir. Son olarak, hücre Pelet kültür orta ve bir hücre kültür çanak (5. adım) kaplama hücreleri feshedilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: medaka hipofiz diseksiyon ayrıntılarını. (A) bir immobilize medaka (dorsal görünümü) Başkanı bir balmumu plakasına tutturulmuş ve kafatası çatı üst üst beyin ortaya çıkarmak için iyi forseps ile kaldırılır. (B) spinal kord kopmuş ve hipofiz maruz öyle ki baş öne doğru beyin devrildiğinde. (C) hipofiz temiz, iyi forseps ile toplanır. Ok ucu panelinde hipofiz B ve Cişaret eder. Ölçek çubuğu 1000 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Medaka hipofiz birincil hücre kültürü. Bu paneller gün 0, 3. gün ve 7 gün sonra tohum bir temsilcisi medaka hipofiz birincil hücre kültürü yüksek çözünürlüklü confocal görüntülerini göster. Üst paneli parlak alan mikroskobu görüntüleri temsilcisi alanının orta masası görüş GFP ifade Lh-gonadotrope hücreleri görüntüleme aynı alan floresan mikroskopi görüntüleri gösterir ve alt panel bir bindirme iki tabak içinde gösterir. Ölçek çubuğu 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: canlılık medaka hipofiz hücreleri kültür. Bu şekilde gün 0, 1, 3 ve 7 tohum sonra ölçü vasıl hipofiz birincil hücre kültürleri canlılığı gösterilmiştir. Sayıları GFP ifade Lh-gonadotrope hücre zaman 0 göre farklı zaman noktalarda çanak başına toplam sayısı dayalı ve açık kaynak yazılım CellProfiler V2 kullanarak hesaplanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: hipofiz hücreleri elektrofizyolojik kayıtları. Bu paneller bir GFP ifade Lh-gonadotrope hücreden elektrofizyolojik kayıtlar sonra tohum,(a)spontan Aksiyon potansiyelleri, temsili bir iz gösteriliyor (Btarafından) takip 4 gününde gerçekleştirilen bir birincil hücre kültürü göstermek bir stimülasyon ile 10 gonadotropin - releasing hormon Gnrh1 s. Gnrh1 uyarım ardından depolarizasyon ve artan süresi (% 50 zirvesinde ölçülür) aksiyon potansiyelleri hücre zarının hyperpolarization bifazik yanıtta 8,9 ± 3,0 ms stimülasyon önce 29.2 ± 9.9 ms sonra neden olmaktadır uyarım. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vitro hücre kültür sistemleri doğru şekilde1' de kullanılan bir bolluk farklı biyolojik soru cevap araştırmacılar için güçlü araçları sağlar. Onlar aslında içinde vivodaha onların bağlantı komşu hücrelere kaybetmiş Disosiye hücreleri farklı işlevsel özellikleri alınan olduğunu hatırlamak önemlidir. Vitro deneylerden elde edilen sonuçları misinterpreting riskini önlemek için faiz türler ve hücre türü birincil hücre kültür yordamına ayarlama dikkate almak önemlidir. Hatta orta ayarlamalar standart kültür yordamlar ve çözümleri kullanılan çoğu kez son derece belirli hücre tipi kültür şartları değiştirmek yeterli.
Bu protokolü hazırlama ve sıcaklık, osmolalite, pH ve pCO2 çözümleri için kullanılan gibi parametreleri ayarlayarak elde yetişkin medaka pituitaries birincil hücre kültürleri korumak için en iyi duruma getirilmiş koşulları açıklar Bu tür fizyolojik koşullarıyla eşleşir. PH bağımlı sıcaklığı ve bu nedenle, aynı zamanda farklı farklı sıcaklıklarda17, yaşayan teleost balık türleri arasında ayarlanmalıdır. Osmolalite hücre ayrılma ve kültür sırasında kullanılan tüm çözümleri de hücreleri durumunu iyileştirmek için ayarlanmalıdır. Özellikle, varsa bir tutarsızlık osmolalite içinde yalıtım işlem sırasında kullanılan farklı çözümleri arasında bir azalmış canlılık (yayınlanmamış yazarların kendi sonuçları) önde gelen kültür kalitesi üzerinde yıkıcı etkileri olabilir. Hyperosmotic çözümleri daraltmak için hücre (ve tersi), böylece membran bütünlüğü ve membran protein işlevi21ile müdahale neden olur. Bu bağlamda önemli bir nokta osmolalite ve pH gibi parametreleri genellikle ölçülen ne de ticari arabellekleri farklı toplu işlemleri ve kültür memeli kültür koşullarında kullanılan medya arasında istikrarlı değildir. Osmolalite ve pH yalıtım işlem sırasında kullanılan farklı çözümleri arasındaki farklılıkları her zaman kaçınılmalıdır.
