Summary
Her beskriver vi en protokol for at forberede og vedligeholde primære hypofyse cellekulturer fra medaka (Oryzias latipes). De optimerede betingelser i denne protokol tage vigtige parametre såsom temperatur, osmolalitet og pH ved at efterligne de fysiologiske tilstande af fisk, hvorved fysiologisk mere meningsfulde resultater.
Abstract
Primære cellekultur er et kraftfuldt værktøj, der er almindeligt anvendt af forskere til at studere cellulær egenskaber og mekanismer af isolerede celler i et kontrolleret miljø. Trods store forskelle i fysiologi mellem pattedyr og fisk, er primære celle kultur protokoller fra fisk ofte baseret på pattedyr dyrkningsbetingelser, ofte med kun mindre ændringer. Miljømæssige forskellene berører ikke kun kropstemperatur, men også blodserum parametre såsom osmolalitet, pH buffer kapacitet og pH. Celle Kulturmedier og lignende arbejder løsninger er beregnet til at efterligne Karakteristik af den ekstracellulære væske og/eller blod serum som en celle er tilpasset, er det af afgørende betydning, at disse parametre er tilpasset specielt til det pågældende dyr.
Den nuværende protokol beskriver optimeret primære dyrkningsbetingelserne for medaka (Oryzias latipes). Protokollen indeholder detaljerede trin til at isolere og opretholde sunde dissocieres hypofyse celler for mere end en uge og omfatter følgende trin: 1. justering af osmolalitet værdier fundet i medaka blodplasma, 2. tilpasning af de inkubation temperaturen til normal medaka temperatur (her i akvarium anlægget), og 3. justering af pH og bikarbonat bufferen til værdier sammenlignes med andre fiskearter, der lever på lignende temperaturer. Resultaterne præsenteres ved hjælp af den beskrevne protokol fremme fysiologisk meningsfulde resultater for medaka og kan bruges som en referenceguide af forskere at gøre primære cellekulturer fra andre ikke-pattedyr arter.
Introduction
Cellekultur er en af de vigtigste værktøjer, der anvendes i molekylær biologisk forskning, giver en fremragende modelsystem for at besvare forskellige biologiske spørgsmål spænder fra normale cellulær fysiologi stof screening og carcinogenese1. Primærelementer, isoleret direkte fra animalsk væv ved hjælp af enzymatiske og/eller mekaniske metoder er ofte betragtes som mere biologisk relevante end cellelinjer som den biologiske respons kan være tættere på i vivo situation. Protokoller for at forberede primære cellekulturer skal optimeres for hvert art og celle type af interesse for at efterligne de egenskaber, som en celle er tilpasset og opnå fysiologisk meningsfulde resultater.
Mange protokoller beskrive dyrkningsbetingelserne for pattedyr celle systemer, mens lignende protokoller der beskriver primære dyrkningsbetingelserne for fisk celler er temmelig sjælden i sammenligning. Celler er sårbare over for hurtige ændringer i temperatur, pH og osmolalitet og er særligt skrøbelige under proceduren dissociation. Kommercielle saltopløsninger og medier anvendt til pattedyr cellekulturer er ikke optimalt for teleost fisk, især hvad angår pH buffer system(er) og osmolalitet. Det er derfor vigtigt at måle og justere løsninger til fysiologisk relevante niveauer af disse parametre med arterne af interesse.
Primære hypofyse kulturer har gjort fra flere teleost fiskearter, herunder almindelig karpe (Cyprinus carpio)2,3, græs karper (Ctenopharyngodon idella)4, guldfisk (Carassius auratus )5, Regnbueørred (Oncorhynchus mykiss)6, europæisk ål (Anguilla anguilla)7, tilapia (Oreochromis mossambicus)8, zebrafisk (Danio rerio)9, og Torsk (Gadus morhua)10. Bortset fra justering inkubation temperatur for arter af interesse, har flere af disse protokoller inkuberes celler i pattedyr-lignende forhold, der kan være suboptimal for arter af interesse, med en pH-værdi fra 7,2 til 7,5 i en fugtig atmosfære der indeholder 3-5% CO2. Derudover er det uklart, om osmolalitet af løsninger, der anvendes til at forberede flere af disse primære cellekulturer blev justeret og stabil mellem forskellige løsninger.
Den nuværende protokol er baseret på tidligere arbejde med primære kulturer fra torsk10 og omfatter justeringer af inkubation temperatur, osmolalitet, pH buffersystemer, herunder partialtrykket af kuldioxid (pCO2), og pH til fysiologi af medaka (O. latipes). Medaka er en lille (3-4 cm) ferskvandsfisk, oprindelig i Østasien. Disse dage, bruges det som en model art i mange forskningslaboratorier verden over, da det er relativt let at opdrætte og meget modstandsdygtig over for mange almindelige fisk sygdomme11. Der er flere fordele ved at bruge medaka som en model, herunder en temperaturtolerance fra 4-40 ° C11, en kort generationstid, gennemsigtig embryoner, en sex-bestemmende gen12, og en sekventeret genom13, samt mange andre tilgængelige genetiske ressourcer.
