Summary
Transitoria expresión heteróloga de enzimas biosintéticas en las hojas de Nicotiana benthamiana puede desviar fuentes endógenas de 2,3-oxidosqualene hacia la producción de nuevos productos de alto valor triterpeno. Es en este documento se describe un protocolo detallado para rápido (5 días) escala de preparativo de triterpenos y análogos utilizando esta potente plataforma basada en plantas.
Abstract
Los triterpenos son uno de los más grandes y más familias estructuralmente diversas de productos naturales. Muchos derivados triterpénicos han demostrado poseer actividad biológica medicinal relevante. Sin embargo, hasta ahora este potencial no se ha traducido en una gran cantidad de medicamentos derivados de triterpenos en la clínica. Podría decirse que se trata (al menos parcialmente) una consecuencia de acceso sintético práctico limitado a esta clase de compuesto, un problema que puede sofocar la exploración de las relaciones estructura-actividad y desarrollo de llevar candidatos por tradicionales medicinales flujos de trabajo de química. A pesar de su inmensa diversidad, triterpenos todos derivan de un único precursor lineal, oxidosqualene 2.3. Transitoria expresión heteróloga de enzimas biosintéticas en N. benthamiana puede desviar fuentes endógenas de 2,3-oxidosqualene hacia la producción de nuevos productos de alto valor triterpeno que no son producidos naturalmente por este host. Infiltración del agro es un medio eficiente y simple para lograr la expresión transitoria en N. benthamiana. El proceso consiste en la infiltración de hojas de las plantas con una suspensión de Agrobacterium tumefaciens llevando la construct(s) de expresión de interés. La infiltración de un adicional de a. tumefaciens cepa lleva una construcción de expresión codificación enzima que aumenta el suministro de precursores significativamente aumenta los rendimientos. Después de un período de cinco días, el material de hoja infiltrada puede cosechado y procesado para extraer y aislar los productos resultantes del triterpeno. Este es un proceso que es linealmente y confiablemente escalable, simplemente incrementando el número de plantas utilizadas en el experimento. Es en este documento se describe un protocolo para la rápida producción a escala de preparativo de triterpenos utilizando esta plataforma basada en plantas. El protocolo utiliza un aparato de vacío fácilmente replicable de la infiltración, que permite la infiltración simultánea de hasta cuatro plantas, lo que permite la infiltración batch-wise de cientos de plantas en un corto período de tiempo.
Introduction
Los triterpenos son uno de los más grandes y más familias estructuralmente diversas de productos naturales. A pesar de su inmensa diversidad, triterpeno todos los productos naturales se creen para ser derivado del mismo precursor lineal 2,3-oxidosqualene, un producto de la vía del mevalonato en plantas. Ciclización del oxidosqualene 2.3 es iniciado y controlado por una familia de enzimas denominado cyclases del oxidosqualene (OSCs). Este paso de ciclización representa el primer nivel de diversificación, con cientos de andamios diferentes triterpeno haber divulgado de la naturaleza1. Estos andamios están más diversificados por sastrería enzimas incluyendo pero no limitado a, cytochrome p450s (CYP450s)1,2. Tales vías biosintéticas pueden llevar a complejidad inmensa, a veces dando por resultado productos finales que son apenas reconocibles desde el triterpeno del padre. Por ejemplo, la estructura compleja de la potente insecticida y antialimentario limonoide de azadiractina se cree que derivan de un triterpeno tetracíclico de los tirucallane tipo3.
Muchos derivados de triterpenos productos naturales, incluso aquellos con andamios de padres relativamente sin modificar, han demostrado poseer actividad biológica medicinal relevantes4,5,6,7. Sin embargo, hasta ahora este potencial no se ha traducido en una gran cantidad de medicamentos derivados de triterpenos en la clínica. Podría decirse que se trata (al menos parcialmente) una consecuencia de acceso sintético práctico limitado a esta clase de compuesto, un problema que puede sofocar la exploración de las relaciones estructura-actividad y desarrollo de llevar candidatos por tradicionales medicinales flujos de trabajo de química.
La expresión transitoria de las enzimas biosintéticas triterpeno de otras especies de plantas en hojas de N. benthamiana puede desviar fuentes endógenas de 2,3-oxidosqualene hacia la producción de nuevos productos de alto valor triterpeno (figura 1). Este proceso puede utilizarse para caracterizar funcionalmente enzimas candidato y reconstruir las vías de biosíntesis de metabolitos natural importantes. Igualmente, también puede ser explotada en enfoques biosíntesis combinatorios triterpeno nuevos productos, una estrategia que puede resultar en bibliotecas de análogos estructuralmente relacionados, que permite la exploración sistemática de las relaciones estructura y actividad de plomo biológicamente activo, compuestos de8,9.
Agroinfiltration es un medio eficiente y simple para lograr la expresión transitoria en hojas de N. benthamiana . El proceso consiste en la infiltración de hojas con una suspensión de a. tumefaciens llevando la expresión binaria construct(s) de interés. Esto se logra mediante la aplicación de presión que fuerza el líquido a través de los estomas, desplazando el aire en el espacio intercelular y sustituirla por la suspensión de a. tumefaciens . La bacteria transferir las respectivas DNAs de T al interior de las células de la planta, dando por resultado la expresión de la proteína localizada y transitoria en el tejido de la hoja infiltrada.
Mientras que cualquier vector binario adecuado para generar plantas transgénicas puede ser empleado para la expresión transitoria, utilizamos derivados del fríjol mosaico Virus CPMV Hypertranslational (HT) proteína expresión sistema10, 11. en este sistema el gen de interés es flanqueado por regiones no traducidas (UTR) de CPMV RNA-2. El UTR 5' contiene modificaciones dando como resultado niveles muy elevados de la traducción de la proteína con ninguna dependencia de la replicación viral12. Esta técnica se ha convertido en la serie de vector binario de fácil y rápido (pEAQ) que incluye la recombinación específica del sitio clonación compatible con protocolo de construcciones (pEAQ -HT- DEST)10,11. La mayoría pEAQ vectores contienen también un tomate achaparramiento arbustivo derivado de virus P19 silenciamiento supresor gen13 dentro de la porción del T-ADN del cassette de expresión, que evita la necesidad de coinfiltrate una cepa de P19-llevar separada y es muy expresión de proteínas de alto nivel en la sede de la planta celular10,11.
