इस प्रोटोकॉल का मुख्य फोकस कुशलतापूर्वक बहाव अनुप्रयोगों की एक किस्म में उपयोग के लिए ंयूनतम दूषित पदार्थों के साथ व्यवहार्य प्राथमिक glomeruli संस्कृतियों को अलग करने के लिए है । अलग glomeruli घटक सेल प्रकार के बीच संरचनात्मक संबंधों को बनाए रखने और एक छोटे समय के लिए पूर्व vivo cultureed जा सकता है ।
glomerular संरचना और समारोह के संरक्षण स्तवकवृक्कशोथ, गुर्दे की बीमारी की एक श्रेणी proteinuria जो अंततः जीर्ण और अंत चरण गुर्दे की बीमारी के लिए नेतृत्व कर सकते हैं की विशेषता की रोकथाम में निर्णायक है । glomerulus एक जटिल उपकरण शरीर से प्लाज्मा के निस्पंदन के लिए जिंमेदार है । रोग में, संरचनात्मक अखंडता खो दिया है और मूत्र में प्लाज्मा सामग्री के असामान्य रिसाव के लिए अनुमति देता है । एक विधि को अलग करने और संस्कृति में glomeruli की जांच करने के लिए इन रोगों के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है । इस प्रोटोकॉल में, जबकि संरचनात्मक और रूपात्मक विशेषताओं के संरक्षण वयस्क चूहे गुर्दे से बरकरार glomeruli पुन प्राप्त करने का एक कुशल विधि वर्णित है । यह प्रक्रिया अन्य nephron खंडों से न्यूनतम संदूषण के साथ प्रति गुर्दे glomeruli की उच्च पैदावार पैदा करने में सक्षम है । इन glomeruli के साथ, चोट की स्थिति उन्हें protamine सल्फेट सहित रासायनिक विषाक्त पदार्थों की एक किस्म के साथ, जो पैर प्रक्रिया effacement और पशु मॉडल में proteinuria कारण बनता है द्वारा नकल उतारा जा सकता है । चोट के अंश संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला, और पश्चिमी सोख्ता का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है । Nephrin और Wilms ट्यूमर 1 (WT1) के स्तर का भी इन संस्कृतियों से आकलन किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल की सहजता और लचीलेपन के कारण, पृथक glomeruli के रूप में वर्णित या एक तरह से उपयोग किया जा सकता है कि सबसे अच्छा सूट शोधकर्ता की जरूरतों को बेहतर अध्ययन glomerular स्वास्थ्य और रोगग्रस्त राज्यों में संरचना में मदद करने के लिए ।
glomerulus प्लाज्मा घूम के निस्पंदन के लिए जिंमेदार केशिकाओं का एक अति विशिष्ट गुच्छा है । यह nephron की शुरुआत है, जो गुर्दे की बुनियादी कार्यात्मक इकाई है रूपों । Glomerular समारोह एक विशिष्ट fenestrated केशिका endothelium, podocytes के भट्ठा डायाफ्राम, और एक हस्तक्षेप तहखाने झिल्ली द्वारा परिभाषित किया गया है । इन परतों को छानने का में पदार्थों के चयनात्मक उत्सर्जन के लिए अनुमति देने के लिए एक semipermeable बाधा के रूप में । पानी, आयनों, और अंय छोटे अणुओं के माध्यम से आम तौर पर गुजरती हैं, जबकि बड़े अणुओं प्लाज्मा में बनाए रखे हैं । Podocytes विशेष उपकला कोशिकाओं है कि तहखाने झिल्ली पर फैल रहे हैं, पैर प्रक्रियाओं के रूप में जाना जाता cytoplasmic अनुमानों के साथ केशिकाओं आसपास । सन्निकट podocytes interdigitate के पैर प्रक्रियाओं और भट्ठा डायाफ्राम द्वारा पार कर रहे हैं जैसे कि nephrin, podocin, पी-cadherin, और ZO-11के रूप में प्रोटीन के