Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

एक Preparative पैमाने पर Triterpene उत्पादन के लिए निकोटियाना Benthamiana पत्तियों में क्षणिक अभिव्यक्ति

Published: August 16, 2018 doi: 10.3791/58169
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1John Innes Centre

Summary

निकोटियाना benthamiana पत्तियों में कृत्रिम एंजाइमों के क्षणिक heterologous अभिव्यक्ति नए उच्च मूल्य oxidosqualene उत्पादों के उत्पादन की दिशा में 2, 3-triterpene की अंतर्जात आपूर्ति को डायवर्ट कर सकते हैं । इस के साथ साथ तेजी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया है (5 दिन) triterpenes और इस शक्तिशाली संयंत्र आधारित मंच का उपयोग सादृश्य के preparative पैमाने पर उत्पादन ।

Abstract

triterpenes संयंत्र प्राकृतिक उत्पादों के सबसे बड़े और सबसे संरचनात्मक रूप से विविध परिवारों में से एक हैं । कई triterpene डेरिवेटिव के लिए औषधीय प्रासंगिक जैविक गतिविधि के अधिकारी दिखाया गया है । हालांकि, इस प्रकार अभी तक इस क्षमता triterpene के एक बहुतायत में अनुवाद नहीं किया है क्लिनिक में दवाओं व्युत्पंन । यह यकीनन (कम से आंशिक रूप से) परिसर के इस वर्ग के लिए सीमित व्यावहारिक सिंथेटिक उपयोग का एक परिणाम है, एक समस्या यह है कि संरचना की खोज-गतिविधि संबंधों और पारंपरिक औषधीय द्वारा नेतृत्व के उंमीदवारों के विकास को दबाना कर सकते है रसायन विज्ञान कार्यप्रवाह । उनके विशाल विविधता के बावजूद, triterpenes सभी एक रेखीय अग्रदूत, 2, 3-oxidosqualene से प्राप्त कर रहे हैं । एन benthamiana में कृत्रिम एंजाइमों के क्षणिक heterologous अभिव्यक्ति 2, 3-oxidosqualene के नए उच्च मूल्य triterpene उत्पादों है कि स्वाभाविक रूप से इस मेजबान द्वारा उत्पादित नहीं कर रहे है के उत्पादन की दिशा में अंतर्जात आपूर्ति को हटा सकते हैं । एग्रो घुसपैठ एन benthamianaमें क्षणिक अभिव्यक्ति प्राप्त करने का एक कुशल और सरल साधन है । इस प्रक्रिया में एग्रोबेक्टीरियम tumefaciens के निलंबन के साथ संयंत्र के पत्तों की घुसपैठ शामिल है, जो कि ब्याज की अभिव्यक्ति का निर्माण (ओं) को लेकर है । एक अतिरिक्त A. tumefaciens तनाव एक अभिव्यक्ति ले जाने के सह घुसपैठ एक एंजाइम है कि अग्रदूत की आपूर्ति को बढ़ा देता है एंकोडिंग का निर्माण काफी पैदावार बढ़ जाती है । पांच दिनों की अवधि के बाद, घुसपैठ पत्ती सामग्री काटा जा सकता है और परिणामी triterpene उत्पाद (ओं) को अलग करने और निकालने के लिए संसाधित किया जाता है । यह एक प्रक्रिया है कि रैखिक और मज़बूती से स्केलेबल है, बस प्रयोग में इस्तेमाल पौधों की संख्या में वृद्धि से । स्पेसिफिकेशंस इस संयंत्र आधारित मंच का उपयोग triterpenes के तेजी से preparative पैमाने पर उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है । प्रोटोकॉल एक आसानी से replicable वैक्यूम घुसपैठ तंत्र का इस्तेमाल करता है, जो चार पौधों को एक साथ घुसपैठ की अनुमति देता है, जो समय की एक छोटी अवधि में सैकड़ों पौधों की बैच-वार घुसपैठ को सक्षम बनाता है ।

Introduction

triterpenes संयंत्र प्राकृतिक उत्पादों के सबसे बड़े और सबसे संरचनात्मक रूप से विविध परिवारों में से एक हैं । उनके विशाल विविधता के बावजूद, सभी triterpene प्राकृतिक उत्पादों को एक ही रैखिक प्रणेता 2, 3-oxidosqualene, पौधों में mevalonate मार्ग के एक उत्पाद से व्युत्पंन माना जाता है । 2, 3 के Cyclization-oxidosqualene शुरू की है और एंजाइमों oxidosqualene cyclases (OSCs) के एक परिवार द्वारा नियंत्रित किया जाता है । इस cyclization कदम विविधीकरण के पहले के स्तर का प्रतिनिधित्व करता है, अलग triterpene पाड़ के सैकड़ों प्रकृति1से सूचित किया गया है के साथ । इन पाड़ों आगे सहित एंजाइमों सिलाई द्वारा विविध रहे हैं, लेकिन सीमित करने के लिए नहीं, cytochrome p450s (CYP450s)1,2। इस तरह के सिंथेटिक रास्ते असीम जटिलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, कभी-कभार अंतिम उत्पादों जो माता पिता triterpene से पहचानने योग्य हैं में जिसके परिणामस्वरूप । उदाहरण के लिए, शक्तिशाली कीटनाशक और antifeedant limonoid azadirachtin के जटिल संरचना tetracyclic प्रकार3के एक triterpene tirucallane से निकलने के लिए माना जाता है ।

कई triterpene-व्युत्पंन प्राकृतिक उत्पादों, यहां तक कि अपेक्षाकृत संशोधित माता पिता पाड़ के साथ उन, को औषधीय प्रासंगिक जैविक गतिविधि के अधिकारी दिखाया गया है4,5,6,7। हालांकि, इस प्रकार अभी तक इस क्षमता triterpene के एक बहुतायत में अनुवाद नहीं किया है क्लिनिक में दवाओं व्युत्पंन । यह यकीनन (कम से आंशिक रूप से) परिसर के इस वर्ग के लिए सीमित व्यावहारिक सिंथेटिक उपयोग का एक परिणाम है, एक समस्या यह है कि संरचना की खोज-गतिविधि संबंधों और पारंपरिक औषधीय द्वारा नेतृत्व के उंमीदवारों के विकास को दबाना कर सकते है रसायन विज्ञान कार्यप्रवाह ।

एन benthamiana पत्तियों में अन्य प्रजातियों के पौधे से triterpene के कृत्रिम एंजाइम की परिवर्तनीय अभिव्यक्ति 2, 3-oxidosqualene के नए उच्च मूल्य triterpene उत्पादों (चित्रा 1) के उत्पादन की दिशा में अंतर्जात की आपूर्ति को डायवर्ट कर सकते हैं । इस प्रक्रिया को कार्यात्मक उंमीदवार एंजाइमों की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और महत्वपूर्ण स्वाभाविक रूप से होने वाली चयापचयों के कृत्रिम रास्ते फिर से संगठित । समान रूप से, यह भी मिश्रित में इस्तेमाल किया जा सकता है कृत्रिम triterpene उत्पादों, एक रणनीति है कि संरचनात्मक रूप से संबंधित सादृश्य के पुस्तकालयों में परिणाम कर सकते है उत्पादन, संरचना के व्यवस्थित अंवेषण-गतिविधि संबंधों की अनुमति के जैविक रूप से सक्रिय नेतृत्व यौगिकों8,9.

Agroinfiltration N. benthamiana पत्तियों में क्षणिक अभिव्यक्ति प्राप्त करने का एक कुशल और सरल साधन है । इस प्रक्रिया में एक. tumefaciens के निलंबन के साथ पत्तियों की घुसपैठ शामिल है जो बाइनरी एक्सप्रेशन का निर्माण (एस) ब्याज के रूप में ले रहा है । यह दबाव है जो stomata के माध्यम से तरल बलों के आवेदन के माध्यम से प्राप्त की है, सेलुलर अंतरिक्ष में हवा की जगह है, और यह एक. tumefaciens निलंबन के साथ की जगह । जीवाणु पौधों की कोशिकाओं के इंटीरियर के लिए संबंधित टी-DNAs स्थानांतरण, घुसपैठ पत्ती ऊतक में स्थानीयकृत और परिवर्तनीय प्रोटीन अभिव्यक्ति में जिसके परिणामस्वरूप ।

जबकि किसी भी द्विआधारी ट्रांसजेनिक पौधों पैदा करने के लिए उपयुक्त वेक्टर क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए नियोजित किया जा सकता है, हम लोबिया मोज़ेक वायरस (CPMV) का उपयोग-व्युत्पंन Hypertranslational (एचटी) प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली10, 11. इस प्रणाली में ब्याज की जीन CPMV आरएनए-2 से अनुवादित क्षेत्रों (UTR) द्वारा पार्श्व है । 5 ' UTR वायरल प्रतिकृति12पर कोई निर्भरता के साथ प्रोटीन अनुवाद के बहुत उच्च स्तर में जिसके परिणामस्वरूप संशोधनों में शामिल हैं । इस तकनीक में विकसित किया गया है आसान और जल्दी (pEAQ) द्विआधारी वेक्टर श्रृंखला जो साइट विशिष्ट पुनर्संयोजन क्लोनिंग प्रोटोकॉल संगत constructs (pEAQ-एचटी-लक्ष्य)10,11शामिल हैं । सबसे pEAQ वैक्टर भी एक टमाटर जंगली स्टंट वायरस-व्युत्पंन P19 मुंह बंद करने दमन जीन13 टी के भीतर अभिव्यक्ति कैसेट है, जो एक अलग P19 coinfiltrate की जरूरत दरकिनार-ले जाने के तनाव और मुलाजिम बहुत से डीएनए भाग उच्च स्तरीय प्रोटीन अभिव्यक्ति में मेजबान संयंत्र सेल10,11.

