Summary
يمكن تحويل تعبير مغايرة عابر للإنزيمات السكروز في أوراق بينثاميانا نيكوتيانا الإمدادات المحلية من 2، 3-أوكسيدوسكواليني نحو إنتاج منتجات عالية القيمة ترتيربين جديدة. وهنا يتم وصف بروتوكول مفصلة لإنتاج إعداد مقياس السريع (5 أيام) triterpenes والنظير استخدام هذه المنصة القوية المستندة إلى النباتات.
Abstract
Triterpenes هي واحدة من أكبر ومعظم الأسر هيكلياً متنوعة من المنتجات النباتية الطبيعية. أظهرت العديد من مشتقات ترتيربين لامتلاك النشاط البيولوجي ذات الصلة طبي. ومع ذلك، حتى الآن هذه الإمكانية لم يترجم إلى عدد كبير العقاقير المشتقة ترتيربين في العيادة. وهذا يمكن القول أن (على الأقل جزئيا) تؤدي نتيجة لمحدودية الوصول الاصطناعية العملي لهذه الفئة من المجمع، وهي مشكلة يمكن خنق استكشاف علاقات الهيكل والنشاط والتنمية من المرشحين بالتقليدية الطبية كيمياء مهام سير العمل. وبالرغم من تنوعها الهائل، triterpenes جميعا مستمدة من سليفة خطية واحدة، أوكسيدوسكواليني 2 و 3. عابر تعبير مغايرة للإنزيمات السكروز في بينثاميانا أ. يمكن تحويل الإمدادات المحلية من 2، 3-أوكسيدوسكواليني نحو إنتاج منتجات جديدة ترتيربين ذات القيمة العالية التي لا تنتج بطبيعة الحال من هذا المضيف. الزراعية-تسلل وسيلة بسيطة وفعالة لتحقيق التعبير عابرة في بينثاميانا أ. وتنطوي العملية على تسلل أوراق النبات مع تعليق tumefaciens المتبعة تحمل construct(s) التعبير للفائدة. تسلل إضافية A. tumefaciens المشارك سلالة تحمل بناء تعبير ترميز إنزيم إمدادات السلائف ويعزز إلى حد كبير يزيد الغلة. بعد فترة خمسة أيام، يمكن حصاد نبات تسلل المواد ومعالجتها لاستخراج وعزل المنتج ترتيربين الناتجة. هذا هو عملية يتم تحجيم خطيا وبشكل موثوق، ببساطة عن طريق زيادة عدد النباتات المستخدمة في التجربة. وهنا يتم وصف بروتوكول لإنتاج إعداد النطاق السريع triterpenes الاستفادة من هذا النظام الأساسي المستندة إلى النباتات. البروتوكول يستخدم جهاز تسلل فراغ يمكن تكرارها بسهولة، مما يتيح تسلل متزامنة من النباتات يصل إلى أربعة، وتمكين باتشويسي تسلل مئات نباتات في فترة قصيرة من الزمن.
Introduction
Triterpenes هي واحدة من أكبر ومعظم الأسر هيكلياً متنوعة من المنتجات النباتية الطبيعية. ويعتقد جميع المنتجات الطبيعية ترتيربين رغم تنوعها الهائل، المستمدة من 2 و 3 السلائف الخطي نفسها-أوكسيدوسكواليني، نتاج لمسار mevalonate في النباتات. بدأت سيكليزيشن أوكسيدوسكواليني 2 و 3 والتي تسيطر عليها عائلة من الإنزيمات يسمى أوكسيدوسكواليني سيكلاسيس (منظمات المجتمع المدني). وتمثل هذه الخطوة سيكليزيشن المستوى الأول من التنويع، مع مئات سقالات ترتيربين مختلفة وقد تم الإبلاغ عن طبيعة1. كذلك يتم تنويع هذه السقالات بالخياطة الإنزيمات بما في ذلك، على سبيل المثال لا الحصر، الفسفرة p450s1،(CYP450s)2. هذه مسارات السكروز يمكن أن يؤدي إلى تعقيدات هائلة، تؤدي أحياناً إلى المنتجات النهائية التي يتم التعرف عليها بالكاد من ترتيربين الأصل. على سبيل المثال، يعتقد البنية المعقدة لإبادة الحشرات و antifeedant azadirachtin ليمونويد قوية تستمد ترتيربين tetracyclic من نوع تيروكالاني3.
أظهرت العديد من ترتيربين الطبيعية المنتجات المشتقة، حتى تلك ذات الأصل غير معدلة نسبيا السقالات، تمتلك النشاط البيولوجي ذات الصلة طبي4،5،،من67. ومع ذلك، حتى الآن هذه الإمكانية لم يترجم إلى عدد كبير العقاقير المشتقة ترتيربين في العيادة. وهذا يمكن القول أن (على الأقل جزئيا) تؤدي نتيجة لمحدودية الوصول الاصطناعية العملي لهذه الفئة من المجمع، وهي مشكلة يمكن خنق استكشاف علاقات الهيكل والنشاط والتنمية من المرشحين بالتقليدية الطبية كيمياء مهام سير العمل.
تعبير عابر للإنزيمات ترتيربين السكروز من سائر الأنواع النباتية في أوراق بينثاميانا أ. يمكن تحويل الإمدادات المحلية من 2، 3-أوكسيدوسكواليني نحو إنتاج منتجات عالية القيمة ترتيربين جديدة (الشكل 1). يمكن استخدام هذه العملية وظيفيا تميز المرشح الإنزيمات وإعادة بناء مسارات السكروز من نواتج الأيض الهامة التي تحدث طبيعيا. على قدم المساواة، فإنه يمكن أيضا استغلالها في النهج السكروز اندماجي إنتاج منتجات ترتيربين الرواية، واستراتيجية التي يمكن أن تسفر عن مكتبات النظير هيكلياً المتصلة بها، مما يتيح الاستكشاف المنهجي لعلاقات الهيكل والنشاط يؤدي نشاطا بيولوجيا مركبات8،9.
أجروينفيلتريشن وسيلة بسيطة وفعالة لتحقيق التعبير عابر في أوراق بينثاميانا أ . وتنطوي العملية على تسلل يترك مع تعليق A. tumefaciens تحمل construct(s) التعبير ثنائي للفائدة. ويتحقق هذا عن طريق تطبيق الضغط الذي يجبر السائل من خلال الثغور، مما أدى إلى تشريد الجوية في الفضاء بين الخلايا، والاستعاضة عنه بتعليق A. tumefaciens . نقل البكتيريا كل منهما تي-السلطات الوطنية المعينة إلى داخل الخلايا النباتية، أسفر عن التعبير البروتين المترجمة وعابر في أنسجة نبات تسلل.
بينما أي ناقل ثنائي مناسب لتوليد النباتات المعدلة وراثيا يجوز للتعبير عابرة، فنحن نستخدم المستمدة من اللوبيا فسيفساء فيروس كبمف هايبرترانسلاشونال (HT) البروتين التعبير نظام10، 11. في هذا النظام هو محاط الجينات التي تهم المناطق غير مترجمة (UTR) من الحمض النووي الريبي كبمف-2. 5 ' UTR يحتوي على تعديلات أدى إلى مستويات عالية جداً من البروتين الترجمة مع لا الاعتماد على النسخ المتماثل الفيروسية12. هذا الأسلوب قد وضعت في سلسلة متجه ثنائي سهلة وسريعة (بيك) الذي يتضمن الموقع جزئ استنساخ المتوافقة مع بروتوكول نيات (بيك-HT-DEST)10،11. تحتوي معظم بيك ناقلات أيضا طماطم حيلة كثيف المستمدة من الفيروسات P19 إسكات القامع جينات13 داخل الجزء تي-دنا من كاسيت التعبير، التي تلتف الحاجة إلى كوينفيلتراتي سلالة منفصلة تحمل P19 ويتيح جداً تعبير البروتين رفيع المستوى في البلد المضيف زرع خلية10،11.