शामिल. पार अनुभाग में, इन पैरों की प्रक्रियाओं को समान रूप से तहखाने झिल्ली पर व्यवस्थित कर रहे हैं । रोगग्रस्त glomeruli में, पैर प्रक्रियाओं मोटे तौर पर असामान्य हो या “effaced,” छानने का में प्लाज्मा सामग्री के असामान्य रिसाव के लिए अग्रणी । जैसे, glomerular नुकसान आम तौर पर प्रोटीन की असामान्य रूप से बड़ी मात्रा की उपस्थिति की विशेषता है (जैसे, proteinuria) और/या लाल रक्त कोशिकाओं (जैसे, रक्तमेह) मूत्र में । इसके अलावा, घायल podocytes nephrin की अभिव्यक्ति खो के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपने नियामक Wilms ट्यूमर 1 (WT1), एक प्रमुख प्रोटीन2,3विभेद के रखरखाव के लिए जिंमेदार है । glomeruli मधुमेह नेफ्रोपैथी और अन्य glomerulonephritides जैसे न्यूनतम परिवर्तन रोग, झिल्लीदार नेफ्रोपैथी, और फोकल फॉल्ट glomerulosclerosis में नुकसान का एक प्राथमिक लक्ष्य कर रहे हैं । इन रोगों प्रगतिशील गुर्दे की विफलता के प्रमुख कारण है और अंत चरण गुर्दे की बीमारी के विकास, एक शर्त है जिसमें जीवन रक्षा डायलिसिस या गुर्दे प्रत्यारोपण पर निर्भर करता है । इसलिए क्रोनिक किडनी डिजीज (सीकेडी) पैथोलॉजी को बेहतर ढंग से समझने के लिए glomeruli का अध्ययन करना जरूरी है ।
एक कोशिका संस्कृति प्रणाली glomerular जीवविज्ञान का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है । भट्ठा डायाफ्राम पैदा करने में अपनी केंद्रीय भूमिका के कारण, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विशिष्ट proteinuric भट्ठा डायाफ्राम प्रोटीन उत्परिवर्तनों के कारण रोगों के अस्तित्व, बहुत अनुसंधान जाहिर है अलगाव में podocyte का उपयोग किया । यह प्राथमिक podocyte सेल लाइनों की पीढ़ी के लिए इन विट्रो मेंउपयोग करने के लिए नेतृत्व किया गया है । इन कोशिकाओं की स्थिति की एक किस्म के तहत किया जा सकता है और भी पारगंय पर उगाया जा सकता है4पारगम्यता का आकलन करने के लिए समर्थन करता है. हालांकि, proliferating कोशिकाओं के अलगाव अक्सर विभेदित कोशिकाओं है कि उनके podocyte मार्करों के कुछ खो दिया है चुनता है । यह सशर्त अमर एक ट्रांसजेनिक माउस SV40 बड़ी टी जीन (जैसे immortomouse), जो संस्कृति में उगाया जा सकता है, लेकिन यह भी हो सकती है की एक तापमान के प्रति संवेदनशील उत्परिवर्ती ले जाने के तनाव से व्युत्पंन podocytes की पीढ़ी के लिए नेतृत्व किया है podocyte मार्करों की एक पूरी सरणी व्यक्त करने के लिए विभेदित5. प्राथमिक संस्कृति के इन तरीकों को समझने में निर्णायक रहा है podocyte जीव विज्ञान4,6,7।
फिर भी, एकल कोशिका प्रकार वाले संस्कृतियों में सेलुलर संबंधों की कमी होती है जो vivo के साथ-साथ समर्थन संरचना और मैट्रिक्स में होती है, और इन कोशिकाओं के monolayers तीन आयामी दोहराऊंगा जरूरी नहीं है glomeruli की वास्तुकला । अमर podocytes भी बोझिल और संस्कृति8के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और या तो immortomouse या स्थापित जांचकर्ताओं से कोशिकाओं के एक प्रारंभिक aliquot के कब्जे की आवश्यकता को आरंभ करने के लिए । इसके अलावा, glomerulus न केवल podocytes के शामिल है, लेकिन यह भी केशिका endothelial कोशिकाओं और तहखाने झिल्ली, साथ ही साथ mesangial कोशिकाओं जो संरचना के लिए समर्थन प्रदान करते हैं । इसलिए यह एक पूर्व vivo बरकरार glomeruli के अध्ययन के लिए सभी जांचकर्ताओं के लिए उपलब्ध दृष्टिकोण है कि उनके मूल संरचना को बनाए रखने के साथ ही सभी कोशिकाओं को विकसित उपयोगी है सामांय glomerulus ।