El uso de N. benthamiana como un anfitrión de expresión tiene ventajas particulares cuando se trabaja con vías biosintéticas de la planta. La arquitectura de la célula apoya intrínsecamente correspondiente mRNA y proteína procesamiento y compartimentación adecuada, además de poseer la necesarias Co-enzimas, reductasas (para CYP450s) y precursores metabólicos. La fuente de carbono es la fotosíntesis; así, simplemente pueden cultivarse plantas en compost de buena calidad, que requieren sólo agua, CO2 (desde el aire) y la luz del sol como entradas. La plataforma es también muy conveniente para la expresión de diferentes combinaciones de proteínas, como esto puede lograrse suelen Co la infiltración de diferentes cepas de a. tumefaciens, negando la necesidad de construir grandes expresión multigénica cassettes. Además, el proceso puede ser linealmente y confiablemente escala simplemente incrementando el número de plantas utilizadas en el experimento.
Trabajos previos en nuestro laboratorio han demostrado la utilidad de esta plataforma de experimentos escala preparativa. Esto incluye la preparación de nuevos triterpenos para uso en ensayos de bioactividad y escala hasta alcanzar cantidades de gramo del producto aislado. Además, se puede aumentar la acumulación de productos heterogéneos triterpeno varios doblan coexpresión de una forma truncada N-terminal, insensible a la retroalimentación de la 3-hidroxi, 3-methyglutary-coenzima A reductasa (tHMGR), una limitación de velocidad por aguas arriba enzima en el camino de mevalonate8.
Clave para tales experimentos escala preparativo es capaz convenientemente para arriba-escala el proceso de infiltración. En un experimento típico, se requiera decenas a cientos de plantas para lograr la cantidad de destino del producto aislado. Infiltración de hojas individuales a mano (utilizando una jeringa no hace falta) es operacionalmente exigente y a menudo prohibitivo desperdiciador de tiempo, haciendo este método impráctico para escala-para arriba rutinario. Infiltración vacío ofrece ventajas sobre la infiltración de la mano, ya que no es dependiente en el nivel de habilidad del operador y permite la infiltración de una mayor área de la superficie foliar. Este procedimiento se utiliza comercialmente para la producción a gran escala de proteínas farmacéuticas14. Este protocolo utiliza un aparato de infiltración vacío fácilmente replicables, que puede construirse de piezas disponibles en el mercado. Esto permite la infiltración simultánea de hasta 4 plantas, con infiltración batch-wise rápida y práctica de cientos de plantas en un corto periodo de tiempo (Figura 2a -2b). El aparato de vacío de infiltración consiste en un horno de vacío que forma la cámara de infiltración (figura 2f). El horno está conectado a una bomba a través de un depósito vacío. Esto reduce considerablemente el tiempo necesario para lograr el vacío deseado en la cámara de infiltración. Las plantas son garantizadas en un soporte a medida e invertidas en un baño de agua de acero inoxidable de 10 L con suspensión de a. tumefaciens (Figura 2a -2 c). Inmersión completa de las partes aéreas de las plantas es importante infiltración eficiente. El baño de agua se coloca dentro de la cámara de infiltración (Figura 2d -2e) y el vacío aplicado para dibujar el aire de los espacios intersticiales de la hoja. Una vez que la presión se ha reducido en 880 mbar (un proceso que toma aproximadamente 1 minuto) la cámara de infiltración vuelva rápidamente a la presión atmosférica 20-30 s con la apertura de la válvula de entrada del horno, con lo cual la infiltración es completa.
Cinco días después de la infiltración el material vegetal está listo para la cosecha y la posterior extracción y aislamiento del producto deseado. Desde este punto el proceso es simplemente uno de los productos naturales extracción y purificación a partir de material de la hoja, un flujo de trabajo que es familiar a cualquier químico de productos naturales. Muchos diversos métodos de extracción inicial y posterior purificación existen15. La opción más adecuada de los métodos y las condiciones exactas que se utiliza es altamente dependiente de las propiedades químicas del compuesto de interés, además de la disponibilidad de destrezas y/o equipo. No es posible incluir en este protocolo un método totalmente generalizable, paso a paso para la transformación aguas abajo de la hoja cosechada de la planta al producto aislado que podría seguir ciegamente cualquier producto triterpeno de interés, ni sería apropiado para intentar hacerlo. Sin embargo, este protocolo proporcionará una visión general del flujo de trabajo básico utilizado en nuestro laboratorio y algunos métodos para las primeras etapas del proceso, que en nuestra experiencia han demostrado ser generalizables para los productos de triterpeno aglicona más oxigenados. Esto incluye dos técnicas relativamente poco común, es decir, extracción de solvente presurizado (PSE) y un método conveniente de fase heterogénea para eliminación de clorofila usando una resina de intercambio iónico fuertemente básico.
PSE es una técnica muy eficiente para la extracción de pequeñas moléculas orgánicas de matrices sólidas. Las extracciones se realizan bajo presión (ca. 100-200 bar), la principal ventaja es la habilidad de usar temperaturas aliviadas que excedan el punto de ebullición punto del solvente de extracción. Esto puede reducir significativamente el tiempo y la cantidad de disolvente necesaria para lograr una extracción exhaustiva, en comparación con otras técnicas solvente caliente como reflujo simple o de extracciones Soxhlet16. Comercial Banco PSE instrumentos están disponibles, que utilizan las células de extracción intercambiables y solvente automatizado manejo, calefacción y control. Esto hace que esta técnica muy conveniente. También es sin duda menos peligroso, particularmente para los operadores con experiencia de química práctica limitada.
Saponificación de los extractos de hoja cruda bajo seguido de partición líquido/líquido de reflujo es una técnica común para el retiro a granel de clorofilas antes de purificación posterior o análisis. Sin embargo, esto puede a menudo ser operacionalmente exigentes en escalas más grandes. Además, la detección de la interfaz, o pérdida del producto debido a la formación de emulsiones puede ser problemática. El uso de resinas de intercambio iónico fuertemente básico para llevar a cabo la hidrólisis de fase heterogénea puede servir como una alternativa conveniente. La porción pigmentada de la clorofila hidrolizada permanece adherida a la resina y puede eliminarse simplemente por filtración. Este protocolo utiliza una adaptación de la escala preparativa de un procedimiento analítico previamente divulgados17 que emplea una resina de intercambio iónico básicas disponibles en el mercado.
