De belangrijkste focus van dit protocol is efficiënt isoleren levensvatbare primaire glomeruli culturen met minimale contaminanten voor gebruik in een verscheidenheid van downstream toepassingen. De geïsoleerde glomeruli structurele relaties tussen component celtypes behouden en kunnen gekweekte ex vivo voor een korte tijd.
Behoud van de glomerulaire structuur en functie is cruciaal in de preventie van glomerulonephritis, een soort gekenmerkt door Proteïnurie die uiteindelijk tot chronische leiden kan nierziekte en einde-fase nierziekte. De glomerulus is een complex apparaat verantwoordelijk voor de filtratie van plasma uit het lichaam. In ziekte, structurele integriteit is verloren en zorgt voor de abnormale lekkage van plasma inhoud in de urine. Een methode om te isoleren en bestuderen van de glomeruli in cultuur is essentieel voor de studie van deze ziekten. In dit protocol wordt een efficiënte methode voor het ophalen van intact glomeruli van volwassen ratten nieren terwijl het behoud van de structurele en morfologische kenmerken beschreven. Dit proces is geschikt voor het genereren van hoge rendementen van de glomeruli per nier met minimale besmetting van andere segmenten van het Nefron. Met deze glomeruli, kunnen letsel voorwaarden worden geïmiteerd door hen met een verscheidenheid aan chemische toxinen, met inbegrip van tijdje sulfaat, welke oorzaken proces geweest en Proteïnurie in diermodellen voet aan het broeden. Mate van letsel kan worden beoordeeld met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie, immunofluorescentie kleuring en westelijke bevlekken. Nephrin en Wilms Tumor 1 (WT1) niveaus kunnen ook van deze culturen worden beoordeeld. Vanwege het gemak en de flexibiliteit van dit protocol, kunnen het geïsoleerde glomeruli zoals beschreven of op een manier die het best past bij de behoeften van de onderzoeker te helpen betere studie glomerulaire gezondheid en structuur in zieke Staten worden gebruikt.
De glomerulus is een zeer gespecialiseerde plukje haarvaten verantwoordelijk voor de filtratie van plasma circuleren. Het vormt het begin van het Nefron, oftewel de basis functionele eenheid van de nier. Glomerulaire functie is gedefinieerd door een uniek fenêtré capillaire endotheel, het middenrif gleuf van podocytes en een tussenliggende kelder-membraan. Deze lagen vormen een semipermeable barrière te maken voor de selectieve uitscheiding van stoffen in het filtraat. Water, ionen en andere kleine moleculen in het algemeen passeren, terwijl grotere moleculen worden bewaard in het plasma. Podocytes zijn gespecialiseerde epitheliale cellen die worden verspreid via het membraan van de kelder, de haarvaten rond met cytoplasmatische projecties bekend als voet processen. De voet van de aangrenzende podocytes interdigitate verwerkt en worden doorkruist door de gleuf pessarium bestaat uit eiwitten zoals nephrin, podocin, P-cadherine en ZO-11. Doorsnede, deze voet processen zijn gelijkmatig gerangschikt over het membraan van de kelder. In zieke glomeruli worden de voet-processen Grove abnormale of “gewist,” leiden tot abnormale lekken van plasma inhoud in het filtraat. Als zodanig, is glomerulaire schade in het algemeen gekenmerkt door de aanwezigheid van abnormaal grote hoeveelheden eiwitten (bijvoorbeeld Proteïnurie) en/of rode bloedcellen (b.v., hematurie) in de urine. Bovendien verliezen gewonde podocytes expressie van nephrin, alsmede de regelgever Wilms Tumor 1 (WT1), een belangrijke eiwit verantwoordelijk voor onderhoud van differentiatie2,3. De glomeruli zijn een primaire doelstelling van schade in diabetische nefropathie en andere glomerulonephritides zoals minimale verandering ziekte, membraanachtig nefropathie en focale segmentale glomerulosclerosis. Deze ziekten zijn belangrijke oorzaken van progressief nierfalen en de ontwikkeling van de einde-fase nierziekte, een aandoening waarbij overleven op dialyse of niertransplantatie berust. Daarom is het belangrijk om te bestuderen van de glomeruli om chronische nier ziekte (CKD) pathologie beter te begrijpen.