استخدام بينثاميانا أ كمضيف تعبير له مزايا خاصة عند العمل مع مسارات السكروز النبات. وتؤيد العمارة خلية عضويا مرناً المناسبة وتجهيز البروتين، والتقسيم السليم، بالإضافة إلى امتلاك الإنزيمات المشاركة الضرورية، ريدوكتاسيس (على CYP450s)، والسلائف الأيضية. مصدر الكربون هو التمثيل الضوئي؛ وهكذا، يمكن ببساطة زراعة النباتات في السماد جيدة النوعية، التي تتطلب فقط الماء و أول أكسيد الكربون2 (من الهواء) وأشعة الشمس كمدخلات. النظام الأساسي أيضا مريحة للغاية للتعبير المشترك عن تركيبات مختلفة من البروتينات، كما يمكن تحقيق فاسيليلي بتسلل المشارك من سلالات مختلفة من A. tumefaciens، يلغي الحاجة إلى بناء تعبير مولتيجيني كبيرة أشرطة الكاسيت. وعلاوة على ذلك، العملية يمكن أن يكون خطيا وبشكل موثوق تحجيم ببساطة عن طريق زيادة عدد النباتات المستخدمة في التجربة.
العمل السابق في المختبر أثبتت فائدة هذا منهاج مقياس محضرة التجارب. هذا وشملت إعداد triterpenes رواية لاستخدامها في فحوصات بيواكتيفيتي ومقياس حتى تحقيق غرام كميات من المنتجات المعزولة. وعلاوة على ذلك، يمكن زيادة تراكم منتجات ترتيربين ايربان عدة مرات قبل المشاركين التعبير عن شكل اقتطاع N--المحطة الطرفية، وردود الفعل غير متحسسة من هيدروكسي-3, 3-ميثيجلوتاري-إنزيم ريدكتيز (ثمجر)، حد من معدل المنبع إنزيم في مسار mevalonate8.
هو المفتاح لهذه التجارب وإعداد مقياس القدرة على مريح يصل حجم عملية تسلل. في تجربة نموذجية، عشرات ومئات نباتات قد يكون ضروريا لتحقيق الكمية المستهدفة للمنتج معزولة. التسلل إلى أوراق فردية باليد (باستخدام المحاقن لا داعي لها) عمليا صعبة وباهظة وكثيراً ما تستغرق وقتاً طويلاً، مما يجعل هذا الأسلوب غير عملي للارتقاء بالروتينية. تسلل فراغ يوفر مزايا أكثر من التسلل من ناحية، كما أنها لا تعتمد على مستوى المهارة للمشغل ويسمح تسلل مساحة أكبر من سطح ورقة. يتم استخدام هذا الإجراء تجارياً لإنتاج البروتينات الدوائية14على نطاق واسع. هذا البروتوكول يستخدم جهاز يمكن تكرارها بسهولة تسلل فراغ، التي يمكن بناؤها من أجزاء المتاحة تجارياً. يسمح هذا التسلل متزامنة من النباتات يصل إلى 4، منح تسلل باتشويسي السريع والعملي لمئات نباتات في فترة قصيرة من الزمن (الشكل 2a -2b). يتألف الجهاز تسلل فراغ فرن الفراغ الذي يشكل غرفة عمليات التسلل (الشكل 2 واو). الفرن متصل بمضخة عن طريق خزان فراغ. وهذا يقلل كثيرا من الوقت اللازم لتحقيق الفراغ المطلوب في قاعة عمليات التسلل. النباتات هي المضمونة في حامل مفصل ومقلوب في حمام مائي الفولاذ المقاوم للصدأ 10 لتر مليئة بتعليق A. tumefaciens (الشكل 2a -2 (ج)). المهم الغمر الكامل من أجزاء الجوي من النباتات لكفاءة عمليات التسلل. حمام الماء ثم يوضع داخل قاعة تسلل (الشكل 2d --2e)، وفراغ تطبيقها على رسم الهواء خارج المساحات المتداخلة ليف. بمجرد الضغط انخفض بمقدار 880 [مبر] (عملية التي تستغرق حوالي 1 دقيقة) قاعة تسلل يتم إحضارها بسرعة العودة إلى الضغط الجوي على مدى 20-30 ثانية عن طريق فتح صمام مدخل الفرن، عندها اكتمال عمليات التسلل.
خمسة أيام بعد تسلل المواد النباتية على استعداد لاستخراج الجني واللاحقة والعزلة للمنتج المطلوب. من هذه النقطة هو ببساطة العملية واحدة لاستخراج المنتجات الطبيعية وتنقيتها من المواد ليف، سير عمل مألوفة لأي كيميائي منتج طبيعي. وتوجد العديد من أساليب مختلفة لاستخراج الأولية واللاحقة تنقية15. اختيار أنسب الأساليب والظروف الدقيقة المستخدمة تعتمد اعتماداً كبيرا على خصائص كيميائية خاصة مجمع للفائدة، بالإضافة إلى توافر مهارات و/أو المعدات. من غير الممكن أن تدرج في هذا البروتوكول أسلوب خطوة بخطوة، وقابلاً للتعميم الكامل لتجهيز المواد أوراق النبات المقطوع للمنتج المعزولة التي يمكن اتباعها عمياء لأي منتج ترتيربين من اهتمام المتلقين للمعلومات، ولا يكون المناسبة لمحاولة القيام بذلك. بيد أن هذا البروتوكول سوف تقدم لمحة عامة عن سير العمل الأساسية المستخدمة في المختبر وبعض الطرق للمراحل المبكرة من العملية، التي أثبتت التعميم لمنتجات ترتيربين aglycone الأكثر اﻷوكسيجين في تجربتنا. وهذا يشمل اثنين من التقنيات غير شائع نسبيا، أي استخراج المذيبات المضغوط (PSE)، وأسلوب مرحلة مريحة لإزالة الكلوروفيل راتنج تبادل الأيوني أساسية بشدة باستخدام.
PSE تقنية عالية كفاءة لاستخراج الجزيئات العضوية الصغيرة من مصفوفات الصلبة. يتم تنفيذ عمليات الاستخراج تحت ضغط (ca. 100-200 بار)، أشر حاليا القدرة على استخدام تخفف من درجات الحرارة التي تتجاوز الغليان والميزة الرئيسية لاستخراج المذيبات. وهذا يمكن أن تقلل الوقت وكمية المذيب المطلوبة لتحقيق استخراج حصرية، بالمقارنة مع التقنيات الأخرى الساخنة المذيبات مثل refluxing بسيطة أو عمليات الاستخراج سوكسهليت16. الصكوك PSE أعلى هيئة تجارية متوفرة، التي تستخدم الخلايا استخراج للتبادل، والمذيبات الآلي المناولة والتدفئة، والرصد. وهذا يجعل هذا الأسلوب مريحة للغاية. وأيضا جدلا أقل خطورة، خاصة بالنسبة للمشغلين ذوي الخبرة المحدودة الكيمياء العملية.
تصبن مقتطفات ليف النفط الخام تحت ارتداد متبوعاً بسائل/التقسيم تقنية شائعة لإزالة الجزء الأكبر من تشلوروفيلس قبل تنقية اللاحقة أو التحليل. لكن هذا يمكن غالباً ما يكون عمليا تطالب في جداول أكبر. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون الكشف عن واجهة، أو فقدان المنتج بسبب تشكيل مستحلبات إشكالية. يمكن استخدام راتنجات التبادل الأيوني بقوة أساسية لأداء المرحلة ايربان التحلل المائي بمثابة بديل مناسب. ما زال يلتزم الراتنج المصطبغة جزء الكلوروفيل طحين ويمكن إزالتها ببساطة عن طريق الترشيح. ويستخدم هذا البروتوكول للتكيف مع حجم محضرة من الإجراءات التحليلية سبق الإبلاغ عنها17 التي توظف راتنج تبادل الأيوني أساسية متاحة تجارياً.
فيما يلي يصف لنا بروتوكول مفصل وسريع لإنتاج نطاق محضرة triterpenes الاستفادة من هذا النظام الأساسي المستندة إلى النباتات. هذا البروتوكول يستخدم بشكل روتيني في المختبر لإعداد عشرات ومئات ملليغرام من المنتج ترتيربين معزولة لتطبيقات هذا وصف هيكلي بالتحليل الطيفي الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي)، و/أو مواصلة الدراسة في الوظيفية فحوصات.
