Hovedfokus i denne protokol er effektivt isolere levedygtige primære glomeruli kulturer med minimal forurenende stoffer til brug i en lang række downstream applikationer. Isolerede glomeruli bevarer strukturelle relationer mellem komponent celletyper og kan være kulturperler ex vivo for kort tid.
Bevarelse af glomerulær struktur og funktion er omdrejningspunktet for en kategori af nyresygdom karakteriseret ved proteinuri, som kan i sidste ende føre til kronisk og slutstadiet nyresygdom, forebyggelse af glomerulonephritis. Glomerulus er en kompleks apparater ansvarlig for filtrering af plasma fra kroppen. I sygdom, strukturelle integritet er tabt og giver mulighed for unormal udsivning af plasma indholdet i urinen. En metode til at isolere og undersøge glomeruli i kultur er afgørende for studiet af disse sygdomme. I denne protokol, er en effektiv metode til hentning af intakt glomeruli fra voksen rotte nyrerne samtidig bevare strukturelle og morfologiske karakteristika beskrevet. Denne proces er i stand til at generere høje udbytter af glomeruli pr. nyre med minimal forurening fra andre segmenter, nephron. Med disse glomeruli kan skade betingelser efterlignes af inkubere dem med en bred vifte af kemiske giftstoffer, herunder protamine-sulfat, der forårsager foden proces effacement og proteinuri i dyremodeller. Graden af skade kan vurderes ved hjælp af transmissions elektronmikroskopi, immunofluorescens farvning og western blotting. Nephrin og Wilms Tumor 1 (WT1) niveauer kan også vurderes ud fra disse kulturer. På grund af den lethed og fleksibilitet i denne protokol, kan de isolerede glomeruli udnyttes som beskrevet eller på en måde, der bedst passer til behovene hos forskeren til at hjælpe bedre undersøgelse glomerulær sundhed og struktur i syge stater.
Glomerulus er en højt specialiseret TOT af kapillærer ansvarlig for filtrering af cirkulerende plasma. Det danner begyndelsen af nephron, som er den grundlæggende funktionelle enhed i nyrerne. Glomerulær funktion er defineret af et entydigt fenestrated kapillære endothelium, slids mellemgulvet af podocytes og en mellemliggende basalmembranen. Disse lag danner en semipermeable barriere at muliggør selektiv udskillelsen af stoffer til filtratet. Vand, ioner og andre små molekyler generelt passerer igennem, mens større molekyler er bevaret i plasma. Podocytes er specialiserede epitelceller, der breder sig over basalmembranen, omgivende kapillærer med cytoplasmatisk fremskrivninger kendt som foden processer. Foden processer af tilstødende podocytes interdigitate og er gennemskåret af slids membraner består af proteiner som nephrin, podocin, P-cadherin og ZO-11. I tværsnit, disse mund processer er jævnt arrangeret over basalmembranen. I syge glomeruli bliver foden processer groft unormal eller “udviskes,” fører til unormal lækage af plasma indholdet i filtratet. Som sådan er glomerulær skade generelt kendetegnet ved tilstedeværelsen af unormalt store mængder af protein (fx proteinuri) og/eller røde blodlegemer (fx hæmaturi) i urinen. Tilskadekomne podocytes mister desuden udtryk nephrin såvel som dens regulator Wilms Tumor 1 (WT1), en vigtig protein ansvarlig for vedligeholdelse af differentiering2,3. Glomeruli er et primært mål for skader i diabetisk nefropati og andre glomerulonephritides som minimal ændring sygdom, hindeagtige nefropati og fokale segmental glomerulosclerosis. Disse sygdomme er store årsager til gradvis nyresvigt og udviklingen af slutstadiet nyresygdom, en tilstand, hvor overlevelse er afhængig af dialyse eller renal transplantation. Det er derfor vigtigt at studere glomeruli for bedre at forstå kronisk nyre sygdom (Cementovnstøv) patologi.
