निकोटियाना benthamiana पत्तियों में कृत्रिम एंजाइमों के क्षणिक heterologous अभिव्यक्ति नए उच्च मूल्य oxidosqualene उत्पादों के उत्पादन की दिशा में 2, 3-triterpene की अंतर्जात आपूर्ति को डायवर्ट कर सकते हैं । इस के साथ साथ तेजी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया है (5 दिन) triterpenes और इस शक्तिशाली संयंत्र आधारित मंच का उपयोग सादृश्य के preparative पैमाने पर उत्पादन ।
triterpenes संयंत्र प्राकृतिक उत्पादों के सबसे बड़े और सबसे संरचनात्मक रूप से विविध परिवारों में से एक हैं । कई triterpene डेरिवेटिव के लिए औषधीय प्रासंगिक जैविक गतिविधि के अधिकारी दिखाया गया है । हालांकि, इस प्रकार अभी तक इस क्षमता triterpene के एक बहुतायत में अनुवाद नहीं किया है क्लिनिक में दवाओं व्युत्पंन । यह यकीनन (कम से आंशिक रूप से) परिसर के इस वर्ग के लिए सीमित व्यावहारिक सिंथेटिक उपयोग का एक परिणाम है, एक समस्या यह है कि संरचना की खोज-गतिविधि संबंधों और पारंपरिक औषधीय द्वारा नेतृत्व के उंमीदवारों के विकास को दबाना कर सकते है रसायन विज्ञान कार्यप्रवाह । उनके विशाल विविधता के बावजूद, triterpenes सभी एक रेखीय अग्रदूत, 2, 3-oxidosqualene से प्राप्त कर रहे हैं । एन benthamiana में कृत्रिम एंजाइमों के क्षणिक heterologous अभिव्यक्ति 2, 3-oxidosqualene के नए उच्च मूल्य triterpene उत्पादों है कि स्वाभाविक रूप से इस मेजबान द्वारा उत्पादित नहीं कर रहे है के उत्पादन की दिशा में अंतर्जात आपूर्ति को हटा सकते हैं । एग्रो घुसपैठ एन benthamianaमें क्षणिक अभिव्यक्ति प्राप्त करने का एक कुशल और सरल साधन है । इस प्रक्रिया में एग्रोबेक्टीरियम tumefaciens के निलंबन के साथ संयंत्र के पत्तों की घुसपैठ शामिल है, जो कि ब्याज की अभिव्यक्ति का निर्माण (ओं) को लेकर है । एक अतिरिक्त A. tumefaciens तनाव एक अभिव्यक्ति ले जाने के सह घुसपैठ एक एंजाइम है कि अग्रदूत की आपूर्ति को बढ़ा देता है एंकोडिंग का निर्माण काफी पैदावार बढ़ जाती है । पांच दिनों की अवधि के बाद, घुसपैठ पत्ती सामग्री काटा जा सकता है और परिणामी triterpene उत्पाद (ओं) को अलग करने और निकालने के लिए संसाधित किया जाता है । यह एक प्रक्रिया है कि रैखिक और मज़बूती से स्केलेबल है, बस प्रयोग में इस्तेमाल पौधों की संख्या में वृद्धि से । स्पेसिफिकेशंस इस संयंत्र आधारित मंच का उपयोग triterpenes के तेजी से preparative पैमाने पर उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है । प्रोटोकॉल एक आसानी से replicable वैक्यूम घुसपैठ तंत्र का इस्तेमाल करता है, जो चार पौधों को एक साथ घुसपैठ की अनुमति देता है, जो समय की एक छोटी अवधि में सैकड़ों पौधों की बैच-वार घुसपैठ को सक्षम बनाता है ।
triterpenes संयंत्र प्राकृतिक उत्पादों के सबसे बड़े और सबसे संरचनात्मक रूप से विविध परिवारों में से एक हैं । उनके विशाल विविधता के बावजूद, सभी triterpene प्राकृतिक उत्पादों को एक ही रैखिक प्रणेता 2, 3-oxidosqualene, पौधों में mevalonate मार्ग के एक उत्पाद से व्युत्पंन माना जाता है । 2, 3 के Cyclization-oxidosqualene शुरू की है और एंजाइमों oxidosqualene cyclases (OSCs) के एक परिवार द्वारा नियंत्रित किया जाता है । इस cyclization कदम विविधीकरण के पहले के स्तर का प्रतिनिधित्व करता है, अलग triterpene पाड़ के सैकड़ों प्रकृति1से सूचित किया गया है के साथ । इन पाड़ों आगे सहित एंजाइमों सिलाई द्वारा विविध रहे हैं, लेकिन सीमित करने के लिए नहीं, cytochrome p450s (CYP450s)1,2। इस तरह के सिंथेटिक रास्ते असीम जटिलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, कभी-कभार अंतिम उत्पादों जो माता पिता triterpene से पहचानने योग्य हैं में जिसके परिणामस्वरूप । उदाहरण के लिए, शक्तिशाली कीटनाशक और antifeedant limonoid azadirachtin के जटिल संरचना tetracyclic प्रकार3के एक triterpene tirucallane से निकलने के लिए माना जाता है ।