A continuación se describe un protocolo detallado y rápido para la producción a escala preparativa de triterpenos utilizando esta plataforma basada en plantas. Este protocolo se utiliza rutinariamente en nuestro laboratorio para preparar decenas hasta cientos de miligramos de producto triterpeno aislado para aplicaciones tal una caracterización por espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), o estudiar más funcional ensayos.
Protocol
Nota: Antes de seguir este protocolo, familiarizarse con los datos de seguridad del material para todas las sustancias utilizadas y tomar precauciones de seguridad apropiadas. Éstos incluyen pero no están limitados a: usar gafas de seguridad cuando se trabaja con el vidrio bajo vacío y el manejo de Silicagel seco en un armario del humo. También es esencial que la legislación local con respecto a trabajar con material transgénico es comprobada y observada, incluyendo siguientes apropiados procedimientos de contención.
1. generar cepas de a. tumefaciens para infiltración
Nota: Aquí proporcionamos una descripción simplificada de los pasos necesarios para generar adecuados a. tumefaciens cepas de expresión transitoria. Más detalles de estos pasos son descritos por Sainsbury et al. 8.
- Amplificar por PCR o sintetizar la proteína codificación región del gen de interés flanqueado por secuencias attB 5' y 3' adecuadas para la generación de un clon de una entrada para el uso con una recombinación específica del sitio clonación protocolo18,19.
- Use primer avance: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTANNNNNNNNNNNNNNNNNN, primer revés: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTANNNNNNNNNNNNNNNNNN (NNNN... = secuencia de secuencia específica).
- Condiciones PCR (representantes) del uso: almacenador de intermediario (25 μl, total), mezcla de reacción (x 5, 5 μl, véase Tabla de materiales), dNTPs (10 mM, 0,5 μl), primer avance (10 μm, 1,25 μl), primer revés (10 μm, 1,25 μl), plantilla de ADN (concentración variable, 50-250 ng), 0.5 μl ), Polimerasa de la DNA (2000 U/mL, 0.25 μl, véase Tabla de materiales), agua libre de nucleasas (para 25 μl). Ejecutar el termociclador como sigue: desnaturalización inicial (98 ° C, 30 s); iniciar el ciclo (98 ° C, 30 s; 45 – 72 ° C, 20 s; 72 ° C, 30 s/kb) terminar ciclo; 35 ciclos; extensión final (72 ° C, 10 minutos).
- Seguir una estándar recombinación específica del sitio clonación protocolo18,19 para generar un clon de entrada usando cualquier vector de entrada no basado en la kanamicina (usamos pDONR207 que está comercialmente disponible).
Nota: La integridad de la copia de entrada debe ser confirmada por secuenciación, antes de usar para generar pEAQ -HT-DEST1 construcción de expresión. PEAQ -HT-DEST1 está disponible a petición del laboratorio Lomonossoff en el centro John Innes en Norwich, Reino Unido. - Aislar la pEAQ -HT-DEST1 vector del clon de expresión generada en paso 1.1.3 y almacenar a-20 ° C antes de usarlo en el paso 1.3.
Nota: Cualquier kit de purificación de plásmido basada en columna de giro conveniente disponible en el mercado diseñado para la extracción de plásmidos de cepas de e. coli la clonación es conveniente. Siga las instrucciones específicas de la purificación del plásmido solicitadas kit (véase Tabla de materiales).
- Preparar químicamente competentes a. tumefaciens para la transformación.
- Inocular un LB selectivo (medio de Luria-Bertani: bacto-triptona 10 g/L, 10 g/L de NaCl y 5 g/L Extracto de levadura, agar 10 g/L, pH 7.0) placa de agar (50 rifampicina μg/mL, estreptomicina 100 μg/mL), por rayas de a. tumefaciens LBA4404 de un cultivo stock de glicerol. Incubar durante una noche a 28 ° C en un incubador de pie.
- Sembrar 50 mL de medio LB líquido selectivo (50 rifampicina μg/mL, estreptomicina 100 de μg/mL) con una muestra de las células a. tumefaciens LBA4404 paso 1.2.1. Incubar durante una noche a 28 ° C en un incubador de agitación a 200 rpm.
- Enfriar la cultura del paso 1.2.2 en hielo durante 10 min y luego sedimenten las células a. tumefaciens por centrifugación a 4 ° C y 4500 x g durante 5 minutos (descarte el sobrenadante).
- Resuspender el precipitado de paso 1.2.3 en 1 mL de CaCl2 solución acuosa de helada de 20 mM y repetir la centrifugación del paso 1.2.3 (descarte el sobrenadante).
- Resuspender el precipitado de paso 1.2.4 en 1 mL de CaCl2 solución acuosa de helado 20 mM y la parte alícuota de la suspensión resultante a 50 lotes μl. Flash congelar las porciones de líquido N2 y conservar a-80 ° C antes de usarlo.
- Transformar el preparado a. tumefaciens LBA4404 pEAQ aislado -HT-DEST1 vector generado en el paso 1.2.
- Descongelar 50 μl de suspensión de a. tumefaciens generó en el paso 1.2 en el hielo e incubar con 100 \u2012 200 ng de aislados pEAQ -HT-DEST1 vector, generada en el paso 1.1, a 0 ° C durante 5 minutos.
- Choque de frío la suspensión se incubó de paso 1.3.1 líquido N2 30 s, luego permite a temperatura ambiente.
- Añadir 200 μL de medio SOC (SOC: 20 g/L bacto-triptona, extracto de levadura 5 g/L, 0,58 g/L de NaCl, 0,19 g/L de KCl, 2,03 g/L de MgCl2, sulfato de magnesio 7-hidrato de 2,46 g/L, glucosa 3,6 g/L) a la suspensión shock frío de paso 1.3.2 e incubar durante 4 h a 28 ° C en un incubador de agitación a 200 rpm.
- Inocular una placa de agar LB selectivo (50 rifampicina μg/mL, kanamicina de 50 μg/mL, estreptomicina 100 de μg/mL) con la cultura de la SOC de paso 1.3.3. Bien se difundió e incubar durante 3 días a 28 ° C en un incubador de pie.