En celle kultur system er afgørende for at studere glomerulær biologi. På grund af sin centrale rolle i at generere slids mellemgulvet, samt eksistensen af specifikke proteinuric sygdomme som følge af slids mellemgulvet protein mutationer, har megen forskning forståeligt nok udnyttet podocyte i isolation. Dette har ført til generation af primær podocyte cellelinjer til at udnytte i vitro. Disse celler kan være kulturperler under en række betingelser og kan endda dyrkes på gennemtrængelig understøtter at vurdere permeabilitet4. Men isolationen af prolifererende celler ofte vælger dedifferentiated celler, der har mistet noget af deres podocyte markører. Dette har ført til generation af betinget udødeliggjort podocytes stammer fra en Transgene mus stamme bærer et temperatur-følsomme mutant af SV40 store T genet (f.eks. immortomouse), der kunne dyrkes i kultur, men også være differentieret for at udtrykke en komplet vifte af podocyte markører5. Disse metoder til primære kultur har været afgørende i forståelsen podocyte biologi4,6,7.
Ikke desto mindre kulturer der indeholder enkelt celletyper mangler de intercellulære relationer, der opstår i vivo samt den støttestruktur og matricer, og encellelag af disse celler nødvendigvis sammenfatte ikke det tredimensionale arkitektur af glomeruli. Udødeliggjort podocytes kan også være besværlige og udfordrende at kultur8, og kræver besiddelse af enten en immortomouse eller en start alikvot af celler fra etableret efterforskerne at komme i gang. Yderligere, glomerulus består af ikke blot podocytes, men også kapillære endothelceller den basalmembranen, samt og mesangial celler, som yder støtte til struktur. Det er derfor nyttigt at udvikle en ex vivo tilgang anvendelig til alle efterforskere for studiet af intakt glomeruli, der bevarer deres oprindelige arkitektur samt alle de celler, der udgør den normale glomerulus.
I 1958 beskrevet Cook og Pickering den første isolation af glomeruli fra kanin nyre. Efter iagttagelser at fedt emboli blev indgivet i glomeruli, postuleret de, at partikler af samme størrelse kan bruges til at specifikt isolere disse strukturer. Faktisk, infusion af jernoxid partikler ind i nyren førte til fangst af disse partikler i glomeruli. Efter mekanisk dissociation og sigtning af nyrerne, kunne glomeruli være isolerede intakt og med renhed ved hjælp af magnetisk separation9. I 1971 viste Misra, at jernoxid infusioner kan udelades, og glomerulær isolation opnåede med sigtning af hakket human, hund, kanin eller rotte nyre væv10. Denne teknik er blevet ændret siden derefter afhængigt af målet for efterforskerne men har hovedsagelig resulterede i renset præparater der kunne undersøges yderligere eller hvorfra primære cellekulturer kunne være etableret11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17.
Her beskriver vi en protokol til isolering af intakt levedygtige glomeruli fra rotte nyre. Hele protokollen tager kun et par timer. Selv om de ikke formere sig, kan eksperimentelle planer af enhver størrelse understøttes ved blot at øge antallet af nyrerne som udgangspunkt materiale. Mens der er publicerede protokoller for magnetisk bead adskillelse af glomeruli, de kræver en intravenøs injektion af perler, er dyrere, og kan ændre biologi da perlerne bevares enten ved glomeruli i kultur eller kræve glomerulær” Lysing”og fjernelse af centrifugering19. Sammenlignet med musen glomeruli, gør den større størrelse af rotte glomeruli (næsten 100 µm i to måneder gamle rotter18) det meget lettere at adskille dem fra andre nyre strukturer ved hjælp af en simpel sieving teknik.
Som bevis for deres nytte, har vi kendetegnet glomeruli for at demonstrere de forskellige celletyper. De kan også blive udsat for agenser, der vides at skade glomeruli in vivo og vi påvise de negative virkninger af protamine sulfat (PS) på disse kulturer. PS er en polycation, der neutraliserer de anioniske steder langs glomerulær kapillar væggen20. Denne neutralisering har en dramatisk effekt på glomerulær filtration barriere og derfor øger proteinuri og mund proces effacement. Disse glomeruli kan vurderes med immunoblots for vigtige proteiner som nephrin og WT1 at vurdere generelle sundhed. Desuden kan deres struktur evalueres med lys, immunofluorescens og elektronmikroskopi.
