Summary
Her beskriver vi en protokoll for å forberede og opprettholde primære hypofysen cellekulturer fra medaka (Oryzias latipes). Optimalisert forholdene i denne protokollen ta viktige parametre som temperatur, osmolality og pH hensyn mimicking de fysiologiske forholdene av fisk, og dermed gjør fysiologisk mer meningsfulle resultater.
Abstract
Primær cellekultur er et kraftig verktøy som vanligvis brukes av forskere mobilnettet egenskaper og mekanismer for isolert cellene i et kontrollert miljø. Til tross for store forskjeller i fysiologi mellom pattedyr og fisk, er primær celle kultur protokoller fra fisk ofte basert på pattedyr kultur forhold, ofte med bare mindre endringer. Miljømessige forskjellene påvirker ikke bare kroppstemperatur, men også blodårene parametere som osmolality og pH pH buffer kapasitet. Som celle kultur medier og lignende arbeider løsninger er ment å etterligne egenskaper av ekstracellulære væske eller blod serum som en celle er tilpasset, er det avgjørende at disse parameterne er tilpasset spesielt dyret i spørsmålet.
Gjeldende protokollen beskriver optimalisert primære kultur betingelser for medaka (Oryzias latipes). Protokollen gir detaljert skritt opp på hvor å isolere og vedlikeholde sunn avstand hypofysen celler i mer enn en uke og inkluderer følgende: 1. justering av osmolality verdiene funnet i medaka blod plasma, 2. justering av den inkubasjon temperatur normal medaka temperatur (her i akvarium anlegget), og 3. justering av pH og bikarbonat bufferen til verdier sammenlignes med andre fiskearter på lignende temperaturer. Resultatene presenteres ved hjelp av beskrevet protokollen fremme fysiologisk meningsfulle resultater for medaka og kan brukes som en referanseguide av forskere gjør primært cellekulturer fra andre ikke-pattedyr arter.
Introduction
Cellekultur er en av de viktigste verktøyene som brukes i molekylær biologisk forskning, gir en utmerket modellsystem for ulike biologiske spørsmål mellom normale mobilnettet fysiologi narkotika screening og kreft1. Primær celler, isolert direkte fra dyr vev med enzymatisk og/eller mekanisk metoder er ofte betraktet som mer biologisk relevant enn linjer som biologiske svaret kan være nærmere situasjonen i vivo . Protokoller for å forberede primært cellekulturer skal være optimalisert for hver arter og celle interesse for å etterligne egenskapene som en celle er tilpasset og få fysiologisk meningsfulle resultater.
Flere protokoller beskriver oppdrettsforholdene for pattedyr celle systemer, mens like protokoller som beskriver primære oppdrettsforholdene for fisk celler er ganske mangelvare i sammenligning. Celler er sårbare for raske endringer i temperatur, pH og osmolality, og er spesielt sårbare under dissosiasjon prosedyren. Kommersielle salt løsninger og kultur medier brukes for pattedyr cellekulturer er ikke optimal på teleost fisk, spesielt når det gjelder pH buffer system og osmolality. Derfor er det viktig å måle og justere løsninger til fysiologisk relevante nivåer av disse parameterne i arter av interesse.
Primære hypofysen kulturer har foretatt flere teleost fiskearter, inkludert felles karpe (Cyprinus carpio)2,3, gress karpe (Ctenopharyngodon idella)4, gullfisk (Carassius auratus )5, regnbueørret (Oncorhynchus mykiss)6, ål (a. anguilla)7, tilapia (Oreochromis mossambicus)8, sebrafisk (Danio rerio)9, og Torsk (Gadus morhua)10. Bortsett fra justere inkubasjon temperaturen til arter av interesse, har flere av disse protokollene ruges cellene på pattedyr-lignende forhold som kan ikke arter av interesse, med en pH fra 7.2 til 7.5 i en fuktet atmosfære inneholder 3-5% CO2. Dessuten, er det uklart om osmolality av løsninger for tilberedning flere av disse primært cellekulturer ble justert og stabilt mellom ulike løsninger.
Gjeldende protokollen er basert på tidligere arbeid med primære kulturer torsk10 og omfatter justeringer av inkubasjon temperatur, osmolality, pH og pH buffer systemer, inkludert delvis presset av karbondioksid (pCO2), til fysiologi av medaka (O. latipes). Medaka er en liten (3-4 cm) ferskvannsfisk, innfødt til Asia. Disse dager, er det brukt som modell Art i mange forskningslaboratorier verden over, som det er relativt enkelt å avle og svært motstandsdyktig mot mange vanlige fisk sykdommer11. Det er flere fordeler med å bruke medaka som modell, inkludert temperaturtoleranse fra 4-40 ° C11, en kort generasjonstid, gjennomsiktig embryo, en sex-bestemme genet12, og en sekvensert genomet13, samt mange andre genetiske ressurser.