Protocol
ملاحظة: قبل متابعة هذا البروتوكول، أصبحت مألوفة مع بيانات السلامة المادية لجميع المواد المستخدمة، واتخاذ احتياطات السلامة المناسبة. وهذه تشمل ولكن لا تقتصر على: ارتداء نظارات السلامة عند العمل مع الزجاج تحت الفراغ، والتعامل مع هلام السيليكا الجافة في خزانة الأبخرة. من الضروري أيضا أن فحص التشريعات المحلية المتعلقة بالعمل مع المواد المعدلة وراثيا ولاحظ، بعد بما في ذلك إجراءات الاحتواء مناسبة.
1-توليد سلالات A. tumefaciens للتسلل
ملاحظة: نحن نقدم هنا وصف مبسط للخطوات المطلوبة لإنشاء مناسبة A. tumefaciens سلالات لتعبير عابر. ويرد مزيد من التفاصيل عن هذه الخطوات قبل سنسبري et al. 8.
- تضخيم ببكر أو توليف البروتين ترميز منطقة الجينات التي تهم يحف به 5 'و 3' أتتب تسلسل مناسب لتوليد استنساخ إدخال للاستخدام مع جزئ الخاصة بالموقع الاستنساخ لأغراض البروتوكول18،19.
- استخدام التمهيدي إلى الأمام: جججاكاجتتجتاكاااااجكاجكتاننننننننننننننننن، عكس التمهيدي: ننننننننننننننننن جججاككاكتتجتاكاجااجكتججتا(NNNN... = تسلسل تسلسل معين).
- (الممثل) بكر شروط استخدام: رد فعل خليط العازلة (25 ميليلتر، إجمالي)، (س 5، 5 ميليلتر، انظر الجدول للمواد)، دنتبس (10 مم 0.5 ميليلتر)، إلى الأمام التمهيدي (10 ميكرومتر، 1.25 ميليلتر)، عكس التمهيدي (10 ميكرومتر، 1.25 ميليلتر)، "قالب الحمض النووي" (تركيز متغير، 50 – 250 نانوغرام، 0.5 ميليلتر )، بوليميراز الدنا (2000 U/mL، 0.25 ميليلتر، انظر الجدول للمواد)، والمياه خالية من نوكلاس (إلى 25 ميليلتر). تشغيل ثيرموسيكلير النحو التالي: تمسخ الأولية (98 درجة مئوية، 30 s)؛ بدء دورة (98 درجة مئوية، 30 s; 45-72 درجة مئوية، 20 s; 72 درجة مئوية، 30 s/كيلو بايت) في نهاية دورة؛ دورات 35؛ التمديد النهائي (72 درجة مئوية، 10 دقيقة).
- اتبع التثب الموقع قياسية الاستنساخ لأغراض البروتوكول18،19 لتوليد استنساخ إدخال استخدام أي ناقل الإدخال غير المستندة إلى كاناميسين (ونحن نستخدم pDONR207 ومتوفرة تجارياً).
ملاحظة: ينبغي تأكيد حرمة استنساخ الدخول بالتسلسل، قبل استخدامها لتوليد بيك-HT-بنية التعبير DEST1. بيك-HT-DEST1 متاح عند الطلب من المختبر لومونوسوف في مركز جون إينيس في نورويتش، المملكة المتحدة. - عزل بيك-HT-ناقل DEST1 من استنساخ التعبير التي تم إنشاؤها في الخطوة 1-1-3، وتخزينها في-20 درجة مئوية قبل استخدامها في الخطوة 1، 3.
ملاحظة: كيت تنقية بلازميد المستندة إلى عمود تدور مريحة المتاحة تجارياً أي مصمم لاستخراج البلازميدات من استنساخ السلالات كولاي مناسبة. اتبع التعليمات المحددة لتنقية بلازميد المختار كيت (انظر الجدول للمواد).
- إعداد كيميائيا المختصة A. tumefaciens للتحول.
- تطعيم انتقائية رطل (لوريا بيرتاني المتوسطة: 10 غرام/لتر بكتو-تريبتوني، 10 غرام/لتر كلوريد الصوديوم، واستخراج الخميرة 5 غرام/لتر، أجار 10 غرام/لتر pH 7.0) طبق أجار (50 ميكروغرام/مل الريفامبيسين والستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل)، من streaking LBA4404 tumefaciens أ من ثقافة أسهم والغليسيرول. تبني بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية في حاضنة دائم.
- تلقيح 50 مل من انتقائية الإعلام LB السائل (50 ميكروغرام/مل الريفامبيسين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين) مع عينة خلايا LBA4404 A. tumefaciens من الخطوة 1.2.1. تبني بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية في حاضنة تهز 200 لفة في الدقيقة.
- بارد الثقافة من الخطوة 1.2.2 على الجليد لمدة 10 دقائق وثم بيليه الخلايا A. tumefaciens بالطرد المركزي في 4 درجات مئوية و g x 4500 لمدة 5 دقائق (تجاهل المادة طافية).
- ريسوسبيند بيليه من الخطوة 1.2.3 في 1 مل من المحلول2 كاكل المثلج 20 مم وكرر الخطوة الطرد المركزي من الخطوة 1.2.3 (تجاهل المادة طافية).
- ريسوسبيند بيليه من الخطوة 1.2.4 في 1 مل من المحلول2 كاكل المثلج 20 مم وقاسمه تعليق الناتجة في إلى 50 ميليلتر دفعات. فلاش تجميد مختبرين في سائل ن2 ومخزن في-80 درجة مئوية قبل استخدامها.
- تحويل أعد LBA4404 A. tumefaciens مع معزولة بيك-HT-ناقل DEST1 التي تم إنشاؤها في الخطوة 1، 2.
- ذوبان الجليد 50 ميليلتر من تعليق A. tumefaciens التي تم إنشاؤها في الخطوة 1، 2 في الجليد، واحتضان مع 100 \u2012 200 نانوغرام من عزلة بيك-HT-ناقل DEST1، والتي تم إنشاؤها في الخطوة 1، 1، في 0 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- الباردة صدمة تعليق المحتضنة من الخطوة 1.3.1 في سائل ن2 لمدة 30 ثانية، ثم السماح للحارة إلى درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 200 ميكروليتر من شركة نفط الجنوب متوسطة (شركة نفط الجنوب: 20 غرام/لتر بكتو-تريبتوني، استخراج الخميرة 5 غرام/لتر، 0.58 غرام/لتر كلوريد الصوديوم، 0.19 غرام/لتر بوكل، 2.03 g/L مجكل2، 2.46 غرام/لتر سلفات المغنزيوم 7-هيدرات، الجلوكوز 3.6 غ/لتر) إلى تعليق الصدمة الباردة من خطوة 1.3.2 واحتضانها ح 4 في 28 ° (ج) في حاضنة تهز 200 لفة في الدقيقة.
- تطعيم طبق أجار رطل انتقائي (50 ميكروغرام/مل الريفامبيسين، 50 ميكروغرام/مل كاناميسين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين) مع ثقافة شركة نفط الجنوب من الخطوة 1.3.3. انتشار جيدا، واحتضان لمدة 3 أيام في 28 درجة مئوية في حاضنة دائم.
- تلقيح 5 مل من انتقائية الإعلام رطل (50 ميكروغرام/مل الريفامبيسين، 50 ميكروغرام/مل كاناميسين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين) مع مستعمرة واحدة من الخطوة 1.3.4. تبني بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية في حاضنة تهز 200 لفة في الدقيقة.
- إضافة 200 ميكروليتر من الجلسرين إلى 1 مل ثقافة السائل من الخطوة 1.3.5 ومزيج دقيق وتخزينها في-80 درجة مئوية.
ملاحظة: ويمكن أحياء هذه الثقافة للتجارب المقبلة من streaking على لوحات أجار رطل مع المضادات الحيوية المناسبة (الموصوفة أدناه).