कई triterpene-व्युत्पंन प्राकृतिक उत्पादों, यहां तक कि अपेक्षाकृत संशोधित माता पिता पाड़ के साथ उन, को औषधीय प्रासंगिक जैविक गतिविधि के अधिकारी दिखाया गया है4,5,6,7। हालांकि, इस प्रकार अभी तक इस क्षमता triterpene के एक बहुतायत में अनुवाद नहीं किया है क्लिनिक में दवाओं व्युत्पंन । यह यकीनन (कम से आंशिक रूप से) परिसर के इस वर्ग के लिए सीमित व्यावहारिक सिंथेटिक उपयोग का एक परिणाम है, एक समस्या यह है कि संरचना की खोज-गतिविधि संबंधों और पारंपरिक औषधीय द्वारा नेतृत्व के उंमीदवारों के विकास को दबाना कर सकते है रसायन विज्ञान कार्यप्रवाह ।
एन benthamiana पत्तियों में अन्य प्रजातियों के पौधे से triterpene के कृत्रिम एंजाइम की परिवर्तनीय अभिव्यक्ति 2, 3-oxidosqualene के नए उच्च मूल्य triterpene उत्पादों (चित्रा 1) के उत्पादन की दिशा में अंतर्जात की आपूर्ति को डायवर्ट कर सकते हैं । इस प्रक्रिया को कार्यात्मक उंमीदवार एंजाइमों की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और महत्वपूर्ण स्वाभाविक रूप से होने वाली चयापचयों के कृत्रिम रास्ते फिर से संगठित । समान रूप से, यह भी मिश्रित में इस्तेमाल किया जा सकता है कृत्रिम triterpene उत्पादों, एक रणनीति है कि संरचनात्मक रूप से संबंधित सादृश्य के पुस्तकालयों में परिणाम कर सकते है उत्पादन, संरचना के व्यवस्थित अंवेषण-गतिविधि संबंधों की अनुमति के जैविक रूप से सक्रिय नेतृत्व यौगिकों8,9.
Agroinfiltration N. benthamiana पत्तियों में क्षणिक अभिव्यक्ति प्राप्त करने का एक कुशल और सरल साधन है । इस प्रक्रिया में एक. tumefaciens के निलंबन के साथ पत्तियों की घुसपैठ शामिल है जो बाइनरी एक्सप्रेशन का निर्माण (एस) ब्याज के रूप में ले रहा है । यह दबाव है जो stomata के माध्यम से तरल बलों के आवेदन के माध्यम से प्राप्त की है, सेलुलर अंतरिक्ष में हवा की जगह है, और यह एक. tumefaciens निलंबन के साथ की जगह । जीवाणु पौधों की कोशिकाओं के इंटीरियर के लिए संबंधित टी-DNAs स्थानांतरण, घुसपैठ पत्ती ऊतक में स्थानीयकृत और परिवर्तनीय प्रोटीन अभिव्यक्ति में जिसके परिणामस्वरूप ।
जबकि किसी भी द्विआधारी ट्रांसजेनिक पौधों पैदा करने के लिए उपयुक्त वेक्टर क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए नियोजित किया जा सकता है, हम लोबिया मोज़ेक वायरस (CPMV) का उपयोग-व्युत्पंन Hypertranslational (एचटी) प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली10, 11. इस प्रणाली में ब्याज की जीन CPMV आरएनए-2 से अनुवादित क्षेत्रों (UTR) द्वारा पार्श्व है । 5 ‘ UTR वायरल प्रतिकृति12पर कोई निर्भरता के साथ प्रोटीन अनुवाद के बहुत उच्च स्तर में जिसके परिणामस्वरूप संशोधनों में शामिल हैं । इस तकनीक में विकसित किया गया है आसान और जल्दी (pEAQ) द्विआधारी वेक्टर श्रृंखला जो साइट विशिष्ट पुनर्संयोजन क्लोनिंग प्रोटोकॉल संगत constructs (pEAQ-एचटी-लक्ष्य)10,11शामिल हैं । सबसे pEAQ वैक्टर भी एक टमाटर जंगली स्टंट वायरस-व्युत्पंन P19 मुंह बंद करने दमन जीन13 टी के भीतर अभिव्यक्ति कैसेट है, जो एक अलग P19 coinfiltrate की जरूरत दरकिनार-ले जाने के तनाव और मुलाजिम बहुत से डीएनए भाग उच्च स्तरीय प्रोटीन अभिव्यक्ति में मेजबान संयंत्र सेल10,11.