Primære kultur forholdene i denne protokollen er optimalisert for å matche temperaturen på 26 ° C medakas beholdes på i funksjonen fisk. Videre, osmolality er redusert fra 320 mOsm/kg fra torsk i saltvann til 290 mOsm/kg for medaka lever i ferskvann og er den normale osmolality medaka plasma14. Sammenligning er den typiske osmolality av pattedyr plasma i størrelsesorden 275-295 mOsm15. Fisk livet i en rekke temperaturer og har gjellene som er i direkte kontakt med vann, gjør pH og buffer kapasiteten til blod og ekstracellulære væske i fisk i pattedyr. Pattedyr kultur medier inkluderer vanligvis buffer systemer som resulterer i en pH på rundt 7.4 når media er equilibrated til en standard atmosfære av 5% CO2 i fuktet luft på 37 ° C. PH er temperaturen avhengige og verdien for nøytral pH (i vann) øker med en synkende temperatur16. Typisk teleost fisk plasma pH varierer fra 7,7 7.917. Optimalisering av denne protokollen inkludert en reduksjon fra pH 7.85 for torsk holdt ved 12 ° C til pH 7,75 for medaka holdt på 26 ° C ved å øke CO2 fra 0,5% til 1%.
I tillegg er bikarbonat buffer kapasitet ganske forskjellige i fisk og pattedyr. CO2 utveksles lett over gjellene i fisk og pCO2 i vann er bare en liten brøkdel av pCO2 i lunge18. Endrer temperaturen eller pCO2 endres pH og buffer på mediet. Følgelig pH verken pCO2 anbefales for rugende pattedyrceller er optimal for fisk celler, og derfor kultur media skal optimaliseres med buffer systemer fysiologisk relevante verdier for fisk og bestemt arter av interesse. Denne protokollen beskriver hvordan å forberede primært cellekulturer fra medaka pituitaries og inkluderer justeringer av inkubasjon temperatur, osmolality, pH og pH buffer system, i tillegg til andre viktige parametere når du forbereder primære celle kulturer fra ikke-pattedyr arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det dyreforsøkene utført i denne studien ble godkjent av biovitenskap, følgende retningslinjer og dyrevelferd forskning.
1. forberedelse av løsninger
- Kalibrere osmometer og pH meter instrumenter i henhold til produsentens instruksjoner å sikre mål.
-
Forberede 500 mL Ca2 +- og Mg2 +-gratis Dulbeccos fosfat-bufret saltvann (dPBS), justere pH til 7,75 (trinn 1.2.1) og osmolality til 290 mOsm/kg (trinn 1.2.2) før en steril filtrering (trinn 1.2.3).
- Justere pH til 7,75 med en kalibrert pH-meter ved forsiktig å legge dråper en 1 M NaOH løsning mens nøye røring løsningen.
- Måle osmolality av løsningen bruker en kalibrert osmometer og beregne mengden mannitol for å øke osmolality til 290 mOsm/kg. Legg den nødvendige mengden av mannitol og deretter måle osmolality av løsningen igjen for å sikre riktig justering.
Merk: Mengden mannitol nødvendig, avhenger av osmolality målt, som vanligvis varierer mellom forskjellige bunker. Ett molekyl av mannitol tilsvarer 1 osmotisk partikkel. - Sterile-filter dPBS løsningen bruker filtere 0,2 µm.
Merk: Løsningen kan lagres på 4 ° C i minst 3 måneder.
- Forberede 500 mL Leibovitz (L-15) kultur medium uten L-glutamin og natron og komplettere den med 10 mM NaHCO3 (trinn 1.3.1), 4,5 glukose (trinn 1.3.2) og 2 mM kommersielt tilgjengelig glutamin (trinn 1.3.3). Justere løsningen på 290 mOsm/kg (trinn 1.3.4), sterile-filter det (trinn 1.3.5), og legge til 2,5 mL av en penicillin-streptomycin løsning (trinn 1.3.6).
Merk: Løsningen kan lagres på 4 ° C i minst 4 uker.- Legge til 420 mg NaHCO3 per 500 mL kultur medium å oppnå en 10 mM løsning.
- Legge til 405 mg av glukose per 500 mL kultur medium å oppnå en 4,5 løsning.
- Legge til 5 mL av 100 x lager en glutamin løsning i 500 mL kultur medium å oppnå en 2 mM løsning. Rør til alle solutes er oppløst.