2-إعداد تعليق عمليات التسلل
- تطعيم صفيحة أجار رطل انتقائية مع الشرائط المطلوب سلالات A. tumefaciens من الجلسرين مخزون الثقافات التي تم إنشاؤها في الخطوة 1. تبني بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية في حاضنة دائم.
ملاحظة: سلالة تحمل ثمجر داخل بيك-HT-ناقل DEST1 يمكن أن تدرج أيضا.- شكل فردي تلقيح 50 مل من انتقائية رطل الإعلام مع عينة من كل سلالة A. tumefaciens نمت في الخطوة 2، 1 واحتضان بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية في حاضنة تهز 200 لفة في الدقيقة.
- شكل فردي نقل ثقافات 50 مل من الخطوة 2.1.1 إلى 1000 مل من انتقائية الإعلام رطل (والريفامبيسين 50 ميكروغرام/مل، كاناميسين، 50 ميكروغرام/مل ستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل) واحتضان بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية في حاضنة تهز 200 لفة في الدقيقة.
- شكل فردي بيليه A. tumefaciens بالطرد المركزي (4000 x ز)، من ثقافات السائلة التي تم إنشاؤها في الخطوة 2.1.2 (تجاهل المادة طافية).
- ريسوسبيند فردياً الكريات من الخطوة 2.1.3 في 50 مل من المخزن المؤقت لمجلس العمل المتحد الطازجة (المخزن المؤقت لمجلس العمل المتحد: 10 مم 2 حمض-(N-morpholino)-اثانيسولفونيك، pH 5.6 (كوه)، 10 مم مجكل2، 150 ميكرومتر 3 '5'-ديميثوكسي-4-أسيتوفينوني) واحتضان في درجة حرارة الغرفة في الظلام ح 1.
- دمج وحدة التخزين المناسبة لكل تعليق مجلس العمل المتحد A. tumefaciens (الذي تم إنشاؤه في الخطوة 2.1.4) لإنتاج التطوير التنظيمي نهائي600 على الأقل 0.2 لكل سلالة في إجمالي نهائي ل 10.
- إضافة المخزن المؤقت الإضافي في مجلس العمل المتحد لأن الإيقاف المشتركة التي تم إنشاؤها في الخطوة 2.1.5 إلى وحدة تخزين نهائي من 1 لتر (الاستخدام فورا في الخطوة 3).
ملاحظة: فمن المستحسن إعداد حرف L 2 إضافية لوقف عمليات التسلل للحفاظ على مستوى السائل خلال عملية تسلل. - تحضير 1 لتر من قوة x 10 مجلس العمل المتحد المخزن المؤقت.
3-القيام بعمليات تسلل الفراغ
ملاحظة: انظر الشكل 2 للحصول على وصف لتسلل فراغ جهاز البناء. استخدام عمرها 5 الأسبوع النباتات بينثاميانا أ في الأواني 9 × 9 سم لخطوات المتابعة. وينبغي أن تزرع في السماد F1 (مثلاً من ليفينجتون) الشتلات ونمت لمدة أسبوعين قبل أن يتم نقله إلى الأواني الفردية التي تحتوي على المفتاح F2 السماد. ينبغي أن تزرع النباتات في دفيئة عند 25 درجة مئوية، مع 16 ح يوميا الخفيفة (استخدام التكميلية الإضاءة عند الاقتضاء)، المياه يوميا، الحد الأقصى من الكثافة من 100 مصانع/م2.
- نقل ل 1 لوقف عمليات التسلل التي تم إنشاؤها في الخطوة 2 و 1 لتر من 10 × قوة مجلس العمل المتحد المخزن المؤقت إلى حمام التسلل، متبوعاً بحرف L 8 إضافية من المياه.
- إزالة أجنحة قابلة للفصل لصاحب مصنع مفصل، وإدراج 4 النباتات (نباتات عمرها 5 الأسبوع انظر الحاشية السابقة) وإعادة إرفاق الأجنحة. عكس صاحب ثم ضعه أعلى حمام التسلل كي تغرق الأوراق في وقف عمليات التسلل.
ملاحظة: ضمان مستوى تعليق يصل إلى السطح العلوي لصاحب المصنع. رفع مستوى بالإضافة إلى وقف تسلل إضافية إذا لزم الأمر. - نقل حمام التسلل مع النباتات المغمورة إلى غرفة عمليات التسلل وإغلاق الباب. التأكد من إغلاق صمام الهواء المدخول على المتسلل. قم بتشغيل المضخة الفراغ وفتح صمام مضمنة إلى خزان فراغ متبوعاً بفراغ المدخول صمام في قاعة عمليات التسلل.
- بمجرد الضغط في الدائرة التسلل قللت من 880 [مبر]، إغلاق صمام السحب الفراغ، وفتح صمام الهواء المدخول. مرة واحدة قد عاد الدائرة تسلل إلى الضغط الجوي، فتح الباب، وإزالة حمام تسلل.
- رفع صاحب المصنع حتى النباتات مغمورة لم يعد في وقف عمليات التسلل، ثم هزة بلطف حامل للسماح بتعليق الزائدة لتشغيل قبالة يترك مرة أخرى إلى الحمام تسلل.
- العودة الحامل لوضع مستقيم وإزالة أجنحة قابلة للنزع، وإزالة النباتات.
- كرر الخطوات من 3.1.1 إلى 3.1.5 حتى تسللوا من العدد المطلوب من النباتات.
- اﻷوتوكﻻف وقف تسلل المستعملة قبل التخلص منها.
- اﻷوتوكﻻف حمام التسلل قبل إعادة استخدامها في التجارب اللاحقة.
- تعقيم الداخلية الدائرة تسلل عن طريق تنظيف مع الإيثانول 70% ويترك للهواء الجاف قبل إعادة استخدامها في التجارب اللاحقة.
- إزالة أجنحة قابلة للفصل لصاحب مصنع مفصل، وإدراج 4 النباتات (نباتات عمرها 5 الأسبوع انظر الحاشية السابقة) وإعادة إرفاق الأجنحة. عكس صاحب ثم ضعه أعلى حمام التسلل كي تغرق الأوراق في وقف عمليات التسلل.
4-تنمو النباتات تسلل
- ترتيب النباتات تسلل من الخطوة 3 في أقصى كثافة 100 النباتات/م2 في دفيئة.
- تنمو لمدة 5 أيام في 25 درجة مئوية و 16 ح يوميا ضوء (استخدام التكميلية الإضاءة عند الاقتضاء)، والمياه يوميا.
5-المحصول أوراق تسلل
- وبعد 5 أيام نمو، حصاد الأوراق.
- اﻷوتوكﻻف نفايات المواد النباتية والأواني، والتربة قبل التخلص منها.
6-الجاف يترك المقطوع
ملاحظة: ليوفيليزيشن الدقيق الإجراء الموضح أدناه يعتمد على طبيعة الجهاز lyophilization المتاحة المتوفرة.
- ليوفيليزي يترك المقطوع حتى الجاف.
- ضع أوراق المقطوع في كيس البولي بروبيلين 2 مم سميكة. تجميد الأوراق المقطوع بتخزينها في ثلاجة-80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- انثقب الكيس مع العديد من الثقوب الصغيرة باستخدام دبوس. يترك مكان حصل المجمدة في الدائرة المركزية ليوفيليزير. ضمان جميع الصنابير مرفق قارورة مغلقة ومن ثم التبديل على ليوفيليزير. تأمين مكثف تصل إلى-50 درجة مئوية على الأقل، ويقلل من الضغط على الأقل 0.15 [مبر]، وثم ترك بين عشية وضحاها.
- إيقاف تشغيل في ليوفيليزير والتنفيس عن الفراغ بفتح حنفية مرفق قارورة. إزالة الأوراق المجففة من الدائرة المركزية، وانتقل إلى الخطوة 7.