एक अभिव्यक्ति मेजबान के रूप में N. benthamiana का उपयोग विशेष लाभ है जब संयंत्र के साथ काम कर रहे है कृत्रिम रास्ते । कोशिका वास्तुकला आंतरिक रूप से उपयुक्त mRNA और प्रोटीन प्रोसेसिंग का समर्थन करता है, और उचित compartmentalization, आवश्यक सह-एंजाइमों रखने के अलावा, reductases (CYP450s के लिए), और चयापचय पुरोगामी । कार्बन स्रोत प्रकाश संश्लेषण है; इस प्रकार, पौधों को अच्छी गुणवत्ता के खाद में उगाया जा सकता है, केवल पानी की आवश्यकता होती है,2 सह (हवा से), और सूरज की रोशनी के रूप में आदानों । मंच भी सह के लिए अत्यंत सुविधाजनक है प्रोटीन के विभिंन संयोजनों की अभिव्यक्ति, के रूप में इस सह द्वारा facilely प्राप्त किया जा सकता है एक. tumefaciens के विभिंन उपभेदों की घुसपैठ, बड़ी multigene अभिव्यक्ति के निर्माण की जरूरत को नकारने कैसेट. इसके अलावा, प्रक्रिया रैखिक और मज़बूती से बस प्रयोग में इस्तेमाल पौधों की संख्या में वृद्धि से स्केल किया जा सकता है ।
हमारी प्रयोगशाला में पिछले काम preparative पैमाने पर प्रयोगों के लिए इस मंच की उपयोगिता का प्रदर्शन किया है. यह भी शामिल है के लिए उपंयास triterpenes की तैयारी में उपयोग के लिए और अधिक स्केल के लिए अलग उत्पाद के ग्राम मात्रा प्राप्त करने के लिए । इसके अलावा, heterogenous triterpene उत्पादों के संचय कई गुना बढ़ाया जा सकता है एक N-टर्मिनल के सह-अभिव्यक्ति से कटा हुआ, राय-असंवेदनशील रूप 3-hydroxy, 3-methyglutary-कोएंजाइम एक रिडक्टेस (tHMGR), एक दर सीमित ऊपर mevalonate मार्ग में एंजाइम8.
इस तरह के preparative पैमाने पर प्रयोग करने की क्षमता घुसपैठ की प्रक्रिया को सुविधाजनक रूप से चौड़ा करने की है । एक ठेठ प्रयोग में, पौधों की सैकड़ों के लिए दसियों अलग उत्पाद के लक्ष्य मात्रा को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है । हाथ से व्यक्तिगत पत्तियों घुसपैठ (एक अनावश्यक सिरिंज का उपयोग) ऑपरेशन की मांग है, और अक्सर नकारात्मक स्तर तक समय लेने वाली, इस विधि प्रतिपादन दिनचर्या स्केल के लिए अव्यावहारिक । वैक्यूम घुसपैठ हाथ घुसपैठ पर लाभ प्रदान करता है, के रूप में यह ऑपरेटर के कौशल स्तर पर निर्भर नहीं है और पत्ती की सतह के एक अधिक क्षेत्र की घुसपैठ की अनुमति देता है । इस प्रक्रिया को व्यावसायिक रूप से दवा प्रोटीन14के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए प्रयोग किया जाता है । इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल एक आसानी से replicable वैक्यूम घुसपैठ उपकरण है, जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध भागों से निर्माण किया जा सकता है । यह 4 संयंत्रों के लिए एक साथ घुसपैठ की अनुमति देता है, तेजी से और व्यावहारिक बैच वार समय की एक छोटी अवधि में सैकड़ों पौधों की घुसपैठ वहन (चित्रा 2a -2 बी) । वैक्यूम घुसपैठ तंत्र एक वैक्यूम ओवन जो घुसपैठ चैंबर (चित्रा 2f) रूपों के होते हैं । ओवन एक वैक्यूम जलाशय के माध्यम से एक पंप से जुड़ा हुआ है । यह काफी समय के लिए घुसपैठ चैंबर में वांछित निर्वात को प्राप्त करने के लिए आवश्यक कम कर देता है । पौधे एक bespoke धारक में सुरक्षित है और एक 10 एल स्टेनलेस स्टील के पानी के साथ एक. tumefaciens निलंबन (चित्रा 2a -2c) भर स्नान में औंधा । कुशल घुसपैठ के लिए पौधों के हवाई भागों का पूरा विसर्जन महत्वपूर्ण है । पानी स्नान तो घुसपैठ चैंबर (चित्रा 2d -2e) के भीतर रखा जाता है, और निर्वात पत्ती मध्यवर्ती रिक्त स्थान से बाहर हवा आकर्षित करने के लिए लागू होता है । एक बार दबाव ८८० mbar द्वारा कम किया गया है (एक प्रक्रिया है जो लगभग 1 मिनट लेता है) घुसपैठ चैंबर तेजी से वापस लाया है 20-30 एस पर वायुमंडलीय दबाव ओवन प्रवेश वाल्व खोलने से, whereupon घुसपैठ पूरा हो गया है ।
घुसपैठ के पांच दिन बाद संयंत्र सामग्री कटाई और बाद में निष्कर्षण और वांछित उत्पाद (ओं) के अलगाव के लिए तैयार है । इस बिंदु से प्रक्रिया बस एक प्राकृतिक उत्पाद निष्कर्षण और पत्ती सामग्री, एक कार्यप्रवाह है कि किसी भी प्राकृतिक उत्पाद केमिस्ट से परिचित है से शुद्धि है । प्रारंभिक निष्कर्षण और बाद में शुद्धिकरण के लिए कई विभिंन तरीकों15मौजूद हैं । तरीकों का सबसे उपयुक्त विकल्प है और सटीक इस्तेमाल किया शर्तों के उच्च ब्याज की यौगिक के विशेष रासायनिक गुणों पर निर्भर करता है, कौशल की उपलब्धता के अलावा और/ यह इस प्रोटोकॉल में शामिल करने के लिए संभव नहीं है एक पूरी तरह से सामान्य रूप से, काटा संयंत्र पत्ती सामग्री के बहाव प्रसंस्करण के लिए कदम दर कदम विधि अलग उत्पाद है कि ब्याज की किसी भी triterpene उत्पाद के लिए आंख बंद करके पीछा किया जा सकता है, न ही यह होगा ऐसा करने के लिए प्रयास करने के लिए उपयुक्त । हालांकि, इस प्रोटोकॉल हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया बुनियादी कार्यप्रवाह और प्रक्रिया है, जो हमारे अनुभव में सबसे oxygenated aglycone triterpene उत्पादों के लिए सामांयीकरण साबित कर दिया है की प्रारंभिक अवस्था के लिए कुछ तरीकों का एक सिंहावलोकन प्रदान करेगा । यह दो अपेक्षाकृत असामांय तकनीक, अर्थात्, दबाव विलायक निष्कर्षण (सार्वजनिक उपक्रम), और क्लोरोफिल हटाने के लिए एक सुविधाजनक heterogenous चरण विधि एक जोरदार बुनियादी आयन विनिमय राल का उपयोग भी शामिल है ।
सार्वजनिक उपक्रम ठोस मैट्रिक्स से छोटे कार्बनिक अणुओं की निकासी के लिए एक अत्यधिक कुशल तकनीक है । निष्कर्षण दबाव के तहत प्रदर्शन कर रहे है (ca. १००-२०० बार), मुख्य लाभ को समाप्त तापमान जो निष्कर्षण विलायक के उबलते बिंदु से अधिक का उपयोग करने की क्षमता जा रहा है । यह काफी समय और एक संपूर्ण निष्कर्षण प्राप्त करने के लिए आवश्यक विलायक की राशि को कम कर सकते हैं, जब इस तरह के सरल भाटा या Soxhlet निकालने16के रूप में अंय गर्म विलायक तकनीकों की तुलना में । वाणिज्यिक बेंच-शीर्ष सार्वजनिक उपक्रम उपकरण उपलब्ध हैं, जो विनिमेय निष्कर्षण कोशिकाओं का उपयोग, और स्वचालित विलायक हैंडलिंग, हीटिंग, और निगरानी । यह इस तकनीक को बेहद सुविधाजनक बनाता है । यह भी यकीनन कम खतरनाक है, विशेष रूप से सीमित व्यावहारिक रसायन अनुभव के साथ ऑपरेटरों के लिए ।
