PCR quantitative du bactériophage T7 de criblage
Summary
Reproductible, précise et temps efficace quantitative PCR (qPCR) décrit une méthode pour énumérer bactériophage T7 est ici. Le protocole décrit clairement la préparation d’ADN génomique de phage, préparation de réaction PCR, qPCR conditions cyclisme et analyse de données de qPCR.
Abstract
Ce protocole décrit l’utilisation de la PCR quantitative (qPCR) pour énumérer les phages T7 d’expériences de sélection phage (c’est-à-dire, « biopanning »). qPCR est une approche axée sur la fluorescence pour quantifier l’ADN, et ici, il est adapté pour quantifier les génomes phagiques comme une approximation des particules phagiques. Dans le présent protocole, un procédé de préparation d’ADN de phage facile est décrite à l’aide de chauffage haute température sans purification d’ADN supplémentaire. La méthode n’a besoin que de petites quantités de phages traité thermiquement et de petits volumes de la réaction de qPCR. qPCR est haut débit et rapide, capable de traiter et d’obtenir des données d’une plaque à 96 puits de réactions en 2 à 4 h. par rapport aux autres approches d’énumération phage, qPCR soit le plus court possible. Ici, qPCR est utilisée pour énumérer les phages T7 identifiés de criblage contre modèle in vitro de mucus comme la fibrose kystique. La méthode de qPCR peut être étendue pour quantifier les phages T7 d’autres expériences, y compris d’autres types de protéines (p. ex.., dépistage de phage immobilisé la liaison aux protéines, in vivo ) et d’autres sources (par exemple, les systèmes de l’eau ou des liquides organiques). En résumé, ce protocole peut être modifié afin de quantifier des virus à ADN-encapsulé.
Introduction
Technologie d’affichage bactériophage (phage), mis au point par George Smith en 1985, est une approche puissante et à haut débit afin d’identifier des ligands peptidiques ou de protéines contre des cibles ou des récepteurs de la membrane cellulaire, les antigènes de la, les organites cellulaires ou spécifiques organes et tissus dans les dernières deux décennies1,2. Ici, les librairies aléatoires des polypeptides ou des anticorps de la seule chaîne sont affichées sur les protéines de manteau de phages (typiquement M13 ou T7) et des ligands spécifiques peuvent être identifiés de panoramique contre les protéines immobilisées in vitro ou in vivo systèmes biologiques à travers un processus itératif de sélection. Puis, les ligands peuvent être couplés avec des agents d’imagerie ou thérapeutiques pour le diagnostic et le traitement des maladies3,4. Il est essentiel d’énumérer avec précision les phages pendant plusieurs étapes de protéines : (1) pour quantifier les phages qui se lient au substrat et (2) pour quantifier les phages pour déterminer s’il y a enrichissement avec chaque tour de sélection (enrichissement du phage indique biopanned affinité du phage pour la cible). L’étalon-or actuel pour la quantification, essai de plaque double-couche, présente plusieurs défis ; C’est fastidieux, lourd et potentiellement inexacts pour un grand nombre d’échantillons. Par conséquent, notre groupe a développé une méthode de réaction en chaîne (qPCR) de polymérase quantitative sensible, reproductible, précises et économes en temps pour énumérer des particules de protéines5bactériophages M13 et T7.
qPCR est une méthode attrayante et faisable de quantifier avec précision les phages T7 et M13. Étant donné que chaque particule individuelle phage ne peut contenir qu’une seule copie de l’ADN génomique (dsDNA ou ADN simple brin), un génome phagique équivaut à une particule de phage ; en quantifiant le nombre de génomes de phage, il est possible de quantifier le nombre de phages. Au cours de qPCR, journaliste fluorescent colorants lient l’ADN génomique de phage non spécifique ou plus précisément par les amorces spécifiques de séquence au cours de l’amplification par PCR et la fluorescence signal augmente avec chaque tour d’amplification. Lorsque le signal de fluorescence atteint le seuil, ronde/cycle d’amplification est remarqué que le cycle seuil (Ct). Les concentrations connues du phage référence ADN sont tracées contre leurs valeurs de Ct pour tracer une courbe d’étalonnage. À l’aide de la courbe d’étalonnage avec les valeurs de Ct d’échantillons d’ADN, les concentrations de phages peuvent être interpolées.