- Inocular los 5 mL de medios selectivos de LB (50 rifampicina μg/mL, kanamicina de 50 μg/mL, estreptomicina 100 de μg/mL) con una sola Colonia de paso 1.3.4. Incubar durante una noche a 28 ° C en un incubador de agitación a 200 rpm.
- Añadir 200 μL de glicerol a 1 mL del cultivo líquido de paso 1.3.5, mezclar bien y guardar a-80 ° C.
Nota: Esta cultura puede ser revivida para experimentos futuros por estriamiento en placas con agar LB con los antibióticos apropiados (se describe a continuación).
2. preparar suspensión de infiltración
- Inocular una placa de agar LB selectivo con las rayas de la cepas de a. tumefaciens de la glicerol acción culturas generadas en el paso 1. Incubar durante una noche a 28 ° C en un incubador de pie.
Nota: Una cepa con tHMGR dentro de un pEAQ -HT-DEST1 vector también puede ser incluido.- Individualmente inocular 50 mL de medios selectivos de LB con una muestra de cada cepa de a. tumefaciens , crecido en el paso 2.1 e incubar durante una noche a 28 ° C en un incubador de agitación a 200 rpm.
- Individualmente transferir las culturas 50 mL de paso 2.1.1 a 1000 mL de medios selectivos de LB (kanamicina, rifampicina 50 μg/mL, 50 μg/mL estreptomicina 100 μg/mL) e incubar durante una noche a 28 ° C en un incubador de agitación a 200 rpm.
- Individualmente de la pelotilla de a. tumefaciens por centrifugación (4000 x g), de las culturas líquidas generadas en el paso 2.1.2 (descarte el sobrenadante).
- Individualmente vuelva a suspender los pellets de paso 2.1.3 en 50 mL de tampón MMA recién preparada (Buffer de MMA: 10 mM 2-(N-morpholino)-ethanesulphonic ácido, pH 5.6 (KOH), 10 mM de MgCl2, 150 μM 3'5 '-dimetoxi-4'-acetofenona) e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1 hora.
- Combinar el volumen apropiado de cada suspensión de a. tumefaciens MMA (generada en paso 2.1.4) para producir un final OD600 por lo menos 0.2 para cada cepa en un volumen final total de 10 L.
- Añadir amortiguamiento adicional de MMA a las suspensiones combinadas generadas en el paso 2.1.5 hasta un volumen final de 1 L (uso inmediatamente en el paso 3).
Nota: Es recomendable preparar un 2 L adicional de suspensión de infiltración para mantener el nivel de líquido durante el proceso de infiltración. - Preparar 1 L de tampón MMA de fuerza de x 10.
3. realizar infiltración vacío
Nota: Vea la figura 2 para una descripción de la construcción de aparatos de vacío de la infiltración. Uso de 5 semanas de edad las plantas de N. benthamiana en macetas de 9 cm x 9 cm para los pasos del procedimiento. Plántulas deben ser sembradas en compost de F1 (por ejemplo de Levington) y crecidas durante 2 semanas antes de ser trasladado a macetas individuales que contengan compost F2. Plantas deben cultivarse en un invernadero a 25 ° C, con 16 horas diarias de agua (uso complementario de iluminación cuando sea necesario), luz día, densidad máxima de 100 plantas/m2.
- Transferencia de 1 L de suspensión de infiltración generada en el paso 2 y la 1 L de 10 x buffer MMA de fuerza al baño de la infiltración, seguido por un adicional 8 L de agua.
- Quitar las alas desmontables de la titular de la planta a medida, introducir 4 plantas (plantas de 5 semanas de edad ver nota anterior) y vuelva a colocar las alas. Invierta el soporte y coloque encima de la bañera de infiltración con el fin de sumergir las hojas en la suspensión de la infiltración.
Nota: Asegúrese de que la suspensión alcanza la superficie superior del titular de la planta. Elevar el nivel con la incorporación de la suspensión de infiltración extra si es necesario. - El baño de infiltración con plantas sumergidas de transferencia a la cámara de infiltración y cierre la puerta. Compruebe que la válvula de admisión de aire esté cerrada en el infiltrado. Encienda la bomba de vacío y abrir la válvula en línea el depósito vacío seguido de válvula de admisión de vacío en la cámara de infiltración.
- Una vez que ha reducido la presión en la cámara de infiltración por 880 mbar, cerrar la válvula de toma de aspiración y abrir la válvula de admisión de aire. Una vez que la cámara de infiltración ha regresado a la presión atmosférica, abra la puerta y retire la bañera de infiltración.
- Levante el soporte de la planta hasta que las plantas no estén sumergidas en la suspensión de la infiltración, luego agitar suavemente el soporte para permitir la suspensión exceso escurr las hojas en el baño de la infiltración.
- Devolver el soporte a la posición vertical, quite las alas desmontables y retire las plantas.
- Repita los pasos 3.1.1 a 3.1.5 hasta el número deseado de plantas ha sido infiltrado.
- Autoclave de la suspensión de infiltración usado antes de la eliminación.
- Autoclave de la infiltración del baño antes de su reutilización en experimentos posteriores.
- Esterilizar el interior de la cámara de infiltración por limpieza con etanol al 70% y dejar al aire seco antes de su reutilización en experimentos posteriores.
- Quitar las alas desmontables de la titular de la planta a medida, introducir 4 plantas (plantas de 5 semanas de edad ver nota anterior) y vuelva a colocar las alas. Invierta el soporte y coloque encima de la bañera de infiltración con el fin de sumergir las hojas en la suspensión de la infiltración.
4. crecer las infiltradas plantas
- Arreglar las plantas infiltradas desde el paso 3 a una densidad máxima de 100 plantas/m2 en un invernadero.
- Crecer durante 5 días a 25 ° C y 16 h / día de luz (uso complementario de iluminación cuando sea necesario) y el agua diariamente.
5. cosecha las hojas infiltradas
- Después de 5 días de crecimiento, la cosecha las hojas.
- Autoclave de residuos material vegetal, macetas y suelo antes de la eliminación.
6. secar las hojas cosechadas
Nota: El procedimiento de liofilización exacto que se describe a continuación depende de la naturaleza de los aparatos de liofilización disponibles disponibles.