एक अभिव्यक्ति मेजबान के रूप में N. benthamiana का उपयोग विशेष लाभ है जब संयंत्र के साथ काम कर रहे है कृत्रिम रास्ते । कोशिका वास्तुकला आंतरिक रूप से उपयुक्त mRNA और प्रोटीन प्रोसेसिंग का समर्थन करता है, और उचित compartmentalization, आवश्यक सह-एंजाइमों रखने के अलावा, reductases (CYP450s के लिए), और चयापचय पुरोगामी । कार्बन स्रोत प्रकाश संश्लेषण है; इस प्रकार, पौधों को अच्छी गुणवत्ता के खाद में उगाया जा सकता है, केवल पानी की आवश्यकता होती है,2 सह (हवा से), और सूरज की रोशनी के रूप में आदानों । मंच भी सह के लिए अत्यंत सुविधाजनक है प्रोटीन के विभिंन संयोजनों की अभिव्यक्ति, के रूप में इस सह द्वारा facilely प्राप्त किया जा सकता है एक. tumefaciens के विभिंन उपभेदों की घुसपैठ, बड़ी multigene अभिव्यक्ति के निर्माण की जरूरत को नकारने कैसेट. इसके अलावा, प्रक्रिया रैखिक और मज़बूती से बस प्रयोग में इस्तेमाल पौधों की संख्या में वृद्धि से स्केल किया जा सकता है ।

हमारी प्रयोगशाला में पिछले काम preparative पैमाने पर प्रयोगों के लिए इस मंच की उपयोगिता का प्रदर्शन किया है. यह भी शामिल है के लिए उपंयास triterpenes की तैयारी में उपयोग के लिए और अधिक स्केल के लिए अलग उत्पाद के ग्राम मात्रा प्राप्त करने के लिए । इसके अलावा, heterogenous triterpene उत्पादों के संचय कई गुना बढ़ाया जा सकता है एक N-टर्मिनल के सह-अभिव्यक्ति से कटा हुआ, राय-असंवेदनशील रूप 3-hydroxy, 3-methyglutary-कोएंजाइम एक रिडक्टेस (tHMGR), एक दर सीमित ऊपर mevalonate मार्ग में एंजाइम8.

इस तरह के preparative पैमाने पर प्रयोग करने की क्षमता घुसपैठ की प्रक्रिया को सुविधाजनक रूप से चौड़ा करने की है । एक ठेठ प्रयोग में, पौधों की सैकड़ों के लिए दसियों अलग उत्पाद के लक्ष्य मात्रा को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है । हाथ से व्यक्तिगत पत्तियों घुसपैठ (एक अनावश्यक सिरिंज का उपयोग) ऑपरेशन की मांग है, और अक्सर नकारात्मक स्तर तक समय लेने वाली, इस विधि प्रतिपादन दिनचर्या स्केल के लिए अव्यावहारिक । वैक्यूम घुसपैठ हाथ घुसपैठ पर लाभ प्रदान करता है, के रूप में यह ऑपरेटर के कौशल स्तर पर निर्भर नहीं है और पत्ती की सतह के एक अधिक क्षेत्र की घुसपैठ की अनुमति देता है । इस प्रक्रिया को व्यावसायिक रूप से दवा प्रोटीन14के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए प्रयोग किया जाता है । इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल एक आसानी से replicable वैक्यूम घुसपैठ उपकरण है, जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध भागों से निर्माण किया जा सकता है । यह 4 संयंत्रों के लिए एक साथ घुसपैठ की अनुमति देता है, तेजी से और व्यावहारिक बैच वार समय की एक छोटी अवधि में सैकड़ों पौधों की घुसपैठ वहन (चित्रा 2a -2 बी) । वैक्यूम घुसपैठ तंत्र एक वैक्यूम ओवन जो घुसपैठ चैंबर (चित्रा 2f) रूपों के होते हैं । ओवन एक वैक्यूम जलाशय के माध्यम से एक पंप से जुड़ा हुआ है । यह काफी समय के लिए घुसपैठ चैंबर में वांछित निर्वात को प्राप्त करने के लिए आवश्यक कम कर देता है । पौधे एक bespoke धारक में सुरक्षित है और एक 10 एल स्टेनलेस स्टील के पानी के साथ एक. tumefaciens निलंबन (चित्रा 2a -2c) भर स्नान में औंधा । कुशल घुसपैठ के लिए पौधों के हवाई भागों का पूरा विसर्जन महत्वपूर्ण है । पानी स्नान तो घुसपैठ चैंबर (चित्रा 2d -2e) के भीतर रखा जाता है, और निर्वात पत्ती मध्यवर्ती रिक्त स्थान से बाहर हवा आकर्षित करने के लिए लागू होता है । एक बार दबाव ८८० mbar द्वारा कम किया गया है (एक प्रक्रिया है जो लगभग 1 मिनट लेता है) घुसपैठ चैंबर तेजी से वापस लाया है 20-30 एस पर वायुमंडलीय दबाव ओवन प्रवेश वाल्व खोलने से, whereupon घुसपैठ पूरा हो गया है ।

घुसपैठ के पांच दिन बाद संयंत्र सामग्री कटाई और बाद में निष्कर्षण और वांछित उत्पाद (ओं) के अलगाव के लिए तैयार है । इस बिंदु से प्रक्रिया बस एक प्राकृतिक उत्पाद निष्कर्षण और पत्ती सामग्री, एक कार्यप्रवाह है कि किसी भी प्राकृतिक उत्पाद केमिस्ट से परिचित है से शुद्धि है । प्रारंभिक निष्कर्षण और बाद में शुद्धिकरण के लिए कई विभिंन तरीकों15मौजूद हैं । तरीकों का सबसे उपयुक्त विकल्प है और सटीक इस्तेमाल किया शर्तों के उच्च ब्याज की यौगिक के विशेष रासायनिक गुणों पर निर्भर करता है, कौशल की उपलब्धता के अलावा और/ यह इस प्रोटोकॉल में शामिल करने के लिए संभव नहीं है एक पूरी तरह से सामान्य रूप से, काटा संयंत्र पत्ती सामग्री के बहाव प्रसंस्करण के लिए कदम दर कदम विधि अलग उत्पाद है कि ब्याज की किसी भी triterpene उत्पाद के लिए आंख बंद करके पीछा किया जा सकता है, न ही यह होगा ऐसा करने के लिए प्रयास करने के लिए उपयुक्त । हालांकि, इस प्रोटोकॉल हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया बुनियादी कार्यप्रवाह और प्रक्रिया है, जो हमारे अनुभव में सबसे oxygenated aglycone triterpene उत्पादों के लिए सामांयीकरण साबित कर दिया है की प्रारंभिक अवस्था के लिए कुछ तरीकों का एक सिंहावलोकन प्रदान करेगा । यह दो अपेक्षाकृत असामांय तकनीक, अर्थात्, दबाव विलायक निष्कर्षण (सार्वजनिक उपक्रम), और क्लोरोफिल हटाने के लिए एक सुविधाजनक heterogenous चरण विधि एक जोरदार बुनियादी आयन विनिमय राल का उपयोग भी शामिल है ।

सार्वजनिक उपक्रम ठोस मैट्रिक्स से छोटे कार्बनिक अणुओं की निकासी के लिए एक अत्यधिक कुशल तकनीक है । निष्कर्षण दबाव के तहत प्रदर्शन कर रहे है (ca. १००-२०० बार), मुख्य लाभ को समाप्त तापमान जो निष्कर्षण विलायक के उबलते बिंदु से अधिक का उपयोग करने की क्षमता जा रहा है । यह काफी समय और एक संपूर्ण निष्कर्षण प्राप्त करने के लिए आवश्यक विलायक की राशि को कम कर सकते हैं, जब इस तरह के सरल भाटा या Soxhlet निकालने16के रूप में अंय गर्म विलायक तकनीकों की तुलना में । वाणिज्यिक बेंच-शीर्ष सार्वजनिक उपक्रम उपकरण उपलब्ध हैं, जो विनिमेय निष्कर्षण कोशिकाओं का उपयोग, और स्वचालित विलायक हैंडलिंग, हीटिंग, और निगरानी । यह इस तकनीक को बेहद सुविधाजनक बनाता है । यह भी यकीनन कम खतरनाक है, विशेष रूप से सीमित व्यावहारिक रसायन अनुभव के साथ ऑपरेटरों के लिए ।

Saponification के तहत कच्चे पत्ते के अर्क के बाद भाटा तरल/तरल विभाजन के बाद शोधन या विश्लेषण करने से पहले क्लोरोफिलों के थोक हटाने के लिए एक आम तकनीक है । हालांकि, यह अक्सर बड़े पैमाने पर संचालन की मांग कर सकते हैं । इसके अलावा, इंटरफेस का पता लगाने, या पायस के गठन के कारण उत्पाद नुकसान समस्याग्रस्त किया जा सकता है । जोरदार बुनियादी आयन का उपयोग-विनिमय रेजिन heterogenous चरण hydrolysis प्रदर्शन करने के लिए एक सुविधाजनक विकल्प के रूप में सेवा कर सकते हैं । hydrolyzed क्लोरोफिल के pigmented भाग राल के लिए पालन रहता है और बस निस्पंदन द्वारा हटाया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल एक पहले रिपोर्ट विश्लेषणात्मक प्रक्रिया17 कि एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बुनियादी आयन-विनिमय राल रोजगार के एक preparative पैमाने पर अनुकूलन का इस्तेमाल करता है ।

नीचे हम इस संयंत्र आधारित मंच का उपयोग triterpenes के preparative पैमाने पर उत्पादन के लिए एक विस्तृत और तेजी से प्रोटोकॉल का वर्णन । इस प्रोटोकॉल नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता है के लिए अलग triterpene उत्पाद के मिलीग्राम के सैकड़ों को दसियों तैयार परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा इस तरह के एक संरचनात्मक लक्षण वर्णन, और कार्यात्मक में/ assays.