Samlet set er denne protokol tilgængelig for de fleste efterforskere (man behøver blot adgang til dyrene og nogle enkle udstyr). Med morfologiske træk tilbage ubeskadiget, forskeren er i stand til at analysere glomeruli og se hvordan andre vigtige celletyper og matrix bevarelse i glomeruli påvirke funktion og sygdom progression, en mangel ved podocyte kulturer.
Dette er en effektiv metode til at inddrive glomeruli fra rotte nyre bruger billig, genanvendelige udstyr med en enkel protokol. Som med alle procedurer, er der begrænsninger for sin nytte. Først, selv om vi får > 95% renhed, på grund af sieving arten af protokollen og råvaren er det umuligt at udelukke alle forurenende stoffer, og et par røde blodlegemer og den lejlighedsvise rørformede segment vil være til stede i kulturen. Vi forventer ikke disse små forurenende stoffer for at være et problem for det store flertal af programmer. For det andet bygger den sieving protokol på brugen af rotte nyrer, hvor glomeruli er meget større end i mus. Hvis musen glomeruli er nødvendigt, har en teknik, ved hjælp af kommercielle magnetiske perler (f.eks.Dynabeads) været offentliggjort22. For det tredje har det vist at specifikke mRNAs (plasminogen aktivator inhibitor-1 og kollagen jeg) i isolerede glomeruli stammer næsten udelukkende fra Bowman’s kapsel i stedet for intraglomerular celler23. Dette kan føre til uhensigtsmæssige konklusioner, hvis mRNA isolation er forsøgt fra disse glomeruli. Det skal bemærkes, at størstedelen af glomeruli i vores hænder er decapsulated og bør derfor mangler væsentlige bidrag fra Bowmans kapsler. For det fjerde begynder celledød at optræde relativt hurtigt under kultur.
Vi fandt, at den apoptotiske program, som det fremgår af udseendet af kløvet caspase-3, blev aktiveret, startende fra 2 h af kultur. Generelt er aftale med tidligere betænkninger viser, at apoptose, som vurderet af DNA fragmentering, TUNEL og histologiske analyse, begynder at forekomme inden for 1-2 h efter isolation24. Det skal dog også bemærkes, at tidlige observationer viste, at metaboliske aktivitet kunne påvises fra isolerede sigtede glomeruli når kulturperler i mindst 3 timer, hvilket tyder på stor cellulære levedygtighed på dette tidspunkt16. Ikke desto mindre mener baseret på resultaterne, vi, at det ville være klogt at udnytte isolerede glomeruli straks i tilsigtede eksperimenter for de bedste resultater. Vi anbefaler, at alle eksperimenter skal udføres før 72 h, som vi har bemærket, at hele glomerulær struktur begynder at forringes efter dette tidspunkt.
Det er meget nemmere at opnå højere udbytter, når du starter med 4-8 nyrerne i stedet for kun 2, fordi en række glomeruli er tabt på grund af overholdelse af de forskellige sigter, men når sigterne belægges maksimalt er der ingen yderligere tab. Af samme grund er det vigtigt at suge sigterne i BSA/PBS buffer forudgående bruge som glomeruli er mere tilbøjelige til at overholde en tør si, og at begrænse væv eksponering til kanten af sien. Vi foreslår, begyndende med ikke færre end 6 nyrerne (3 rotter) at få et fornuftigt udbytte.
Nogle efterforskere har isoleret primære podocyte kulturer fra isolerede glomeruli, som har tendens til at vokse ud af glomeruli under kultur17. Vi har bemærket at nogle isolerede glomeruli vil overholde kultur parabol plast og at celler vil begynde at migrere ud af glomerulær struktur på sene timepoints (72 h efter isolation). Studiet af disse celler er uden for rammerne af denne isolation protokol, og der er en vis uenighed om, hvorvidt disse celler er podocytes, parietal epitelceller eller begge15,25. Især, Mundel et al., har rapporteret at brostensbelagte celler høstet fra sigtede glomeruli kan foranlediges til at differentiere i modne podocytes under specifikke dyrkning betingelser26. Nogle forvirring om cellen identitet kan afhænge af om isolerede glomeruli er indkapslet (herunder Bowman’s kapsel, som er befolket af parietal epitelceller) eller decapsulated i den sieving procedure. I vores hænder, ved hjælp af sekventielle si størrelser af 180, 90 og 75 µm førte til størstedelen af glomeruli bliver decapsulated.
De fleste former for proteinuric kronisk nyresygdom er som følge af stigninger i glomerulær permeabilitet. Flere forfattere har udnyttet isolerede glomeruli i ex vivo permeabilitet eksperimenter. I én metode, blev ændring i glomerulær volumen efter at ændre den osmotiske indhold af de omkringliggende medier brugt til at estimere permeabilitet27. For nylig, blev det konstateret, lækage af en fluorescerende sonde fra isolerede glomeruli kunne kvantificeres for at måle permeabilitet og kunne udføres i gnavere udsat for glomerulær sygdom eksperimentelle modeller28.
Vi har bemærket, at i forberedelsesprocessen TEM vi undertiden Se podocyte fod processer lift off basalmembranen. Vi mener ikke, dette sker i kulturen og er mere sandsynligt en artefakt under TEM prøveforberedelse. Navnlig, selv når det sker, er det klart, om foden processer ser “normal” eller er udviskes.
Samlet set giver denne protokol en metode, hvormed man kan evaluere morfologiske og cellulære ændringer som reaktion på skade. Vi forventer, at det kan bruges som en følgesvend teknik til isolerede podocyte kulturer, især når interaktioner med ekstracellulære matrix eller andre indfødte celletyper er under overvejelse. Det holder løftet for at øge forståelsen af proteinuric Cementovnstøv, som ville forbedre evnen til at udvikle fremtidige therapeutics for denne invaliderende sygdom.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af American Heart Association grant FTF 16990086, NIH P30 DK079307, American Society of nefrologi Gottschalk Award, en University of Pittsburgh Medical Center konkurrencedygtige medicinsk forskning fond Award og en University of Pittsburgh Læger akademiske Foundation Award. Vi takker Gerard Apodaca for hans tekniske forslag til glomerulær bevarelse for histologiske analyse, Mara Sullivan og Ming solen for bistand med elektronmikroskopi, og Yingjian Li og Youhua Liu for deres tekniske input i denne protokol. Vi takker også Cynthia St. Hilaire for CD31 antistof.
Solutions, Chemicals, and Animals | |||
Sprague-Dawley Rats | Envigo | 207M | |
Bovine serum albumin | Fisher | BP1605100 | |
Hank's Balanced Salt Solution with Ca2+ and Mg2+ | Thermo | 14025092 | |
1x Phosphate Buffered Saline | VWR | 97063-660 | |
Protamine sulfate | MP Bio | ICN15197105 | |
Karnovsky's Fixative | |||
Gelatin | |||
Paraformaldehyde | EMD | EM-PX0055-3 | |
O.C.T. | Scigen | 23730571 | |
RIPA Buffer | |||
Halt Protease Inhibitors | Thermo | PI78442 | |
Nephrin Antibody | Fitzgerald | 2OR-NP002 | |
WT-1 Antibody | Abcam | ab89901-10ul | |
PDGFR-β Antibody | Cell Signaling | #3169S | |
CD31 Antibody | LSBio | LS-C348736 | |
Cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling | 9661S | |
Poly/Bed 812 (Luft) epoxy | Polysciences | 08792-1 | |
Equipment | |||
Carbon dioxide chamber | |||
Conical tubes, 15 mL | |||
Conical tubes, 50 mL | |||
Surgical scissors | |||
Surgical forceps | |||
Sterile gauze | |||
Petri dishes, 100 mm | |||
Scalpels | |||
Razor blades | |||
Sterile filter apparatus | |||
Sieve Pan | Alfa Aesar | AA39999ON | |
180um Sieve | Alfa Aesar | AA39996ON | |
90um Sieve | Alfa Aesar | AA39990ON | |
75um Sieve | Alfa Aesar | AA39991ON | |
10 mL syringes | |||
600 mL beakers | |||
Cell culture incubator | |||
Picofuge | |||
Vortex | |||
Tissue Homogenizers | Fisher Scientific | 50550226 | |
20 G needles | |||
Leica Reichart Ultracut | ultramicrotome |