- Justere løsningen på 290 mOsm/kg med mannitol bruker en osmometer (som utført i trinn 1.2.2).
- Utføre et sterilt filtrering av L-15 mediet bruker filtere 0,2 µm.
- Etter den sterile filtrering, Legg 2,5 mL av en penicillin-streptomycin løsning, tilsvarer 50 U/mL av penicillin og 50 µg/mL av streptomycin.
- Forberede 50 mL av en trypsin løsning å bruke 1 mg/mL (0,1%) trypsin type II-S oppløst i den endrede dPBS (forberedt i trinn 1.2). Gjøre dele 2 mL i steril plast rør og lagre dem på 20 ° C før bruk.
Merk: Dele 2 mL kan lagres på 20 ° C i minst 3 måneder. - Forberede 50 mL av en trypsin inhibitor løsning å bruke 1 mg/mL (0,1%) trypsin inhibitor type jeg-S, og supplere det med 2 µg/mL DNase jeg oppløst i den endrede dPBS (forberedt i trinn 1.2). Gjøre dele 2 mL i steril plast rør og lagre dem på 20 ° C før bruk.
Merk: Dele 2 mL kan lagres på 20 ° C i minst 3 måneder.
2. klargjøring av utstyr
- Klargjør glass Pipetter ved brann polering tips for cellen dissosiasjon. Lage tips med 2 forskjellige størrelser kategorier (en middels åpning av 0.6-0,8 µm og en liten åpning av 0,4-0.6 µm) ved å spille med tiden og avstanden fra flammen mens samtidig vri pipette. Plass glass Pipetter i en ren glassbeholder autoklav dem (med solid modus på 105 ° C for 45 min).
- Forberede en polystyren boks med is.
- Forberede et plastrør med 1,5 mL modifisert dPBS (forberedt i trinn 1.2) å overføre pituitaries til under dissection og holde det på is.
- Forberede en 15 mL tube med 10 mL modifisert dPBS (forberedt i trinn 1.2) og holde den på is til celle dissosiasjon.
- Forberede frisk eller tine dele trypsin og trypsin inhibitor løsninger (forberedt i trinn 1,4 og 1,5) og holde dem på is til bruk.
- Angi vannbad 26 ° c før dissection for å la vannet nå den ønskede temperaturen før kjemiske dissosiasjon av pituitaries.
- Rengjør alle disseksjon verktøy med 70% etanol før, under og etter bruk, inkludert fine tang bruke for dissection og fine nåler og voks plate feste fisken. Bruk ren hansker (endre og rengjør ofte) under hele prosedyren for å unngå en potensiell forurensning av cellene.
3. hypofysen disseksjon og celle dissosiasjon
- Euthanize fisken ved å leve det i isen slaps (0 ° C). La fisken i isen slaps for minst 1 min å sikre en irreversibel hypothermic sjokk.
Merk: Immobilisering og likevekt vil skje etter noen sekunder. Kontroller at fisken er helt under vann i isvann og ikke ligger over isen, som sistnevnte vil føre til kvelning og potensielle huden brenner i stedet for en rask og Human hypothermic sjokk. - Raskt overføre fisken i nettet til en voks plate under disseksjon mikroskopet og ødelegge ryggraden ved en nål punch gjennom halsen.
- Feste hodet av fisken til voks plate med fine nåler, ved å sette en pinne i foran (over munnen) og en på hver side av hodet (bak hjernen) for å stabilisere hodet før dissection.
- Vis fisken under disseksjon mikroskopet og forsiktig skrape av skalaer på toppen av hodet med en vinklet tips fint tang.
- Nøye stikk vinklet fine tang under huden fra siden av hodet og fjerne hodeskallen har ved sakte beveger seg tang i retning av munnen, mens du holder et fast grep til tang omsluttende hodeskallen har.
- Avskåret ryggmargen helt tang med en vinklet tips.
Merk: Tiden er en viktig faktor, så arbeide effektivt og nøyaktig å begrense tiden tilbrakte fra Disseksjon av pituitaries inntil cellene er belagt i fatet. Etter litt øvelse, hypofysen disseksjon tar ca 2-3 minutter per fisk, som bare rundt 10 s er nødvendig å plukke hypofysen når hjernen er allerede utsatt. - Nøye snu hjernen mot munnen å avsløre hypofysen og dissekere den med ren tang med rett tips. Overføre hypofysen til et plastrør som inneholder 1,5 mL modifisert dPBS (for detaljer, se trinn 2.3) plassert på is. Sjekk tuppen av Tang under mikroskop for å sikre at hypofysen er lagt til røret og ingenting er igjen på tang.