Een celcultuur is cruciaal voor de glomerulaire biologie studeren. Vanwege haar centrale rol in het genereren van het middenrif gleuf, alsmede het bestaan van specifieke proteinuric ziekten als gevolg van de gleuf membraan eiwit mutaties, heeft veel onderzoek begrijpelijkerwijs gebruikt de podocyte los. Dit heeft geleid tot de generatie van primaire podocyte cellijnen in vitrogebruiken. Deze cellen kunnen worden gekweekt onder allerlei omstandigheden en zelfs kunnen worden gekweekt op poreuze ondergronden te beoordelen permeabiliteit4. Echter, het isolement van delende cellen vaak selecteert u dedifferentiated cellen die sommige van hun podocyte markers hebben verloren. Dit heeft geleid tot de generatie van voorwaardelijk vereeuwigd podocytes afgeleid van een stam van de transgene muis een temperatuurgevoelige mutant van het SV40 grote T gen (bijvoorbeeld immortomouse), die kan worden geteeld in cultuur maar ook uitvoering gedifferentieerd om uit te drukken een volledige reeks van podocyte markeringen5. Deze methoden van primaire cultuur zijn cruciaal in begrip podocyte biologie4,6,7.
Niettemin, culturen met eencellige soorten ontbreken de intercellulaire relaties die zich in vivo evenals de ondersteunende structuur en matrices voordoen, en monolayers van deze cellen doen niet per se het driedimensionele recapituleren architectuur van de glomeruli. De vereeuwigd podocytes kunnen ook worden omslachtig en uitdagende cultuur8, en bezit van ofwel de immortomouse of een startende hoeveelheid cellen uit gevestigde onderzoekers aan de slag. Verder is de glomerulus bestaat uit niet alleen podocytes, maar ook capillaire endotheliale cellen en het membraan van de kelder, evenals mesangial cellen, die ondersteuning voor de structuur bieden. Daarom is het nuttig aan een ex vivo benadering beschikbaar aan alle onderzoekers voor de studie van intact glomeruli die behouden hun inheemse architectuur evenals alle cellen vormen de normale glomerulus.
In 1958 beschreef Cook en Pickering de eerste isolatie van de glomeruli van de nier konijn. Na opmerkingen dat vet emboli werd ingediend in de glomeruli, ze gepostuleerd dat deeltjes van dezelfde grootte kunnen worden gebruikt om specifiek deze structuren te isoleren. Inderdaad, de infusie van ijzeroxide deeltjes in de nier die leidde tot de vangst van deze deeltjes in de glomeruli. Na mechanische dissociatie en zeven van de nier, zou de glomeruli geïsoleerde intact en heeft daar met zuiverheid door het gebruik van magnetische scheiding9. In 1971, Misra heeft aangetoond dat de ijzeroxide infusies kon worden weggelaten, en glomerulaire isolatie bereikt met zeven van gehakt mens, hond, konijn of rat nier weefsel10. Deze techniek is gewijzigd sinds dan afhankelijk van het doel van de onderzoekers, maar in wezen heeft geresulteerd in gezuiverde voorbereidingen die verder kan worden onderzocht of waaruit zou primaire celculturen gevestigde11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17.
Hier beschrijven we een protocol voor de isolatie van intact levensvatbare glomeruli van de nier van de rat. Het gehele protocol duurt slechts een paar uur. Hoewel ze niet verspreiden, kunnen experimentele plannen van elke grootte worden ondersteund door het simpelweg toename van de nieren als grondstof. Hoewel er gepubliceerde protocollen voor de scheiding van de magnetische parel van de glomeruli, ze vereisen een intraveneuze injectie van parels zijn duurder en biologie kunnen veranderen aangezien de kralen ofwel door de glomeruli in cultuur behouden zijn of glomerulaire vereisen” Lysing”en verwijdering door centrifugeren19. Vergeleken met de glomeruli van de muis, maakt de grotere omvang van de glomeruli van de rat (bijna 100 µm in twee maanden oude ratten18) het veel gemakkelijker om ze te scheiden van andere structuren van de nier met behulp van een eenvoudige zeven techniek.
Als bewijs van hun nut, hebben we de glomeruli om aan te tonen van de verschillende soorten cellen gekenmerkt. Ze kunnen ook worden blootgesteld aan agentia bekend te verwonden glomeruli in vivo, en wij laten zien dat de nadelige gevolgen van tijdje sulfaat (PS) op deze culturen. PS is een polycation dat de anionogene bezienswaardigheden langs de glomerulaire capillaire muur20 neutraliseert. Deze neutralisatie heeft een dramatisch effect op de barrière van de glomerulaire filtratie en daarom verhoogt Proteïnurie en voet proces geweest. Deze glomeruli kunnen worden beoordeeld met immunoblots voor belangrijke eiwitten zoals nephrin en WT1 om te beoordelen van de algehele gezondheid. Bovendien kan hun structuur worden geëvalueerd met licht, immunofluorescentie, en elektronenmicroscopie.
Globaal, is dit protocol is toegankelijk voor de meeste onderzoekers (hoeft alleen toegang tot de dieren en enkele eenvoudige apparatuur). Met de morfologische kenmerken links onbeschadigd, de onderzoeker vermag de glomeruli analyseren en zien hoe andere belangrijke celtypes en matrix behoud in de glomeruli invloed op functie en ziekte progressie, een tekortkoming van podocyte culturen.
Dit is een efficiënte methode voor het herstellen van de glomeruli van rat nier met behulp van goedkope, herbruikbare apparatuur met een eenvoudig protocol. Zoals bij alle ingrepen, zijn er beperkingen aan het nut ervan. Ten eerste, hoewel we > 95% zuiverheid krijgen, vanwege de zeven aard van het protocol en de grondstof is het onmogelijk om uit te sluiten alle verontreinigingen, en een paar rode bloedcellen en het occasionele tubulaire segment zullen aanwezig zijn in de cultuur. Wij verwachten niet dat deze kleine verontreinigingen worden een probleem voor de overgrote meerderheid van de aanvragen. Ten tweede het zeven protocol is gebaseerd op het gebruik van rat nieren, waarin de glomeruli veel groter dan bij muizen zijn. Als muis glomeruli nodig zijn, is een techniek die gebruik van commerciële magnetische kralen (bvDynabeads) gepubliceerd22geweest. Ten derde is gebleken dat specifieke mRNAs (plasminogen activator inhibitor-1 en collageen ik) in geïsoleerde glomeruli ontlenen bijna volledig Bowman van capsule in plaats van intraglomerular cellen23. Dit kan leiden tot verkeerde conclusies als mRNA geïsoleerd uit deze glomeruli wordt geprobeerd. Opgemerkt moet worden dat de meerderheid van de glomeruli in onze handen gepelde zijn en moet daarom gebrek aan significante bijdragen van Bowman capsules. Ten vierde, begint celdood optreden relatief snel onder de kweekomstandigheden.
We vonden dat de apoptotic programma, zoals blijkt uit de vormgeving van gekloofd caspase-3, was geactiveerd vanaf 2U voor cultuur. Dit is in het algemeen akkoord met vorige verslagen waaruit blijkt dat apoptosis, zoals beoordeeld door DNA fragmentatie TUNEL en histologische analyse, begint te gebeuren binnen 1-2 uur na isolatie24. Echter moet ook opgemerkt worden dat de vroege opmerkingen toonde dat metabole activiteit van geïsoleerde gezeefde glomeruli wanneer gekweekt voor ten minste 3 uur, suggereren aanzienlijke cellulaire levensvatbaarheid op deze timepoint16kon worden opgespoord. Wij vinden echter gebaseerd op de resultaten, dat zou het verstandig om gebruik te maken van geïsoleerde glomeruli onmiddellijk in beoogde experimenten voor de beste resultaten. Het is raadzaam dat alle experimenten worden uitgevoerd voordat 72 h, zoals we hebben gezien dat de gehele structuur van de glomerulaire begint te verslechteren buiten dat timepoint.
Het is veel gemakkelijker te verkrijgen van hogere opbrengsten bij het starten met 4-8 nieren in tegenstelling tot slechts 2 omdat een aantal van de glomeruli verloren als gevolg van naleving van de verschillende zeven, maar zodra de zeven zijn maximaal gecoat er geen extra verlies is. Om dezelfde reden is het belangrijk om de zeven weken in de BSA/PBS buffer vóór gebruik zoals glomeruli zijn meer kans te houden op een droge zeef, en beperken van weefsel blootstelling aan een van de randen van de zeef. Wij stellen voor beginnend met maar liefst 6 nieren (3 ratten) te verkrijgen van een redelijke opbrengst.
Sommige onderzoekers hebben de primaire podocyte culturen van geïsoleerde glomeruli die neigen te groeien van de glomeruli tijdens cultuur17geïsoleerd. Wij hebben gemerkt dat sommige geïsoleerde glomeruli zich aan de cultuur schotel plastic houden zal en dat cellen beginnen zal te migreren uit de glomerulaire structuur laat timepoints (72 uur na de isolatie). De studie van deze cellen valt buiten het bestek van dit protocol van de isolatie, en er is enige controverse over de vraag of deze cellen podocytes, pariëtale epitheliale cellen of beide15,25. Met name Mundel et al., hebben gemeld dat geplaveide cellen geoogst van gezeefde glomeruli kunnen worden opgewekt om te differentiëren in volwassen podocytes onder specifieke voorwaarden26kweken. Sommige van de verwarring met betrekking tot de identiteit van de cel kan afhangen van of de geïsoleerde glomeruli worden ingekapseld (met inbegrip van Bowman van capsule die wordt bevolkt door pariëtale epitheliale cellen) of Ontschaalde in de zeven procedure. In onze handen, met behulp van opeenvolgende zeef maten van 180, 90 en 75 µm geleid tot de meerderheid van de glomeruli wordt gepelde.
De meeste vormen van proteinuric chronische nierziekten zijn als gevolg van de stijgingen van de glomerulaire permeabiliteit. Verschillende auteurs hebben geïsoleerd glomeruli in ex vivo permeabiliteit experimenten gebruikt. In één methode, werd de verandering in de glomerulaire volume na het veranderen van de osmotische inhoud van de omliggende media gebruikt om te schatten permeabiliteit27. Onlangs, werd vastgesteld dat lekkage van een fluorescente sonde van geïsoleerde glomeruli kon voor het meten van de permeabiliteit worden gekwantificeerd en in knaagdieren blootgesteld aan glomerulaire ziekte experimentele modellen28kon worden uitgevoerd.
We hebben gemerkt dat in het voorbereidingsproces van TEM, soms zien we de podocyte voet processen lift uit de kelder-membraan. Wij denken niet dat dit gebeurt in de cultuur en is meer waarschijnlijk een artefact tijdens de bereiding van de monsters van de TEM. Met name, zelfs wanneer dit gebeurt, is het duidelijk de voet processen “normaal” kijken of zijn gewist.
Globaal, is dit protocol biedt een methode waarmee een morfologische en cellulaire veranderingen in reactie op schade kan evalueren. Wij verwachten dat het kan worden gebruikt als een metgezel techniek om geïsoleerde podocyte culturen, met name bij interacties met de extracellulaire matrix of andere inheemse celtypes worden overwogen. Het houdt belofte voor het vergroten van kennis van proteinuric CKD, die het vermogen om toekomstige therapeutics voor deze slopende ziekte zou verbeteren.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de American Heart Association grant FTF 16990086, NIH P30 DK079307, American Society of Nefrologie Gottschalk Award, een universiteit van Pittsburgh Medical Center concurrerende medische Research Fund Award en een universiteit van Pittsburgh Artsen academische Foundation Award. Wij danken Gerard Apodaca voor zijn technische suggesties voor glomerulaire behoud voor histologische analyse, Mara Sullivan en Ming zon voor hulp bij elektronenmicroscopie, en Yingjian Li en Youhua Liu voor hun technische inbreng in dit protocol. Wij danken ook Cynthia St. Hilaire voor het antilichaam CD31.
Solutions, Chemicals, and Animals | |||
Sprague-Dawley Rats | Envigo | 207M | |
Bovine serum albumin | Fisher | BP1605100 | |
Hank's Balanced Salt Solution with Ca2+ and Mg2+ | Thermo | 14025092 | |
1x Phosphate Buffered Saline | VWR | 97063-660 | |
Protamine sulfate | MP Bio | ICN15197105 | |
Karnovsky's Fixative | |||
Gelatin | |||
Paraformaldehyde | EMD | EM-PX0055-3 | |
O.C.T. | Scigen | 23730571 | |
RIPA Buffer | |||
Halt Protease Inhibitors | Thermo | PI78442 | |
Nephrin Antibody | Fitzgerald | 2OR-NP002 | |
WT-1 Antibody | Abcam | ab89901-10ul | |
PDGFR-β Antibody | Cell Signaling | #3169S | |
CD31 Antibody | LSBio | LS-C348736 | |
Cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling | 9661S | |
Poly/Bed 812 (Luft) epoxy | Polysciences | 08792-1 | |
Equipment | |||
Carbon dioxide chamber | |||
Conical tubes, 15 mL | |||
Conical tubes, 50 mL | |||
Surgical scissors | |||
Surgical forceps | |||
Sterile gauze | |||
Petri dishes, 100 mm | |||
Scalpels | |||
Razor blades | |||
Sterile filter apparatus | |||
Sieve Pan | Alfa Aesar | AA39999ON | |
180um Sieve | Alfa Aesar | AA39996ON | |
90um Sieve | Alfa Aesar | AA39990ON | |
75um Sieve | Alfa Aesar | AA39991ON | |
10 mL syringes | |||
600 mL beakers | |||
Cell culture incubator | |||
Picofuge | |||
Vortex | |||
Tissue Homogenizers | Fisher Scientific | 50550226 | |
20 G needles | |||
Leica Reichart Ultracut | ultramicrotome |