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल का पालन करने से पहले, इस्तेमाल सभी पदार्थों के लिए सामग्री सुरक्षा डेटा के साथ परिचित हो, और उचित सुरक्षा सावधानियों ले । ये शामिल हैं, लेकिन करने के लिए सीमित नहीं हैं: वैक्यूम के तहत कांच के साथ काम करते समय सुरक्षा चश्मा पहने हुए, और एक धुएं अलमारी में सूखी सिलिका जेल हैंडलिंग । यह भी आवश्यक है कि स्थानीय कानून ट्रांसजेनिक सामग्री के साथ काम करने के विषय में जांच की है और कहा, निंनलिखित सहित उचित शामिल प्रक्रियाओं ।

1. घुसपैठ के लिए एक. tumefaciens उपभेदों उत्पन्न

नोट: हम यहां क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए उपयुक्त a. tumefaciens उपभेदों उत्पंन करने के लिए आवश्यक चरणों का एक सरलीकृत विवरण प्रदान करते हैं । इन कदमों का अधिक विवरण Sainsbury एट अल द्वारा बताया गया है । 8.

  1. पीसीआर द्वारा बढ़ाना या एक साइट विशेष पुनर्संयोजन क्लोनिंग प्रोटोकॉल18,19के साथ प्रयोग के लिए एक प्रविष्टि क्लोन की पीढ़ी के लिए उपयुक्त 5 ' और 3 ' attB अनुक्रम द्वारा पार्श्व ब्याज की जीन के प्रोटीन कोडन क्षेत्र ।
    1. आगे प्राइमर का प्रयोग करें: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTANNNNNNNNNNNNNNNNNN, रिवर्स प्राइमर: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTANNNNNNNNNNNNNNNNNN (NNNN... = अनुक्रम विशिष्ट अनुक्रम) ।
    2. उपयोग (प्रतिनिधि) पीसीआर शर्तें: रिएक्शन मिक्सचर (25 µ l, कुल), बफर (5x, 5 µ l, सामग्री की तालिकादेखें), dNTPs (10 मिमी, ०.५ µ एल), फॉरवर्ड प्राइमर (10 µ एम, १.२५ µ एल), रिवर्स प्राइमर (10 µ एम, १.२५ µ एल), टेम्पलेट डीएनए (चर एकाग्रता, ५० – २५० एनजी, ०.५ µ एल ), डीएनए पोलीमरेज़ (२००० यू/एमएल, ०.२५ µ एल, सामग्री की तालिकादेखें), Nuclease-मुक्त पानी (करने के लिए 25 µ एल) । thermocycler को निम्नानुसार चलाएं: आरंभिक विकार (९८ ° c, 30 s); प्रारंभ चक्र (९८ ° c, 30 s; ४५ – ७२ ° c, 20 s; ७२ ° c, 30 s/अंत चक्र; ३५ चक्र; अंतिम विस्तार (७२ डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट) ।
    3. एक मानक साइट का पालन करें-विशिष्ट पुनर्संयोजन क्लोनिंग प्रोटोकॉल18,19 एक प्रविष्टि क्लोन उत्पंन करने के लिए किसी भी गैर कनमीसिन आधारित प्रवेश सदिश का उपयोग (हम pDONR207 जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है का उपयोग करें) ।
      नोट: प्रविष्टि क्लोन की अखंडता sequencing द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए, pEAQ-एचटी-DEST1 अभिव्यक्ति का निर्माण उत्पन्न करने के लिए उपयोग करने से पहले. pEAQ-एचटी-DEST1 नॉर्विच, यूके में जॉन Innes सेंटर में Lomonossoff लेबोरेटरी से अनुरोध पर उपलब्ध है ।
    4. अलग pEAQ-एचटी-DEST1 सदिश अभिव्यक्ति क्लोन से कदम 1.1.3 में उत्पंन, और स्टोर-20 ° c से पहले चरण १.३ में उपयोग करने के लिए ।
      नोट: किसी भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सुविधाजनक स्पिन कॉलम आधारित प्लाज्मिड शुद्धि ई. कोलाई के उपभेदों क्लोनिंग से plasmids निकालने के लिए डिजाइन किट उपयुक्त है । चुने प्लाज्मिड शोधन किट के विशिष्ट निर्देशों का पालन करें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  2. परिवर्तन के लिए रासायनिक सक्षम A. tumefaciens तैयार करें ।
    1. Inoculate एक चुनिंदा पौंड (Luria-Bertani मीडियम: 10 g/l bacto-tryptone, 10 g/l NaCl, और 5 g/l खमीर निकालने, आगर 10 g/l pH ७.०) आगर प्लेट (५० μg/एमएल रिफैंपिसिन, १०० μg/एमएल streptomycin), एक tumefaciens स्टॉक संस्कृति से एक. LBA4404 ग्लिसरॉल लकीर से । एक खड़े मशीन में 28 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
    2. Inoculate ५० एमएल के चुनिंदा लिक्विड पौंड मीडिया (५० μg/एमएल रिफैंपिसिन, १०० μg/एमएल streptomycin) के एक नमूने के साथ tumefaciens LBA4404 कोशिकाओं से कदम 1.2.1 । २०० rpm में एक मिलाते हुए मशीन में 28 ° c पर रात भर में मशीन ।
    3. 10 मिनट के लिए बर्फ पर कदम 1.2.2 से संस्कृति शांत और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक द्वारा A. tumefaciens कोशिकाओं गोली और 5 मिनट के लिए ४५०० x g (supernatant को त्यागें) ।
    4. बर्फ के 1 मिलीलीटर ठंड 20 मिमी जलीय CaCl2 समाधान में कदम 1.2.3 से गोली resuspend और कदम 1.2.3 से केंद्रापसारक कदम दोहराने (supernatant त्यागें) ।
    5. बर्फ के 1 मिलीलीटर ठंड 20 मिमी जलीय CaCl2 समाधान में कदम 1.2.4 से गोली resuspend और ५० µ एल बैचों में परिणामी निलंबन aliquot । फ्लैश तरल एन2 में aliquots फ्रीज और उपयोग करने से पहले-८० डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
  3. तैयार A. tumefaciens LBA4404 अलग pEAQ-एचटी-DEST1 वेक्टर चरण १.२ में जनरेट किया गया के साथ ट्रांस्फ़ॉर्म ।
    1. गल ५० µ एल ऑफ ए. tumefaciens निलंबन बर्फ पर १.२ चरण में उत्पंन, और १०० \u2012 २०० अलग pEAQ-एचटी-DEST1 वेक्टर के एनजी के साथ मशीन, चरण १.१ में उत्पंन, 0 ° c 5 मिनट के लिए ।
    2. शीत सदमे के लिए तरल एन2 में कदम 1.3.1 से मशीन निलंबन 30 एस के लिए, तो कमरे के तापमान को गर्म करने की अनुमति ।
    3. समाज माध्यम के २०० μL जोड़ें (समाज: 20 g/l bacto-tryptone, 5 g/l खमीर निकालने, ०.५८ g/l NaCl, ०.१९ g/l KCl, २.०३ g/l MgCl2, २.४६ g/l मैग्नीशियम सल्फेट 7-हाइड्रेट, ३.६ जी/एल ग्लूकोज) को ठंड से हैरान कर दिया निलंबन के लिए कदम 1.3.2 और 4 ज के लिए मशीन पर 28 ° २०० rpm में एक मिलाना मशीन में सी ।
    4. Inoculate एक चयनात्मक पौंड आगर प्लेट (५० μg/एमएल रिफैंपिसिन, ५० μg/एमएल कनमीसिन, १०० μg/एमएल streptomycin) कदम 1.3.3 से समाज संस्कृति के साथ । अच्छी तरह से फैला है, और एक खड़े मशीन में 28 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए मशीन ।
    5. Inoculate के चुनिंदा पौंड मीडिया की 5 मिलीलीटर (५० μg/एमएल रिफैंपिसिन, ५० μg/एमएल कनमीसिन, १०० μg/एमएल streptomycin) के साथ एक ही कॉलोनी से कदम 1.3.4 । २०० rpm में एक मिलाते हुए मशीन में 28 ° c पर रात भर में मशीन ।
    6. जोड़ें २०० μL ग्लिसरॉल के 1 मिलीलीटर से तरल संस्कृति के कदम 1.3.5, अच्छी तरह से मिश्रण और पर स्टोर-८० ° c.
      नोट: इस संस्कृति को उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पौंड आगर प्लेटों पर लकीर के द्वारा भविष्य के प्रयोगों के लिए पुनर्जीवित किया जा सकता है (नीचे वर्णित) ।

