המוקד העיקרי של פרוטוקול זה הוא לבודד ביעילות glomeruli העיקרי קיימא תרבויות עם מזהמים מינימלית לשימוש במגוון רחב של יישומים במורד הזרם. Glomeruli מבודד שומרים על קשרים מבניים בין סוגי תאים רכיב וניתן בתרבית שמחוץ לזמן קצר.
שימור מבנה glomerular ותפקוד הוא מכריע למניעת דלקת פקעיות הכליה, קטגוריה של מחלת כליות מאופיין פרוטאינוריה אשר יכול להוביל בסופו של דבר את כרונית, מחלת כליות סופנית. פקעית הוא מנגנון מורכב אחראי על הסינון של פלסמה מן הגוף. במחלה, שלמות מבנית אובד ומאפשר חריג לדליפת פלזמה תוכן לתוך השתן. שיטה לבודד ולבחון glomeruli בתרבות חיוני לחקר מחלות אלו. ב פרוטוקול זה, מתוארת שיטה יעילה לאחזור glomeruli ללא פגע מן החולדה למבוגרים כליות תוך שימור מאפיינים מורפולוגיים מבניים. תהליך זה הוא מסוגל לייצר תפוקה גבוהה של glomeruli לכל כליה עם זיהום מזערי של מקטעים אחרים נפרון. עם אלה glomeruli, ופציעות ספורט יכול להיות חיקה מאת המקננת אותם עם מגוון של רעלנים כימיים, כולל מה לעזאזל קרה סולפט, הגורמת רגל תהליך הצטנעות, פרוטאינוריה במודלים של בעלי חיים. חומרת הפגיעה יכול להיות מוערך באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים, immunofluorescence מכתים סופג המערבי. Nephrin ורמות 1 גידול Wilms (WT1) יכול גם להיות מוערך מהתרביות האלה. בשל נוחות וגמישות של פרוטוקול זה, glomeruli מבודד יכול להיות מנוצל כמתואר או בצורה המתאימה ביותר לצרכים של החוקר כדי לסייע טוב יותר בריאות glomerular המחקר ומבנה במדינות נגועים.
פקעית הוא ציצה מאוד מיוחדים של נימים אחראי על הסינון של מחזורי פלזמה. היא יוצרת את תחילת נפרון, אשר היא היחידה הפונקציונלית הבסיסית של הכליה. Glomerular פונקציה מוגדרת על-ידי אנדותל נימי fenestrated ייחודי של הסרעפת שסע של podocytes, של קרום המרתף להתערב. שכבות אלה ליצור מחסום semipermeable כדי לאפשר הפרשה סלקטיבית של חומרים לתוך פילטרט. מים, יונים, מולקולות קטנות אחרות בדרך כלל עוברים דרך, ואילו מולקולות גדולות יותר נשמרים ב הפלזמה. Podocytes הן מיוחדות לתאי האפיתל שהתפשט על פני קרום המרתף, סביב הנימים עם תחזיות cytoplasmic המכונה רגל תהליכים. כף הרגל מעבד של interdigitate הסמוכה podocytes, נרשמו על ידי חריץ דיאפרגמות מורכב של חלבונים כגון nephrin, podocin, P-קדהרין זואי-11. במקטע קרוס, רגל אלה תהליכים באופן שווה מסודרים על קרום המרתף. התהליכים רגל glomeruli נגועים, הופכים בגסות חריג או “התרחבות”, שמוביל חריג לדליפת פלזמה תוכן לתוך פילטרט. ככזה, נזק glomerular מאופיין בדרך כלל על ידי הנוכחות של כמות גדולה באופן חריג של חלבון (למשל, פרוטאינוריה) ו/או תאי דם אדומים (למשל, המטוריה) בשתן. בנוסף, podocytes הפצוע מאבד הביטוי של nephrin, כמו גם את הרגולטור 1 גידול Wilms (WT1), חלבון מפתח אחראי על תחזוקה של בידול2,3. Glomeruli מהווה מטרה עיקרית של נזק ב סוכרת כלייתית הינם glomerulonephritides אחרים כגון שינויים מזעריים מחלה כלייתית עלי הלוואי קרומיים, glomerulosclerosis סגמנטלי מוקד. מחלות אלו הם הגורמים העיקריים אי ספיקת כליות מתקדמת, ההתפתחות של מחלת כליות סופנית, מצב שבו הישרדות נשענת על דיאליזה או השתלת כליות. לכן, חשוב ללמוד glomeruli להבין טוב יותר את כליות כרונית (CKD) המחלה פתולוגיה.