7-الضغط الاستخلاص بالمذيبات
ملاحظة: الخطوات المتابعة التي تشير إلى استخدام صك PSE المتاحة تجارياً (انظر الجدول للمواد). يرجى الرجوع إلى الأدب الخاص بالشركة المصنعة للحصول على معلومات أكثر تفصيلاً عن العملية. الأداة تنفذ 4 عمليات الاستخراج بالتوازي.
- تطحن الأوراق المجففة إلى مسحوق بالطبع عن طريق أسلوب مناسب (مثلاً، لمعظم المركبات ترتيربين من الفائدة استخدام الخلاط المنزلي، أو يدوياً سحق الأوراق بينما الواردة داخل حقيبة).
ملاحظة: طحن بالمدقة والهاون تحت النتروجين السائل ليس من الضروري عادة.- يخلط مسحوق أوراق رمال الكوارتز (\u2012 0.3 0.9 ملم، 20 في المائة من حيث الحجم) في حاوية مناسبة؛ وهذا بمثابة مشتت ويحسن كفاءة عملية الاستخراج.
- إعداد 4 استخراج خلايا (120 مل) لملء. لذلك، عكس الخلايا الاستخراج وإدراج تصفية الألياف الزجاجية، تليها أطل معدنية وعقد التوصيل. العودة استخراج الخلايا تستقيم الموقف وإضافة 1 سم طبقة عميقة من رمال الكوارتز (0.3 \u2012 0.9 ملم).
- تعبئة الخلايا من الاستخراج.
- تعبئة الخلايا الاستخراج مع مسحوق نبات المعدة التي تم إنشاؤها في الخطوة 7، 1 إلى خط التعبئة. إذا لزم الأمر، بلطف ضغط المسحوق خلال هذه العملية لتسهيل إضافة كمية أكبر في كل خلية الاستخراج.
- إضافة طبقة صغيرة من رمال الكوارتز (0.3 \u2012 0.9 مم) إلى الجزء العلوي من مسحوق معبأة وإدراج عامل التصفية السليلوز أعلى.
- إدراج الخلايا استخراج معبأة في الصك PSE وتشغيل الأسلوب المطلوب. استخدم الإعدادات التالية والمواد؛ المذيبات: خلات الإيثيل 100%؛ درجة الحرارة: 100 درجة مئوية، والضغط: 130 بار. تشغيل 3 دورات كالتالي: دورة 1: 0 دقيقة وقت الانتظار ودورة 2 ووقت عقد 3:5 دقيقة، تنتهي بمطاردة المذيبات 2 دقيقة، و 12 دقيقة النيتروجين الغاز تدفق.
ملاحظة: فمن المستحسن لتحسين طريقة الاستخراج على نطاق صغير أولاً. ومع ذلك، الأسلوب التالي غالباً كافية لمعظم المؤكسد ترتيربين aglycones. ويمكن الجمع بين الخمور من كل خلية استخراج في نفس السفينة جمع خارجي عن طريق تحديد خط النفايات كوجهة الاستخراج، بدلاً من الخطوط القياسية جمع الفردية. يجب أن تدرك مقدار المذيبات المستخدمة تعتمد على التعبئة لاستخراج الخلايا وضبط درجة الحرارة والضغط. أسلوب أعلاه يولد عادة حوالي 800 مل من استخراج الخمور للاستخراج موازية 4. - كرر الخطوات من 7.2 إلى 7.3.3 حتى كل من مسحوق نبات قد تمت معالجتها.
- تركيز الخمور استخراج مجتمعة إلى جفاف، وعن طريق التبخر الروتاري تحت الفراغ. تحقق من الإخراج المتوقع (أي، الطين الأخضر الداكن).
ملاحظة: قد تختلف إجراءات الضبط اعتماداً على مجموعة أعلى من مبخر دوراني المتاحة. دائماً ارتداء حماية العين عند أداء تبخر دوارة، وتحقق الأواني الزجاجية للضرر قبل إخضاع ظروف الفراغ.- قم بتشغيل إعادة تدوير المبردات، وتسمح للسائل نقل الحرارة لتبريد إلى مالا يقل عن 5 درجة مئوية. بدوره في حوض ماء، وضبط درجة الحرارة إلى 35 درجة مئوية.
- نقل الخمور الاستخراج قارورة تبخر (عدم ملء أكثر من نصف حجم قارورة). تركيز الخمور باتشويسي (في إلى قارورة نفسه) إذا تجاوز إجمالي حجم هذا. إرفاق قارورة التبخر مليئة بالبخار-مجرى هواء مبخر دوراني (آمنة مع مقطع مشترك).
- ضبط موضع رفع قارورة وزاوية، حيث غمر الجزء السفلي الثالث من قارورة التبخر في حوض ماء في زاوية 45 درجة تقريبا. بدء قارورة الغزل في سرعة التي يبدأ انتشار الخمور الاستخراج تصل جدران قارورة.
- التأكد من إغلاق الصنبور تنفيس والبدء في تخفيض الضغط (باستخدام وحدة تحكم مضخة فراغ) حتى يحتفل بالتنقيط معتدلة بين قارورة مكثف والمتلقي.
ملاحظة: لا تسمح بالخمور الاستخراج البدء في الغليان. إذا كان هذا يحدث تخفيض قوام الفراغ جلب تقطير تحت السيطرة. - رصد وضبط سرعة فراغ القوة وزيادة ونقصان حسب الاقتضاء حتى يتبخر جميع المذيبات.
8-الأساسية التبادل الأيوني راتنج العلاج لإزالة تشلوروفيلس
ملاحظة: الكميات التي نقلت في الخطوات التالية التي تحمل على نطاق عمل الأصلي 100 \u2012 150 النباتات. الخطوة 8 ليست مناسبة للمنتجات التي تحتوي على حمض الكربوكسيلية الجماعات أو المجموعات الوظيفية التي سوف تحلل الظروف الأساسية مثل اﻻسترات.
- حل استخراج النفط الخام التي تم إنشاؤها في الخطوة 7 في كمية ضئيلة من الإيثانول.
- إضافة 50 مل حبات راتنج التبادل الأيوني الأساسية (انظر الجدول للمواد) على ناتج الخطوة 7.1.1، واهتزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: لا تحل محل تهتز لاستخدام جهاز التحريك. النفقات العامة المغناطيسية أو الميكانيكية إثارة يمكن أن تمس سلامة الخرز الراتنج. الانفعالات مناسبة أيضا مريح يمكن ببطء دوران قارورة رد فعل على مبخر دوراني مع الفراغ في الضغط الجوي أو قطع الاتصال. - إضافة 50 مل إضافية من حبات راتنج التبادل الأيوني الأساسية كل 30 دقيقة حتى رد فعل قد ذهب للإنجاز؛ سيتم تغيير الخرز راتنج التبادل الأيوني الأساسية من الوردي إلى اللون الأخضر في اللون، وسيتم تغيير الطور السائل من الأخضر إلى البرتقالي أو لون بني غامضة تبعاً للمقياس.
- إذا كنت في شك في أن رد فعل قد ذهب إلى الإنجاز، عينة 0.5 مل السائل. تصفية النموذج عن طريق عمود صغير من الأرض مشطوري ومراقبة لون فيلتراتي؛ أن رد الفعل عادة كاملة داخل ح 1.5.
- قم بتصفية الخليط رد فعل عن طريق عمود قصير من الأرض مشطوري.
- تنفيذ ذلك عن طريق الترشيح فراغ، أو عن طريق عمود لوني فلاش زجاج باستخدام الكير من ناحية تطبيق الضغط. إذا كان يؤدي إلى إبطاء معدل الترشيح، تخل بأعلى لوحة المفاتيح مشطوري الأرض بقضيب إثارة. جمع في فيلتراتي.
- شطف الخرز الراتنجات التي تم جمعها مع الإيثانول، تليها الإيثانول: الهكسين 1:1، وأخيراً الهكسين. استخدام شطف وحدة يكفي ريسوسبيند الخرز على رأس العمود مشطوري الأرض.
- الجمع بين فيلتراتي من الخطوة 8.4، ويشطف من الخطوة 8.5، والتركيز على جفاف بتبخر دوارة تحت الفراغ.