Merk: Dissekere så mange pituitaries etter behov, avhengig av antall kultur retter som tilberedes samtidig. Som en tommelfingerregel, Beregn minst 10 pituitaries fra voksen fisk per fat har en riktig tettheten av celler (som avhenger av nedstrøms programmet). - Nedspinning pituitaries i en tabletop centrifuge for 1-2 s ved romtemperatur. Nøye fjerne dPBS ved hjelp av en glass pipette og ta vare for å unngå fjerne alle pituitaries.
- Legg til 1 mL av trypsin løsningen (forberedt i trinn 1.4) å vaske pituitaries Nedspinning dem i en tabletop centrifuge for 1-2 s og fjerne det meste av væsken ved hjelp av en glass pipette før du legger til en ekstra 1 mL av trypsin løsning.
- Inkuber røret i et vannbad ved 26 ° C i 30 min, fortrinnsvis med mild risting, eller alternativt flick røret et par ganger under inkubasjonstiden.
- Nedspinning pituitaries i en tabletop centrifuge for 1-2 s ved romtemperatur og kontroller at alle pituitaries er plassert på bunnen av røret. Fjerne det meste av trypsin løsningen med en pipette for glass og legge til 1 mL av trypsin inhibitor løsningen (forberedt i trinn 1.5) deaktivere trypsin og vaske pituitaries.
- Samle pituitaries på bunnen av røret ved å spinne dem ned i en tabletop centrifuge for 1-2 s ved romtemperatur. Fjerne mesteparten av væsken med en glass pipette og legger 1 mL av trypsin inhibitor løsningen (forberedt i trinn 1.5). Sett røret i et vannbad på 26 ° C for 20 min, fortrinnsvis med mild risting, eller alternativt flick røret et par ganger under inkubasjonstiden å deaktivere trypsin.
- Forberede en 35 mm poly-d-lysin-belagt celle kultur parabol med sentrale glass bunn av tilføyer 2 mL L-15 middels og la den ruge på minst 10 min 26 ° C og med 1% CO2 slik at den kan nå riktig temperatur og pH før plating cellene.
Merk: En plast celle kultur parabol kan også brukes. Den største fordelen med å bruke en parabol med sentralisert glass bunn er at området der cellene er belagt er mindre, og derfor færre hypofysen celler kreves per fat. Noen nedstrøms programmer kan også kreve et glass bunn (dvs, noen Bildeteknikker). - Angi kjøling centrifuge for 15 mL rør 4 ° C å tillate det å nå den ønskede temperaturen før mekanisk dissosiasjon.
- Samle pituitaries på bunnen av røret av snurrende ned røret med trypsin inhibitor løsningen (fra trinn 3.11) i en tabletop centrifuge for 1-2 s ved romtemperatur og kontroller at alle pituitaries ligger på bunnen av røret før nøye fjerner det meste av trypsin inhibitor løsning ved hjelp av en glass pipette.
Merk: Utføre alle følgende av protokollen i laminær strømning benken (LEIV) sertifisert for cellen arbeidet for å unngå en forurensning av cellene. - Legg 1 mL av iskalde modifisert dPBS (forberedt i trinn 2.4) til hypofysen vev bitene og forsiktig suger vev bitene opp og ned (6-7 x) i en brann-polert glass pipette (forberedt i trinn 2.1).
Merk: Temperatur er en vesentlig del, så hold alle løsninger på 4 ° C. Fra dette punktet og framover, utføre alle skritt på is når mulig. - Nedspinning vev bitene i en tabletop centrifuge for 1-2 s ved romtemperatur og nøye overføre øvre del av dPBS som inneholder dissosiert cellene (nesten 1 mL) til en ny 15 mL tube plassert på is. Unngå å flytte pipette mot bunnen av røret der vev bitene er igjen.
- Gjenta trinn 3.16-3.17, dissociating cellene i 1 mL av iskalde dPBS om gangen, til alle 10 mL av dPBS brukes. Starte benytter en glass pipette mellomstore åpning og bytte til en glass pipette med en mindre åpning mot slutten (for de siste 3-4 mL dPBS lagt) av dissosiasjon. Hvis det er fremdeles synlig vev stykker mot slutten av dissosiasjon prosedyren, øke pipettering til ca 10 x mot 2 siste trinnene av dPBS for dissosiasjon, og endelig etterlate gjenværende vev bitene. Resuspend cellene forsiktig og unngå å skape bobler som det kan føre celleskader når cellene fester til overflaten av bobler.