Saponification के तहत कच्चे पत्ते के अर्क के बाद भाटा तरल/तरल विभाजन के बाद शोधन या विश्लेषण करने से पहले क्लोरोफिलों के थोक हटाने के लिए एक आम तकनीक है । हालांकि, यह अक्सर बड़े पैमाने पर संचालन की मांग कर सकते हैं । इसके अलावा, इंटरफेस का पता लगाने, या पायस के गठन के कारण उत्पाद नुकसान समस्याग्रस्त किया जा सकता है । जोरदार बुनियादी आयन का उपयोग-विनिमय रेजिन heterogenous चरण hydrolysis प्रदर्शन करने के लिए एक सुविधाजनक विकल्प के रूप में सेवा कर सकते हैं । hydrolyzed क्लोरोफिल के pigmented भाग राल के लिए पालन रहता है और बस निस्पंदन द्वारा हटाया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल एक पहले रिपोर्ट विश्लेषणात्मक प्रक्रिया17 कि एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बुनियादी आयन-विनिमय राल रोजगार के एक preparative पैमाने पर अनुकूलन का इस्तेमाल करता है ।
नीचे हम इस संयंत्र आधारित मंच का उपयोग triterpenes के preparative पैमाने पर उत्पादन के लिए एक विस्तृत और तेजी से प्रोटोकॉल का वर्णन । इस प्रोटोकॉल नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता है के लिए अलग triterpene उत्पाद के मिलीग्राम के सैकड़ों को दसियों तैयार परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा इस तरह के एक संरचनात्मक लक्षण वर्णन, और कार्यात्मक में/ assays.
उच्च के माध्यम से डाल वैक्यूम घुसपैठ इस प्रोटोकॉल नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला में विभिंन अनुप्रवाह अनुप्रयोगों के लिए ब्याज की triterpene यौगिकों के preparative उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति देता है । यहां वर्णित वैक्यूम घुसपैठ उपकरण आसानी से दोहराया जाता है । वैक्यूम जलाशय के अलावा आवश्यक निर्वात खींचने के लिए आवश्यक समय कम करने के लिए सलाह दी जाती है, लेकिन यह बस घुसपैठ चैंबर के रूप में एक संशोधित वैक्यूम ओवन repurpose करने के लिए संभव है. एक उपयुक्त संघनित्र के अलावा वैक्यूम पंप की रक्षा सैद्धांतिक रूप से समझदार है, लेकिन हमारी प्रयोगशाला में हम इस पाया है कि अनावश्यक है ।
अगर विपत्तियों को पूरी तरह से घुसपैठ के निलंबन में नहीं डुबोया जाता है तो घुसपैठ कवरेज समझौता है । यह समस्या यह सुनिश्चित करने से कम है कि निलंबन का स्तर संयंत्र धारक की शीर्ष सतह तक पहुंचता है, और यह कि प्लांट धारक घुसपैठ स्नान के लिए चुस्त फिट है । चित्रा 2 से ध्यान दें कि संयंत्र धारक के ऊपर की सतह में घुसपैठ स्नान करने के लिए जब जगह में अवकाश है । यह धारक जो घुसपैठ स्नान के शीर्ष के साथ लंगर बिंदु फार्म के मध्य किनारों पर पैनलों द्वारा हासिल की है । घुसपैठ निलंबन को निलंबन का स्तर बनाए रखने के लिए आवधिक परिवर्धन की आवश्यकता होगी । यह सबसे अच्छा अतिरिक्त घुसपैठ निलंबन के अलावा एक बड़े बैच वार घुसपैठ के पाठ्यक्रम पर आयुध डिपो६०० की क्रमिक कटौती को रोकने के द्वारा हासिल की है । हालांकि, हमारे हाथ में, पानी के लिए प्रतिस्थापन के लिए एक preparative पैमाने पर उंमीद की पैदावार पर एक नजर प्रभाव नहीं लगता है, हालांकि इस quantitively जांच नहीं किया गया है । घुसपैठ के एक बैच से कितने संयंत्रों में घुसपैठ हो सकती है निलंबन अब भी खुला सवाल है । हम नियमित रूप से घुसपैठ निलंबन के एक बैच के साथ १०० और २०० संयंत्रों के बीच घुसपैठ । इसके अलावा, घुसपैठ की प्रक्रिया के दौरान घुसपैठ निलंबन के दौरान कुछ मिट्टी नमकीन पानी के लिए सामांय है । इस वजह से घुसपैठ की प्रभावकारिता पर कोई असर नजर नहीं आ पाया है.
फसल के दौरान यह सलाह दी जाती है (लेकिन महत्वपूर्ण नहीं) केवल पत्ते कि घुसपैठ कर रहे थे (कुछ पत्तियों के बाद हो जाएगा घुसपैठ) । चयनात्मक फसल अनुत्पादक ऊतक, जो अंयथा ब्याज की यौगिक के सापेक्ष अंतर्जात अशुद्धियों के अनुपात में वृद्धि होगी के साथ कमजोर पड़ने रोकता है । यह बहाव शोधन की आसानी पर नाममात्र का प्रभाव पड़ता है, और इन प्रक्रियाओं के पैमाने बढ़ जाती है । जब tHMGR का उपयोग करने के लिए अग्रदूत साबित आपूर्ति को बढ़ावा देने के लिए, एक necrosed phenotype अक्सर बाद घुसपैठ वृद्धि की अवधि में विकसित करने के लिए मनाया जाता है । यह सामांय है और वास्तव में एड्स चयनात्मक फसल और बहाव सुखाने की प्रक्रिया । सूखे पत्ते पाउडर आमतौर पर एक सील कंटेनर में एक शांत, सूखी, अंधेरी जगह में संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन आदर्श रूप में एक desiccator में शूंय के तहत । यह रुचि के यौगिक की स्थिरता पर निर्भर करता है । अगर एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करने के लिए चुनने सावधानी बरतें । यह सुनिश्चित करें कि सूखे पत्ते एक निविड़ अंधकार कंटेनर में हैं, और भंडारण से हटाने पर, इस कंटेनर को खोलने से पहले कमरे के तापमान को गर्म करने की अनुमति दें । ऐसा करने में विफलता पत्तियों के पुनः गीला करने में परिणाम होगा, नीचे बाधा-धारा प्रसंस्करण ।
इस प्रोटोकॉल में बाद फसल कदम गाये प्रयोजनों के लिए प्रदान की जाती हैं, और उन शोधकर्ताओं जो व्यावहारिक रसायन विज्ञान अनुभव सीमित हो सकता है सहायता । वे कई अंय प्राकृतिक उत्पाद निष्कर्षण के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता/ परिचय में विस्तृत रूप में, सार्वजनिक उपक्रम के कई फायदे हैं, लेकिन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सार्वजनिक उपक्रम उपकरण की पूंजी लागत निषेध हो सकता है, और यह आवश्यक नहीं है । बुनियादी आयन-विनिमय राल उपचार एक बहुत ही सुविधाजनक तरीका पारंपरिक तरल द्वारा पीछा किया saponification की जगह/ हालांकि, यह carboxylic एसिड समूहों या कार्यात्मक समूहों है कि ऐसे एस्टर के रूप में बुनियादी स्थितियों, के तहत hydrolyzed होगा युक्त उत्पादों के लिए उपयुक्त नहीं है । इन उत्पादों को बुनियादी आयन एक्सचेंज राल पर बनाए रखने की उंमीद होगी । हालांकि, वहां एक को पकड़ने और जारी प्रक्रिया के लिए इस शोषण की क्षमता है (यहां प्रलेखित नहीं) । जहां पारंपरिक saponification उचित होगा, बुनियादी आयन-विनिमय राल उपचार एक सुविधाजनक विकल्प के रूप में कार्य करता है । चरण 9 में वर्णित क्रोमैटोग्राफी पद्धति, आरेख 3में वर्णित यौगिकों के लिए सामांयीकरण करने के लिए पाया गया है । हालांकि, वृद्धि हुई ध्रुवीय यौगिकों एक विस्तारित १००% एथिल एसीटेट रेफरेंस अवधि की आवश्यकता हो सकती है । ९.२ कदम के संदर्भ के साथ, बहाव ठीक शुद्धि पूरी तरह से विशिष्ट यौगिक है, और यह भी पैमाने पर निर्भर है । अनुकूलित ढाल के साथ छोटे पैमाने पर फ्लैश क्रोमैटोग्राफी के दोहराया दौर, आमतौर पर एक एनएमआर विश्लेषण के लिए उपयुक्त पवित्रता प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है । बड़े पैमाने पर, क्रिस्टलीकरण अक्सर एक सुविधाजनक विकल्प है । कठिन मामलों में, preparative या अर्द्ध preparative उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) अलग यौगिक की वांछित मात्रा के आधार पर नियोजित किया जा सकता है । प्रतिनिधि यौगिकों की एक सीमा के लिए बहाव शोधन प्रक्रियाओं के उदाहरण8कहीं और पाया जा सकता है ।
वर्तमान प्रोटोकॉल, के रूप में यहां प्रस्तुत, हमारी प्रयोगशाला में नियमित रूप से प्रयोग किया जाता है, और सिद्ध उपयोगिता है । हालांकि, अभिव्यक्ति प्लेटफ़ॉर्म के आगे अनुकूलन के लिए अभी भी महत्वपूर्ण गुंजाइश है । काम हमारी प्रयोगशाला में चल रहा है कि कैसे आगे मार्ग इंजीनियरिंग और प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के अंतर नियंत्रण triterpene उत्पादन में सुधार और आगे की जांच कर सकता है, जबकि की मेजबानी कोशिकाओं को विषाक्तता मध्यस्थता । वहां भी intracellular परिवहन प्रणालियों20,21के हेरफेर की जांच करने की क्षमता है, और विभिंन सेलुलर डिब्बों को एंजाइमों की दिशा22,23, रास्ते जो सुधार सकता है कई ऑक्सीकरण घटनाओं की दक्षता । महत्वपूर्ण organelles की अंतर्निहित आकृति विज्ञान को संशोधित करने के संभावित लाभों का भी पता लगाया जा सकता है । उदाहरण के लिए, Arabidopsis थालियाना HMGR की झिल्ली डोमेन के एक्सप्रेस24पौधों में endoplasmic जालिका के अतिवृद्धि प्रेरित करने के लिए मनाया गया है; CYP450 गतिविधि के लिए एक महत्वपूर्ण साइट । इस प्रोटोकॉल आदर्श मिलीग्राम के उत्पादन के लिए ग्राम triterpene उत्पादों के पैमाने मात्रा के लिए अनुकूल है, और एक अनुसंधान स्थापित करने के लिए बहाव के अध्ययन के लिए यौगिकों का उपयोग करने में नियोजित किया जा सकता है (जैसे, संरचना की व्यवस्थित अंवेषण-गतिविधि रिश्ते, और नैदानिक ब्याज की सीसा यौगिकों के pharmacodynamic और pharmacokinetic गुण में प्रारंभिक जांच) । हालांकि, मंच रैखिक और मज़बूती से इस्तेमाल किया पौधों की संख्या में वृद्धि से बस स्केलेबल है, और agroinfiltration के माध्यम से क्षणिक अभिव्यक्ति की व्यावहारिकता दवा प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक औद्योगिक पैमाने पर प्रदर्शन किया गया है 14, इस प्रकार इस मंच के लिए क्षमता है उच्च मूल्य triterpenes के वाणिज्यिक उत्पादन के लिए बढ़ाया जाएगा । वैकल्पिक रूप से, यह भी स्थिर transformants के उत्पादन को अंतिम रूप देने की इच्छा multigene कृत्रिम मार्ग ले जाने की कल्पना संभव है, बड़े पैमाने पर खेती और ट्रांसजेनिक एन benthamiana उपभेदों के ‘ जारी खेती ‘ की अनुमति वाणिज्यिक मूल्य के विभिंन यौगिकों का उत्पादन ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम एक नॉर्विच अनुसंधान पार्क के छात्र द्वारा समर्थित किया गया था (जूनियर), संयुक्त इंजीनियरिंग और भौतिक विज्ञान अनुसंधान परिषद/जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद (BBSRC)-वित्त पोषित OpenPlant सिंथेटिक जीव विज्ञान अनुसंधान केंद्र अनुदान (BB /L014130/1) (M.J.S., A.O.); एक जॉन Innes सेंटर नॉलेज एक्सचेंज और व्यावसायीकरण अनुदान (BB/KEC1740/1) (बीएसफ); और BBSRC संस्थान सामरिक कार्यक्रम अनुदान ‘ प्रकृति से अणु ‘ (BB/P012523/1) और जॉन Innes फाउंडेशन (A.O.) । हम pEAQ वैक्टर और फोटोग्राफी के लिए एंड्रयू डेविस प्रदान करने के लिए जॉर्ज Lomonossoff शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
GC-MS instrument | any | n/a | |
Thermocycler suitable for performing PCR reactions | any | n/a | |
Gel electrophoresis apparatus | any | n/a | |
Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L) | any | n/a | |
Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/> 15000 rpm) | any | n/a | |
Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
Standing incubator | any | n/a | |
Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L) | any | n/a | |
Centrifuge bottles (1 L) | any | n/a | |
Vacuum infiltration apparatus | bespoke | n/a | |
9 x 9 cm plant pots | any | n/a | |
Freeze drying apparatus (=/> 8 litre condenser capacity) | any | n/a | |
Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument) | Buchi | SpeedExtractor E-914 | |
Rotary evaporator apparatus | any | n/a | |
Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L) | any | n/a | |
Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L) | any | n/a | |
Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L) | any | n/a | |
Spatulas (assorted sizes) | any | n/a | |
Analytical balance (5 figures) | any | n/a | |
Balance (2 figures) | any | n/a | |
Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L) | any | n/a | |
A -80 freezer | any | n/a | |
Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument | Biotage | ISO-1EW | |
Safety glasses | any | n/a | |
Lab coat | any | n/a | |
Autoclave | any | n/a | |
Consumables | |||
Micropipette tips (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL) | any | n/a | |
Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL) | any | n/a | |
Disposable Transfer pipettes (size 2 mL) | any | n/a | |
Petri dishes (Size: 100 mL) | any | n/a | |
Biotage® SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges | Biotage | FSK0-1107-0100 | |
HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps | any | n/a | |
Disposable purple nitrile gloves | any | n/a | |
Top filter for E-914, cellulose | Buchi | 51249 | |
Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber | Buchi | 11055932 | |
Reagents | |||
Quartz sand, 0.3 – 0.9 mm | Buchi | 37689 | |
Celite 545 (diatomaceous earth) | Simga-Alrich | 22140-1KG-F | |
Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm) | Merck | 1.09385.5000 | |
2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid | Melford | B2002 | |
MgCl2 | Simga-Alrich | 208337-100G | |
KOH | Simga-Alrich | 60377-1KG | |
3’5’-dimethoxy-4’-acetophenone (acetosyringone) | Simga-Alrich | D134406-1G | |
Rifampicin | Alfa Aesar | J60836 | |
Kanamycin sulfate | Gibco | 11815-032 | |
Streptomycin | Simga-Alrich | S6501-100G | |
Gentamycin | MP biomedicals | 190057 | |
Agarose LE gel | Melford | MB1203 | |
LB broth Millar | Simga-Alrich | L3522-250G | |
Agar | Simga-Alrich | A5306-250G | |
NaCl | Simga-Alrich | S5886-500G | |
KCl | Simga-Alrich | P9541-500G | |
MgSO4.7H2O | Sigma-Alrich | M2773-500G | |
Glucose | Sigma-Alrich | G7021-100G | |
Ambersep® 900 hydroxide (basic ion exchange resin) | Sigma-Alrich | 06476-1KG | |
Hexane | Fisher | H/0406/PB17 | |
Ethyl acetate | Fisher | E/0900/PB17 | |
Dichloromethane | Fisher | D/1852/PB17 | |
Methanol | Fisher | M/4056/PB17 | |
Ethidium bromide | Sigma-Alrich | E7637-1G | |
Ethanol | VWR | 20821-330 | |
Milli-Q water | any | n/a | |
Levington F1 Compost | any | n/a | |
Levington F2 Compost | any | n/a | |
QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit). | Qiagen | 27104 | |
NEB 5-alpha Competent E. coli | Supplier New England Biolabs Ltd | C2987I | |
pEAQ-HT-DEST1 vector | Lomonossoff laboratory John Innes Center | n/a | |
pDONR207 | Thermo-Fisher | pDONR207 | |
A. tumefaciens LBA4404 | Thermo-Fisher | 18313015 | |
GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11791020 | |
GATEWAY BP CLONASE ™ II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11789020 | |
GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX | Promega UK Ltd | M7822 | |
PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE | New England Biolabs Ltd | M0530S | |
dNTP SET 100mm | Thermo-Fisher | 10297018 | |
RNEASY PLANT MINI KIT | Qiagen Ltd | 74904 | |
RQ1 RNASE-FREE DNASE | Promega UK Ltd | M6101 | |
Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System | Fisher | 10308632 | |
Trytone | Sigma-Alrich | T7293-250G | |
Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | n/a |