9-الأولية وجود الخام
ملاحظة: الأسلوب التالي عادة ما يناسب aglycones ترتيربين المؤكسد نموذجية، وتستخدم أداة مؤتمتة لوني فلاش. الرجوع إلى الأدب الخاص بالشركة المصنعة لمزيد من التفاصيل حول العملية.
- الجسميات المنتج الخام التي تم إنشاؤها في الخطوة 8 على الصف فلاش السليكا هلام (المسام الحجم: 60، حجم جسيمات: 35 \u2012 75 ميكرو) للتطبيق لخرطوشة لوني فلاش عن طريق منهجية تحميل الجافة.
- حل النفط الخام المنتج التي تم إنشاؤها في الخطوة 8 في كمية ضئيلة من المذيبات العضوية المناسبة. ضمان حل كامل.
ملاحظة: الميثان بالإضافة إلى بضع قطرات من الميثانول عادة خياراً ملائماً للمذيبات. - فك الجزء العلوي من خرطوشة اللوني فلاش المعبأة 100 غرام (انظر الجدول للمواد)، وقم بإزالة الأقراص للكشف عن مساحة الرأس تحميل الجافة. استخدام الفضاء الرئيسي لقياس حجم مناسب من هلام السليكا لتحميل الجافة.
- نقل قياس حجم هلام السليكا لتحميل الجافة للحل من النفط الخام المنتج، ثم إزالة المذيب بتبخر دوارة تحت الفراغ.
ملاحظة: يجب إرجاع هلام السليكا إلى مسحوق التدفق الحر. نحو النهاية لإلغاء عملية التبخر لطيف قد يلزم لتحرير هلام السليكا من الجانب من قارورة التبخر. - حجته خرطوشة اللوني فلاش 100 غ في 100 مل/دقيقة مع أحجام العمود 5 على الأقل من الهكسين 100%، لكن مثالي حتى يصبح المحتوى خرطوشة ترطب تماما وموحد.
- نقل هلام السليكا تحميل الجافة المعدة إنشاؤها في الخطوة 9.1.3 إلى مساحة تحميل الجافة الرأس خرطوشة اللوني فلاش متوازن 100 غرام، بصب. تعليق في الهكسين وماصة ترتيل واسعة يمكن استخدامها للمساعدة في نقل أي هلام السليكا تحميل الجافة المتبقية.
- هلام السليكا تحميل الجافة المنقولة في الفراش مع الهكسين 100% لإزالة الهواء من headspace تحميل الجاف الرطب.
- تشغيل الأسلوب اللوني التالي: المذيبات [أ]: الهكسين، والمذيبات [ب]: وخلات الإيثيل، ومعدل التدفق: 100 مل/دقيقة، التدرج: 0% [ب] 100% [ب] أكثر من 3000 مل، جمع: "جمع كافة"، حجم الكسر: 250 مل.
- تحليل الكسور بطبقة رقيقة اللوني (TLC)8 أو الكتلي الفصل اللوني للغاز (GC-MS)8، وتركيز لجفاف fraction(s) الذي يحتوي على مجمع للفائدة عن طريق التبخر الروتاري تحت الفراغ.
- حل النفط الخام المنتج التي تم إنشاؤها في الخطوة 8 في كمية ضئيلة من المذيبات العضوية المناسبة. ضمان حل كامل.
- إجراء تنقية غرامة المصب حتى يتم التوصل إلى المستوى المطلوب من النقاء.
ملاحظة: تنقية غرامة المتلقين للمعلومات الخاصة بمجمع تماما وليس من الممكن تقديم خطوات موحدة (انظر القسم المناقشة).
Representative Results
غلة معزولة النموذجية التي تعتمد على تركيبة الإنزيم/إنزيم تحت التحقيق والاستقرار الكيميائي للمجمع المستهدف، وكيف كان التحدي في عملية تنقية. سبق أبلغنا غلة معزولة من β-أميرين الجاف المشتقات من تجاربنا الحيوي اندماجي تتراوح بين 0.12 ملغ 3.87 جرام من مسحوق نبات بينثاميانا أ . هذه المركبات على نطاق واسع وتراوح مستوى الأكسدة، وشملت مجموعات غير طبيعي للإنزيمات (الشكل 3)8. هذا البروتوكول يستخدم بشكل روتيني في المختبر لإنتاج عشرات أو مئات من ملليغرام من المنتج المنقي لتوصيف الهيكلية بالتحليل الطيفي الرنين المغناطيسي والاختبارات الوظيفية المتلقين للمعلومات. كما أثبتنا الأداة المساعدة التحضيرية لهذا النظام الأساسي بإنتاج 0.8 غرام من السقالة ترتيربين β-أميرين في درجة نقاء أكثر من 98 في المائة. هذه التجربة تستخدم نباتات 459، ويمثل عائد معزولة ملغ 3.3 جرام من الجاف بينثاميانا أ نبات مسحوق8.
رقم 1: ملخص تخطيطي. التمثيل التخطيطي لعملية استغلال تعبير عابر للإنزيمات السكروز في نبات بينثاميانا أ لتحويل الإمدادات المحلية من 2، 3-أوكسيدوسكواليني نحو إنتاج منتجات عالية القيمة ترتيربين جديدة محضرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: فراغ البناء المتسلل وعملية.) مفصل الجناح واحد صاحب مصنع فصل. ب) بيسبوكي أجنحة صاحب المصنع المرفقة. ج) انعكاس وغمر النباتات. د) إدراج حمام تسلل. حمام ه) تسلل في مكان داخل قاعة عمليات التسلل. و) إكمال فراغ المتسلل: مضخة فراغ (1) (2) اتصال من مضخة فراغ إلى فراغ الخزان (3) فراغ الخزان العزلة صمام (4) اتصال بين فراغ الخزان وتسلل الدائرة (5) (6) قياس الضغط الجوي المدخول صمام (7) تسلل الدائرة (8) فراغ الخزان. يترك ز) ممثل من مصنع واحد تسلل مع بنية تعبير للبروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) بعد نمو عمليات التسلل بعد خمسة أيام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: أفادت نتائج تمثيلية لإنتاج مشتقات β-أميرين استخدام هذا البروتوكول8محضرة سابقا. هذا الجدول هو أمر من غلة معزولة. يتم تنسيق الأعمدة مشروط مع لون الإشارة إلى القيمة النسبية. أحمر = عالية، أخضر = منخفضة (على الرغم من أن متوسط أصفر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
تسلل فراغ عالية عن طريق وضع يسمح هذا البروتوكول لاستخدامها بشكل روتيني في المختبر لإنتاج مركبات ترتيربين من الفائدة لمختلف التطبيقات المصب محضرة. ويتكرر بسهولة تسلل فراغ جهاز الموصوفة هنا. بالإضافة لخزان فراغ من المستحسن لتقليل الوقت المطلوب لسحب الفراغ اللازمة، ولكن من الممكن ببساطة إعادة توظيفها فرن فراغ غير معدلة كغرفة عمليات التسلل. حماية مضخة فراغ عن طريق إضافة مكثف مناسبة معقولة من الناحية النظرية، ولكن في مختبرنا وجدنا هذا غير ضروري.
تغطية تسلل الخطر إذا كان يترك لا مغمورة تماما في وقف عمليات التسلل. يتم تصغير هذه المشكلة بضمان أن يصل مستوى التعليق إلى السطح العلوي لصاحب المصنع، وأن صاحب المصنع تناسب ضيق للحمام تسلل. نلاحظ من الشكل 2 أن السطح العلوي لصاحب المصنع هو راحة في إلى حمام تسلل عندما تكون في المكان. ويتحقق ذلك بلوحات على حواف الحامل المتوسطة التي تشكل نقطة الربط مع الجزء العلوي من الحمام تسلل. سوف تتطلب وقف تسلل الإضافات الدورية للحفاظ على مستوى التعليق. وهذا يتحقق على أفضل وجه بإضافة تعليق تسلل الزائدة لمنع تخفيض تدريجي ل التطوير التنظيمي600 على مدى تسلل باتشويسي كبيرة. ومع ذلك، في أيدينا، الاستعاضة عن الماء لا يبدو لها تأثير ملحوظ على الغلة المتوقعة على نطاق محضرة، على الرغم من أن هذا لم يكن كوانتيتيفيلي التحقيق. يمكن تسللت إلى النباتات كم من دفعة واحدة لوقف عمليات التسلل لا تزال مسألة مفتوحة. نحن التسلل بشكل روتيني بين 100 و 200 من النباتات مع دفعة واحدة لوقف عمليات التسلل. وباﻹضافة إلى ذلك، فمن الطبيعي لبعض التربة ليتش في وقف تسلل خلال عملية تسلل. قد لا تم العثور على أن يكون لها تأثير ملحوظ على فعالية عمليات التسلل.