- Liofilizar las hojas recolectadas hasta que se seque.
- Coloque las hojas recolectadas en una bolsa polipropileno de 2 mm de espesor. Congelar las hojas cosechadas por almacenar en un congelador de-80 ° C durante 30 minutos.
- Perforar la bolsa con muchos pequeños orificios con un alfiler. Lugar deja bolsas congeladas en la cámara central del liofilizador. Asegúrese de que todos los frasco accesorio grifos están cerrados y luego en el liofilizador. Asegúrese el condensador alcanza menos de-50 ° C y la presión se reduce a por lo menos 0,15 mbar y luego dejar durante la noche.
- Apague el liofilizador y ventear el vacío abriendo un grifo de accesorio del matraz. Quitar las hojas secas de la cámara central y vaya al paso 7.
7. presión de extracción por solvente
Nota: Los pasos de procedimiento se refieren al uso de un instrumento PSE comercialmente disponible (véase Tabla de materiales). Por favor refiérase a la literatura del fabricante para obtener más información sobre el funcionamiento. El instrumento lleva a cabo extracciones de 4 en paralelo.
- Moler las hojas secas en un polvo de curso a través de un método conveniente (por ejemplo, para la mayoría de los compuestos triterpénicos de interés utilizar un procesador de alimentos doméstico, o machacar manualmente las hojas mientras que dentro de una bolsa).
Nota: Muele con un mortero y mortero con nitrógeno líquido no es generalmente necesario.- Mezclar el polvo de la hoja con arena de cuarzo (\u2012 0,3 0,9 mm, 20% por volumen) en un recipiente adecuado; Esto actúa como un dispersante y mejora la eficiencia del proceso de extracción.
- Preparar 4 células de extracción (120 mL) para el relleno. Para ello, invertir las celdas de extracción e Inserte el filtro de fibra de vidrio, seguido por el metal de la frita y sosteniendo el tapón. Volver las células de extracción a la vertical posición y agregar una capa profunda de 1 cm de arena de cuarzo (\u2012 0,3 0,9 mm).
- Rellenar las celdas de extracción.
- Llene las celdas de extracción con el polvo de la hoja preparada generada en el paso 7.1 hasta la línea de llenado. Si es necesario, comprimir suavemente el polvo durante este proceso para facilitar la adición de una cantidad mayor en cada célula de extracción.
- Añadir una pequeña capa de arena de cuarzo (\u2012 0,3 0,9 mm) en la parte superior del polvo embalado e inserte el filtro de celulosa superior.
- Introduzca las células de extracción embalado al instrumento PSE y ejecute el método deseado. Utilice la siguiente configuración y material; Solvente: 100% acetato de etilo; temperatura: 100 ° C, presión: 130 bar. Ejecutar los siguientes 3 ciclos: ciclo 1: 0 min tiempo de retención, ciclo 2 y 3: 5 minuto espera tiempo, termina con una descarga de disolvente de 2 min y 12 min nitrógeno gas ras.
Nota: Es recomendable primero optimizar el método de extracción a pequeña escala. Sin embargo, el siguiente método es a menudo suficiente para agliconas triterpeno más oxidados. El licor de cada célula de extracción puede combinarse en el mismo recipiente para recogida externa, especificando la línea de residuos como el destino de la extracción, en lugar de las líneas de la colección individual estándar. Tenga en cuenta la cantidad de solvente utilizado es dependiente en el embalaje de las celdas de extracción y la temperatura y la presión. El método anterior normalmente genera aproximadamente 800 mL de licor de extracción de 4 extracciones paralelas. - Repita los pasos 7.2 a 7.3.3 hasta que todo el polvo de la hoja ha sido procesada.
- Concentrar el licor extracción combinada a secado mediante evaporación rotatoria bajo vacío. Busque la salida esperada (es decir, mezcla de verde oscurezca).
Nota: El procedimiento exacto puede variar dependiendo el set up del evaporador rotatorio disponible. Siempre utilice gafas de protección cuando se realiza la evaporación rotatoria y compruebe cristalería por daños antes de someter a condiciones de vacío.- Encienda el reciclador de refrigerador y permita que el líquido de transferencia de calor enfriar por lo menos 5 ° c. Encender el baño de agua y ajustar la temperatura a 35 º C.
- Transferir el licor de extracción a un matraz de evaporación (no llenar más de la mitad del volumen del frasco). Concentrar el licor batch-wise (en el mismo matraz) si el volumen total es superior a esto. Coloque el matraz de evaporación rellena en el conducto de vapor del evaporador rotatorio (seguro con un clip conjunto).
- Ajustar el matraz posición y ángulo, con el fin de sumergir la parte inferior tercera del matraz de evaporación en el baño de agua a un ángulo aproximado de 45 °. Iniciar el frasco girando a una velocidad que comienza a extenderse el licor de la extracción por las paredes del matraz.
- Asegurar se cierra el grifo de salida y comenzar a reducir la presión (con el controlador de la bomba de vacío) hasta un goteo moderado se observa entre el matraz del condensador y receptor.
Nota: No permita que el licor de extracción empezar a hervir. Si esto ocurre disminuir la fuerza del vacío para llevar la destilación bajo control. - Monitorear y ajustar la velocidad fuerza y giro vacío según el caso hasta que el solvente se evapora.
8. tratamiento de resina de intercambio iónico básico para la extracción de clorofilas
Nota: Las cantidades indicadas en los siguientes pasos asumen una escala original de trabajo de 100 \u2012 150 plantas. Paso 8 no es adecuado para productos que contienen grupos de ácido carboxílico, o grupos funcionales que se hidroliza bajo condiciones básicas tales como esteres.
- Disolver el extracto crudo generado en el paso 7 en un volumen mínimo de etanol.
- Añadir 50 mL de granos de la resina de intercambio iónico básicas (véase Tabla de materiales) a la salida de paso 7.1.1 y agitar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Nota: No sustituya los temblores durante el uso de aparatos de agitación. Sobrecarga magnética o mecánica agitación puede comprometer la integridad de los granos de resina. Agitación adecuada puede también convenientemente conseguirse lenta rotación del matraz de reacción en un evaporador rotatorio con vacío a presión atmosférica o desconectado. - Añadir un adicional 50 mL de granos de la resina de intercambio iónico básicas cada 30 minutos hasta que la reacción ha llegado a la conclusión; los granos de la resina de intercambio iónico básicas cambia de color de rosa a verde en color, y la fase líquida cambiará de verde a anaranjado o un color marrón turbio según la escala.