מערכת התרבות התא חיוני ללמוד ביולוגיה glomerular. בשל תפקידה מרכזי ביצירת הסרעפת שסע, כמו גם על קיום מחלות ספציפיות proteinuric עקב מוטציות חלבון הסרעפת שסע, מחקרים רבים בצורה מובנת ניצל את podocyte בבידוד. זה הוביל הדור של שורות תאים podocyte העיקרית לנצל במבחנה. תאים אלה יכולים להיות בתרבית תחת מגוון תנאים, ניתן לגדל אפילו על תמיכה חדיר כדי להעריך את חדירות4. עם זאת, הבידוד של תאים מתרבים לעיתים קרובות בוחר תאים dedifferentiated שאיבדת חלק סמנים podocyte שלהם. זה הוביל הדור של podocytes מותנית מונצחים נגזר זן העכבר הטרנסגניים נושא מוטציה רגיש לטמפרטורה של SV40 גדול T הגן (למשל immortomouse), אשר יכול להיות גדלו בתרבות אלא גם להיות הבדיל לבטא מערך מלא של סמנים podocyte5. שיטות אלה של התרבות העיקרי היה מרכזי ההבנה podocyte ביולוגיה4,6,7.
למרות זאת, תרבויות המכילה סוגי תאים יחיד חוסר המערכת היחסים המתרחשות ויוו וכן את מבנה התמיכה של מטריצות, monolayers של תאים אלה לא בהכרח לסכם את תלת מימדי הארכיטקטורה של glomeruli. Podocytes immortalized ניתן גם מסורבל ומאתגרים תרבות8, והם ידרשו אחזקת או immortomouse או aliquot ההתחלתי של תאים מ הוקמה חוקרים כדי להתחיל. עוד יותר, פקעית מורכבת לא רק podocytes, אבל גם תאי אנדותל נימי קרום המרתף, וכן תאים mesangial אשר מספקים תמיכה עבור המבנה. לכן זה שימושי לפתח שמחוץ גישה זמינה כל החוקרים לחקר glomeruli שלם לשמור את הארכיטקטורה הטבעית שלהם, כמו גם כל התאים המהווים את פקעית נורמלי.
בשנת 1958, קוק, פיקרינג תיאר את הבידוד הראשון של glomeruli מן הכליה ארנב. לאחר תצפיות תסחיף שומני הפך תקוע glomeruli, הם הניחו כי חלקיקים בגודל זהה יכול לשמש לבודד במיוחד מבנים אלה. אכן, העירוי של חלקיקי תחמוצת ברזל לתוך הכליה הובילו ההשמנה של החלקיקים ב glomeruli. לאחר דיסוציאציה מכני, ניפוי של הכליה, glomeruli יכול להיות מבודדת ללא פגע עם טוהר באמצעות הפרדה מגנטית9. ב-1971 Misra הראה כי את תחמוצת ברזל יכול להיות מושמט חליטות, ובידוד glomerular מושגת עם ניפוי של האדם טחון, כלב, ארנבת או עכבר כליות רקמות10. טכניקה זו שונתה מאז ואז בהתאם למטרה של החוקרים, אבל בעיקרו של דבר הביא מטוהרים ההכנות זה. יכול להיות עוד יותר למד או שממנו תרבויות התא הראשי יכול להיות הוקמה11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17.
כאן נתאר פרוטוקול עבור בידודו של glomeruli קיימא ללא פגע מן הכליה חולדה. פרוטוקול כולה אורכת שעות ספורות. למרות שהם לא להתרבות, תוכניות ניסיוני בכל גודל ייתמכו על-ידי פשוט להגדיל את מספר הכליות כמתחילה חומר. אמנם ישנם פרוטוקולים שפורסמו עבור הפרדת חרוז מגנטי glomeruli, הם דורשים זריקה תוך ורידי של חרוזים יקרים יותר, עשוי לשנות ביולוגיה מאז החרוזים נשמרות גם על-ידי glomeruli בתרבות או לדרוש glomerular” lysing”והסרה על ידי צנטריפוגה19. לעומת עכבר glomeruli, גודל גדול יותר של עכברוש glomeruli (קרוב ל-100 מיקרומטר חולדות בת שני חודשים18) מקלה בהרבה להפריד אותם מבנים אחרים הכליה באמצעות טכניקה פשוטה sieving.
כראיה של התועלת שלהם, אנחנו שאפיינו glomeruli להפגין את סוגי תאים שונים. הם יכולים גם להיות חשופים סוכנים ידוע לפצוע glomeruli ויוו, נדגים את ההשפעות השליליות של? מה לעזאזל קרה סולפט (PS) על תרבויות אלה. נ. ב הוא polycation זה מנטרל את האתרים anionic לאורך הקיר נימי glomerular20. סתירה זו השפעה דרמטית על המכשול סינון glomerular ומגביר לכן הצטנעות תהליך פרוטאינוריה ו כף הרגל. יכול להיות מוערך glomeruli אלה עם immunoblots חלבונים מפתח כגון nephrin ו- WT1 כדי להעריך את הבריאות הכללית. יתר על כן, ניתן להעריך את המבנה שלהם עם אור, immunofluorescence של מיקרוסקופ אלקטרונים.