خلال موسم الحصاد فمن المستصوب (ولكن لا حرج) لحصاد سوى الأوراق التي كانوا تسللوا إلى (بعض أوراق سوف تزرع تسلل فيما بعد). يمنع الحصاد الانتقائي تمييع مع أنسجة غير المنتجة، مما سيزيد إلا النسبة الشوائب الذاتية بالنسبة إلى مجمع للفائدة. وهذا له أثر رمزي على سهولة تنقية المصب، ويزيد من حجم هذه العمليات. عند استخدام ثمجر لتعزيز إمدادات السلائف، كثيرا ما لوحظ من النمط الظاهري نيكروسيد تتطور على مدى فترة النمو بعد انتهاء عمليات التسلل. وهذا أمر طبيعي وفعلا الإيدز الحصاد الانتقائي وعملية التجفيف المتلقين للمعلومات. ويمكن تخزين مسحوق الأوراق المجففة عادة في حاوية محكمة الإغلاق في مكان بارد، جاف، والظلام، ولكن من الناحية المثالية في مجفف تحت الفراغ. وهذا يعتمد على استقرار المجمع من المهتمين. توخي الحذر في حالة اختيار لتخزين في ثلاجة-80 درجة مئوية. التأكد من أن المجففة يترك حاوية لماء، وعلى إزالة من المخزن، تسمح هذه الحاوية الحارة إلى درجة حرارة الغرفة قبل الافتتاح. عدم القيام بذلك سيؤدي إلى الترطيب من الأوراق، التي تعرقل تجهيز تيار أسفل.
يتم توفير الخطوات ما بعد الحصاد في هذا البروتوكول لأغراض توضيحية، وتجربة لمساعدة هؤلاء الباحثين الذين قد تكون محدودة الكيمياء العملية. أنها يمكن أن تكون بديلاً للعديد من تقنيات الاستخراج/تنقية المنتجات الطبيعية الأخرى. كما هو مفصل في المقدمة، PSE مزايا كثيرة ولكن العاصمة التكلفة المتاحة تجارياً PSE الجهاز قد تكون باهظة، وليس من الضروري. العلاج راتنج التبادل الأيوني الأساسية وسيلة مريحة للغاية لتحل محل التقليدية تصبن متبوعاً بتقسيم/سائل. ومع ذلك، أنها ليست مناسبة للمنتجات التي تحتوي على حمض الكربوكسيلية الجماعات أو المجموعات الوظيفية التي سوف تحلل الظروف الأساسية، مثل اﻻسترات. هذه المنتجات يتوقع الإبقاء على راتنج التبادل الأيوني الأساسية. ومع ذلك، هناك إمكانية لاستغلال هذا لالتقاط والإفراج عن الإجراء (لم يتم توثيقها هنا). حيث سيكون من المناسب تصبن التقليدية، يقدم العلاج راتنج التبادل الأيوني الأساسية كبديل مناسب. قد وجد اللوني للطريقة الموضحة في الخطوة رقم 9، يكون قابلاً للتعميم للمركبات المبينة في الشكل 3. ومع ذلك، قد تتطلب مركبات قطبية زيادة فترة ممتدة شطف وخلات الإيثيل 100%. فيما يتعلق بالخطوة 9.2، تنقية غرامة المتلقين للمعلومات الخاصة بمجمع تماما، وهو أيضا وتعتمد على مقياس. جولات متكررة من اللوني فلاش أصغر حجماً مع التدرجات الأمثل، عادة ما تكون كافية لتحقيق درجة نقاء مناسبة لتحليل الرنين المغناطيسي النووي. على نطاقات أوسع، بلورة غالباً بديلاً ملائماً. وفي الحالات الصعبة، يمكن أن تستخدم محضرة أو شبه محضرة عالية الأداء اللوني السائل ([هبلك]) تبعاً للكمية المطلوبة من مجمع معزول. أمثلة على عمليات تنقية المصب لمجموعة من المركبات تمثيلية ويمكن الاطلاع على أماكن أخرى8.
البروتوكول الحالي، كما عرضت هنا، يستخدم بشكل روتيني في المختبر، وقد ثبت الأداة المساعدة. ومع ذلك، هناك مجال لا يزال كبيرا لمزيد من التحسين منهاج التعبير. والعمل جار في المختبر للتحقيق في كيفية مواصلة مسار الهندسة ومراقبة مستويات البروتين التعبير التفاضلية يمكن تحسين إنتاج ترتيربين علاوة على ذلك، بينما الوساطة سمية للخلايا المضيفة. هناك أيضا إمكانية للتحقيق في التلاعب بنظم النقل داخل الخلايا،من2021، والاتجاه للإنزيمات إلى الأقسام الخلوية المختلفة22،23، السبل التي يمكن أن تحسن الكفاءة أحداث أكسدة متعددة. ويمكن أيضا استكشاف الفوائد المحتملة لتعديل مورفولوجية العضيات الرئيسية الكامنة. وقد لوحظ على سبيل المثال، overexpression من الغشاء مجال التمويل نبات همجر للحث على تضخم هيولى في24من النباتات؛ موقع رئيسي للنشاط CYP450. هذا البروتوكول يعتبر مثاليا لإنتاج مليغرام غرام على نطاق كميات من المنتجات ترتيربين، ويمكن أن تستخدم في إعداد بحوث للحصول على مركبات لدراسة المتلقين للمعلومات (مثلاً، الاستكشاف المنهجي للهيكل والنشاط العلاقات، والتحقيقات الأولية في خصائص الحرائك الدوائية وميكروبيولوجية لقيادة المركبات ذات الأهمية السريرية). ومع ذلك، المنهاج خطيا وموثوق للتحجيم ببساطة عن طريق زيادة عدد النباتات المستخدمة، والطابع العملي للتعبير عابر عبر أجروينفيلتريشن ثبت على نطاق صناعي لإنتاج البروتينات الصيدلية 14، وبالتالي هناك إمكانية لهذا النظام الأساسي تمديد للإنتاج التجاري من تريتيربينيس ذات القيمة العالية. بدلاً من ذلك، أنها أيضا يمكن أن يتصور إنتاج مستقر ترانسفورمانتس تحمل في مسار السكروز مولتيجيني الرغبة في صيغتها النهائية، مما يسمح زراعة جماعية واستمرار 'تربية' المعدلة وراثيا بينثاميانا أ. سلالات إنتاج مركبات مختلفة ذات قيمة تجارية.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
كان يؤيد هذا العمل بها نورويتش البحوث بارك سنهم (الابن)، الهندسة المشتركة، ومجلس بحوث العلوم الفيزيائية/التكنولوجيا الأحيائية و BBSRC مجلس بحوث العلوم البيولوجية الممول أوبينبلانت بحوث البيولوجيا التركيبية المركز منح (BB /L014130/1) (M.J.S.)، أنطونيو اونوراتي)؛ جون إينيس مركز تبادل المعرفة وتسويقها منح (BB/KEC1740/1) (باء)؛ ومنح البرنامج الاستراتيجي المعهد BBSRC 'جزيئات من طبيعة' (BB/P012523/1)، ومؤسسة جون إينيس (أنطونيو اونوراتي). نود أن نشكر لومونوسوف جورج لتوفير ناقلات بيك وأندرو ديفيس للتصوير الفوتوغرافي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GC-MS instrument | any | n/a | |
| Thermocycler suitable for performing PCR reactions | any | n/a | |
| Gel electrophoresis apparatus | any | n/a | |
| Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
| Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L) | any | n/a | |
| Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/> 15000 rpm) | any | n/a | |
| Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
| Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
| Standing incubator | any | n/a | |
| Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L) | any | n/a | |
| Centrifuge bottles (1 L) | any | n/a | |
| Vacuum infiltration apparatus | bespoke | n/a | |
| 9 x 9 cm plant pots | any | n/a | |
| Freeze drying apparatus (=/> 8 litre condenser capacity) | any | n/a | |
| Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument) | Buchi | SpeedExtractor E-914 | |
| Rotary evaporator apparatus | any | n/a | |
| Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L) | any | n/a | |
| Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L) | any | n/a | |
| Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L) | any | n/a | |
| Spatulas (assorted sizes) | any | n/a | |
| Analytical balance (5 figures) | any | n/a | |
| Balance (2 figures) | any | n/a | |
| Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L) | any | n/a | |
| A -80 freezer | any | n/a | |
| Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument | Biotage | ISO-1EW | |
| Safety glasses | any | n/a | |
| Lab coat | any | n/a | |
| Autoclave | any | n/a | |
| Consumables | |||
| Micropipette tips (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
| Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL) | any | n/a | |
| Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL) | any | n/a | |
| Disposable Transfer pipettes (size 2 mL) | any | n/a | |
| Petri dishes (Size: 100 mL) | any | n/a | |
| Biotage® SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges | Biotage | FSK0-1107-0100 | |
| HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps | any | n/a | |