Merk: Dette er et avgjørende skritt i denne protokollen og krever litt trening for å oppnå et godt resultat. - Balansere røret i sentrifuger (pre kjølt ned til 4 ° C) og rotere ned cellene på 200 x g i 10 min på 4 ° C. Husk å merke siden av røret der cellen pellet skal.
- Fjern forsiktig røret fra sentrifuge og forsiktig overføre nedbryting med et glass Pipetter til en tom 15 mL plastrør rett etter sentrifugering. Husk å fjerne det meste av nedbryting men pass på å unngå å miste de små (ofte usynlig) cellen pellet.
- Nøye resuspend celle pellet i 50-100 µL L-15 kultur medium.
Merk: På dette trinnet er det mulig å telle celler og/eller teste levedyktighet (for eksempel en celle teller i nærvær av trypan blå med et hemocytometer), men pass på at bruke del av cellen suspensjon for dette formålet vil redusere avkastningen. Unngå å bruke et stort suspensjon volum som øker risikoen for celler spre utenfor sentrum av parabolen. - Nøye dryppe dissosiert cellene i celle kultur parabol med 2 mL L-15 mediet (forberedt i trinn 3,13). At cellene å synke å bunnen av fatet i ca 5 minutter før du flytter dem til inkubator, unngå at cellene spre utenfor den sunkne delen av glass bunnen.
- Inkuber retten på 26 ° C og 1% CO2 å tillate alle cellene til vask grundig og feste til bunnen av parabolen.
- Etter 30 min, se på cellene i mikroskop for å sørge for at de har knyttet til kultur parabolen.
- Fortsette å ruge cellene på 26 ° C og 1% CO2.
- Nøye endre de fleste (men ikke alle) medium hver 3-4 dager.
Merk: Unngå endring mediet oftere, som kan forstyrre cellene og gjøre dem koble fra glass bunnen. Bruk cellene for eksperimenter innen en uke etter seeding dem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen beskriver utarbeidelse med et primært cellekulturer fra medaka pituitaries og gir friske celler som kan være i en kultur for minst en uke. Protokollen er basert på fysiologiske relevante verdiene for medaka14 og i tillegg er optimalisert til hypofysen vev i voksen fisk, med en pH på 7,75 og en osmolality på 290 mOsm/kg under hele prosedyren fra vev høsting til de belagt cellene i kultur (figur 1 og figur 2).
Representant resultatene fra eksperimentene på primært cellekulturer produsert av denne protokollen vises i Figur 3og Figur 4 figur 5. For resultatene som presenteres her, en transgene medaka linje, der luteinizing hormone (Lh)-gonadotrope celler uttrykke grønne fluorescerende protein (GFP), ble benyttet19. Figur 3 viser et representativt felt i parabolen med en primært cellekulturer fra dag 0 dag 7 etter seeding, inkludert både lyse-feltet og fluorescerende mikroskopi bilder, viser GFP-uttrykke Lh-gonadotrope cellene. Med rundt 10 voksen medaka pituitaries per parabolen vanligvis resulterer i en tetthet av rundt 5 x 104 -1 x 105 celler per rett etter seeding. Levedyktigheten til hypofysen cellene i kultur er beregnet basert på antall GFP-uttrykke celler i kulturen på dag 1, 3 og 7 etter plating, sammenlignet med dagen 0 (Figur 4). Grafen vist i Figur 4 angir at antall døende celler er nesten konstant over tid, med over 95% av cellene i live etter 1 dag og over 90% er fortsatt i live etter 3 dager. Selv om det er en liten nedgang i cellen levedyktighet med tiden, er de fleste celler (rundt 75%) fortsatt i live etter en uke i kultur. Elektrofysiologiske opptak av GFP-uttrykke Lh-gonadotrope celler (utført som beskrevet i Strandabø, et al.) 20 viser at cellene skal kunne skyte action potensialer spontant etter 4 dager i kultur (figur 5A). Videre, ved stimulering av gonadotropin - lanserer hormone, en innledende forbigående hyperpolarization i cellemembranen etterfølges av en dramatisk økning i avfyring frekvens som er samtidig med depolarization og økt varigheten av handlingen potensialer (figur 5B).