פרוטוקול זה נגיש באופן כללי, רוב החוקרים (ורק צריך גישה החיות, ציוד פשוט). עם תכונות מורפולוגיות נשאר ניזוק, החוקר לנתח glomeruli ולראות סוגי תאים חשוב איך אחרים, שימור מטריקס glomeruli להשפיע על תפקוד ומחלות התקדמות, חסרונה תרבויות podocyte.
זוהי שיטה יעילה להתאוששות glomeruli מן החולדה הכליה באמצעות ציוד זול, לשימוש חוזר עם פרוטוקול פשוט. כמו עם כל ההליכים, קיימות מגבלות על תועלתו. ראשית, למרות אנו משיגים > 95% טוהר, בשל מהות sieving את הפרוטוקול ואת חומר המוצא שזה בלתי אפשרי לא לכלול כל מזהמים, ואת מספר כדוריות דם אדומות על קטע צינורי ומדי פעם להיות נוכחים בתרבות אנו מצפים האלה מזהמים קטנים כדי להיות בעיה עבור הרוב המכריע של יישומים. שנית, פרוטוקול sieving מסתמך על השימוש של עכברוש כליות, שבה glomeruli הם הרבה יותר גדול מאשר בעכברים. אם העכבר glomeruli נדרשים, טכניקה שימוש מסחרי beads מגנטי (למשל, Dynabeads) כבר פורסם22. שלישית, הוכח mRNAs הספציפי הזה (plasminogen activator מעכב-1 וקולגן אני) ב glomeruli מבודד שואבים כמעט לחלוטין כמוסה של באומן ולא intraglomerular תאים23. זה עלול להוביל למסקנות לא הולם אם mRNA בידוד מתבצע ניסיון של אלה glomeruli. יצוין כי בידיים שלנו רוב glomeruli הם decapsulated ולא צריך ולכן חוסר תרומה משמעותית מן קפסולות של באומן. רביעית, מוות של תאים מתחיל להתרחש במהירות יחסית בתנאים תרבות.
מצאנו כי התוכנית מוות, כפי שמעידים המראה של קספאז cleaved-3, הופעלה החל מ- 2 h של תרבות. . זה בדרך-כלל הסכם עם דוחות קודמים מציג שאת אפופטוזיס, כפי מוערך על ידי ה-DNA פיצול TUNEL, ניתוח היסטולוגית, מתחילה להתרחש בתוך 1-2 h לאחר בידוד24… עם זאת, גם יצוין כי מוקדם תצפיות הראו כי פעילות חילוף החומרים יכול להתגלות מ glomeruli sieved מבודד כאשר תרבותי לפחות 3 h, רומז ניכר הכדאיות הסלולר בגיל הזה timepoint16. למרות זאת, בהתבסס על התוצאות, אנו מאמינים שזה יהיה שקול לנצל glomeruli מבודד מיד בניסויים המיועד לקבלת התוצאות הטובות ביותר. אנו ממליצים כי כל ניסויים להתבצע לפני 72 h כפי שצפינו בה כל המבנה glomerular מתחיל להתדרדר מעבר timepoint הזה.
. זה הרבה יותר קל להשיג תשואות גבוהות כאשר החל מ 4-8 הכליות ולא רק 2 כי מספר מסוים של glomeruli הם איבדו בשל ההקפדה הנפות השונות, אבל ברגע הנפות הן מצופה מקסימאלית יש אין הפסד נוסף. מאותה סיבה, חשוב לטבול את הנפות המנזר מאגר BSA/PBS להשתמש glomeruli נוטים יותר לדבוק מסננת יבש, וכדי להגביל את החשיפה רקמות לקצה אחד של המסננת. אנו מציעים החל הכליות לא פחות מ 6 (3 חולדות) להשיג תשואה סבירה.
כמה חוקרים שללו podocyte העיקרי של glomeruli מבודד אשר נוטים לצמוח מתוך glomeruli במהלך תרבות17תרבויות. אנו ציינו כי כמה glomeruli מבודד דוגלים תרבות צלחת פלסטיק, כי התאים יתחיל להגר המבנה glomerular בשעה מאוחרת timepoints (72 h לאחר בידוד). המחקר של תאים אלה הוא מעבר להיקף של פרוטוקול זה בידוד, ויש מחלוקת באשר אם תאים אלה הם podocytes, הקודקוד תאי אפיתל או בני15,25. ראוי לציין, Mundel. et al., דיווחו כי תאים המרוצף שנקטפו sieved glomeruli עשוי להיגרם כדי להתמיין podocytes בוגרים תחת ספציפיים culturing תנאים26. חלק מן הבלבול לגבי זהות תא תלויים אם glomeruli מבודד כמוסות (כולל הקפסולה של באומן אשר מאוכלס על ידי תאים אפיתל הקודקוד) או decapsulated בהליך sieving. בידיים שלנו, באמצעות מסננת רציפים בגדלים של 180, 90, ו- 75 מיקרומטר הובילו רוב glomeruli להיות decapsulated.