- En caso de duda de que la reacción ha ido a la terminación, 0,5 mL del líquido de la muestra. Filtrar la muestra a través de una pequeña columna de tierra de diatomeas y observar el color del filtrado; la reacción es generalmente completa en 1,5 horas.
- Filtrar la mezcla de reacción a través de una columna corta de tierra de diatomeas.
- Realizar esto mediante filtración de vacío, o mediante una columna de cromatografía flash de vidrio con fuelles de mano para aplicar presión. Si la tasa de filtración disminuye, molestar a la parte superior de la plataforma de tierra de diatomeas con una varilla. Recoger el filtrado.
- Enjuagar los granos recogidos resinas con etanol, seguida por etanol: hexano 1:1 y finalmente hexano. Utilizar un volumen de enjuague suficiente para resuspender los granos en la parte superior de la columna de tierra de diatomeas.
- Combinar el filtrado de paso 8.4 y los enjuagues en el paso 8.5 y concentrar a sequedad mediante evaporación rotatoria bajo vacío.
9. fraccionamiento áspero inicial
Nota: El siguiente método es generalmente apropiado para agliconas típico triterpeno oxidado y emplea un instrumento automatizado cromatografía flash. Consulte la literatura del fabricante para más detalles sobre la operación.
- Absorber el producto bruto generado en el paso 8 en grado flash gel de sílice (tamaño de poro: 60 Å, tamaño de las partículas: 35 \u2012 75 μm) para la aplicación a un cartucho de la cromatografía flash vía metodología de carga seca.
- Disolver el producto bruto generado en el paso 8 en un volumen mínimo de disolvente orgánico apropiado. Asegurar la completa disolución.
Nota: Diclorometano con la adición de unas gotas de metanol suele ser una elección adecuada del disolvente. - Destornille la parte superior de un cartucho de jeringas cromatografía flash de 100 g (véase Tabla de materiales) y retire el inserto para revelar el espacio de carga seca cabeza. Utilice el espacio principal para medir el volumen adecuado del gel de silicona para carga seca.
- Transfiera el volumen medido de gel de silicona para carga seca a la solución de producto crudo y eliminar el disolvente por evaporación rotatoria bajo vacío.
Nota: El gel de sílice debe volver al polvo de flujo libre. Hacia el final de la evaporación proceso suave raspado se requiera liberar el gel de silicona de la parte del matraz de evaporación. - Equilibrar el cartucho de la cromatografía flash de 100 g a 100 mL/min por lo menos 5 volúmenes de columna de 100% hexano, pero idealmente hasta que el contenido del cartucho esté completamente y uniformemente húmedo.
- El gel de sílice de cargamento seco preparado generado en el paso 9.1.3 al espacio de carga seca cabeza de cartucho equilibrado 100 g cromatografía flash, vertiendo la transferencia. Suspensión en hexano y una pipeta de boca ancha puede utilizarse para facilitar la transferencia de cualquier carga seca restante del gel de silicona.
- Húmedo el gel de sílice de transferir carga seca cama con 100% de hexano para extraer el aire desde el espacio de carga seca.
- Ejecutar el siguiente método de cromatografía: solvente [A]: hexano, solvente [B]: acetato de etilo, caudal: 100 mL/min, gradiente: 0% [B] 100% [B] más de 3000 mL, Colección: recoger todo, tamaño de fracción: 250 mL.
- Analizar las fracciones de cromatografía (TLC) de capa delgada8 o cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS)8y concentración a sequedad el fraction(s) que contiene el compuesto de interés mediante evaporación rotatoria bajo vacío.
- Disolver el producto bruto generado en el paso 8 en un volumen mínimo de disolvente orgánico apropiado. Asegurar la completa disolución.
- Realizar depuración fina aguas abajo hasta alcanzar el nivel de pureza deseado.
Nota: Depuración fina descendente es enteramente compuesto específico y no es posible dar pasos estandarizados (véase la sección discusión).
Representative Results
Típicos rendimientos aislados dependen de la combinación de la enzima enzimático bajo investigación, la estabilidad química del compuesto blanco, y como desafiando el proceso de purificación fue. Hemos divulgado previamente aislada producción de β-amirina derivados de nuestros experimentos de biosíntesis combinatoria desde 0.12 hasta 3,87 mg por gramo de polvo de hoja de N. benthamiana seco. Estos compuestos se extendieron ampliamente en el nivel de oxidación e incluyen la combinación natural de enzimas (figura 3)8. Este protocolo se utiliza rutinariamente en nuestro laboratorio para producir decenas o centenares de miligramos del producto purificado para la caracterización por espectroscopia RMN y análisis funcionales descendentes. También hemos demostrado la utilidad preparativa de esta plataforma mediante la producción de 0.8 g de triterpeno andamio β-amirina en una pureza superior al 98%. Este experimento utiliza 459 plantas y representa una producción aislada de 3,3 mg por gramo de seco N. benthamiana de la hoja en polvo8.
Figura 1: esquema Resumen. Representación esquemática del proceso de explotación de la expresión transitoria de las enzimas biosintéticas en hojas de N. benthamiana desviar fuentes endógenas de 2,3-oxidosqualene hacia la producción preparación de nuevos productos de alto valor triterpeno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: construcción infiltrado y proceso de vacío un) A medida separada de una ala planta titular. alas de b) Bespoke planta titular adjuntadas. c) la inversión y la inmersión de las plantas. d) inserción de la bañera de infiltración. baño e) infiltración en lugar dentro de la cámara de infiltración. infiltrado vacío f) completo: bomba de vacío (1) (2) conexión de bomba de vacío a la válvula de aislamiento de depósito depósito vacío vacío (3) (4) conexión entre depósito vacío y la válvula de admisión de aire del calibrador de presión (5) (6) infiltración cámara (7) Tanque de vacío de cámara (8) infiltración. g) representante sale de una planta que se infiltraron con una construcción de expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) después crecimiento de infiltración después de cinco días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: previamente divulgados resultados representativos para la producción de preparación de derivados de la β-amirina usando este protocolo8. Esta tabla se ordena por producciones aisladas. Formatean condicional de columnas con indicación del valor relativo del color. Rojo = alto, verde = bajo (aunque intermedio amarillo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Rendimiento alto vacío infiltración permite este protocolo a ser utilizado rutinariamente en nuestro laboratorio para la producción preparativa de triterpeno compuestos de interés para diferentes aplicaciones posteriores. El aparato de vacío de la infiltración que se describe aquí se reproducen fácilmente. Además del depósito vacío es aconsejable disminuir el tiempo necesario para tirar el vacío necesario, sin embargo, es posible reutilizar simplemente un horno de vacío sin modificar como la cámara de infiltración. La protección de la bomba de vacío vía la adición de un condensador adecuado es teóricamente razonable, pero en nuestro laboratorio hemos encontrado que sea innecesario.