Başarı oranı bu protokol tarafından eğitim artırıldı, o beklenmektedir böylece araştırmacılar tekniği farklı adımları ile daha yakından tanımak için biraz zaman gerekir. Örneğin, hücreleri tabakta kaplama kadar pituitaries diseksiyon zaman ters hücre sağlıkla ilgili. Cam Pipet kullanarak pituitaries mekanik ayrışma Protokolü'nün özellikle kritik bir adımdır ve iyi bir sonuç elde etmek için bazı eğitim gerektirir. Ayrılma yordamı hücrelere zararlıdır ozmotik ve mekanik stres tanıtabilirsiniz. Ayrıca mekanik ayrışma için tekrarlanan adımda değiştirilmiş dPBS küçük hacimli araştırmacı devam ederken nerede zaten Disosiye hücreleri yeni tüp ve sol el değmemiş, Transfer nazik bir ayrılma işlem sağlar ek hücreleri dPBS yeni bir birimdeki dokusundan ayırmak.
Bu iletişim kuralı yetişkin medaka hipofiz hücreleri için optimize edilmiştir. Farklı türler, dokular veya hayvan aynı doku içinde bile farklı yaşam evreleri kültür koşullardan en iyi duruma getirmeleri gerekir. Örneğin, olgunlaşmamış hayvanlardan elde edilen hücreleri daha kırılgan olabilir ve bu nedenle, apoptozis karşı daha duyarlı ve hücre ölüm ve, böylece, özellikle nazik bir ayrılma yordam doğru iletişim kuralı ayarlamak için gereken gerekli. Çok zor apoptozis ve/veya hücre ölüm neden olabilir ederken çok dikkatli bir mekanik ayrışma daha düşük bir kazanç için yol açacak gibi bir cam pipet kullanarak mekanik ayrışma yordam, çok kritik bir adımdır. Farklı enzimler ayrılma için kabul edilir, farklı sindirim zaman ve enzim konsantrasyon kullanmak gerekli olabilir. Medaka pituitaries çok küçük ve nispeten kolay tarif protokolünü kullanarak ayırmak için. Ancak, en iyi duruma getirmeleri diğer türler için ayrılma sonra enkaz kaldırmak için bir mikro gözenekli filtre kullanımı gerekebilir. Bu iletişim kuralı başarısı da büyük ölçüde steril koşullarda hücreleri kirletici önlemek için adımları gerçekleştirmek üzerinde bağlıdır.
Çanak başına tohum için hücre sayısı pituitaries başında sayısı yanı sıra ayrılma yordamı başarısı bağlıdır. Kabaca bir bozulmamış yetişkin medaka hipofiz yaklaşık 15.000 hücreleri vardır. Ancak, hücreleri ayrılma işlemi sırasında kaybolur ve bunun için bir deney için gerekli pituitaries sayısı hesaplanırken muhasebesi. Çanak en az 10 pituitaries kullanarak genellikle neden olacaktır bir yoğunluğu içinde yemek başına 50.000-100.000 hücre. Bu yoğunluk toplama herhangi bir önemli miktarda, düz-den sonra 7 gün içinde kültür formu değil. Fark, toplama yoğunluk bağımlı, gibi daha yoğun seribaşı hücreleri, daha onlar görünmek gibi görünüyor toplamak. Bazı prosedürleri daha yoğun bir kültür gerekli olabilir ve bu nedenle, en iyi tohum yoğunluğu aşağı akım uygulamaya bağlı olarak düşünülmelidir. Pituitaries sayısı planlarken çanak kullanmak için göz önünde önemli bir noktadır.
En yaygın karşıdan akış uygulamaları birincil hücre kültürleri tohum sonra ilk birkaç gün içinde kullanın. Burada, elektrofizyolojik kayıtlar için hücre canlılığı üzerinden sunulan sonuçları tohum sonra 1 hafta açıklanan protokolü kullanılarak hazırlanan birincil hücre kültürleri iyi sonuçlar elde etmek mümkün olduğunu göstermek. Yine de, kültürler uzun tutulabilir ve sağlıklı hücreler Kültür (yayınlanmamış yazarların kendi sonuçları) üzerinden 2 hafta sonra hala mevcut. Bu protokol için sunulan en iyi duruma getirilmiş koşulları fizyolojik açıdan anlamlı sonuçlar kolaylaştırır ve diğer bilim adamları birincil hücre kültürleri memeli olmayan hücrelerden hazırlık için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bildirmek için bir şey yok.