רוב צורות של מחלת כליות כרונית proteinuric הן בשל עליות glomerular חדירות. מספר סופרים נעזרו glomeruli מבודד בניסויים חדירות ‘ ex-vivo . בשיטה אחת, שינוי נפח glomerular לאחר שינוי תוכן osmotic התקשורת שמסביב שימש להערכת חדירות27. לאחרונה, נקבע כי דליפה של בדיקה פלורסנט מ glomeruli מבודדים ניתן לכמת למדוד פרמאביליות, היה יכול. להתבצע בחולדות חשופים למחלות glomerular ניסיוניות28.
אנו ציינו כי בתהליך הכנה TEM, אנחנו לפעמים לראות את podocyte ברגל תהליכי הרמה את קרום המרתף. אנחנו לא מרגישים זה קורה בתרבות, סביר יותר להניח חפץ במהלך הכנת הדוגמא TEM. ראוי לציין, גם כאשר מצב זה מתרחש, ברור אם התהליכים הרגל נראה “נורמלי” או הם התרחבות.
בסך הכל, פרוטוקול זה מספק שיטה שבה אחד יכול להעריך שינויים מורפולוגיות, הסלולר, בתגובה לפציעה. אנו צופים כי זה עשוי לשמש. טכניקה לוויה לתרבויות podocyte מבודדים, במיוחד כאשר שוקלים את האינטראקציות עם מטריצה חוץ-תאית או סוגי תאים מקומיים אחרים. זה טומן בחובו הבטחה להגברת ההבנה של CKD proteinuric, אשר לשפר את היכולת לפתח בעתיד הרפוי במחלה הזו מתישה.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקאי גרנט FTF 16990086, NIH P30 DK079307, אמריקאי החברה של נפרולוגיה גוטשאלק, של אוניברסיטת פיטסבורג רפואי מרכז תחרותי רפואי מחקר קרן פרס, ובפרס של אוניברסיטת פיטסבורג רופאים האקדמי פרס. אנו מודים ג’רארד Apodaca על שלו הצעות טכניות לשימור glomerular עבור ניתוח היסטולוגית, מארה סאליבן, מינג סאן לקבלת סיוע עם מיקרוסקופ אלקטרונים, Yingjian Li, Youhua ליו לקלט הטכני שלהם ב פרוטוקול זה. אנו מודים גם סינתיה סנט הילר על הנוגדן CD31.
Solutions, Chemicals, and Animals | |||
Sprague-Dawley Rats | Envigo | 207M | |
Bovine serum albumin | Fisher | BP1605100 | |
Hank's Balanced Salt Solution with Ca2+ and Mg2+ | Thermo | 14025092 | |
1x Phosphate Buffered Saline | VWR | 97063-660 | |
Protamine sulfate | MP Bio | ICN15197105 | |
Karnovsky's Fixative | |||
Gelatin | |||
Paraformaldehyde | EMD | EM-PX0055-3 | |
O.C.T. | Scigen | 23730571 | |
RIPA Buffer | |||
Halt Protease Inhibitors | Thermo | PI78442 | |
Nephrin Antibody | Fitzgerald | 2OR-NP002 | |
WT-1 Antibody | Abcam | ab89901-10ul | |
PDGFR-β Antibody | Cell Signaling | #3169S | |
CD31 Antibody | LSBio | LS-C348736 | |
Cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling | 9661S | |
Poly/Bed 812 (Luft) epoxy | Polysciences | 08792-1 | |
Equipment | |||
Carbon dioxide chamber | |||
Conical tubes, 15 mL | |||
Conical tubes, 50 mL | |||
Surgical scissors | |||
Surgical forceps | |||
Sterile gauze | |||
Petri dishes, 100 mm | |||
Scalpels | |||
Razor blades | |||
Sterile filter apparatus | |||
Sieve Pan | Alfa Aesar | AA39999ON | |
180um Sieve | Alfa Aesar | AA39996ON | |
90um Sieve | Alfa Aesar | AA39990ON | |
75um Sieve | Alfa Aesar | AA39991ON | |
10 mL syringes | |||
600 mL beakers | |||
Cell culture incubator | |||
Picofuge | |||
Vortex | |||
Tissue Homogenizers | Fisher Scientific | 50550226 | |
20 G needles | |||
Leica Reichart Ultracut | ultramicrotome |