Cobertura de infiltración se ve comprometida si las hojas no son completamente sumergidas en la suspensión de la infiltración. Este problema se reduce al mínimo asegurándose de que el nivel de la suspensión llega a la superficie superior del titular de la planta, y que el titular de la planta es un ajuste apretado para el baño de la infiltración. Nota de la figura 2 que la superficie superior del titular de la planta es empotrada en el baño de infiltración cuando en lugar. Esto se logra mediante paneles en los bordes mediados del titular de los que forman el punto de anclaje con la parte superior de la bañera de infiltración. La suspensión de infiltración requieren adiciones periódicas para mantener el nivel de suspensión. Esto se logra mejor por la adición de la suspensión de exceso de infiltración para evitar la reducción gradual de la OD600 en el transcurso de una gran infiltración batch-wise. Sin embargo, en nuestras manos, sustitución por agua no parecen tener un efecto notable en los rendimientos esperados a escala preparativa, aunque esto no ha sido posible investigar. Cuantas plantas se pueden infiltradas de un lote de suspensión de infiltración es todavía una cuestión abierta. Rutinariamente infiltran entre 100 y 200 plantas con un solo lote de suspensión de infiltración. Además, es normal que algunos suelo para lixiviación en la suspensión de infiltración a lo largo del proceso de infiltración. Esto no se ha encontrado para tener un efecto notable sobre la eficacia de la infiltración.
Durante la cosecha es recomendable (pero no fundamental) para cosechar solamente las hojas que se infiltraron (algunas hojas habrán crecido después de la infiltración). Cosecha selectiva evita la dilución con tejido improductivo, que de lo contrario aumentaría la proporción de impurezas endógenas en relación con el compuesto de interés. Esto tiene un impacto nominal en la facilidad de purificación de aguas abajo y aumenta la magnitud de estos procesos. Cuando se utiliza tHMGR para impulsar el suministro de precursores, un fenotipo necrosado se observa a menudo a desarrollar durante el período de crecimiento después de la infiltración. Esto es normal y realmente ayuda a la cosecha selectiva y el posterior proceso de secado. El polvo de hoja secas generalmente puede almacenarse en un recipiente hermético en un lugar fresco, seco y oscuro, pero idealmente en un desecador bajo vacío. Esto depende de la estabilidad del compuesto de interés. Tenga cuidado si decide almacenar en un congelador de-80 ° C. Asegurarse de que las secas hojas están en un recipiente resistente al agua y en salida de almacén, permite este contenedor a temperatura ambiente antes de su apertura. No hacerlo resultará en remojo de las hojas, dificultando el proceso corriente abajo.
Los pasos posteriores a la cosecha en este protocolo se proporcionan con fines ilustrativos y para ayudar a aquellos investigadores que pueden haber limitado química práctica de la experimentan. Puede ser sustituidas por muchas otras técnicas de extracción/purificación de productos naturales. Como se indica en la introducción, PSE tiene muchas ventajas, sin embargo el capital coste de aparatos disponibles en el mercado de PSE puede ser prohibitivo, y no es esencial. Tratamiento de la resina básica de intercambio iónico es un método muy conveniente para reemplazar a saponificación tradicional seguido por partición líquido-líquido. Sin embargo, no es conveniente para los productos que contienen grupos de ácido carboxílico o grupos funcionales que se hidroliza bajo condiciones básicas, tales como esteres. Estos productos se espera a ser retenidos en la resina básica de intercambio iónico. Sin embargo, hay potencial para explotar esto para una captura y liberación de procedimiento (no documentado aquí). Donde saponificación tradicional sería apropiado, tratamiento de resina de intercambio iónico básicas sirve como una alternativa conveniente. El método de cromatografía se describe en el paso 9, se ha encontrado para ser generalizable para los compuestos descritos en la figura 3. Sin embargo, compuestos de polaridad creciente pueden requerir un largo periodo de elución 100% acetato de etilo. Paso 9.2, purificación fina descendente es enteramente compuesto específico y también es dependiente de la escala. Reiteradas rondas de cromatografía flash de pequeña escala con gradientes optimizados, es suficiente para lograr una pureza adecuada para el análisis de NMR. En escalas más grandes, la cristalización es a menudo una alternativa conveniente. En casos difíciles, preparativa o semi-preparativa alta cromatografía líquida (HPLC) se puede emplear dependiendo de la cantidad deseada de compuesto aislado. Ejemplos de procesos de purificación de aguas abajo para una gama de compuestos representativos se pueden encontrar en otra parte8.