Acknowledgments
Bu proje, yaşam bilimleri ve Araştırma Konseyi Norveç, grant numarası 243811 ve 244461 (su ürünleri programı) Norveççe üniversite tarafından finanse edildi. Balık tesisi korumak için Lourdes Carreon Tan yaşam bilimleri Norveççe Üniversitesi için minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D8537 | Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol. |
| L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | L5520 | Supplement 500 ml culture medium with 10 mM NaHCO3, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 µm PES sterile filter, before adding 2.5 mL Penicillin-Streptomycin solution (see below for details). |
| NaOH | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5881 | Add drops of 1 M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75. |
| NaHCO3 | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5761 | 10 mM NaHCO3 equals 420 mg per 500 mL culture medium. |
| D-mannitol | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | 63565 | Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm. |
| D-glucose | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | G5400 | 4.5 mM D-glucose equals 405 mg per 500 mL culture medium. |
| GlutaMAX Supplement | Gibco (Life Technologies, Paisley, UK) | 35050-061 | Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100x stock in 500 mL culture medium. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | P0781 | Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 mL of stock solution in 500 mL L-15 medium (equivalent of 50 U/mL Penicillin and 50 µg/mL Streptomycin). |
| Trypsin type II-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T7409 | Prepare 1 mg/mL in dPBS solution. |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T6522 | Prepare 1 mg/mL in dPBS solution, supplement with 2 µg/ml Dnase I (see details below). |
| Dnase I | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D5025 | Use in trypsin inhibitor solution (see above). |
| 0.2 µm Polyethersulfone (PES) sterile filter system | Corning Inc. (Corning, NY) | 431097 | Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments. |
| 35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-10-C | Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application. |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11254-20 | Straight tip |
| Dumont #5/45 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11253-25 | Angled 45° tip |
| Stereo microscope SZ61 | Olympus Corp. (Tokyo, Japan) | Use for dissection of pituitaries. | |
| Alegra X-22R Centrufuge | Beckman Coulter Inc. (Brea, CA) | With cooling option (similar to current model XR-30). | |
| Water bath | Techne (Staffordshire, UK) | Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do. | |
| Pasteur glass pipettes | VWR (NY) | 612-1701 | Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use. |
| Galaxy MiniStar table centrifuge | VWR (NY) | 521-2844 | Any small table centrigue will do. |
| Fine needles/insect pins | Fine Science Tools (CA) | 26001-40 | Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead. |
| Wax plate | Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish. |
References
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2010).
- Ribeiro, L. P., Ahne, W. Fish cell culture: initiation of a line of pituitary cells from carp (Cyprinus carpio) to study the release of gonadotropin in vitro. In Vitro. 18 (5), 419-420 (1982).
- Ribeiro, L., Ahne, W., Lichtenberg, V. Primary culture of normal pituitary cells of carp (Cyprinus carpio) for the study of gonadotropin release. In Vitro. 19 (1), 41-45 (1983).
- Wong, A. O., Ng, S., Lee, E. K., Leung, R. C., Ho, W. K. Somatostatin inhibits (d-Arg6, Pro9-NEt) salmon gonadotropin-releasing hormone- and dopamine D1-stimulated growth hormone release from perifused pituitary cells of chinese grass carp, Ctenopharyngodon idellus. General and Comparative Endocrinology. 110 (1), 29-45 (1998).
- Chang, J. P., et al. Use of a pituitary cell dispersion method and primary culture system for the studies of gonadotropin-releasing hormone action in the goldfish, Carassius auratus. I. Initial morphological, static, and cell column perifusion studies. General and Comparative Endocrinology. 77 (2), 256-273 (1990).
- Weil, C., Hansen, P., Hyam, D. Use of pituitary cells in primary culture to study the secretion in rainbow-trout - Setting up and validating the system as assessed by its responsiveness to mammalian and salmon gonadotropin-releasing hormone. General and Comparative Endocrinology. 62 (2), 202-209 (1986).
- Montero, M., LeBelle, N., Vidal, B., Dufour, S. Primary cultures of dispersed pituitary cells from estradiol-pretreated female silver eels (Anguilla anguilla L): Immunocytochemical characterization of gonadotropic cells and stimulation of gonadotropin release. General and Comparative Endocrinology. 104 (1), 103-115 (1996).
- Xu, S. H., Cooke, I. M. Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells. General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).
- Lin, S. W., Ge, W. Differential regulation of gonadotropins (FSH and LH) and growth hormone (GH) by neuroendocrine, endocrine, and paracrine factors in the zebrafish-An in vitro approach. General and Comparative Endocrinology. 160 (2), 183-193 (2009).
- Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO2, and pH. General and Comparative Endocrinology. 178 (2), 206-215 (2012).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - a model organism from the far East. Nature Reviews Genetics. 3, 53-64 (2002).
- Matsuda, M., et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).
- Kasahara, M., et al. The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution. Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).
- Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes. Zoological Letters. 2 (12), (2016).
- Waymouth, C. Osmolality of mammalian blood and of media for culture of mammalian cells. In Vitro. 6 (2), 109-127 (1970).
- Cameron, J. N. Acid-base homeostasis - past and present perspectives. Physiological Zoology. 62 (4), 845-865 (1989).
- Claiborne, J. B., Edwards, S. L., Morrison-Shetlar, A. I. Acid-base regulation in fishes: cellular and molecular mechanisms. Journal of Experimental Zoology. 293 (3), 302-319 (2002).
- Perry, S. F., Tufts, B. L. Fish respiration. , Academic Press. San Diego, CA. (1998).
- Hildahl, J., et al. Developmental tracing of luteinizing hormone β-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function. Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).
- Strandabø, R. A. U., et al. Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes). Molecular and Cellular Endocrinology. 372 (1-2), 128-139 (2013).
- Verbalis, J. G. Brain volume regulation in response to changes in osmolality. Neuroscience. 168 (4), 862-870 (2010).