१९५८ में, कुक और पिकरिंग खरगोश गुर्दे से glomeruli के पहले अलगाव वर्णित है । टिप्पणियों के बाद कि वसा emboli glomeruli में दर्ज हो गया, वे माने कि एक ही आकार के कणों को विशेष रूप से इन संरचनाओं को अलग किया जा सकता है । दरअसल, गुर्दे में आयरन ऑक्साइड कणों का अर्क glomeruli में इन कणों के फँसाने के लिए नेतृत्व किया. यांत्रिक पृथक्करण और गुर्दे की sieving के बाद, glomeruli बरकरार रखा जा सकता है और शुद्धता के साथ चुंबकीय जुदाई9के उपयोग के माध्यम से. १९७१ में, मिसळा दिखाया है कि लौह ऑक्साइड सुई लेनी छोड़ा जा सकता है, और glomerular अलगाव कीमा बनाया हुआ मानव, कुत्ता, खरगोश या चूहे गुर्दे ऊतक10के sieving के साथ हासिल की । इस तकनीक के बाद से संशोधित किया गया है तो जांचकर्ताओं के लक्ष्य पर निर्भर करता है, लेकिन अनिवार्य रूप से शुद्ध तैयारी है कि आगे का अध्ययन किया जा सकता है या से जो प्राथमिक सेल संस्कृतियों11,12 स्थापित किया जा सकता है के परिणामस्वरूप , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. शी.
यहां हम चूहे गुर्दे से बरकरार व्यवहार्य glomeruli के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । पूरे प्रोटोकॉल बस कुछ ही घंटे लगते हैं । हालांकि वे पैदा करना नहीं है, किसी भी आकार की प्रयोगात्मक योजनाओं बस शुरू सामग्री के रूप में गुर्दे की संख्या में वृद्धि के द्वारा समर्थित किया जा सकता है । जबकि वहां glomeruli के चुंबकीय मनका जुदाई के लिए प्रोटोकॉल प्रकाशित कर रहे हैं, वे मोतियों की नसों में इंजेक्शन की आवश्यकता होती है, और अधिक महंगे हैं, और जीव विज्ञान को बदलने के बाद से मोतियों या तो संस्कृति में glomeruli द्वारा बनाए रखा या glomerular की आवश्यकता हो सकती है ” lysing “और हटाने के द्वारा केंद्रापसारक19। माउस glomeruli की तुलना में, चूहे glomeruli का बड़ा आकार (लगभग १०० µm दो महीने पुराने चूहों18में) बनाता है यह बहुत आसान उंहें एक सरल sieving तकनीक का उपयोग कर अंय गुर्दे की संरचनाओं से अलग करने के लिए ।
उनकी उपयोगिता के सबूत के रूप में, हम glomeruli विशेषता है कि विभिंन प्रकार के सेल का प्रदर्शन । वे भी vivo में glomeruli घायल करने के लिए जाना जाता एजेंटों को उजागर किया जा सकता है, और हम इन संस्कृतियों पर protamine सल्फेट (पी एस) के प्रतिकूल प्रभाव प्रदर्शित करता है । पुनश्च एक polycation कि glomerular केशिका दीवार20के साथ anionic साइटों बेअसर है । इस बेअसर glomerular निस्पंदन बाधा पर एक नाटकीय प्रभाव पड़ता है और इसलिए proteinuria और पैर प्रक्रिया effacement बढ़ जाती है । इन glomeruli में nephrin और WT1 जैसे प्रमुख प्रोटीन्स के लिए immunoblots के साथ समग्र स्वास्थ्य का आकलन किया जा सकता है. इसके अलावा, उनकी संरचना प्रकाश, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है ।
कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल सबसे जांचकर्ताओं के लिए सुलभ है (एक ही जानवरों और कुछ सरल उपकरणों के लिए उपयोग की जरूरत है) । रूपात्मक सुविधाओं के साथ नुकसान छोड़ दिया है, शोधकर्ता को glomeruli का विश्लेषण करने में सक्षम है और कैसे अंय महत्वपूर्ण कोशिका प्रकार और मैट्रिक्स संरक्षण glomeruli में समारोह और रोग प्रगति, podocyte संस्कृतियों की एक कमी को प्रभावित करते हैं ।
यह एक सरल प्रोटोकॉल के साथ सस्ती, पुन: प्रयोज्य उपकरणों का उपयोग कर चूहे गुर्दे से glomeruli उबरने के लिए एक कारगर तरीका है । सभी प्रक्रियाओं के साथ के रूप में, वहां अपनी उपयोगिता के लिए सीमाएं हैं । सबसे पहले, यद्यपि हम प्राप्त > ९५% शुद्धता, क्योंकि प्रोटोकॉल और प्रारंभिक सामग्री के sieving प्रकृति के सभी दूषित पदार्थों को बाहर करने के लिए असंभव है, और कुछ लाल रक्त कोशिकाओं और सामयिक ट्यूबलर खंड संस्कृति में मौजूद हो जाएगा । हम इन छोटे दूषित अनुप्रयोगों के विशाल बहुमत के लिए एक समस्या होने की आशंका नहीं है । दूसरा, sieving प्रोटोकॉल चूहा गुर्दे, जिसमें glomeruli बहुत चूहों की तुलना में बड़ा कर रहे हैं के उपयोग पर निर्भर करता है । यदि माउस glomeruli की जरूरत है, एक तकनीक का उपयोग कर वाणिज्यिक चुंबकीय मोती (जैसे, Dynabeads)22प्रकाशित किया गया है । तीसरे, यह दिखाया गया है कि विशिष्ट mRNAs (plasminogen उत्प्रेरक अवरोधक-1 और कोलेजन मैं) अलग glomeruli में लगभग पूरी तरह से है बोमन कैप्सूल से नहीं बल्कि intraglomerular कोशिकाओं से प्राप्त23। यह अनुचित निष्कर्ष के लिए नेतृत्व अगर mRNA अलगाव इन glomeruli से प्रयास किया है सकता है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हमारे हाथ में glomeruli के बहुमत decapsulated है और इसलिए है बोमन कैप्सूल से महत्वपूर्ण योगदान की कमी चाहिए । चौथा, कोशिका मृत्यु संस्कृति की स्थिति के तहत अपेक्षाकृत जल्दी होते है शुरू होता है ।
हमने पाया है कि अपोप्तोटिक कार्यक्रम, के रूप में सट caspase-3 की उपस्थिति द्वारा सबूत, संस्कृति के 2 ज में शुरू सक्रिय था । यह है कि apoptosis, डीएनए विखंडन, TUNEL, और histologic विश्लेषण के द्वारा मूल्यांकन के रूप में दिखा पिछले रिपोर्टों के साथ सामांय समझौते में24अलगाव के बाद 1-2 ज के भीतर होने शुरू होता है । हालांकि, यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रारंभिक टिप्पणियों से पता चला है कि चयापचय गतिविधि पृथक छलनी glomeruli से पता लगाया जा सकता है जब कम 3 ज के लिए संस्कृति, इस timepoint16में काफी सेलुलर व्यवहार्यता का सुझाव । फिर भी, परिणामों के आधार पर, हमें विश्वास है कि यह सबसे अच्छा परिणाम के लिए इरादा प्रयोगों में अलग glomeruli तुरंत उपयोग करने के लिए विवेकपूर्ण होगा । हम अनुशंसा करते हैं कि सभी प्रयोगों ७२ ज के पहले किया जा के रूप में हमने देखा है कि पूरे glomerular संरचना कि timepoint से परे खराब करने के लिए शुरू होता है.