De primære kultur betingelser i denne protokol er optimeret til at matche temperatur på 26 ° C, at medakas holdes på i fisk facilitet. Yderligere, osmolalitet reduceres fra 320 mOsm/kg fra torsk lever i saltvand til 290 mOsm/kg for medaka lever i ferskvand og er i overensstemmelse med den normale osmolalitet medaka plasma14. Til sammenligning er den typiske osmolalitet af pattedyr plasma i rækken af 275-295 mOsm15. Fiske liv i en bred vifte af temperaturer og har gæller, som er i direkte kontakt med vand, hvilket gør pH og buffer kapaciteten af blod og ekstracellulære væske i fisk forskellige fra dem i pattedyr. Pattedyr kultur medier omfatter normalt buffersystemer, der resulterer i en pH-værdi omkring 7,4, når medierne er ekvilibreres til en standard atmosfære med 5% CO2 i befugtet luft ved 37 ° C. PH er temperatur afhængige og værdien for neutral pH (i vand) stiger med en faldende temperatur16. Typiske teleost fisk plasma pH spænder fra 7,7 til 7,917. Optimering af denne protokol omfattede en reduktion fra pH 7,85 for torsk holdt på 12 ° C til pH 7,75 for medaka holdt ved 26 ° C ved at øge CO2 fra 0,5% til 1%.
Derudover er bikarbonat buffer kapaciteten helt anderledes i fisk og pattedyr. CO2 er let udveksles over gæller i fisk og pCO2 i vand er kun en lille brøkdel af pCO2 i lunge18. Ændre enten temperatur eller pCO2 ændrer pH og buffer af mediet. Derfor hverken pH eller pCO2 anbefales til inkubere pattedyrceller er optimal for fisk celler, og derfor kultur medier bør optimeres med buffersystemer indeholdende fysiologisk relevante værdier for fisk og den særlige arter af interesse. Denne protokol beskriver hvordan du forbereder primære cellekulturer fra medaka pituitaries og omfatter justeringer af inkubation temperatur, osmolalitet, pH og pH buffersystem, ud over andre vigtige parametre til at overveje, når du forbereder primære celle kulturer fra ikke-pattedyr arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøg udført i denne undersøgelse blev godkendt af norske University of Life Sciences, følgende retningslinjer for pleje og dyrevelfærd, forskning.
1. forberedelse af løsninger
- Kalibrere osmometer og pH meter instrumenterne ifølge producentens anvisninger til at sikre korrekte målinger.
-
Forberede 500 mL af Ca2 +- og Mg2 +-gratis Dulbeccos fosfatbufferet saltopløsning (dPBS), justering af pH til 7,75 (trin 1.2.1) og osmolalitet til 290 mOsm/kg (trin 1.2.2) før en steril filtrering (trin 1.2.3).
- Justere pH til 7,75 med et kalibreret pH-meter ved omhyggeligt at tilføje dråber i en 1 M natriumhydroxidoploesning mens forsigtigt omrøring løsningen.
- Måle osmolalitet af løsningen ved hjælp af en kalibreret osmometer og beregne mængden af mannitol skulle øge osmolalitet til 290 mOsm/kg. Tilføje den nødvendige mængde af mannitol og derefter måle osmolalitet løsning igen for at sikre den korrekte tilpasning.
Bemærk: Mængden af mannitol behov afhænger osmolalitet målt, som normalt varierer mellem forskellige batches. Et molekyle af mannitol er lig med 1 osmotisk partikel. - Sterilt-filter dPBS løsning ved hjælp af en 0,2 µm filter.
Bemærk: Løsningen kan opbevares ved 4 ° C i mindst 3 måneder.
- Forberede 500 mL Leibovitz (L-15) kultur medie uden L-glutamin og bikarbonat, og supplere den med 10 mM NaHCO3 (trin 1.3.1), 4,5 mM glukose (trin 1.3.2) og 2 mM kommercielt tilgængelige glutamin (trin 1.3.3). Justere løsning til 290 mOsm/kg (trin 1.3.4), steril-filter (skridt 1.3.5), og der tilsættes 2,5 mL af en penicillin-streptomycin løsning (trin 1.3.6).
Bemærk: Løsningen kan opbevares ved 4 ° C i mindst 4 uger.- Tilføje 420 mg af NaHCO3 pr 500 mL af næringssubstratet en 10 mM løsning.
- Tilføje, 405 mg af glucose pr. 500 mL af næringssubstratet en 4,5 mM løsning.