2. घुसपैठ को तैयार करें निलंबन

  1. Inoculate 1 चरण में उत्पंन ग्लिसरॉल स्टॉक संस्कृतियों से वांछित a. tumefaciens उपभेदों की धारियां के साथ एक चयनात्मक पौंड आगर प्लेट । एक खड़े मशीन में 28 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
    नोट: एक pEAQ-एचटी-DEST1 वेक्टर के भीतर tHMGR को ले जाने वाला तनाव भी शामिल हो सकता है ।
    1. व्यक्तिगत रूप से हर a. tumefaciens के एक नमूने के साथ चयनात्मक पौंड मीडिया के ५० मिलीलीटर inoculate २.१ और एक मिलाना मशीन में 28 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में गर्मी २०० rpm में वृद्धि हुई ।
    2. व्यक्तिगत रूप से ५० एमएल संस्कृतियों से कदम 2.1.1 के लिए चयनात्मक पौंड मीडिया (रिफैंपिसिन ५० μg/एमएल, कनमीसिन, ५० μg/एमएल streptomycin १०० μg/एमएल) और 28 ° c पर रात भर में एक मिलाना मशीन में २०० rpm में गर्मी से १००० मिलीलीटर स्थानांतरण ।
    3. व्यक्तिगत रूप से एक tumefaciens (४००० x जी), तरल संस्कृतियों से कदम 2.1.2 में उत्पंन (supernatant को त्यागना) द्वारा गोली ।
    4. व्यक्तिगत रूप से नए सिरे से तैयार एमएमए बफर के ५० मिलीलीटर में कदम 2.1.3 से छर्रों resuspend (एमएमए बफर: 10 मिमी 2-(N-morpholino)-ethanesulphonic एसिड, पीएच ५.६ (कोह), 10 मिमी MgCl2, १५० माइक्रोन 3 ' 5 '-dimethoxy-4'-acetophenone) और में कमरे के तापमान पर मशीन अंधेरे के लिए 1 ज ।
    5. प्रत्येक a. tumefaciens एमएमए निलंबन (चरण 2.1.4 में उत्पंन) के उपयुक्त मात्रा का मिश्रण करने के लिए एक 10 एल कुल अंतिम मात्रा में एक तनाव के लिए ंयूनतम ०.२ से एक अंतिम आयुध डिपो६०० का उत्पादन ।
    6. अतिरिक्त एमएमए बफर जोड़ने के लिए संयुक्त निलंबन चरण 2.1.5 में उत्पंन 1 एल के अंतिम खंड (तुरंत उपयोग चरण 3 में) ।
      नोट: घुसपैठ की प्रक्रिया के दौरान तरल स्तर को बनाए रखने के लिए घुसपैठ निलंबन के एक अतिरिक्त 2 एल तैयार करने की सलाह दी जाती है ।
    7. 10x ताकत एमएमए बफर के 1 एल तैयार करते हैं ।

3. वैक्यूम घुसपैठ प्रदर्शन

नोट: वैक्यूम घुसपैठ तंत्र निर्माण के विवरण के लिए चित्र 2 देखें । आगे बढ़ने के लिए 9 cm x 9 cm के बर्तन में 5 सप् ताह पुराने N benthamiana पौधों का प्रयोग करें । अंकुर F1 खाद में बोया जाना चाहिए (Levington सेउदाहरण के लिए) और 2 सप्ताह के लिए उगाया जा रहा है व्यक्तिगत F2 खाद युक्त बर्तन को हस्तांतरित किया जा रहा है । पौधों को 25 डिग्री सेल्सियस पर एक ग्रीनहाउस में उगाया जाना चाहिए, 16 घंटे प्रति प्रकाश के साथ (पूरक प्रकाश का उपयोग करें जब आवश्यक), पानी दैनिक, १०० पौधों की अधिकतम घनत्व/

  1. 1 l स्थानांतरण चरण 2 में उत्पन्न घुसपैठ निलंबन और 1 l के लिए 10x ताकत एमएमए बफर घुसपैठ स्नान करने के लिए, एक अतिरिक्त 8 l के बाद पानी.
    1. bespoke संयंत्र धारक के detachable पंख निकालें, 4 पौधों डालने (5 सप्ताह पुराने पौधों पिछले नोट देखें), और पंख reattach । धारक को उल्टियां करना और घुसपैठ स्नान के शीर्ष पर जगह देना ताकि घुसपैठ के निलंबन में पत्तियों को जलमग्न कर दें ।
      नोट: सुनिश्चित करें कि निलंबन स्तर संयंत्र धारक के शीर्ष सतह तक पहुंचता है । यदि आवश्यक हो तो अतिरिक्त घुसपैठ निलंबन के अलावा के साथ स्तर बढ़ाएं ।
    2. जलमग्न पौधों के साथ घुसपैठ स्नान को घुसपैठ कक्ष में स्थानांतरित करें और दरवाजा बंद करें । सुनिश्चित करें कि हवा का सेवन वाल्व को खदेड़ा जाने पर बंद किया गया है । वैक्यूम पंप पर मुड़ें और वैक्यूम वाल्व घुसपैठ चैंबर पर वैक्यूम सेवन वाल्व के बाद करने के लिए इनलाइन वॉल्व खोलें ।
    3. एक बार घुसपैठ चैंबर में दबाव ८८० mbar द्वारा कम हो गया है, वैक्यूम सेवन वाल्व बंद, और हवा का सेवन वाल्व खोलो । एक बार जब घुसपैठ चैंबर वायुमंडलीय दबाव में लौट आया है, दरवाजा खुला है, और घुसपैठ स्नान हटा दें ।
    4. पौधों को अब तक घुसपैठ निलंबन में जलमग्न नहीं कर रहे है जब तक संयंत्र धारक उठाएं, तो धीरे धारक को मिलाने के लिए अतिरिक्त निलंबन की अनुमति के लिए रवाना वापस घुसपैठ स्नान में छोड़ देते हैं ।
    5. धारक को ईमानदार स्थिति में लौटें, detachable पंखों को हटा दें, और पौधों को हटा दें ।
    6. जब तक वांछित संख्या में पौधों की घुसपैठ न हो जाए तब तक 3.1.1 चरणों को 3.1.5 दोहराएं ।
    7. आटोक्लेव घुसपैठ निलंबन से पहले निपटान के लिए इस्तेमाल किया ।
    8. बाद के प्रयोगों में पुनः प्रयोग करने से पूर्व घुसपैठ स्नान को आटोक्लेव.
    9. ७०% इथेनॉल के साथ सफाई और बाद में प्रयोगों में पुन: उपयोग करने से पहले सूखी हवा छोड़ने के द्वारा घुसपैठ चैंबर के इंटीरियर निष्फल ।

4. घुसपैठ संयंत्रों बढ़ने

  1. एक ग्रीनहाउस में १०० संयंत्रों/एम2 के एक अधिकतम घनत्व पर कदम 3 से घुसपैठ संयंत्रों की व्यवस्था ।
  2. 25 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए हो जाना और प्रकाश की प्रति दिन 16 घंटे (पूरक प्रकाश का उपयोग करें जब आवश्यक), और पानी दैनिक ।

5. घुसपैठ की पत्तियों की कटाई

  1. विकास के 5 दिनों के बाद, पत्तियों फसल ।
  2. आटोक्लेव अपशिष्ट संयंत्र सामग्री, बर्तन, और मिट्टी निपटान से पहले ।

6. काटा पत्ते सूखी

नोट: नीचे वर्णित सटीक lyophilization प्रक्रिया उपलब्ध lyophilization तंत्र की प्रकृति पर निर्भर करता है ।

  1. सूख जाने तक काटी हुई पत्तियों को Lyophilize.
    1. एक 2 मिमी मोटी के बैग में काटा पत्तियों प्लेस । 30 मिनट के लिए एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में भंडारण द्वारा काटा पत्ते फ्रीज ।
    2. एक पिन का उपयोग कर कई छोटे छेद के साथ बैग छिद्र । lyophilizer के केंद्रीय कक्ष में ाती जमे हुए पत्तों को रखें । सुनिश्चित करें कि सभी कुप्पी कुर्की नल बंद कर रहे हैं और फिर lyophilizer पर स्विच. सुनिश्चित करें कि संघनित्र कम-से-५० डिग्री सेल्सियस तक पहुंच जाता है और दबाव कम से कम ०.१५ mbar को कम कर देता है, और फिर रात भर छोड़ दें ।
    3. lyophilizer बंद करें और एक कुप्पी लगाव नल खोलकर वैक्यूम वेंट । केंद्रीय कक्ष से सूखे पत्ते निकालें, और चरण 7 पर जाएं ।

7. दबाव विलायक निष्कर्षण

नोट: कार्यवाही कदम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सार्वजनिक उपक्रम साधन का उपयोग करने के लिए देखें ( सामग्री की तालिकादेखें) । ऑपरेशन के बारे में अधिक विस्तृत जानकारी के लिए कृपया निर्माता के साहित्य को देखें । उपकरण समानांतर में 4 निष्कर्षण बाहर किया जाता है ।