| Disposable purple nitrile gloves | any | n/a | |
| Top filter for E-914, cellulose | Buchi | 51249 | |
| Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber | Buchi | 11055932 | |
| Reagents | |||
| Quartz sand, 0.3 - 0.9 mm | Buchi | 37689 | |
| Celite 545 (diatomaceous earth) | Simga-Alrich | 22140-1KG-F | |
| Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm) | Merck | 1.09385.5000 | |
| 2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid | Melford | B2002 | |
| MgCl2 | Simga-Alrich | 208337-100G | |
| KOH | Simga-Alrich | 60377-1KG | |
| 3’5’-dimethoxy-4’-acetophenone (acetosyringone) | Simga-Alrich | D134406-1G | |
| Rifampicin | Alfa Aesar | J60836 | |
| Kanamycin sulfate | Gibco | 11815-032 | |
| Streptomycin | Simga-Alrich | S6501-100G | |
| Gentamycin | MP biomedicals | 190057 | |
| Agarose LE gel | Melford | MB1203 | |
| LB broth Millar | Simga-Alrich | L3522-250G | |
| Agar | Simga-Alrich | A5306-250G | |
| NaCl | Simga-Alrich | S5886-500G | |
| KCl | Simga-Alrich | P9541-500G | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Alrich | M2773-500G | |
| Glucose | Sigma-Alrich | G7021-100G | |
| Ambersep® 900 hydroxide (basic ion exchange resin) | Sigma-Alrich | 06476-1KG | |
| Hexane | Fisher | H/0406/PB17 | |
| Ethyl acetate | Fisher | E/0900/PB17 | |
| Dichloromethane | Fisher | D/1852/PB17 | |
| Methanol | Fisher | M/4056/PB17 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Alrich | E7637-1G | |
| Ethanol | VWR | 20821-330 | |
| Milli-Q water | any | n/a | |
| Levington F1 Compost | any | n/a | |
| Levington F2 Compost | any | n/a | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit). | Qiagen | 27104 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | Supplier New England Biolabs Ltd | C2987I | |
| pEAQ-HT-DEST1 vector | Lomonossoff laboratory John Innes Center | n/a | |
| pDONR207 | Thermo-Fisher | pDONR207 | |
| A. tumefaciens LBA4404 | Thermo-Fisher | 18313015 | |
| GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11791020 | |
| GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11789020 | |
| GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX | Promega UK Ltd | M7822 | |
| PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE | New England Biolabs Ltd | M0530S | |
| dNTP SET 100mm | Thermo-Fisher | 10297018 | |
| RNEASY PLANT MINI KIT | Qiagen Ltd | 74904 | |
| RQ1 RNASE-FREE DNASE | Promega UK Ltd | M6101 | |
| Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System | Fisher | 10308632 | |
| Trytone | Sigma-Alrich | T7293-250G | |
| Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | n/a |
References
- Thimmappa, R., et al. Triterpene biosynthesis in plants. Annual Review of Plant Biology. 65, 225-257 (2014).
- Seki, H., Tamura, K., Muranaka, T. P450s and UGTs: Key players in the structural diversity of triterpenoid saponins. Plant Cell Physiology. 56 (8), 1463-1471 (2015).
- Roy, A., Saraf, S. Limonoids: overview of significant bioactive triterpenes distributed in plants kingdom. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 29 (2), 191-201 (2006).
- Kamble, S. M., Goyal, S. N., Patil, C. R. Multifunctional pentacyclic triterpenoids as adjuvants in cancer chemotherapy: a review. RSC Advances. 4 (63), 33370-33382 (2014).
- Liby, K. T., Sporn, M. B. Synthetic oleanane triterpenoids: multifunctional drugs with a broad range of applications for prevention and treatment of chronic disease. Pharmacological Reviews. 64 (4), 972-1003 (2012).
- Yadav, V. R., et al. Targeting inflammatory pathways by triterpenoids for prevention and treatment of cancer. Toxins. 2 (10), 2428-2466 (2010).
- Christensen, L. P. Ginsenosides chemistry, biosynthesis, analysis, and potential health effects. Advances in Food and Nutrition Research. 55, 1-99 (2009).
- Reed, J., et al. A translational synthetic biology platform for rapid access to gram-scale quantities of novel drug-like molecules. Metabolic Engineering. 42, 185-193 (2017).
- Andersen-Ranberg, J., et al. Expanding the landscape of diterpene structural diversity through stereochemically controlled combinatorial biosynthesis. Angewandte Chemie International Edition. 55 (6), 2142-2146 (2016).
- Peyret, H., Lomonossoff, G. P. The pEAQ vector series: the easy and quick way to produce recombinant proteins in plants. Plant Molecular Biology. 83, 51-58 (2013).
- Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants. Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).
- Sainsbury, F., Lomonossoff, G. P. Extremely high-level and rapid transient protein production in plants without the use of viral replication. Plant Physiology. 148 (3), 1212-1218 (2008).
- Voinnet, O., et al. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. The Plant Journal. 33 (5), 949-956 (2003).
- Holtz, B. R., et al. Commercial-scale biotherapeutics manufacturing facility for plant-made pharmaceuticals. Plant Biotechnology Journal. 13 (8), 1180-1190 (2015).
- Bucar, F., Wubea, A., Schmidb, M. Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds. Natural Product Reports. 30, 525-545 (2003).
- Kaufmann, B., Christen, P. Recent extraction techniques for natural products: microwave-assisted extraction and pressurised solvent extraction. Phytochemical Analysis. 13 (2), 105-113 (2002).
- Larsen, E., Christensen, L. P. Simple saponification method for the quantitative determination of carotenoids in green vegetables. Journal of Archaeological and Food Chemistry. 53 (17), 6598-6602 (2005).
- Sainsbury, F., et al. Using a virus-derived system to manipulate plant natural product biosynthetic pathways. Methods Enzymology. , 185-202 (2012).
- Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA Cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research. 10, 1788-1795 (2000).
- Ting, H., et al. SNARE-RNAi results in higher terpene emission from ectopically expressed caryophyllene synthase in Nicotiana benthamiana. Molecular Plant. 8, 454-466 (2015).
- Wang, B., et al. Transient production of artemisininin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua. Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).
- Nielsen, A. Z., et al. Redirecting photosynthetic reducing power toward bioactive natural product synthesis. ACS Synthetic Biology. 2, 308-315 (2013).
- Dong, L., et al. Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments. New Phytologist. 209, 679-690 (2016).
- Ferrero, S., et al. Proliferation and morphogenesis of the endoplasmic reticulum driven by the membrane domain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A reductase in plant cells. Plant Physiology. 168, 899-914 (2015).