- Der tilsættes 5 mL af 100 x bestand af en glutamin løsning i 500 mL af næringssubstratet en 2 mM løsning. Rør indtil alle opløste stoffer er opløst.
- Justere løsning til 290 mOsm/kg med mannitol ved hjælp af en osmometer (som udført i trin 1.2.2).
- Udføre en steril filtrering af L-15 medium ved hjælp af en 0,2 µm filter.
- Efter den sterile filtrering, tilsættes 2,5 mL en penicillin-streptomycin, svarende til 50 U/mL af penicillin og 50 µg/mL af streptomycin.
- Forberede 50 mL trypsin løsning ved hjælp af 1 mg/mL (0,1%) trypsin type II-S opløst i den modificerede dPBS (udarbejdet i trin 1.2). Gøre delprøver af 2 mL i sterile plasticrør og gemme dem på-20 ° C indtil brug.
Bemærk: Delprøver af 2 mL kan opbevares ved-20 ° C i mindst 3 måneder. - Forberede 50 mL trypsin hæmmer løsning ved hjælp af 1 mg/mL (0,1%) trypsin inhibitor type I-S, og supplerer den med 2 µg/mL DNase jeg opløst i den modificerede dPBS (udarbejdet i trin 1.2). Gøre delprøver af 2 mL i sterile plasticrør og gemme dem på-20 ° C indtil brug.
Bemærk: Delprøver af 2 mL kan opbevares ved-20 ° C i mindst 3 måneder.
2. fremstilling af udstyr
- Forbered glas pipetter af brand polering tip til celle dissociation. Gøre tips med 2 forskellige størrelseskategorier (en mellemlang åbning af 0,6-0,8 µm og en lille åbning på 0,4-0,6 µm) ved at spille med tid og afstand fra flammen mens du samtidigt tænder en pipette. Placer glas pipetter i en ren glasbeholder og autoklave dem (bruge tilstanden fast ved 105 ° C i 45 min).
- Forberede en Varmekrympende boks med is.
- Forberede et plastikrør med 1,5 mL af modificerede dPBS (udarbejdet i trin 1.2) til at overføre pituitaries til under dissektion og holde det på is.
- Forberede en 15 mL tube med 10 mL af modificerede dPBS (udarbejdet i trin 1.2) og holde den på køl indtil cellen dissociation.
- Forberede friske eller tø delprøver af trypsin og trypsin hæmmer løsninger (udarbejdet i trin 1.4 og 1.5) og holde dem på køl indtil brug.
- Indstille et vandbad til 26 ° C før dissektion at tillade vand at nå den ønskede temperatur inden de kemiske dissociation af pituitaries.
- Ren alle dissektion værktøjer med 70% ethanol, før, under og efter brug, herunder fine pincet til brug for dissektion og fine nåle og en voks plade til at fastgøre fisken. Bruge rene handsker (ændre og rengør hyppigt) under hele proceduren at undgå en mulig kontaminering af cellerne.
3. hypofyse dissektion og celle Dissociation
- Aflive fisken ved at nedsænke det i isen sjap (0 ° C). Lad fisken i ice sjap for mindst 1 min til at sikre en irreversibel hypotermiske chok.
Bemærk: Immobilisering og ligevægt tab vil opstå efter et par sekunder. Sørg for fisken er helt nedsænket i isvand og ikke ligger på toppen af isen, som sidstnævnte vil føre til kvælning og potentielle hud brænder i stedet for en hurtig og human hypotermiske chok. - Hurtigt overføre fisk i net til en voks plade mikroskopet dissektion og ødelægge ryggen af en nål punch gennem halsen.
- Fastgøre hovedet af fisk til voks pladen ved hjælp af fine nåle, ved at indsætte en nål i front (via munden) og en på hver side af hovedet (bag hjernen) for at stabilisere hoved før dissektion.
- Se fisk mikroskopet dissektion og forsigtigt skrabe off vægte på toppen af hovedet ved hjælp af fine pincet med en vinklet spids.
- Omhyggeligt indsætte vinklet spidsen af den fint pincet under huden fra siden af hovedet og fjerne kraniet taget ved at langsomt flytte pincet i retning af munden, mens du holder et fast greb pincet omslutter kraniet tag.
- Afbrød rygmarven helt med en vinklet spids pincet.
NOTE: Tid er en vigtig faktor, så arbejdet effektivt og præcist at begrænse tid brugt fra dissektion af pituitaries indtil cellerne er belagt i fadet. Efter nogle praksis, hypofyse dissektion bør tage omkring 2-3 min. pr. fisk, hvoraf kun omkring 10 s behøves at vælge hypofysen, når hjernen er allerede udsat. - Omhyggeligt flip hjernen mod mund at eksponere hypofysen og dissekere det med ren pincet med en glat spids. Overføre hypofysen til et plastikrør, som indeholder 1,5 mL modificeret dPBS (for detaljer, se trin 2.3) placeret på is. Kontroller spidsen af pincet under mikroskop for at hypofysen er føjet til røret og intet er tilbage på pincet.