El protocolo actual, tal como se presenta aquí, se utiliza rutinariamente en nuestro laboratorio y ha demostrado utilidad. Sin embargo, es todavía significativo alcance para la mayor optimización de la plataforma de expresión. Está trabajando en nuestro laboratorio para investigar cómo más ingeniería de vías y control diferencial de los niveles de expresión de la proteína podría mejorar la producción de triterpeno, mientras mediadores de toxicidad para las células del huésped. También existe la posibilidad para investigar la manipulación de los sistemas de transporte intracelular20,21y la dirección de las enzimas a diferentes compartimentos celulares22,23, avenidas que podrían mejorar la eficiencia de varios eventos de oxidación. Beneficios potenciales para la modificación de la morfología subyacente de orgánulos claves también podrían explorarse. Por ejemplo, se ha observado sobreexpresión del dominio de membrana de Arabidopsis thaliana HMGR para inducir la hipertrofia del retículo endoplásmico en plantas24; un sitio clave para la actividad de CYP450. Este protocolo es ideal para la producción de mg para cantidades de gramo-escala de productos de triterpeno y puede emplearse en un entorno de investigación a compuestos para estudio aguas abajo (por ejemplo, la exploración sistemática de la estructura y actividad relaciones y las investigaciones preliminares en las propiedades farmacodinámicas y farmacocinéticas de compuestos de plomo de interés clínico). Sin embargo, la plataforma es linealmente y confiablemente escalable simplemente incrementando el número de plantas utilizadas y el sentido práctico de expresión transitoria mediante agroinfiltration se ha demostrado a escala industrial para la producción de proteínas farmacéuticas 14, por lo tanto hay potencial de esta plataforma para ser extendido para la producción comercial de triterpenos de alto valor. Por otra parte, también es posible visualizar la producción de transformantes estables llevando el camino biosintético del deseo finalizado multigénica, permitiendo el cultivo masivo y continuo 'cultivo' de N. benthamiana de transgénicos cepas la producción de diferentes compuestos de valor comercial.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por una beca de Parque de investigación Norwich (JR), la ingeniería conjunta y Consejo de investigación de ciencias físicas/biotecnológicos y financiado por el BBSRC de Consejo de investigación de ciencias biológicas OpenPlant sintética biología centro de investigación conceden (BB L014130/1) (M.J.S., A.O.); un intercambio de conocimientos de centro John Innes y comercialización conceden (BB/KEC1740/1) (BB); y el Instituto BBSRC programa estratégico 'Las moléculas de la naturaleza' (BB/P012523/1) y el John Innes (A.O.). Nos gustaría agradecer a George Lomonossoff para proporcionar los vectores pEAQ y Andrew Davis para la fotografía.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GC-MS instrument | any | n/a | |
| Thermocycler suitable for performing PCR reactions | any | n/a | |
| Gel electrophoresis apparatus | any | n/a | |
| Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
| Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L) | any | n/a | |
| Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/> 15000 rpm) | any | n/a | |
| Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
| Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
| Standing incubator | any | n/a | |
| Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L) | any | n/a | |
| Centrifuge bottles (1 L) | any | n/a | |
| Vacuum infiltration apparatus | bespoke | n/a | |
| 9 x 9 cm plant pots | any | n/a | |
| Freeze drying apparatus (=/> 8 litre condenser capacity) | any | n/a | |
| Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument) | Buchi | SpeedExtractor E-914 | |
| Rotary evaporator apparatus | any | n/a | |
| Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L) | any | n/a | |
| Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L) | any | n/a | |
| Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L) | any | n/a | |
| Spatulas (assorted sizes) | any | n/a | |
| Analytical balance (5 figures) | any | n/a | |
| Balance (2 figures) | any | n/a | |
| Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L) | any | n/a | |
| A -80 freezer | any | n/a | |
| Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument | Biotage | ISO-1EW | |
| Safety glasses | any | n/a | |
| Lab coat | any | n/a | |
| Autoclave | any | n/a | |
| Consumables | |||
| Micropipette tips (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
| Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL) | any | n/a | |
| Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL) | any | n/a | |
| Disposable Transfer pipettes (size 2 mL) | any | n/a | |
| Petri dishes (Size: 100 mL) | any | n/a | |
| Biotage® SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges | Biotage | FSK0-1107-0100 | |
| HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps | any | n/a | |
| Disposable purple nitrile gloves | any | n/a | |
| Top filter for E-914, cellulose | Buchi | 51249 | |
| Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber | Buchi | 11055932 | |
| Reagents | |||
| Quartz sand, 0.3 - 0.9 mm | Buchi | 37689 | |
| Celite 545 (diatomaceous earth) | Simga-Alrich | 22140-1KG-F | |
| Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm) | Merck | 1.09385.5000 | |
| 2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid | Melford | B2002 | |
| MgCl2 | Simga-Alrich | 208337-100G | |
| KOH | Simga-Alrich | 60377-1KG | |
| 3’5’-dimethoxy-4’-acetophenone (acetosyringone) | Simga-Alrich | D134406-1G | |
| Rifampicin | Alfa Aesar | J60836 | |
| Kanamycin sulfate | Gibco | 11815-032 | |
| Streptomycin | Simga-Alrich | S6501-100G | |
| Gentamycin | MP biomedicals | 190057 | |
| Agarose LE gel | Melford | MB1203 | |
| LB broth Millar | Simga-Alrich | L3522-250G | |
| Agar | Simga-Alrich | A5306-250G | |
| NaCl | Simga-Alrich | S5886-500G | |
| KCl | Simga-Alrich | P9541-500G | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Alrich | M2773-500G | |
| Glucose | Sigma-Alrich | G7021-100G | |
| Ambersep® 900 hydroxide (basic ion exchange resin) | Sigma-Alrich | 06476-1KG | |
| Hexane | Fisher | H/0406/PB17 | |
| Ethyl acetate | Fisher | E/0900/PB17 | |
| Dichloromethane | Fisher | D/1852/PB17 | |
| Methanol | Fisher | M/4056/PB17 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Alrich | E7637-1G | |
| Ethanol | VWR | 20821-330 | |
| Milli-Q water | any | n/a | |
| Levington F1 Compost | any | n/a | |
| Levington F2 Compost | any | n/a | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit). | Qiagen | 27104 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | Supplier New England Biolabs Ltd | C2987I | |
| pEAQ-HT-DEST1 vector | Lomonossoff laboratory John Innes Center | n/a | |
| pDONR207 | Thermo-Fisher | pDONR207 | |
| A. tumefaciens LBA4404 | Thermo-Fisher | 18313015 | |
| GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11791020 | |
| GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11789020 | |
| GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX | Promega UK Ltd | M7822 | |
| PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE | New England Biolabs Ltd | M0530S | |
| dNTP SET 100mm | Thermo-Fisher | 10297018 | |
| RNEASY PLANT MINI KIT | Qiagen Ltd | 74904 | |
| RQ1 RNASE-FREE DNASE | Promega UK Ltd | M6101 | |
| Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System | Fisher | 10308632 | |
| Trytone | Sigma-Alrich | T7293-250G | |
| Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | n/a |
References
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