  1. एक सुविधाजनक विधि के माध्यम से एक कोर्स पाउडर में सूखे पत्ते पीस (जैसे, ब्याज की सबसे triterpene यौगिकों के लिए एक घरेलू भोजन प्रोसेसर का उपयोग करें, या मैंयुअल रूप से पत्तियों को कुचल जबकि एक बैग के भीतर समाहित) ।
    नोट: एक मूसल और तरल नाइट्रोजन के तहत मोर्टार के साथ पीसने आमतौर पर आवश्यक नहीं है ।
    1. एक उपयुक्त कंटेनर में क्वार्ट्ज रेत (०.३ \u2012 ०.९ मिमी, मात्रा से 20%) के साथ पत्ती पाउडर मिश्रण; यह एक disperser के रूप में कार्य करता है और निष्कर्षण प्रक्रिया की दक्षता में सुधार ।
  2. भरने के लिए 4 निष्कर्षण कोशिकाओं (१२० एमएल) तैयार करते हैं । इस के लिए, निष्कर्षण कोशिकाओं पलटना और कांच फाइबर फिल्टर डालने, धातु frit और प्लग होल्डिंग द्वारा पीछा किया । एकमुश्त स्थिति के लिए निष्कर्षण कोशिकाओं लौटें और एक 1 सेमी गहरी क्वार्ट्ज रेत की परत (०.३ \u2012 ०.९ mm) जोड़ें ।
  3. निष्कर्षण कक्षों को भरें ।
    1. भरने के लिए तैयार पत्ती पाउडर चरण ७.१ में उत्पंन के साथ निष्कर्षण कोशिकाओं भरें लाइन के लिए । यदि आवश्यक हो, तो इस प्रक्रिया के दौरान पाउडर को प्रत्येक निष्कर्षण कक्ष में अधिक मात्रा में जोड़ने की सुविधा के लिए संपीड़ित करें ।
    2. पैक पाउडर के शीर्ष करने के लिए क्वार्ट्ज रेत (०.३ \u2012 ०.९ मिमी) की एक छोटी सी परत जोड़ें और शीर्ष फाइबर फिल्टर डालें ।
    3. सार्वजनिक उपक्रम साधन में पैक निष्कर्षण कोशिकाओं डालें और वांछित विधि चलाते हैं । निंन सेटिंग्स और सामग्री का उपयोग करें; विलायक: १००% एथिल एसीटेट; तापमान: १०० ° c, दबाव: १३० बार । इस प्रकार के रूप में 3 चक्र भागो: चक्र 1:0 मिनट पकड़ समय, 2 चक्र और 3:5 मिनट पकड़, एक 2 मिनट विलायक फ्लश के साथ अंत, और 12 मिनट नाइट्रोजन गैस फ्लश ।
      नोट: यह पहले एक छोटे पैमाने पर निष्कर्षण विधि का अनुकूलन करने के लिए सलाह दी जाती है । हालांकि, निंनलिखित विधि अक्सर सबसे ऑक्सीकरण triterpene aglycones के लिए पर्याप्त है । प्रत्येक निष्कर्षण कक्ष से शराब एक ही बाह्य संग्रह पोत में निष्कर्षण गंतव्य के रूप में बेकार लाइन निर्दिष्ट द्वारा संयुक्त किया जा सकता है, बजाय मानक व्यक्तिगत संग्रह लाइनों की । ध्यान रखें कि इस्तेमाल किया विलायक की राशि निष्कर्षण कोशिकाओं और सेट तापमान और दबाव की पैकिंग पर निर्भर है । इसके बाद के संस्करण विधि आमतौर पर 4 समानांतर निकालने के लिए निष्कर्षण शराब की लगभग ८०० मिलीलीटर उत्पंन करता है ।
    4. सभी पत्ती पाउडर संसाधित किया गया है जब तक 7.3.3 करने के लिए ७.२ चरणों को दोहराएँ ।
    5. वैक्यूम के तहत रोटरी वाष्पीकरण के माध्यम से, सूखापन के लिए संयुक्त निष्कर्षण शराब ध्यान केंद्रित । अपेक्षित उत्पादन के लिए जांच करें (यानी, गहरे हरे रंग का घोल) ।
      नोट: सटीक प्रक्रिया उपलब्ध रोटरी वाष्पन की स्थापना के आधार पर भिन्न हो सकते हैं । हमेशा आंख संरक्षण जब रोटरी वाष्पीकरण प्रदर्शन, और वैक्यूम शर्तों के अधीन होने से पहले नुकसान के लिए कांच के बन की जांच पहनते हैं ।
      1. मिर्च रिसाइकिलर पर बारी है, और गर्मी हस्तांतरण करने के लिए 5 डिग्री सेल्सियस ठंडा करने के लिए तरल की अनुमति देते हैं । पानी स्नान पर बारी, और ३५ डिग्री सेल्सियस के लिए तापमान निर्धारित किया है ।
      2. एक वाष्पीकरण कुप्पी के लिए निष्कर्षण शराब हस्तांतरण (कुप्पी के आधे से अधिक मात्रा में नहीं भरें) । शराब बैच वार ध्यान केंद्रित (एक ही कुप्पी में) यदि कुल मात्रा इस से अधिक है । रोटरी वाष्पक (एक संयुक्त क्लिप के साथ सुरक्षित) के वाष्प-वाहिनी के लिए भरा वाष्पीकरण कुप्पी संलग्न करें ।
      3. कुप्पी लिफ्ट स्थिति और कोण को समायोजित करें, ताकि एक लगभग ४५ ° कोण पर पानी के स्नान में वाष्पीकरण कुप्पी के नीचे तीसरे को जलमग्न कर सके । एक गति है जो कुप्पी की दीवारों को निष्कर्षण शराब प्रसार शुरू होता है पर कुप्पी कताई शुरू करो ।
      4. सुनिश्चित करें कि वेंट नल बंद है और दबाव को कम करने के लिए शुरू (वैक्यूम पंप के नियंत्रक का उपयोग कर) जब तक एक मध्यम ड्रिप संघनित्र और रिसीवर कुप्पी के बीच मनाया जाता है ।
        नोट: निष्कर्षण शराब फोड़ा शुरू करने की अनुमति नहीं है । यदि यह होता है शूंय की शक्ति को कम करने के नियंत्रण में आसवन लाने के लिए ।
      5. मॉनिटर और सभी विलायक काफूर है जब तक उपयुक्त के रूप में वैक्यूम शक्ति और स्पिन गति को समायोजित करें ।

8. क्लोरोफिलों को हटाने के लिए बुनियादी आयन एक्सचेंज राल उपचार

नोट: निंनलिखित चरणों में उद्धृत मात्रा १०० \u2012 १५० पौधों की एक मूल कार्य पैमाने पर ग्रहण । 8 कदम carboxylic एसिड समूहों, या कार्यात्मक समूहों है कि ऐसे एस्टर के रूप में बुनियादी स्थितियों के तहत hydrolyzed होगा युक्त उत्पादों के लिए उपयुक्त नहीं है ।

  1. कच्चे तेल इथेनॉल का एक ंयूनतम मात्रा में 7 कदम में उत्पंन निकालने भंग ।
  2. बुनियादी आयन एक्सचेंज राल मोतियों की ५० मिलीलीटर जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) कदम 7.1.1 के उत्पादन के लिए, और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर हिला ।
    नोट: सरगर्मी तंत्र के उपयोग के लिए मिलाते विकल्प नहीं है । चुंबकीय या यांत्रिक उपरि सरगर्मी राल मोतियों की अखंडता समझौता कर सकते हैं । उपयुक्त आंदोलन भी आसानी से एक रोटरी वाष्पीकरण पर वायुमंडलीय दबाव या डिस्कनेक्ट वैक्यूम सेट के साथ प्रतिक्रिया कुप्पी के धीमी गति से रोटेशन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है ।
  3. बुनियादी आयन विनिमय राल मोतियों की एक अतिरिक्त ५० मिलीलीटर हर 30 मिनट जोड़ें जब तक प्रतिक्रिया पूर्णता के लिए चला गया है; बुनियादी आयन एक्सचेंज राल मोती रंग में गुलाबी से हरा करने के लिए बदल जाएगा, और तरल चरण नारंगी या एक संदिग्ध भूरे रंग के पैमाने पर निर्भर करता है के लिए हरी से बदल जाएगा ।
    1. अगर संदेह है कि प्रतिक्रिया पूरा करने के लिए चला गया है में, तरल का नमूना ०.५ मिलीलीटर । diatomaceous पृथ्वी के एक छोटे से कॉलम के माध्यम से नमूना फ़िल्टर और छानने का रंग का पालन; प्रतिक्रिया आमतौर पर १.५ घंटे के भीतर पूरा हो गया है ।
  4. diatomaceous पृथ्वी के एक छोटे कॉलम के माध्यम से प्रतिक्रिया मिश्रण फ़िल्टर ।
    1. वैक्यूम निस्पंदन के माध्यम से इस प्रदर्शन, या हाथ धौंकनी का उपयोग करने के लिए दबाव लागू करने के लिए एक गिलास फ्लैश क्रोमैटोग्राफी कॉलम के माध्यम से । निस्पंदन दर को धीमा कर देती है, तो एक सरगर्मी रॉड के साथ diatomaceous पृथ्वी पैड के शीर्ष परेशान । निस्पंदन इकट्ठा ।
  5. इथेनॉल के साथ एकत्र रेजिन मोती कुल्ला, 1:1 इथेनॉल के बाद: hexane, और अंत में hexane । diatomaceous पृथ्वी कॉलम के शीर्ष पर मोतियों को फिर से स्थगित करने के लिए पर्याप्त एक कुल्ला मात्रा का प्रयोग करें ।
  6. ८.४ कदम से छानने का मिश्रण है, और ८.५ कदम से कुल्ला, और वैक्यूम के तहत रोटरी वाष्पीकरण द्वारा सूखापन के लिए ध्यान केंद्रित ।