Bemærk: Dissekere så mange pituitaries som nødvendige, afhængigt af antallet af kultur retter, der skal tilberedes samtidigt. Som en tommelfingerregel, Beregn mindst 10 pituitaries fra voksne fisk pr. parabol til at have en passende tæthed af celler (som afhænger af programmet downstream). - Spin ned pituitaries i en bordplade centrifugeres i 1 – 2 s ved stuetemperatur. Forsigtigt fjerne dPBS ved hjælp af et glas pipette og sørge for at undgå at fjerne eventuelle pituitaries.
- Der tilsættes 1 mL af trypsin løsning (udarbejdet i trin 1.4) for at vaske pituitaries, spin dem ned i en bordplade centrifugeres i 1 – 2 s og fjerne det meste af væsken ved hjælp af et glas pipette før du tilføjer en ekstra 1 mL trypsin løsning.
- Inkuber rør i et vandbad ved 26 ° C i 30 min, helst med blid ryster, eller alternativt, svirp rør et par gange under inkubationstiden.
- Spin ned pituitaries i en bordplade centrifugeres i 1 – 2 s ved stuetemperatur og sørg for, at alle pituitaries er placeret i bunden af røret. Fjerne de fleste af trypsin løsning med et glas pipette og tilsættes 1 mL trypsin hæmmer løsning (udarbejdet i trin 1.5) for at inaktivere trypsin og vaske pituitaries.
- Saml pituitaries i bunden af røret ved at dreje dem ned i en bordplade centrifugeres i 1 – 2 s ved stuetemperatur. Fjerne det meste af væsken med en glas pipette og tilsættes 1 mL trypsin hæmmer løsning (udarbejdet i trin 1,5). Røret anbringes på vandbad ved 26 ° C i 20 min., helst med blid ryster, eller alternativt, svirp rør et par gange under inkubationstiden til at inaktivere trypsin.
- Forberede en 35 mm poly-d-lysin-belagt celle kultur parabol med en central glas bund ved tilsætning 2 mL af L-15 medium og lade der inkuberes i mindst 10 min ved 26 ° C og med 1% CO2 , således at det kan opnå den rigtige temperatur og pH før plating cellerne.
Bemærk: En plastik celle kultur parabol kan også bruges. Den største fordel ved hjælp af en parabol med en centraliseret glas bund er at det område, hvor cellerne er forgyldt er mindre, og derfor færre hypofyse celler er påkrævet per parabol. Nogle downstream applikationer kan også kræve et glas bund (dvs., nogle Billeddannende teknikker). - Angiv den afkøling centrifugeres i 15 mL rør til 4 ° C til at nå den ønskede temperatur før du starter den mekaniske dissociation.
- Saml pituitaries i bunden af røret af spinning ned tube med trypsin hæmmer løsning (fra trin 3.11) i en bordplade centrifugeres i 1 – 2 s ved stuetemperatur og sørg for, at alle pituitaries er placeret i bunden af røret før omhyggeligt at fjerne de fleste af trypsin hæmmer løsning ved hjælp af et glas pipette.
Bemærk: Udføre alle de følgende trin i protokollen i en laminar flow bænk (LAF) certificeret til celle arbejde at undgå en kontaminering af cellerne. - Der tilsættes 1 mL af iskold modificeret dPBS (udarbejdet i trin 2.4) til hypofyse væv stykker og forsigtigt suge væv stykker op og ned (6-7 x) i en brand-poleret glas pipette (udarbejdet i trin 2.1).
Bemærk: Temperatur er et væsentligt aspekt, så hold alle løsninger ved 4 ° C. Fra dette punkt og fremefter, skal du udføre alle trinene på is, når det er muligt. - Spin ned væv stykker i en bordplade centrifugeres i 1 – 2 s ved stuetemperatur og omhyggeligt overføre den øvre del af dPBS med de dissocierede celler (næsten 1 mL) til en ny 15 mL tube anbringes på is. Undgå at flytte pipette mod bunden af røret hvor væv stykker er tilbage.
- Gentag trin 3.16-3.17, vender cellerne i 1 mL iskold dPBS ad gangen, indtil alle 10 mL af dPBS bruges. Begynde at bruge et glas pipette med mellemstore åbning og skifte til et glas pipette med en mindre åbning i slutningen (for de sidste 3-4 mL af dPBS tilføjet) af dissociation. Hvis der er stadig synlige væv stykker i slutningen af dissociation procedure, øge pipettering til ca. 10 x mod de 2 sidste trin i dPBS for dissociation, og efterlade endelig de resterende væv stykker. Resuspend cellerne blidt og undgå at skabe bobler, da det kan forårsage celleskader, når cellerne tillægger overfladen af boblerne.