यह बहुत अधिक उपज प्राप्त करने के लिए आसान है जब 4-8 गुर्दे के साथ शुरू करने के रूप में केवल 2 का विरोध किया क्योंकि glomeruli की एक निश्चित संख्या विभिंन छलनी के पालन के कारण खो रहे हैं, लेकिन एक बार छलनी अधिक से लेपित है वहां कोई अतिरिक्त नुकसान है । एक ही कारण के लिए, यह BSA/पंजाबियों बफर में छलनी सोख महत्वपूर्ण है के रूप में उपयोग करने से पहले glomeruli अधिक एक सूखी चलनी का पालन करने की संभावना है, और छलनी के एक किनारे करने के लिए ऊतक जोखिम सीमा । हम एक उचित उपज प्राप्त करने के लिए कोई कम से 6 गुर्दे (3 चूहों) के साथ शुरू करने का सुझाव ।
कुछ जांचकर्ताओं पृथक glomeruli जो संस्कृति17के दौरान glomeruli से बाहर हो जाना करते है से प्राथमिक podocyte संस्कृतियों अलग है । हमने उल्लेख किया है कि कुछ अलग glomeruli संस्कृति डिश प्लास्टिक का पालन करेंगे और है कि कोशिकाओं को देर timepoints (अलगाव के बाद ७२ ज) में glomerular संरचना से बाहर प्रवास शुरू हो जाएगा । इन कक्षों का अध्ययन इस आइसोलेशन प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर है, और क्या इन कोशिकाओं podocytes हैं, पार्श्विका उपकला कोशिकाओं, या दोनों15,25के रूप में कुछ विवाद है. विशेष रूप से, Mundel एट अल, ने बताया है कि cobblestone कोशिकाओं को छलनी glomeruli से काटा को विशिष्ट संवर्धन26शर्तों के तहत परिपक्व podocytes में अंतर प्रेरित किया जा सकता है । सेल पहचान के बारे में भ्रम की कुछ है कि अलग glomeruli (बोमन के कैप्सूल जो पार्श्विका उपकला कोशिकाओं से आबाद है सहित) encapsulated रहे हैं या sieving प्रक्रिया में decapsulated पर निर्भर हो सकता है । हमारे हाथ में, १८०, ९० के अनुक्रमिक चलनी आकार का उपयोग कर, और ७५ µm glomeruli के बहुमत के लिए नेतृत्व decapsulated जा रहा है ।
proteinuric क्रोनिक गुर्दे की बीमारी के अधिकांश रूपों glomerular पारगम्यता में वृद्धि के कारण कर रहे हैं । कई लेखकों पूर्व vivo पारगम्यता प्रयोगों में अलग glomeruli का उपयोग किया है. एक विधि में, आसपास के मीडिया के आसमाटिक सामग्री बदलने के बाद glomerular मात्रा में परिवर्तन27पारगम्यता अनुमान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । हाल ही में, यह स्थापित किया गया था कि पृथक glomeruli से एक फ्लोरोसेंट जांच के रिसाव पारगम्यता को मापने के लिए quantified किया जा सकता है और glomerular रोग प्रयोगात्मक मॉडल28को उजागर कुतर में प्रदर्शन किया जा सकता है ।
हमने उल्लेख किया है कि उनि तैयारी की प्रक्रिया में, हम कई बार देख podocyte पैर तहखाने झिल्ली से लिफ्ट प्रक्रियाओं । हमें लगता है कि इस संस्कृति में हो रहा है और अधिक होने की संभावना है एक विरूपण साक्ष्य के दौरान उनि नमूना तैयारी है । विशेष रूप से, यहां तक कि जब यह होता है, यह स्पष्ट है कि क्या पैर प्रक्रियाओं देखो “सामांय” या effaced हैं ।
कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल एक विधि जिसके द्वारा एक चोट के जवाब में सुघड़ और सेलुलर परिवर्तन का मूल्यांकन कर सकते है प्रदान करता है । हमें आशा है कि यह पृथक podocyte संस्कृतियों के लिए एक साथी तकनीक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, खासकर जब extracellular मैट्रिक्स या अंय देशी सेल प्रकार के साथ बातचीत पर विचार किया जा रहा है । यह proteinuric सीकेडी की समझ बढ़ाने के लिए वादा है, जो इस दुर्बल रोग के लिए भविष्य चिकित्सकीय विकास करने की क्षमता में सुधार होगा रखती है ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन ग्रांट FTF १६९९००८६, NIH P30 DK079307, अमेरिकन सोसायटी ऑफ नेफ्रोलॉजी ट्विटर अवार्ड, पिट्सबर्ग के एक विश्वविद्यालय के चिकित्सा केंद्र प्रतियोगी चिकित्सा अनुसंधान निधि पुरस्कार, और पिट्सबर्ग के एक विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया फिजीशियन अकादमिक फाउंडेशन पुरस्कार । हम histologic विश्लेषण के लिए glomerular संरक्षण के लिए अपने तकनीकी सुझाव के लिए गेरार्ड Apodaca, धंयवाद मारा सुलिवान और मिंग के साथ सहायता के लिए सूर्य, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और Yingjian ली और Youhua लियू इस प्रोटोकॉल में अपने तकनीकी इनपुट के लिए । हम भी CD31 एंटीबॉडी के लिए सिंथिया सेंट Hilaire धंयवाद ।
Solutions, Chemicals, and Animals | |||
Sprague-Dawley Rats | Envigo | 207M | |
Bovine serum albumin | Fisher | BP1605100 | |
Hank's Balanced Salt Solution with Ca2+ and Mg2+ | Thermo | 14025092 | |
1x Phosphate Buffered Saline | VWR | 97063-660 | |
Protamine sulfate | MP Bio | ICN15197105 | |
Karnovsky's Fixative | |||
Gelatin | |||
Paraformaldehyde | EMD | EM-PX0055-3 | |
O.C.T. | Scigen | 23730571 | |
RIPA Buffer | |||
Halt Protease Inhibitors | Thermo | PI78442 | |
Nephrin Antibody | Fitzgerald | 2OR-NP002 | |
WT-1 Antibody | Abcam | ab89901-10ul | |
PDGFR-β Antibody | Cell Signaling | #3169S | |
CD31 Antibody | LSBio | LS-C348736 | |
Cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling | 9661S | |
Poly/Bed 812 (Luft) epoxy | Polysciences | 08792-1 | |
Equipment | |||
Carbon dioxide chamber | |||
Conical tubes, 15 mL | |||
Conical tubes, 50 mL | |||
Surgical scissors | |||
Surgical forceps | |||
Sterile gauze | |||
Petri dishes, 100 mm | |||
Scalpels | |||
Razor blades | |||
Sterile filter apparatus | |||
Sieve Pan | Alfa Aesar | AA39999ON | |
180um Sieve | Alfa Aesar | AA39996ON | |
90um Sieve | Alfa Aesar | AA39990ON | |
75um Sieve | Alfa Aesar | AA39991ON | |
10 mL syringes | |||
600 mL beakers | |||
Cell culture incubator | |||
Picofuge | |||
Vortex | |||
Tissue Homogenizers | Fisher Scientific | 50550226 | |
20 G needles | |||
Leica Reichart Ultracut | ultramicrotome |