9. प्रारंभिक किसी न किसी अंश

नोट: निंनलिखित विधि ठेठ ऑक्सीकरण triterpene aglycones के लिए आम तौर पर उपयुक्त है, और एक स्वचालित फ़्लैश क्रोमैटोग्राफी साधन कार्यरत हैं । ऑपरेशन के बारे में अधिक जानकारी के लिए निर्माता के साहित्य का संदर्भ लें ।

  1. Adsorb कच्चे उत्पाद फ्लैश ग्रेड सिलिका जेल पर 8 चरण में उत्पंन (ताकना आकार: ६० Å, कण का आकार: ३५ \u2012 ७५ माइक्रोन) शुष्क लोड हो रहा है पद्धति के माध्यम से एक फ्लैश क्रोमैटोग्राफी कारतूस के लिए आवेदन के लिए ।
    1. कच्चे उत्पाद उपयुक्त कार्बनिक विलायक की एक ंयूनतम मात्रा में 8 कदम में उत्पंन भंग । पूर्ण विघटन सुनिश्चित करें ।
      नोट: मेथनॉल की कुछ बूंदों के अलावा के साथ Dichloromethane आमतौर पर विलायक का एक उपयुक्त विकल्प है ।
    2. एक १०० जी से भरा फ़्लैश क्रोमैटोग्राफी कारतूस ( सामग्री की तालिकादेखें) और डालने के लिए सूखी लोड हो रहा है सिर अंतरिक्ष प्रकट हटाने के ऊपर खोल देना । शुष्क लोडिंग के लिए सिलिका जेल की उचित मात्रा को मापने के लिए सिर के स्थान का उपयोग करें ।
    3. कच्चे उत्पाद के समाधान के लिए सूखी लदान के लिए सिलिका जेल की मापा मात्रा स्थानांतरण, तो वैक्यूम के तहत रोटरी वाष्पीकरण द्वारा विलायक हटा दें ।
      नोट: सिलिका जेल एक मुक्त बहने पाउडर के लिए वापस जाना चाहिए । वाष्पीकरण की प्रक्रिया के अंत की ओर कोमल स्क्रैप वाष्पीकरण कुप्पी की ओर से सिलिका जेल मुक्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है ।
    4. Equilibrate १०० मिलीलीटर पर १०० जी फ़्लैश क्रोमैटोग्राफी कारतूस/१००% hexane के कम से 5 कॉलम संस्करणों के साथ, लेकिन आदर्श जब तक कारतूस सामग्री पूरी तरह से और समान रूप से गीला है ।
    5. तैयार ड्राई लोडिंग सिलिका जेल equilibrated १०० जी फ्लैश क्रोमैटोग्राफी कारतूस के शुष्क लोडिंग सिर अंतरिक्ष के लिए कदम 9.1.3 में उत्पंन स्थानांतरण, घनघोर द्वारा । hexane और एक विस्तृत मुंह पिपेट में सस्पेंशन किसी भी शेष सूखी लोडिंग सिलिका जेल के हस्तांतरण सहायता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    6. गीला स्थानांतरित सूखी लोडिंग सिलिका जेल बिस्तर १००% hexane के साथ सूखी लदान headspace से हवा को दूर करने के लिए ।
    7. निंनलिखित क्रोमैटोग्राफी विधि चलाएं: विलायक [A]: hexane, विलायक [बी]: एथिल एसीटेट, प्रवाह दर: १०० एमएल/न्यूनतम, ग्रैडिएंट: 0% [b] से १००% [b] ३००० मिलीलीटर से अधिक, संग्रह: सभी एकत्र करें, भिन्न आकार: २५० मिलीलीटर ।
    8. पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी)8 या गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-MS)8द्वारा अंशों का विश्लेषण, और एकाग्रता शूंय के तहत रोटरी वाष्पीकरण के माध्यम से ब्याज की यौगिक युक्त भिन्न (ओं) सूखापन के लिए ।
  2. पवित्रता के वांछित स्तर तक पहुंच जाता है जब तक बहाव ठीक शोधन प्रदर्शन ।
    नोट: बहाव ठीक शुद्धि पूरी तरह से विशिष्ट यौगिक है और यह मानकीकृत कदम प्रदान करने के लिए संभव नहीं है (चर्चा अनुभाग देखें).

Representative Results

ठेठ पृथक पैदावार जांच के तहत एंजाइम/एंजाइम संयोजन पर निर्भर कर रहे हैं, लक्ष्य यौगिक की रासायनिक स्थिरता, और कैसे चुनौतीपूर्ण शुद्धिकरण की प्रक्रिया थी । हम पहले हमारे मिश्रित से लेकर β-amyrin डेरिवेटिव की अलग पैदावार की सूचना दी है ०.१२ से लेकर ३.८७ मिलीग्राम सूखी N. benthamiana पत्ता पाउडर के प्रति ग्राम । इन यौगिकों ऑक्सीकरण के स्तर में व्यापक रूप से, और एंजाइमों (चित्रा 3)8के अप्राकृतिक संयोजन शामिल थे । इस प्रोटोकॉल नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता है दसियों या एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी और बहाव कार्यात्मक परख द्वारा संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए शुद्ध उत्पाद की मिलीग्राम के सैकड़ों उत्पादन । हम भी ९८% से अधिक की शुद्धता पर triterpene पाड़ β-amyrin के ०.८ ग्राम उत्पादन द्वारा इस मंच के preparative उपयोगिता का प्रदर्शन किया है । इस प्रयोग ४५९ पौधों का इस्तेमाल किया, और ३.३ सूखी N benthamiana पत्ता पाउडर8के ग्राम प्रति मिलीग्राम की एक अलग उपज का प्रतिनिधित्व करता है ।

Figure 1
चित्रा 1: योजनाबद्ध सारांश । नई उच्च मूल्य triterpene उत्पादों के preparative उत्पादन की दिशा में 2, 3-oxidosqualene के अंतर्जात की आपूर्ति को हटाने के लिए एन benthamiana पत्ती में कृत्रिम एंजाइमों के क्षणिक अभिव्यक्ति का शोषण प्रक्रिया का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: वैक्यूम खदेड़ा निर्माण और प्रक्रिया. a) Bespoke संयंत्र धारक एक विंग अलग । ख) Bespoke संयंत्र धारक पंख संलग्न । ग) पौधों का उलटा और डुबकी । घ) घुसपैठ स्नान की प्रविष्टि । ङ) घुसपैठ कक्ष के भीतर जगह में घुसपैठ स्नान । च) पूर्ण वैक्यूम खदेड़ा: (1) वैक्यूम पम्प (2) वैक्यूम पम्प से वैक्यूम जलाशय तक कनेक्शन (3) वैक्यूम जलाशय अलगाव वाल्व (4) वैक्यूम जलाशय और घुसपैठ चैंबर के बीच संबंध (5) दबाव गेज (6) एयर सेवन वाल्व (7) घुसपैठ चैंबर (8) वैक्यूम जलाशय । छ) एक संयंत्र से प्रतिनिधि पत्ते पांच दिनों के बाद घुसपैठ विकास के बाद एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के लिए निर्माण अभिव्यक्ति के साथ घुसपैठ की । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: इस प्रोटोकॉल8का उपयोग कर β-amyrin डेरिवेटिव के preparative उत्पादन के लिए पहले से रिपोर्ट प्रतिनिधि परिणाम. यह सारणी पृथक पैदावार के क्रम में है । स्तंभों के सापेक्ष मान के रंग संकेत के साथ सशर्त स्वरूपित हैं । लाल = उच्च, हरा = कम (हालांकि मध्यवर्ती पीला) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

उच्च के माध्यम से डाल वैक्यूम घुसपैठ इस प्रोटोकॉल नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला में विभिंन अनुप्रवाह अनुप्रयोगों के लिए ब्याज की triterpene यौगिकों के preparative उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति देता है । यहां वर्णित वैक्यूम घुसपैठ उपकरण आसानी से दोहराया जाता है । वैक्यूम जलाशय के अलावा आवश्यक निर्वात खींचने के लिए आवश्यक समय कम करने के लिए सलाह दी जाती है, लेकिन यह बस घुसपैठ चैंबर के रूप में एक संशोधित वैक्यूम ओवन repurpose करने के लिए संभव है. एक उपयुक्त संघनित्र के अलावा वैक्यूम पंप की रक्षा सैद्धांतिक रूप से समझदार है, लेकिन हमारी प्रयोगशाला में हम इस पाया है कि अनावश्यक है ।