Bemærk: Dette er et afgørende skridt i denne protokol og kræver nogle uddannelse at opnå et godt resultat. - Balance røret i en centrifuge (pre afkølet til 4 ° C) og spin-ned celler på 200 x g i 10 min. ved 4 ° C. Sørg for at markere siden af røret hvor celle pellet vil være.
- Fjern forsigtigt røret fra centrifugen og forsigtigt overføre supernatanten med et glas pipette til en tom 15 mL plastik rør direkte efter centrifugeringen. Sørg for at fjerne de fleste af supernatanten men passe på at undgå at miste de små (ofte usynlige) celle pellet.
- Omhyggeligt resuspenderes celle i 50-100 µL af L-15 næringssubstratet.
Bemærk: På dette trin er det muligt at tælle cellerne og/eller udføre en levedygtighed test (f.eks. en celle tælle i nærværelse af trypan blå ved hjælp af en hemocytometer), men pas på at bruge en del af cellesuspension til dette formål vil sænke udbyttet. Undgå at bruge en stor suspension volumen, da det vil øge risikoen for celler spreder uden for midten af fadet. - Omhyggeligt dryppe dissocierede cellerne i celle kultur parabol indeholdende 2 mL af L-15 mediet (parat i trin 3.13). Tillad celler til at synke til bunden af skålen i ca 5 min før du flytter dem til rugemaskine til at undgå, at cellerne spredes uden for den sunkne del af glas-bund.
- Inkuber parabol på 26 ° C og 1% CO2 til at tillade alle celler til vask grundigt og vedhæfte til bunden af skålen.
- Efter 30 min, se på cellerne i mikroskop for at sikre de har knyttet til fadet, kultur.
- Fortsat at udruge celler på 26 ° C og 1% CO2.
- Omhyggeligt ændre de fleste af (men ikke alle) medium hver 3-4 dage.
Bemærk: Undgå at ændre mediet hyppigere, da det kan forstyrre cellerne og få dem til at løsne sig fra glas bund. Bruge cellerne for eksperimenter inden for en uge efter såning dem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol beskriver forberedelse af en primær cellekultur fra medaka pituitaries og giver sunde celler, der kan opretholdes i en kultur for mindst en uge. Protokollen er baseret på fysiologiske relevante værdier for medaka14 og er desuden optimeret til hypofyse væv i voksne fisk, med en pH på 7,75 og en osmolalitet 290 mOsm/kg under hele proceduren fra væv høst til den forgyldt cellerne i kulturen (figur 1 og figur 2).
Repræsentative resultater fra eksperimenter på primære cellekulturer produceret af denne protokol vises i figur 3, figur 4og figur 5. De resultater, der præsenteres her, en transgene medaka linje, hvor luteiniserende hormon (Lh)-gonadotrope celler udtrykker den grøn fluorescerende proteiner (NGL), blev udnyttet19. Figur 3 viser en repræsentativ felt i skålen af en primær cellekultur fra dag 0 til dag 7 efter såning, herunder både lysfelt og fluorescerende mikroskopi billeder, viser normal god landbrugspraksis-udtrykker Lh-gonadotrope celler. Ved hjælp af omkring 10 voksne medaka pituitaries pr parabol normalt resulterer i en tæthed på omkring 5 x 104 – 1 x 105 celler pr. fad efter såning. Levedygtigheden af hypofyse cellerne i kulturen beregnes baseret på det samlede antal udtryk for normal god landbrugspraksis celler i kultur på dag 1, 3 og 7 efter plating, i forhold til dag 0 (figur 4). Grafen vist i figur 4 viser, at antallet af døende celler er næsten konstant over tid, med over 95% af de celler i live efter 1 dag, mens over 90% er stadig i live efter 3 dage. Selv om der er en lille tilbagegang i cellernes levedygtighed med tiden, er de fleste celler (omkring 75%) stadig i live efter en uge i kultur. Elektrofysiologiske optagelser af normal god landbrugspraksis-udtrykker Lh-gonadotrope celler (udføres som beskrevet i Strandabø, et al.) 20 viser, at cellerne er i stand til at fyre handling potentialer spontant efter 4 dage i kultur (figur 5A). Yderligere, ved stimulation af gonadotropin - releasing hormon, en indledende forbigående hyperpolarisering af cellemembranen er efterfulgt af en dramatisk stigning i affyring frekvens, der er samtidige med en depolarisering og øget varighed af handlingen potentialer (figur 5B).