Figur 1: oversikt over hypofysen primære celle kultur teknikken. Pituitaries er dissekert med fine tang og overført til et plastrør som inneholder endrede dPBS på is (trinn 1 av protokollen) til enzymatisk fordøyelsen av pituitaries med trypsin på 26 ° C (trinn 2), etterfulgt av en inaktivering med en trypsin inhibitor på 26 ° C (vises ikke). Mekanisk dissosiasjon av enzymatisk fordøyd pituitaries med et glass pipette utføres nøye i dPBS på is (trinn 3), etterfulgt av en sentrifugering på 4 ° C (trinn 4). Til slutt oppløses cellen pellet i kultur medium og cellene belagt ut i en celle kultur parabol (trinn 5). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: detaljer om medaka hypofysen dissection. (A) leder av en immobilisert medaka (dorsal visning) er festet til en voks plate, og toppen av skallen taket er fjernet med fine tang å avsløre toppen av hjernen. (B) ryggmargen er kuttet, og hjernen snudd mot fronten av hodet slik at hypofysen er utsatt. (C) hypofysen samles med rene, fine tang. Pilspissen peker til hypofysen i panelet B og C. Skala bar = 1000 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Medaka hypofysen primære cellekultur. Disse skjermbildene viser AC confocal oppløsning med en representant medaka hypofysen primært cellekulturer på dag 0, dag 3 og dag 7 etter seeding. Det øvre panelet viser lyse-feltet mikroskopi bilder av et representativt felt i fatet, midtre panelet viser fluorescerende mikroskopi bilder av samme synsfelt viser GFP-uttrykke Lh-gonadotrope celler, og nedre panel er en overlapping av to. Skala bar = 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: levedyktigheten til medaka hypofysen celler i kultur. Denne illustrasjonen viser levedyktigheten til hypofysen primært cellekulturer målt på dag 0, 1, 3 og 7 etter seeding. Tallene er beregnet ved hjelp av åpen kildekode programvare CellProfiler V2 og er basert på antall GFP-uttrykke Lh-gonadotrope celler per rett på ulike tidspunkt points, sammenlignet med tiden 0. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: elektrofysiologiske opptak hypofysen celleområde. Disse skjermbildene viser elektrofysiologiske opptak fra en GFP-uttrykke Lh-gonadotrope celle i en primær cellekultur utført på dag 4 etter seeding, viser (A) representant spor av spontane handling potensialene, etterfulgt av (B) en stimulering med gonadotropin - lanserer hormone Gnrh1 for 10 s. Gnrh1 stimulering induserer bifasisk svar med en hyperpolarization i cellemembranen, etterfulgt av en depolarization og økt varighet av action potensial (målt ved 50% topp) fra 8,9 ± 3.0 ms før stimulering til 29,2 ± 9.9 ms etter den stimulering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro celle kultur systemer gir kraftige verktøy for forskere å svare en mengde ulike biologiske spørsmål om brukes i riktig måte1. Det er viktig å huske at dissosiert celler som har mistet sine forbindelser til nabokommunene cellene kan har fått ulike funksjonelle egenskaper enn de opprinnelig hadde i vivo. For å unngå å være fare for misinterpreting resultatene i vitro eksperimenter, er det viktig å justere primære celle kulturen prosedyren til arter og celle type av interesse. Selv moderat justeringer standard kultur prosedyrer og løsninger brukes er ofte tilstrekkelig dypt endre kultur betingelsene for en bestemt celle type.
Denne protokollen beskriver optimalisert betingelser for utarbeidelse og opprettholde primært cellekulturer fra voksen medaka pituitaries, som kan oppnås ved å justere parametre som temperatur, osmolality, pH og pCO2 løsninger brukes, til oppfyller fysiologiske vilkårene av denne arten. PH er temperaturen avhengige og bør derfor også justeres mellom forskjellige arter av teleost fisk som lever på forskjellige temperaturer17. Osmolality av alle løsninger brukes under cellen dissosiasjon og dyrking bør også justeres for å forbedre tilstanden til cellene. Spesielt hvis det er et avvik i osmolality mellom ulike løsninger brukes under isolasjon prosedyren, kan det ha ødeleggende effekter på kultur kvaliteten, fører til en redusert levedyktighet (forfatternes egen upubliserte resultatene). Hyperosmotic løsninger vil føre celler å krympe (og omvendt), og dermed forstyrrer membran integritet og membran protein funksjonen21. Et viktig poeng i denne sammenheng er at for eksempel osmolality og pH ikke er vanligvis målt eller stabil mellom ulike grupper av kommersielle buffere og kultur medier i pattedyr oppdrettsforholdene. Forskjeller i osmolality og pH mellom ulike løsninger brukes under isolasjon prosedyren bør unngås til enhver tid.
Suksessrate på denne protokollen er forbedret ved å trene, så det forventes forskere trenger litt tid å bli kjent med de ulike trinnene i teknikken. For eksempel er tiden fra Disseksjon av pituitaries til cellene er belagt i parabolen omvendt relatert til cell helse. Mekanisk dissosiasjon av pituitaries ved hjelp av en glass pipette er et spesielt viktig skritt i protokollen, og det krever litt trening for å oppnå et godt resultat. Dissosiasjon prosedyren kan introdusere osmotisk og mekanisk stress som er skadelig for cellene. Tillegg av små mengder modifisert dPBS i gjentatt trinn for mekanisk dissosiasjon sikrer en mildere dissosiasjon prosedyre der allerede dissosiert celler overføres til en ny tube og stående uten endringer, mens hun fortsetter å distansere flere celler fra vevet i et nytt volum av dPBS.
Denne protokollen er optimalisert for adult medaka hypofysen celler. Ulike arter, vev eller med ulike stadier av dyret innenfor samme vev krever optimaliseringer av kultur. For eksempel celler fra umodne dyr kan være mer skjøre og derfor mer utsatt mot apoptose-programmert celle død og dermed kan nødvendiggjøre behovet for å justere protokollen, særlig mot en mildere dissosiasjon prosedyre. Mekanisk dissosiasjon ved hjelp av en glass pipette er en svært kritisk trinn i prosedyren, som en for forsiktig mekanisk dissosiasjon vil føre til en lavere gevinst, mens en for grovt kan indusere apoptose og/eller celle død. Hvis ulike enzymer anses for dissosiasjon, kan det være nødvendig å bruke en annen fordøyelsen tid og enzym konsentrasjon. Medaka pituitaries er liten og relativt lett å dissociate med beskrevet protokollen. Imidlertid kan optimaliseringer for andre arter kreve bruk av en maske filter etter dissosiasjon å fjerne rusk. Suksessen til denne protokollen avhenger også i stor grad utfører trinnene under sterile forhold å unngå forurensende cellene.
Antall celler å frø per fat, avhenger av antall pituitaries i starten, i tillegg til suksessen av dissosiasjon prosedyren. Det er omtrent rundt 15.000 celler i en intakt voksen medaka hypofysen. Men celler er tapt under dissosiasjon prosessen og dette skal regnskapsføres ved beregning av antall pituitaries som er nødvendig for et eksperiment. Med minst 10 pituitaries per fat vil vanligvis resultere i en tetthet av rundt 50 000-100.000 celler per fat. På denne tetthet utgjør aggregering ikke i et betydelig beløp, selv etter 7 dager i kultur. Merkbart, aggregering synes å være tetthet avhengig, så jo tettere cellene er sådd, jo mer synes de å samle. Bestemte prosedyrer kan kreve en tettere kultur, og derfor optimal seeding tetthet bør vurderes avhengig av nedstrøms programmet. Det er et viktig poeng å ta i betraktning når du planlegger antall pituitaries bruke per fat.
Vanligste nedstrøms programmer bruker primært cellekulturer innen få dager etter seeding. Resultatene presenteres her, fra cellen levedyktigheten til elektrofysiologiske opptakene, viser at det er mulig å få gode resultater fra primært cellekulturer tilberedt med beskrevet protokollen for opptil 1 uke etter seeding. Likevel kulturer kan bli holdt lenger, og friske celler er fremdeles etter over 2 uker i kultur (forfatternes egen upubliserte resultatene). Optimalisert betingelsene i denne protokollen forenkler fysiologisk meningsfulle resultater og kan være fordelaktig for andre forskere forberedelser primært cellekulturer fra ikke-pattedyr celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å fortolle.
Acknowledgments
Prosjektet ble finansiert av biovitenskap og av Norges forskningsråd, bevilgning nummer 243811 og 244461 (akvakultur program). Vi er takknemlige til Lourdes Carreon Tan på universitetet for miljø og biovitenskap for å opprettholde funksjonen fisk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D8537 | Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol. |
| L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | L5520 | Supplement 500 ml culture medium with 10 mM NaHCO3, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 µm PES sterile filter, before adding 2.5 mL Penicillin-Streptomycin solution (see below for details). |
| NaOH | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5881 | Add drops of 1 M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75. |
| NaHCO3 | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5761 | 10 mM NaHCO3 equals 420 mg per 500 mL culture medium. |
| D-mannitol | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | 63565 | Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm. |
| D-glucose | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | G5400 | 4.5 mM D-glucose equals 405 mg per 500 mL culture medium. |
| GlutaMAX Supplement | Gibco (Life Technologies, Paisley, UK) | 35050-061 | Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100x stock in 500 mL culture medium. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | P0781 | Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 mL of stock solution in 500 mL L-15 medium (equivalent of 50 U/mL Penicillin and 50 µg/mL Streptomycin). |
| Trypsin type II-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T7409 | Prepare 1 mg/mL in dPBS solution. |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T6522 | Prepare 1 mg/mL in dPBS solution, supplement with 2 µg/ml Dnase I (see details below). |
| Dnase I | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D5025 | Use in trypsin inhibitor solution (see above). |
| 0.2 µm Polyethersulfone (PES) sterile filter system | Corning Inc. (Corning, NY) | 431097 | Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments. |
| 35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-10-C | Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application. |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11254-20 | Straight tip |
| Dumont #5/45 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11253-25 | Angled 45° tip |
| Stereo microscope SZ61 | Olympus Corp. (Tokyo, Japan) | Use for dissection of pituitaries. | |
| Alegra X-22R Centrufuge | Beckman Coulter Inc. (Brea, CA) | With cooling option (similar to current model XR-30). | |
| Water bath | Techne (Staffordshire, UK) | Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do. | |
| Pasteur glass pipettes | VWR (NY) | 612-1701 | Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use. |
| Galaxy MiniStar table centrifuge | VWR (NY) | 521-2844 | Any small table centrigue will do. |
| Fine needles/insect pins | Fine Science Tools (CA) | 26001-40 | Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead. |
| Wax plate | Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish. |
References
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2010).
- Ribeiro, L. P., Ahne, W. Fish cell culture: initiation of a line of pituitary cells from carp (Cyprinus carpio) to study the release of gonadotropin in vitro. In Vitro. 18 (5), 419-420 (1982).
- Ribeiro, L., Ahne, W., Lichtenberg, V. Primary culture of normal pituitary cells of carp (Cyprinus carpio) for the study of gonadotropin release. In Vitro. 19 (1), 41-45 (1983).
- Wong, A. O., Ng, S., Lee, E. K., Leung, R. C., Ho, W. K. Somatostatin inhibits (d-Arg6, Pro9-NEt) salmon gonadotropin-releasing hormone- and dopamine D1-stimulated growth hormone release from perifused pituitary cells of chinese grass carp, Ctenopharyngodon idellus. General and Comparative Endocrinology. 110 (1), 29-45 (1998).
- Chang, J. P., et al. Use of a pituitary cell dispersion method and primary culture system for the studies of gonadotropin-releasing hormone action in the goldfish, Carassius auratus. I. Initial morphological, static, and cell column perifusion studies. General and Comparative Endocrinology. 77 (2), 256-273 (1990).
- Weil, C., Hansen, P., Hyam, D. Use of pituitary cells in primary culture to study the secretion in rainbow-trout - Setting up and validating the system as assessed by its responsiveness to mammalian and salmon gonadotropin-releasing hormone. General and Comparative Endocrinology. 62 (2), 202-209 (1986).
- Montero, M., LeBelle, N., Vidal, B., Dufour, S. Primary cultures of dispersed pituitary cells from estradiol-pretreated female silver eels (Anguilla anguilla L): Immunocytochemical characterization of gonadotropic cells and stimulation of gonadotropin release. General and Comparative Endocrinology. 104 (1), 103-115 (1996).
- Xu, S. H., Cooke, I. M. Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells. General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).
- Lin, S. W., Ge, W. Differential regulation of gonadotropins (FSH and LH) and growth hormone (GH) by neuroendocrine, endocrine, and paracrine factors in the zebrafish-An in vitro approach. General and Comparative Endocrinology. 160 (2), 183-193 (2009).
- Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO2, and pH. General and Comparative Endocrinology. 178 (2), 206-215 (2012).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - a model organism from the far East. Nature Reviews Genetics. 3, 53-64 (2002).
- Matsuda, M., et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).
- Kasahara, M., et al. The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution. Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).
- Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes. Zoological Letters. 2 (12), (2016).
- Waymouth, C. Osmolality of mammalian blood and of media for culture of mammalian cells. In Vitro. 6 (2), 109-127 (1970).
- Cameron, J. N. Acid-base homeostasis - past and present perspectives. Physiological Zoology. 62 (4), 845-865 (1989).
- Claiborne, J. B., Edwards, S. L., Morrison-Shetlar, A. I. Acid-base regulation in fishes: cellular and molecular mechanisms. Journal of Experimental Zoology. 293 (3), 302-319 (2002).
- Perry, S. F., Tufts, B. L. Fish respiration. , Academic Press. San Diego, CA. (1998).
- Hildahl, J., et al. Developmental tracing of luteinizing hormone β-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function. Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).
- Strandabø, R. A. U., et al. Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes). Molecular and Cellular Endocrinology. 372 (1-2), 128-139 (2013).
- Verbalis, J. G. Brain volume regulation in response to changes in osmolality. Neuroscience. 168 (4), 862-870 (2010).