अगर विपत्तियों को पूरी तरह से घुसपैठ के निलंबन में नहीं डुबोया जाता है तो घुसपैठ कवरेज समझौता है । यह समस्या यह सुनिश्चित करने से कम है कि निलंबन का स्तर संयंत्र धारक की शीर्ष सतह तक पहुंचता है, और यह कि प्लांट धारक घुसपैठ स्नान के लिए चुस्त फिट है । चित्रा 2 से ध्यान दें कि संयंत्र धारक के ऊपर की सतह में घुसपैठ स्नान करने के लिए जब जगह में अवकाश है । यह धारक जो घुसपैठ स्नान के शीर्ष के साथ लंगर बिंदु फार्म के मध्य किनारों पर पैनलों द्वारा हासिल की है । घुसपैठ निलंबन को निलंबन का स्तर बनाए रखने के लिए आवधिक परिवर्धन की आवश्यकता होगी । यह सबसे अच्छा अतिरिक्त घुसपैठ निलंबन के अलावा एक बड़े बैच वार घुसपैठ के पाठ्यक्रम पर आयुध डिपो६०० की क्रमिक कटौती को रोकने के द्वारा हासिल की है । हालांकि, हमारे हाथ में, पानी के लिए प्रतिस्थापन के लिए एक preparative पैमाने पर उंमीद की पैदावार पर एक नजर प्रभाव नहीं लगता है, हालांकि इस quantitively जांच नहीं किया गया है । घुसपैठ के एक बैच से कितने संयंत्रों में घुसपैठ हो सकती है निलंबन अब भी खुला सवाल है । हम नियमित रूप से घुसपैठ निलंबन के एक बैच के साथ १०० और २०० संयंत्रों के बीच घुसपैठ । इसके अलावा, घुसपैठ की प्रक्रिया के दौरान घुसपैठ निलंबन के दौरान कुछ मिट्टी नमकीन पानी के लिए सामांय है । इस वजह से घुसपैठ की प्रभावकारिता पर कोई असर नजर नहीं आ पाया है.

फसल के दौरान यह सलाह दी जाती है (लेकिन महत्वपूर्ण नहीं) केवल पत्ते कि घुसपैठ कर रहे थे (कुछ पत्तियों के बाद हो जाएगा घुसपैठ) । चयनात्मक फसल अनुत्पादक ऊतक, जो अंयथा ब्याज की यौगिक के सापेक्ष अंतर्जात अशुद्धियों के अनुपात में वृद्धि होगी के साथ कमजोर पड़ने रोकता है । यह बहाव शोधन की आसानी पर नाममात्र का प्रभाव पड़ता है, और इन प्रक्रियाओं के पैमाने बढ़ जाती है । जब tHMGR का उपयोग करने के लिए अग्रदूत साबित आपूर्ति को बढ़ावा देने के लिए, एक necrosed phenotype अक्सर बाद घुसपैठ वृद्धि की अवधि में विकसित करने के लिए मनाया जाता है । यह सामांय है और वास्तव में एड्स चयनात्मक फसल और बहाव सुखाने की प्रक्रिया । सूखे पत्ते पाउडर आमतौर पर एक सील कंटेनर में एक शांत, सूखी, अंधेरी जगह में संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन आदर्श रूप में एक desiccator में शूंय के तहत । यह रुचि के यौगिक की स्थिरता पर निर्भर करता है । अगर एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करने के लिए चुनने सावधानी बरतें । यह सुनिश्चित करें कि सूखे पत्ते एक निविड़ अंधकार कंटेनर में हैं, और भंडारण से हटाने पर, इस कंटेनर को खोलने से पहले कमरे के तापमान को गर्म करने की अनुमति दें । ऐसा करने में विफलता पत्तियों के पुनः गीला करने में परिणाम होगा, नीचे बाधा-धारा प्रसंस्करण ।

इस प्रोटोकॉल में बाद फसल कदम गाये प्रयोजनों के लिए प्रदान की जाती हैं, और उन शोधकर्ताओं जो व्यावहारिक रसायन विज्ञान अनुभव सीमित हो सकता है सहायता । वे कई अंय प्राकृतिक उत्पाद निष्कर्षण के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता/ परिचय में विस्तृत रूप में, सार्वजनिक उपक्रम के कई फायदे हैं, लेकिन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सार्वजनिक उपक्रम उपकरण की पूंजी लागत निषेध हो सकता है, और यह आवश्यक नहीं है । बुनियादी आयन-विनिमय राल उपचार एक बहुत ही सुविधाजनक तरीका पारंपरिक तरल द्वारा पीछा किया saponification की जगह/ हालांकि, यह carboxylic एसिड समूहों या कार्यात्मक समूहों है कि ऐसे एस्टर के रूप में बुनियादी स्थितियों, के तहत hydrolyzed होगा युक्त उत्पादों के लिए उपयुक्त नहीं है । इन उत्पादों को बुनियादी आयन एक्सचेंज राल पर बनाए रखने की उंमीद होगी । हालांकि, वहां एक को पकड़ने और जारी प्रक्रिया के लिए इस शोषण की क्षमता है (यहां प्रलेखित नहीं) । जहां पारंपरिक saponification उचित होगा, बुनियादी आयन-विनिमय राल उपचार एक सुविधाजनक विकल्प के रूप में कार्य करता है । चरण 9 में वर्णित क्रोमैटोग्राफी पद्धति, आरेख 3में वर्णित यौगिकों के लिए सामांयीकरण करने के लिए पाया गया है । हालांकि, वृद्धि हुई ध्रुवीय यौगिकों एक विस्तारित १००% एथिल एसीटेट रेफरेंस अवधि की आवश्यकता हो सकती है । ९.२ कदम के संदर्भ के साथ, बहाव ठीक शुद्धि पूरी तरह से विशिष्ट यौगिक है, और यह भी पैमाने पर निर्भर है । अनुकूलित ढाल के साथ छोटे पैमाने पर फ्लैश क्रोमैटोग्राफी के दोहराया दौर, आमतौर पर एक एनएमआर विश्लेषण के लिए उपयुक्त पवित्रता प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है । बड़े पैमाने पर, क्रिस्टलीकरण अक्सर एक सुविधाजनक विकल्प है । कठिन मामलों में, preparative या अर्द्ध preparative उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) अलग यौगिक की वांछित मात्रा के आधार पर नियोजित किया जा सकता है । प्रतिनिधि यौगिकों की एक सीमा के लिए बहाव शोधन प्रक्रियाओं के उदाहरण8कहीं और पाया जा सकता है ।