Figur 1: oversigt over hypofyse primære celle kultur teknik. Pituitaries er dissekeret med fine pincet og overført til et plastikrør, som indeholder modificerede dPBS på is (trin 1 i protokollen) indtil den Enzymatisk nedbrydning af pituitaries med trypsin ved 26 ° C (trin 2), efterfulgt af en inaktivering med en trypsin hæmmer ved 26 ° C (ikke vist). Den mekaniske dissociation af enzymatisk fordøjet pituitaries med glas pipette er omhyggeligt udført i dPBS på is (trin 3), efterfulgt af centrifugering ved 4 ° C (trin 4). Endelig, den celle pellet opløses i substratet og cellerne forgyldt ud i en celle kultur parabol (trin 5). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: detaljer af medaka hypofyse dissektion. (A) lederen af en immobiliseret medaka (dorsale udsigt) er fastgjort til en voks plade, og toppen af kraniet taget er fjernet med fine pincet til at eksponere toppen af hjernen. (B) rygmarven er afskåret, og hjernen, der er vendt mod forsiden af hovedet således at hypofysen er udsat. (C) hypofysen er indsamlet med ren, fine pincet. Pilespidsen peger på hypofysen i panelet B og C. Skalalinjen = 1.000 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Medaka hypofyse primære cellekultur. Disse paneler viser Konfokal højopløsningsbilleder af en repræsentativ medaka hypofyse primære cellekultur på dag 0, dag 3 og dag 7 efter såning. Det øverste panel viser-lysfelt mikroskopi billeder af en repræsentativ felt i fadet, det midterste panel viser fluorescerende mikroskopi billeder af samme synsfelt viser normal god landbrugspraksis-udtrykker Lh-gonadotrope celler, og den nederste panel er en overlejring af to. Skalalinjen = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: levedygtighed af medaka hypofyse celler i kultur. Denne figur viser levedygtigheden af de hypofyse primære cellekulturer målt på dag 0, 1, 3 og 7 efter såning. Tallene er beregnet ved hjælp af open source software CellProfiler V2 og er baseret på det samlede antal udtryk for normal god landbrugspraksis Lh-gonadotrope celler pr. parabol på de forskellige tidspunkter, i forhold til tidspunkt 0. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: elektrofysiologiske optagelser af hypofyse celler. Disse paneler viser elektrofysiologiske optagelser fra en normal god landbrugspraksis-udtrykker Lh-gonadotrope celle i en primær cellekultur udføres på dag 4 efter såning, viser (A) en repræsentativ spor af spontan handling potentialer, efterfulgt af (B) en stimulation med gonadotropin - releasing hormon Gnrh1 for 10 s. Gnrh1 stimulation inducerer et bifasisk respons med en hyperpolarisering af cellemembranen, efterfulgt af en depolarisering og øget varighed af de aktion potentialer (målt ved 50% peak) fra 8,9 ± 3,0 ms før stimulering til 29,2 ± 9,9 ms efter den stimulation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro celle kultur systemer giver kraftfulde værktøjer for forskere at besvare et væld af forskellige biologiske spørgsmål, hvis de anvendes i den rigtige vej1. Det er vigtigt at huske at dissocierede celler, der har mistet deres forbindelser til de nærliggende celler kan have opnået forskellige funktionelle egenskaber end de oprindeligt havde in vivo. For at undgå at blive for at fejlfortolke resultater fra in vitro- forsøg, er det vigtigt at overveje at justere den primære celle kultur procedure til de arter og celle type af interesse. Selv moderat tilpasning af standard kultur procedurer og løsninger, der anvendes, er ofte tilstrækkeligt til at ændre dybt kultur i en bestemt celletype.
Denne protokol beskriver optimeret betingelser for at forberede og vedligeholde primære cellekulturer fra voksne medaka pituitaries, som kan opnås ved at justere parametre såsom temperatur, osmolalitet, pCO og pH2 af løsningerne, der anvendes til matche de fysiologiske betingelser af denne art. PH er temperatur afhængige og bør derfor også justeres mellem forskellige arter af teleost fisk lever ved forskellige temperaturer17. Osmolalitet af alle løsninger, der anvendes under celle dissociation og dyrkning bør også justeres for at forbedre tilstanden i cellerne. Især, hvis der er en uoverensstemmelse i osmolalitet mellem forskellige løsninger, der anvendes under proceduren for isolation, kan det have katastrofale følger for kultur kvalitet, fører til en nedsat levedygtighed (forfatternes egen ikke-offentliggjorte resultater). Hyperosmotic løsninger vil forårsage de celler til at skrumpe (og omvendt), derved forstyrrer membran integritet og membran protein funktion21. Et vigtigt punkt i denne sammenhæng er, at parametre som osmolalitet og pH ikke er normalt målt eller stabil mellem forskellige batches af kommercielle buffere og medier anvendt i pattedyr kultur betingelser. Forskelle i osmolalitet og pH mellem forskellige løsninger, der anvendes under proceduren isolation bør undgås på alle tidspunkter.
Succesraten for denne protokol er forbedret ved uddannelse, så det forventes forskere har brug for lidt tid til at stifte bekendtskab med de forskellige trin i teknikken. For eksempel, er tiden fra dissektion af pituitaries indtil cellerne er belagt i skålen omvendt relateret til celle sundhed. Den mekaniske dissociation af pituitaries ved hjælp af et glas pipette er en særlig kritisk trin i protokollen og det kræver nogle uddannelse at opnå et godt resultat. Dissociation procedure kan indføre osmotisk og mekanisk stress, der er skadelig for cellerne. Tilsætning af små mængder af ændrede dPBS i gentagne trin for den mekaniske dissociation sikrer en blidere dissociation procedure hvor allerede dissocierede celler er overført til en ny tube og venstre uberørt, mens forskeren fortsætter med at adskille yderligere celler fra vævet i en ny volumen af dPBS.
Denne protokol er optimeret til voksen medaka hypofyse celler. Forskellige arter, væv eller endda forskellige livsstadier af dyr inden for det samme væv kræver optimeringer af dyrkningsbetingelserne. Eksempelvis celler fremstillet af umodne dyr kan være mere skrøbelige og dermed mere modtagelige over for apoptose og celle død, og således kan nødvendiggøre behovet for at justere protokollen, især mod en blidere dissociation procedure. Den mekaniske dissociation ved hjælp af et glas pipette er en meget kritisk trin i proceduren, som en alt for forsigtig mekaniske dissociation vil føre til en lavere gevinst, mens et for groft kan inducere apoptose og/eller celle død. Hvis forskellige enzymer anses for dissociation, kan det være nødvendigt at bruge en anden fordøjelse tid og enzym koncentration. Medaka pituitaries er meget lille og forholdsvis let at adskille ved hjælp af den beskrevne protokol. Optimeringer for andre arter kan dog kræve brug af en mesh-filter efter dissociation til at fjerne snavs. Succes af denne protokol også afhænger i høj grad udfører trin under sterile betingelser for at undgå kontaminering af cellerne.
Antallet af celler til frø pr parabol afhænger af antallet af pituitaries i starten, som resultat af dissociation indgrebet. Der er groft omkring 15.000 celler i en intakt voksen medaka hypofysen. Men celler går tabt undervejs dissociation og dette bør regnskabsføres ved beregning af antallet af pituitaries behov for et eksperiment. Ved hjælp af mindst 10 pituitaries pr. parabol vil normalt resultere i en tæthed på omkring 50.000-100.000 celler pr. fad. På denne tæthed danner sammenlægning ikke i nogen betydelig mængde, selv efter 7 dage i kultur. Mærkbart, sammenlægning synes at være tæthed afhængige, så jo tættere cellerne er seedet, jo mere de synes at aggregere. Visse procedurer kan kræve et tættere kultur, og derfor den optimale seeding tæthed bør overvejes afhængig af programmet downstream. Det er vigtigt at tage i betragtning ved planlægningen af antallet af pituitaries til at bruge pr parabol.
Mest almindelige downstream applikationer bruger primære cellekulturer inden for de første par dage efter såning. Resultaterne præsenteres her, fra cellernes levedygtighed til de elektrofysiologiske optagelser, viser, at det er muligt at opnå gode resultater fra primære cellekulturer tilberedt med den beskrevne protokol for op til 1 uge efter såning. Ikke desto mindre kulturer kan opbevares længere, og raske celler er stadig til stede efter over 2 uger i kultur (forfatternes egen ikke-offentliggjorte resultater). Optimeret betingelser i denne protokol letter fysiologisk meningsfulde resultater og kan være til gavn for andre forskere forberedelse primære cellekulturer fra ikke-pattedyr celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at erklære.
Acknowledgments
Dette projekt blev finansieret af norsk University of Life Sciences og Norge forskning-Rådet, tilskud antal 243811 og 244461 (akvakultur program). Vi er taknemmelige til Lourdes Carreon Tan på norsk University of Life Sciences for at opretholde fisk facilitet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D8537 | Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol. |
| L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | L5520 | Supplement 500 ml culture medium with 10 mM NaHCO3, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 µm PES sterile filter, before adding 2.5 mL Penicillin-Streptomycin solution (see below for details). |
| NaOH | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5881 | Add drops of 1 M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75. |
| NaHCO3 | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5761 | 10 mM NaHCO3 equals 420 mg per 500 mL culture medium. |
| D-mannitol | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | 63565 | Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm. |
| D-glucose | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | G5400 | 4.5 mM D-glucose equals 405 mg per 500 mL culture medium. |
| GlutaMAX Supplement | Gibco (Life Technologies, Paisley, UK) | 35050-061 | Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100x stock in 500 mL culture medium. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | P0781 | Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 mL of stock solution in 500 mL L-15 medium (equivalent of 50 U/mL Penicillin and 50 µg/mL Streptomycin). |
| Trypsin type II-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T7409 | Prepare 1 mg/mL in dPBS solution. |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T6522 | Prepare 1 mg/mL in dPBS solution, supplement with 2 µg/ml Dnase I (see details below). |
| Dnase I | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D5025 | Use in trypsin inhibitor solution (see above). |
| 0.2 µm Polyethersulfone (PES) sterile filter system | Corning Inc. (Corning, NY) | 431097 | Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments. |
| 35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-10-C | Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application. |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11254-20 | Straight tip |
| Dumont #5/45 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11253-25 | Angled 45° tip |
| Stereo microscope SZ61 | Olympus Corp. (Tokyo, Japan) | Use for dissection of pituitaries. | |
| Alegra X-22R Centrufuge | Beckman Coulter Inc. (Brea, CA) | With cooling option (similar to current model XR-30). | |
| Water bath | Techne (Staffordshire, UK) | Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do. | |
| Pasteur glass pipettes | VWR (NY) | 612-1701 | Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use. |
| Galaxy MiniStar table centrifuge | VWR (NY) | 521-2844 | Any small table centrigue will do. |
| Fine needles/insect pins | Fine Science Tools (CA) | 26001-40 | Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead. |
| Wax plate | Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish. |
References
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2010).
- Ribeiro, L. P., Ahne, W. Fish cell culture: initiation of a line of pituitary cells from carp (Cyprinus carpio) to study the release of gonadotropin in vitro. In Vitro. 18 (5), 419-420 (1982).
- Ribeiro, L., Ahne, W., Lichtenberg, V. Primary culture of normal pituitary cells of carp (Cyprinus carpio) for the study of gonadotropin release. In Vitro. 19 (1), 41-45 (1983).
- Wong, A. O., Ng, S., Lee, E. K., Leung, R. C., Ho, W. K. Somatostatin inhibits (d-Arg6, Pro9-NEt) salmon gonadotropin-releasing hormone- and dopamine D1-stimulated growth hormone release from perifused pituitary cells of chinese grass carp, Ctenopharyngodon idellus. General and Comparative Endocrinology. 110 (1), 29-45 (1998).
- Chang, J. P., et al. Use of a pituitary cell dispersion method and primary culture system for the studies of gonadotropin-releasing hormone action in the goldfish, Carassius auratus. I. Initial morphological, static, and cell column perifusion studies. General and Comparative Endocrinology. 77 (2), 256-273 (1990).
- Weil, C., Hansen, P., Hyam, D. Use of pituitary cells in primary culture to study the secretion in rainbow-trout - Setting up and validating the system as assessed by its responsiveness to mammalian and salmon gonadotropin-releasing hormone. General and Comparative Endocrinology. 62 (2), 202-209 (1986).
- Montero, M., LeBelle, N., Vidal, B., Dufour, S. Primary cultures of dispersed pituitary cells from estradiol-pretreated female silver eels (Anguilla anguilla L): Immunocytochemical characterization of gonadotropic cells and stimulation of gonadotropin release. General and Comparative Endocrinology. 104 (1), 103-115 (1996).
- Xu, S. H., Cooke, I. M. Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells. General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).
- Lin, S. W., Ge, W. Differential regulation of gonadotropins (FSH and LH) and growth hormone (GH) by neuroendocrine, endocrine, and paracrine factors in the zebrafish-An in vitro approach. General and Comparative Endocrinology. 160 (2), 183-193 (2009).
- Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO2, and pH. General and Comparative Endocrinology. 178 (2), 206-215 (2012).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - a model organism from the far East. Nature Reviews Genetics. 3, 53-64 (2002).
- Matsuda, M., et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).
- Kasahara, M., et al. The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution. Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).
- Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes. Zoological Letters. 2 (12), (2016).
- Waymouth, C. Osmolality of mammalian blood and of media for culture of mammalian cells. In Vitro. 6 (2), 109-127 (1970).
- Cameron, J. N. Acid-base homeostasis - past and present perspectives. Physiological Zoology. 62 (4), 845-865 (1989).
- Claiborne, J. B., Edwards, S. L., Morrison-Shetlar, A. I. Acid-base regulation in fishes: cellular and molecular mechanisms. Journal of Experimental Zoology. 293 (3), 302-319 (2002).
- Perry, S. F., Tufts, B. L. Fish respiration. , Academic Press. San Diego, CA. (1998).
- Hildahl, J., et al. Developmental tracing of luteinizing hormone β-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function. Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).
- Strandabø, R. A. U., et al. Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes). Molecular and Cellular Endocrinology. 372 (1-2), 128-139 (2013).
- Verbalis, J. G. Brain volume regulation in response to changes in osmolality. Neuroscience. 168 (4), 862-870 (2010).