Alors que de nombreuses stratégies ont été développées précédemment et largement utilisés pour quantifier les phages de criblage, chacun d’eux a des défis particuliers. Méthode la plus populaire et traditionnelle est double couche plaque de dosage. Ici, les hôtes de bactéries sont infectés par des phages préparés à des dilutions successives, sont cultivées sur un substrat solide agar et sont recouvertes d’agar ; les phages sont énumérés avec le nombre de plaques formées (i.e., unités formant des plaques ou pfu) sur la gélose. Essai de plaque est sensible mais fastidieux, chronophage et imprécise, surtout pour les nombreux échantillons et avec des concentrations élevées de5. En outre, les dosages immuno-enzymatiques (ELISA) ont été adaptés pour énumérer les M13 et T7 phage particules6,7,8. Ici, les phages à différentes dilutions sont liés et capturé sur un substrat solide (c.-à-d. une microplaque), hybridés avec des anticorps spécifiques phage et détectés en utilisant des reporters (p. ex., enzyme sensible substrats chromogènes, fluorophores) à déterminer le nombre de particules phagiques présents. Les afficheurs (p. ex., fluorescence, absorbance) des échantillons peuvent être utilisés pour quantifier les concentrations inconnues contre normes phage à des concentrations connues. Différents tests ELISA axée sur les phages ont été développées, mais ils ont limites potentielles. Un groupe a élaboré un sandwich ELISA, sur papier, avec une gamme de quantification qui a duré sept ordres de grandeur (2-10 109 UFP/mL) ; Cependant, cette méthode requise plusieurs étapes du revêtement de l’anticorps et a pris pour une journée entière pour le dosage de8. Notre groupe a également mis au point une méthode ELISA pour quantifier les particules phagiques M13 mais avait une portée de détection moins sensible de 106 à 1011 UFP/mL5. Lanthanide commutable fluorescence sondes ont été développés pour énumérer des M13 et données de quantification peuvent être obtenues dans les 20 min ; Toutefois, ce test a une étroite plage dynamique de 109 1012 UFP/mL9. Un groupe utilisé microscopie à force atomique pour énumérer les particules phagiques M13 en solution, mais cela requiert la microscopie électronique avancée et ne fonctionnait que dans une fourchette étroite de concentrations10. Une autre étude utilisé monodispersés émulsions pour piéger les phages de journaliste M13 et T4 fluorescents et compter les phages par le nombre de gouttelettes fluorescents ; Cependant, cette approche présentait également une gamme étroite de quantification de 102 106 UFP/mL11. Tout en gouttelettes que numérique PCR a été utilisée pour quantifier les phages M13, cette approche ne peut pas faire la différence entre le nombre de particules infectieuses et non-infectieuses phage12.
Notre groupe a récemment mis au point des méthodes de qPCR pour énumérer des phages T7 et M13 identifiés de criblage contre un modèle de barrière hémato – encéphalique cellulaire à l’aide de deux journaliste fluorescents différents colorants5. Par rapport aux méthodes de quantification susmentionnés, les méthodes de qPCR, nous avons développé étaient haut débit et temps-efficace pour quantifier les nombreux échantillons et capable de différencier les phages infectieux et non infectieux à la DNase I avant le traitement de la échantillons de phages. Ce qui est important, cette approche peut reproductible et précisément quantifier des bactériophages M13 et T7 dans des échantillons de protéines. Pour guider les chercheurs débutants dans le domaine du phage qPCR, nous décrivons ici une méthode détaillée de qPCR pour énumérer des particules de phage T7 auprès d’une bibliothèque sont limitées cystéine (CX7C) batées contre une barrière de mucus in vitro la fibrose kystique (FK). De ce travail, qPCR méthode peut être étendue pour quantifier les particules phagiques depuis d’autres types de protéines et d’autres sources, y compris l’eau, le sol et les fluides de corps.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons développé des méthodes de qPCR pour quantifier le phage d’ADN génomique5, et ici nous avons décrit et adapté une méthode de qPCR pour énumérer les phages T7 sélectionnés contre une barrière de type CF glaire. Minimum d’informations pour connaître les instructions Publication de Quantitative Real-time PCR expériences (MIQE) ont été adaptés afin de développer et de valider la méthode de qPCR pour dénombrement des phages de T715. Le protocole…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par PhRMA subvention de la Fondation recherche Starter et le National Heart, Lung, and Blood Institute des National Institutes of Health octroyer sous attribution numéro R01HL138251.
Materials
| Materials and reagents | |||
| Primers for T7 genomic DNA | IDT | F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT |
|
| T7Select packaging control DNA | EMD Millipore | 69679-1UG | |
| MicroAmp optical 96-well reaction plate | ThermoFisher Scientific | N8010560 | |
| qPCR master mix–Power up SYBR Green master mix | Applied biosystems | A25742 | |
| MicroAmp optical adhesive film kit | ThermoFisher Scientific | 4313663 | |
| T7Select 415-1 Cloning Kit | EMD Millipore | 70015 | User protocols : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP |
| DNase I solution | ThermoFisher Scientific | 90083 | |
| 24-well transwell plate | Corning | 3472 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled H2O | Invitrogen | 10977015 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | Corning | 21040CV | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| ViiA7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block | ThermoFisher Scientific | 4453535 | |
| Heraeus Pico 21 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002415 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| HERMO SCIENTIFIC Multi-Blok Heater | ThermoFisher Scientific | Model:2001 | |
| Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004220 | |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoFisher Scientific | 75003624 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| QuantStudio Real-time PCR software | ThermoFisher Scientific | v1.2 | |
| Real-time qPCR primer design | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT |
References
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