वर्तमान प्रोटोकॉल, के रूप में यहां प्रस्तुत, हमारी प्रयोगशाला में नियमित रूप से प्रयोग किया जाता है, और सिद्ध उपयोगिता है । हालांकि, अभिव्यक्ति प्लेटफ़ॉर्म के आगे अनुकूलन के लिए अभी भी महत्वपूर्ण गुंजाइश है । काम हमारी प्रयोगशाला में चल रहा है कि कैसे आगे मार्ग इंजीनियरिंग और प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के अंतर नियंत्रण triterpene उत्पादन में सुधार और आगे की जांच कर सकता है, जबकि की मेजबानी कोशिकाओं को विषाक्तता मध्यस्थता । वहां भी intracellular परिवहन प्रणालियों20,21के हेरफेर की जांच करने की क्षमता है, और विभिंन सेलुलर डिब्बों को एंजाइमों की दिशा22,23, रास्ते जो सुधार सकता है कई ऑक्सीकरण घटनाओं की दक्षता । महत्वपूर्ण organelles की अंतर्निहित आकृति विज्ञान को संशोधित करने के संभावित लाभों का भी पता लगाया जा सकता है । उदाहरण के लिए, Arabidopsis थालियाना HMGR की झिल्ली डोमेन के एक्सप्रेस24पौधों में endoplasmic जालिका के अतिवृद्धि प्रेरित करने के लिए मनाया गया है; CYP450 गतिविधि के लिए एक महत्वपूर्ण साइट । इस प्रोटोकॉल आदर्श मिलीग्राम के उत्पादन के लिए ग्राम triterpene उत्पादों के पैमाने मात्रा के लिए अनुकूल है, और एक अनुसंधान स्थापित करने के लिए बहाव के अध्ययन के लिए यौगिकों का उपयोग करने में नियोजित किया जा सकता है (जैसे, संरचना की व्यवस्थित अंवेषण-गतिविधि रिश्ते, और नैदानिक ब्याज की सीसा यौगिकों के pharmacodynamic और pharmacokinetic गुण में प्रारंभिक जांच) । हालांकि, मंच रैखिक और मज़बूती से इस्तेमाल किया पौधों की संख्या में वृद्धि से बस स्केलेबल है, और agroinfiltration के माध्यम से क्षणिक अभिव्यक्ति की व्यावहारिकता दवा प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक औद्योगिक पैमाने पर प्रदर्शन किया गया है 14, इस प्रकार इस मंच के लिए क्षमता है उच्च मूल्य triterpenes के वाणिज्यिक उत्पादन के लिए बढ़ाया जाएगा । वैकल्पिक रूप से, यह भी स्थिर transformants के उत्पादन को अंतिम रूप देने की इच्छा multigene कृत्रिम मार्ग ले जाने की कल्पना संभव है, बड़े पैमाने पर खेती और ट्रांसजेनिक एन benthamiana उपभेदों के ' जारी खेती ' की अनुमति वाणिज्यिक मूल्य के विभिंन यौगिकों का उत्पादन ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम एक नॉर्विच अनुसंधान पार्क के छात्र द्वारा समर्थित किया गया था (जूनियर), संयुक्त इंजीनियरिंग और भौतिक विज्ञान अनुसंधान परिषद/जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद (BBSRC)-वित्त पोषित OpenPlant सिंथेटिक जीव विज्ञान अनुसंधान केंद्र अनुदान (BB /L014130/1) (M.J.S., A.O.); एक जॉन Innes सेंटर नॉलेज एक्सचेंज और व्यावसायीकरण अनुदान (BB/KEC1740/1) (बीएसफ); और BBSRC संस्थान सामरिक कार्यक्रम अनुदान ' प्रकृति से अणु ' (BB/P012523/1) और जॉन Innes फाउंडेशन (A.O.) । हम pEAQ वैक्टर और फोटोग्राफी के लिए एंड्रयू डेविस प्रदान करने के लिए जॉर्ज Lomonossoff शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GC-MS instrument any n/a
Thermocycler suitable for performing PCR reactions any n/a
Gel electrophoresis apparatus any n/a
Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) any n/a
Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L) any n/a
Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/> 15000 rpm) any n/a
Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/> 4000 rpm) any n/a
Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/> 4000 rpm) any n/a
Standing incubator any n/a
Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L) any n/a
Centrifuge bottles (1 L) any n/a
Vacuum infiltration apparatus bespoke n/a
9 x 9 cm plant pots any n/a
Freeze drying apparatus (=/> 8 litre condenser capacity) any n/a
Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument) Buchi SpeedExtractor E-914
Rotary evaporator apparatus any n/a
Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L) any n/a
Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L) any n/a
Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L) any n/a
Spatulas (assorted sizes) any n/a
Analytical balance (5 figures) any n/a
Balance (2 figures) any n/a
Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L) any n/a
A -80 freezer any n/a
Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument Biotage ISO-1EW
Safety glasses any n/a
Lab coat any n/a
Autoclave any n/a
Consumables
Micropipette tips (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) any n/a
Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL) any n/a
Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL) any n/a
Disposable Transfer pipettes (size 2 mL) any n/a
Petri dishes (Size: 100 mL) any n/a
Biotage® SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges Biotage FSK0-1107-0100
HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps any n/a
Disposable purple nitrile gloves any n/a
Top filter for E-914, cellulose Buchi 51249
Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber Buchi 11055932
Reagents
Quartz sand, 0.3 - 0.9 mm Buchi 37689
Celite 545 (diatomaceous earth) Simga-Alrich 22140-1KG-F
Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm) Merck 1.09385.5000
2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid Melford B2002
MgCl2 Simga-Alrich 208337-100G
KOH Simga-Alrich 60377-1KG
3’5’-dimethoxy-4’-acetophenone (acetosyringone) Simga-Alrich D134406-1G
Rifampicin Alfa Aesar J60836
Kanamycin sulfate Gibco 11815-032
Streptomycin Simga-Alrich S6501-100G
Gentamycin MP biomedicals 190057
Agarose LE gel Melford MB1203
LB broth Millar Simga-Alrich L3522-250G
Agar Simga-Alrich A5306-250G
NaCl Simga-Alrich S5886-500G
KCl Simga-Alrich P9541-500G
MgSO4.7H2O Sigma-Alrich M2773-500G
Glucose Sigma-Alrich G7021-100G
Ambersep® 900 hydroxide (basic ion exchange resin) Sigma-Alrich 06476-1KG
Hexane Fisher H/0406/PB17
Ethyl acetate Fisher E/0900/PB17
Dichloromethane Fisher D/1852/PB17
Methanol Fisher M/4056/PB17
Ethidium bromide Sigma-Alrich E7637-1G
Ethanol VWR 20821-330
Milli-Q water any n/a
Levington F1 Compost any n/a
Levington F2 Compost any n/a
QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit). Qiagen 27104
NEB 5-alpha Competent E. coli Supplier New England Biolabs Ltd C2987I
pEAQ-HT-DEST1 vector Lomonossoff laboratory John Innes Center n/a
pDONR207 Thermo-Fisher pDONR207
A. tumefaciens LBA4404 Thermo-Fisher 18313015
GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) Thermo-Fisher 11791020
GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) Thermo-Fisher 11789020
GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX Promega UK Ltd M7822
PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE New England Biolabs Ltd M0530S
dNTP SET 100mm Thermo-Fisher 10297018
RNEASY PLANT MINI KIT Qiagen Ltd 74904
RQ1 RNASE-FREE DNASE Promega UK Ltd M6101
Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System Fisher 10308632
Trytone Sigma-Alrich T7293-250G
Nicotiana benthamiana seeds any reputable supplier n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thimmappa, R., et al. Triterpene biosynthesis in plants. Annual Review of Plant Biology. 65, 225-257 (2014).
  2. Seki, H., Tamura, K., Muranaka, T. P450s and UGTs: Key players in the structural diversity of triterpenoid saponins. Plant Cell Physiology. 56 (8), 1463-1471 (2015).
  3. Roy, A., Saraf, S. Limonoids: overview of significant bioactive triterpenes distributed in plants kingdom. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 29 (2), 191-201 (2006).
  4. Kamble, S. M., Goyal, S. N., Patil, C. R. Multifunctional pentacyclic triterpenoids as adjuvants in cancer chemotherapy: a review. RSC Advances. 4 (63), 33370-33382 (2014).
  5. Liby, K. T., Sporn, M. B. Synthetic oleanane triterpenoids: multifunctional drugs with a broad range of applications for prevention and treatment of chronic disease. Pharmacological Reviews. 64 (4), 972-1003 (2012).
  6. Yadav, V. R., et al. Targeting inflammatory pathways by triterpenoids for prevention and treatment of cancer. Toxins. 2 (10), 2428-2466 (2010).
  7. Christensen, L. P. Ginsenosides chemistry, biosynthesis, analysis, and potential health effects. Advances in Food and Nutrition Research. 55, 1-99 (2009).
  8. Reed, J., et al. A translational synthetic biology platform for rapid access to gram-scale quantities of novel drug-like molecules. Metabolic Engineering. 42, 185-193 (2017).
  9. Andersen-Ranberg, J., et al. Expanding the landscape of diterpene structural diversity through stereochemically controlled combinatorial biosynthesis. Angewandte Chemie International Edition. 55 (6), 2142-2146 (2016).
  10. Peyret, H., Lomonossoff, G. P. The pEAQ vector series: the easy and quick way to produce recombinant proteins in plants. Plant Molecular Biology. 83, 51-58 (2013).
  11. Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants. Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).
  12. Sainsbury, F., Lomonossoff, G. P. Extremely high-level and rapid transient protein production in plants without the use of viral replication. Plant Physiology. 148 (3), 1212-1218 (2008).
  13. Voinnet, O., et al. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. The Plant Journal. 33 (5), 949-956 (2003).
  14. Holtz, B. R., et al. Commercial-scale biotherapeutics manufacturing facility for plant-made pharmaceuticals. Plant Biotechnology Journal. 13 (8), 1180-1190 (2015).
  15. Bucar, F., Wubea, A., Schmidb, M. Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds. Natural Product Reports. 30, 525-545 (2003).
  16. Kaufmann, B., Christen, P. Recent extraction techniques for natural products: microwave-assisted extraction and pressurised solvent extraction. Phytochemical Analysis. 13 (2), 105-113 (2002).
  17. Larsen, E., Christensen, L. P. Simple saponification method for the quantitative determination of carotenoids in green vegetables. Journal of Archaeological and Food Chemistry. 53 (17), 6598-6602 (2005).
  18. Sainsbury, F., et al. Using a virus-derived system to manipulate plant natural product biosynthetic pathways. Methods Enzymology. , 185-202 (2012).
  19. Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA Cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research. 10, 1788-1795 (2000).
  20. Ting, H., et al. SNARE-RNAi results in higher terpene emission from ectopically expressed caryophyllene synthase in Nicotiana benthamiana. Molecular Plant. 8, 454-466 (2015).
  21. Wang, B., et al. Transient production of artemisininin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua. Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).
  22. Nielsen, A. Z., et al. Redirecting photosynthetic reducing power toward bioactive natural product synthesis. ACS Synthetic Biology. 2, 308-315 (2013).
  23. Dong, L., et al. Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments. New Phytologist. 209, 679-690 (2016).
  24. Ferrero, S., et al. Proliferation and morphogenesis of the endoplasmic reticulum driven by the membrane domain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A reductase in plant cells. Plant Physiology. 168, 899-914 (2015).

Tags

जैव रसायन १३८ अंक निकोटियाना benthamiana निर्वात घुसपैठ क्षणिक अभिव्यक्ति agroinfiltration triterpenes हाइपर-अनुवाद गाय मटर मोज़ेक वायरस प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली
एक Preparative पैमाने पर Triterpene उत्पादन के लिए <em>निकोटियाना Benthamiana</em> पत्तियों में क्षणिक अभिव्यक्ति
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stephenson, M. J., Reed, J.,… More

Stephenson, M. J., Reed, J., Brouwer, B., Osbourn, A. Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale. J. Vis. Exp. (138), e58169, doi:10.3791/58169 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter