Summary
Midlertidig heterologous uttrykk for biosyntetiske enzymer i Nicotiana benthamiana blader kan avlede endogene forsyninger av 2,3-oxidosqualene mot produksjon av nye høy verdi triterpene produkter. Her er beskrevet en detaljert protokoll for rask (5 dager) skytevåpen skala produksjon av triterpenes og analogs utnytte denne kraftig plante-baserte plattformen.
Abstract
Triterpenes er en av de største og mest strukturelt ulike familier anlegget naturlige produkter. Mange triterpene derivater har vist å ha medicinally relevante biologiske aktivitet. Men har så langt dette potensialet ikke oversatt til en mengde triterpene-avledet narkotika i klinikken. Dette er uten tvil (minst delvis) en konsekvens av begrenset praktisk syntetiske tilgang til denne klassen av sammensatte, et problem som kan hindre utforskningen av struktur aktivitet forholdet og utvikling av føre kandidater av tradisjonelle medisinske kjemi arbeidsflyter. Til tross for sine enorme mangfold, triterpenes er alle avledet fra en enkelt lineær forløper, 2,3-oxidosqualene. Midlertidig heterologous uttrykk for biosyntetiske enzymer i N. benthamiana kan avlede endogene forsyninger av 2,3-oxidosqualene mot produksjon av nye høy verdi triterpene produkter som ikke er naturlig produsert av denne verten. Agro-infiltrasjon er en effektiv og enkel måte å oppnå forbigående uttrykk i N. benthamiana. Prosessen omfatter infiltrasjon av anlegget blader med en suspensjon av Agrobacterium tumefaciens bærer uttrykket construct(s) rundt. Co infiltrasjon av en ekstra A. tumefaciens belastning bærer en uttrykk konstruere koding et enzym som øker forløper forsyning betydelig øker gir. Etter en periode på fem dager, kan infiltrere blad materialet høstes og behandlet for å hente og isolere det resulterende triterpene produktet. Dette er en prosess som er lineært og pålitelig skalerbare, ved å øke antall planter som brukes i eksperimentet. Her er beskrevet en protokoll for rask preparative skala produksjon av triterpenes utnytte denne plante-baserte plattformen. Protokollen bruker en enkelt repliserbar vakuum infiltrasjon apparater, som tillater samtidig infiltrasjon av opptil fire planter, aktivere batch-wise infiltrasjon av hundrevis av planter i en kort periode.
Introduction
Triterpenes er en av de største og mest strukturelt ulike familier anlegget naturlige produkter. Til tross for sine enorme mangfold, er alle triterpene naturlige produkter antatt å være avledet fra den samme lineære forløper 2,3-oxidosqualene, et produkt av den mevalonate stien i planter. Cyclization av 2,3-oxidosqualene er initiert og kontrollert av en familie av enzymer kalles oxidosqualene cyclases (OSCs). Dette cyclization trinnet representerer det første nivået av diversifisering, med hundrevis av forskjellige triterpene stillaser har rapportert fra naturen1. Disse stillasene er mer diversifisert ved å skreddersy enzymer inkludert, men ikke begrenset til, cytochrome p450s (CYP450s)1,2. Slike biosyntetiske veier kan føre til enorme kompleksitet, noen ganger resulterer i siste produkter som knapt gjenkjennelig fra den overordnede triterpene. For eksempel antas av kompliserte strukturer av det potente insecticidal og antifeedant limonoid azadirachtin å komme fra en tetracyclic triterpene av tirucallane type3.
Mange triterpene-avledet naturlige produkter, selv de med relativt uendret overordnede stillaser, har vist seg å ha medicinally relevante biological aktivitet4,5,6,7. Men har så langt dette potensialet ikke oversatt til en mengde triterpene-avledet narkotika i klinikken. Dette er uten tvil (minst delvis) en konsekvens av begrenset praktisk syntetiske tilgang til denne klassen av sammensatte, et problem som kan hindre utforskningen av struktur aktivitet forholdet og utvikling av føre kandidater av tradisjonelle medisinske kjemi arbeidsflyter.
Forbigående uttrykk for triterpene biosyntetiske enzymer fra andre plantearter i N. benthamiana blader kan avlede endogene forsyninger av 2,3-oxidosqualene mot produksjon av nye høy verdi triterpene produkter (figur 1). Denne prosessen kan brukes til å karakterisere funksjonelt kandidat enzymer og rekonstruere biosyntetiske veier av viktige naturlig forekommende metabolitter. Like, kan det også utnyttes i kombinasjon biosyntetiske tilnærminger til å produsere romanen triterpene produkter, en strategi som kan resultere i biblioteker av strukturelt relaterte analogs, slik at systematisk undersøkelse av struktur aktivitet forholdet biologisk aktive bly forbindelser8,9.
Agroinfiltration er en effektiv og enkel måte å oppnå forbigående uttrykk i N. benthamiana blader. Prosessen omfatter infiltrasjon av blader med en suspensjon av A. tumefaciens bærer den binære uttrykket construct(s) rundt. Dette oppnås via anvendelse av press som tvinger væsken gjennom stomata, fortrenge luft i intercellulære plass, og erstatte den med A. tumefaciens suspensjon. Bakterier overføre de respektive T-DNAs til indre av plante celler, som resulterer i lokaliserte og forbigående protein uttrykk i infiltrere blad vevet.
Mens noen binær vektor egnet for generering av transgene planter kan være ansatt for forbigående uttrykk, vi utnytter Cowpea mosaikk Virus CPMV-avledet Hypertranslational (HT) protein uttrykk systemet10, 11. i dette systemet genet av interesse er flankert av uoversatt regioner (UTR) fra CPMV RNA-2. De 5' UTR inneholder endringer som resulterer i svært høye nivåer av protein oversettelsen med ingen avhengighet av viral replikasjon12. Denne teknikken har blitt utviklet til Easy-og-rask (pEAQ) binære vektor serien som inkluderer områdespesifikke rekombinasjon kloning protokoll-kompatible konstruksjoner (pEAQ -HT- DEST)10,11. De fleste pEAQ vektorer også inneholde en tomat buskete stunt virus-avledet P19 stanse suppressor genet13 i den T-DNA delen av uttrykket kassetten, som omgår måtte coinfiltrate en egen P19-bærer belastning og gir svært høyt protein uttrykk i verten plante celle10,11.
Bruk av N. benthamiana som en uttrykk vert har spesielle fordeler når du arbeider med anlegg biosyntetiske trasé. Cellen arkitekturen støtter egentlig riktig mRNA og protein behandling og riktig compartmentalization, i tillegg til besitter den nødvendige co enzymer, reductases (for CYP450s) og metabolske prekursorer. Karbon er fotosyntese; Dermed kan planter bare dyrkes i god kompost, krever bare vann, CO2 (fra luften) og sollys som innganger. Plattformen er også svært praktisk for co uttrykk for forskjellige kombinasjoner av proteiner, som dette kan oppnås facilely av co infiltrasjon av ulike stammer av A. tumefaciens, benektende behovet for å bygge store multigene uttrykk kassetter. Videre kan prosessen lineært og pålitelig skaleres ved å øke antall planter som brukes i eksperimentet.
Tidligere arbeid i vårt laboratorium har vist nytten av denne plattformen for skytevåpen skala eksperimenter. Dette inkluderte utarbeidelse av romanen triterpenes for bruk i bioactivity analyser og skalaen opp for å oppnå gram mengder isolerte produkt. Videre opphopning av heterogene triterpene produkter kan økes flere brett av co uttrykk for en N-terminal-avkuttet, tilbakemelding-ufølsom form av 3-hydroxy, 3-methyglutary-koenzym en reduktase (tHMGR), en hastighetsbegrensning oppstrøms enzymet i mevalonate sti8.
Nøkkelen til slike preparative skala eksperimenter er muligheten til å enkelt opp skala infiltrasjon prosessen. I et typisk forsøk, kan titalls til hundrevis av planter være nødvendig å oppnå målet antall isolerte produkt. Infiltrere personlige blader for hånd (benytter en unødvendig sprøyte) er operativt krevende og ofte uoverkommelig tidkrevende, gjengivelse denne metoden upraktisk for rutinemessig skala-up. Vakuum infiltrasjon tilbyr fordeler over hånd infiltrasjon, den er ikke avhengig av ferdighetsnivå operatør og lar infiltrasjon av et større område av blad overflaten. Denne fremgangsmåten brukes kommersielt for storskala produksjon av farmasøytiske proteiner14. Denne protokollen bruker en enkelt repliserbar vakuum infiltrasjon apparat, som kan konstrueres fra kommersielt tilgjengelige deler. Dette tillater samtidig infiltrasjon av opptil 4 planter, affording rask og praktisk batch-wise infiltrasjon av hundrevis av planter i en kort periode (figur 2a -2b). Vakuum infiltrasjon apparatet består av en vakuum ovn som danner infiltrasjon kammeret (figur 2f). Ovnen er koblet til en pumpe via et vakuum reservoar. Dette reduserer tiden det tar å oppnå det ønskede tomrom i infiltrasjon kammeret. Plantene er sikret i en skreddersydd holder og invertert til 10 L rustfritt stål vann badekar fylt med A. tumefaciens suspensjon (figur 2a -2 c). Komplett nedsenking av antennen deler av planter er viktig for effektiv infiltrasjon. Vannbad er deretter plassert innenfor infiltrasjon kammeret (figur 2d -2e), og brukes til å trekke luft ut av blad interstitiell mellomrom. Når trykket er redusert med 880 mbar (en prosess som tar ca 1 min) infiltrasjon kammeret er brakt raskt tilbake til lufttrykk 20-30 s ved å åpne ovnen inntak ventil, hvorpå infiltrasjon er fullført.
Fem dager etter infiltrasjon er plantemateriale klar for høsting og påfølgende utvinning og isolering av det eller produktene. Fra dette punktet er prosessen naturlig produkt utvinning og rensing av blad materiale, en arbeidsflyt som er kjent for alle naturprodukt kjemiker. Mange ulike metoder for første utvinning og påfølgende rensing finnes15. Passende valg av metoder og den eksakte forholdene brukes er svært avhengig av de bestemte kjemiske egenskapene av sammensatt interesse, i tillegg til tilgjengeligheten av og utstyr. Det er ikke mulig å inkludere i denne protokollen fullt generalizable, trinnvise metode for nedstrøms behandling av høstet plantemateriale blad isolerte produkt som kan være fulgt blindt for ethvert triterpene produkt av interesse, eller ville det være hensiktsmessig for å forsøke å gjøre dette. Men vil denne protokollen gi en oversikt over grunnleggende arbeidsflyten brukes i vårt laboratorium og noen metoder for de tidlige fasene av prosessen, som i vår erfaring bevise generalizable mest oksygenrikt aglycone triterpene produkter. Dette inkluderer to relativt uvanlig teknikker, nemlig trykk løsemiddel utvinning (PSE) og en praktisk heterogene fase metode for klorofyll fjerning ved hjelp av et sterkt grunnleggende ionebytte harpiks.
PSE er en svært effektiv teknikk for utvinning av små organiske molekyler fra solid matriser. Hovedfordelen er muligheten til å bruke lindres temperaturer som overstiger koking peker utvinning løsemiddel utdrag utføres under press (ca. 100-200 bar). Dette kan redusere tid og mengde løsemiddel kreves for å oppnå en uttømmende utvinning, sammenlignet med andre varme løsemiddel teknikker som enkle refluxing eller Soxhlet utdrag16. Kommersielle benk toppen PSE instrumenter er tilgjengelig, som bruker utskiftbare utvinning celler og automatisert løsemiddel håndtering, oppvarming og overvåking. Dette gjør denne teknikken svært praktisk. Det er også kanskje mindre farlig, spesielt for operatører med begrenset praktisk kjemi erfaring.
Forsåpning av råolje blad ekstrakter under reflux etterfulgt av væske og væske partisjonering er en vanlig teknikk for bulk fjerning av chlorophylls før påfølgende rensing eller analyse. Men kan dette ofte være operativt krever større skala. Videre kan gjenkjenning av grensesnitt eller produktet tap på grunn av dannelsen av emulsjoner være problematisk. Bruk av sterkt grunnleggende ionebytte harpiks utføre heterogene fase hydrolyse kan tjene som et praktisk alternativ. Pigmentert delen av hydrolyzed klorofyll er fortsatt adhered til harpiks og bare kan fjernes ved filtrering. Denne protokollen bruker en preparative skala tilpasning av en tidligere rapportert analytiske prosedyren17 som sysselsetter en kommersielt tilgjengelig grunnleggende ionebytte harpiks.
Nedenfor beskriver vi en detaljert og rask protokoll for skytevåpen skala produksjon av triterpenes utnytte denne plante-baserte plattformen. Denne protokollen brukes rutinemessig i vårt laboratorium forberede titalls til hundrevis av milligram isolert triterpene produkt for programmer slik strukturelle karakteristikk av kjernefysiske magnetisk resonans (NRM) spektroskopi, og/eller videre studier i funksjonelle analyser.
Protocol
Merk: Før du følger denne protokollen, bli kjent med HMS-data for alle stoffer som brukes, og ta nødvendige forholdsregler. Dette inkluderer, men er ikke begrenset til: iført vernebriller når du arbeider med glass under vakuum, og håndtering tørr silica gel i en røyk skap. Det er også viktig at lokal lovgivning om arbeider med transgene materiale er kontrollert og observert, inkludert etter passende containment prosedyrer.
1. Generer A. tumefaciens stammer for infiltrasjon
Merk: Vi gir her en forenklet beskrivelse av trinn kreves for å generere egnet A. tumefaciens stammer forbigående uttrykk. Videre detaljer om denne fremgangsmåten beskrives av Sainsbury et al. 8.
- Forsterke av PCR eller syntetisere protein koding genet av interesse flankert av 5' og 3 attB sekvenser egnet for generasjon en posten klone for bruk med en områdespesifikk rekombinasjon kloning protokollen18,19-regionen.
- Bruke frem primer: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTANNNNNNNNNNNNNNNNNN, omvendt primer: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTANNNNNNNNNNNNNNNNNN (NNNN... = sekvens bestemt sekvens).
- Bruke (representant) PCR betingelser: reaksjonen blanding (25 µL, totalt), buffer (5 x 5 µL, se Tabellen for materiale), dNTPs (10 mM, 0,5 µL), frem primer (10 µM, 1,25 µL), omvendt primer (10 µM, 1,25 µL) mal DNA (variabel konsentrasjon, 50 – 250 ng, 0,5 µL ), DNA polymerase (2000 U/mL, 0,25 µL, se Tabellen for materiale), Nuclease-fritt vann (til 25 µL). Kjøre thermocycler som følger: første rødsprit (98 ° C, 30 s); Start syklusen (98 ° C, 30 s, 45-72 ° C, 20 s, 72 ° C, 30 s/kb) avslutte gjennomgangssyklusen; 35 sykluser; endelig utvidelse (72 ° C, 10 min).
- Følg en standard områdespesifikke rekombinasjon kloning protokollen18,19 å generere en oppføring klone med enhver ikke-kanamycin-baserte oppføring vektor (vi bruker pDONR207 som er kommersielt tilgjengelig).
Merk: Integriteten til oppføringen klone skal bekreftes av sekvensering, før du bruker til å generere pEAQ -HT-DEST1 uttrykk konstruksjon. PEAQ -HT-DEST1 er tilgjengelig på forespørsel fra Lomonossoff laboratoriet John Innes midt i Norwich, Storbritannia. - Isolere pEAQ -HT-DEST1 vektor fra uttrykket klone generert i trinn 1.1.3, og lagre på 20 ° C før bruk i trinn 1.3.
Merk: Alle kommersielt tilgjengelig praktisk spinn kolonne-baserte plasmider rensing kit utviklet for utpakking plasmider fra kloning stammer av E. coli er egnet. Følg de spesifikke instruksjonene av valgte plasmider rensing kit (se Tabell for materiale).
- Forberede kjemisk kompetent A. tumefaciens transformasjon.
- Vaksinere en selektiv LB (Luria-Bertani medium: 10 g/L bacto-tryptone, 10 g/L NaCl og 5 finans gjærekstrakt, agar 10 g/L pH 7.0) agar platen (50 μg/mL og, 100 μg/mL streptomycin) av striper A. tumefaciens LBA4404 fra en glyserol lager kultur. Ruge over natten på 28 ° C i en stående inkubator.
- Vaksinere 50 mL av selektiv flytende LB media (50 μg/mL og, 100 μg/mL streptomycin) med A. tumefaciens LBA4404 celler fra trinn 1.2.1. Ruge over natten på 28 ° C i en risting inkubator på 200 rpm.
- Cool kulturen fra trinn 1.2.2 på is 10 min og deretter pellets A. tumefaciens cellene med sentrifugering 4 ° C og 4500 x g i 5 min (kast nedbryting).
- Resuspend pellets fra trinn 1.2.3 i 1 mL av iskalde 20 mM CaCl2 vannoppløsning og gjenta sentrifugering trinnet fra trinn 1.2.3 (kast nedbryting).
- Resuspend pellets fra trinn 1.2.4 i 1 mL av iskalde 20 mM CaCl2 vannoppløsning og aliquot den resulterende suspensjonen i på 50 µL grupper. Flash fryse dele i flytende N2 og butikk på-80 ° C før bruk.
- Transformere den forberedt A. tumefaciens LBA4404 med isolerte pEAQ -HT-DEST1 vektor generert i trinn 1.2.
- Tine 50 µL av A. tumefaciens suspensjon generert i trinn 1.2 på is og ruge med 100 \u2012 200 ng av isolerte pEAQ -HT-DEST1 vektor, generert i trinn 1.1 ved 0 ° C i 5 minutter.
- Kalde sjokk inkubert suspensjon fra trinn 1.3.1 i flytende N2 for 30 s, la varm til romtemperatur.
- Tilsett 200 μL av SOC medium (SOC: 20 finans bacto-tryptone, 5 finans gjærekstrakt, 0.58 finans NaCl 0,19 finans KCl 2.03 finans MgCl2, 2,46 finans magnesium sulfat 7-hydrat, 3,6 finans glukose) til kald sjokkert suspensjon fra trinn 1.3.2 og Inkuber 4 h på 28 ° C i en risting inkubator på 200 rpm.
- Vaksinere en selektiv LB agar plate (50 μg/mL og, 50 μg/mL kanamycin, 100 μg/mL streptomycin) med SOC kultur fra trinn 1.3.3. Spre grundig og ruge for 3 dager på 28 ° C i en stående inkubator.
- Vaksinere 5 mL av selektiv LB media (50 μg/mL og, 50 μg/mL kanamycin, 100 μg/mL streptomycin) med en enkelt koloni fra trinn 1.3.4. Ruge over natten på 28 ° C i en risting inkubator på 200 rpm.
- Tilsett 200 μL glyserol 1 mL av flytende kulturen fra trinn 1.3.5, bland godt og lagre på-80 ° C.
Merk: Denne kulturen kan bli gjenopplivet for senere eksperimenter av striper på LB agar plater med aktuelle antibiotika (beskrevet nedenfor).
2. Forbered infiltrasjon suspensjon
- Vaksinere en selektiv LB agar plate med striper av ønsket A. tumefaciens stammer fra glyserol lager kulturer generert i trinn 1. Ruge over natten på 28 ° C i en stående inkubator.
Merk: En stamme med tHMGR i en pEAQ -HT-DEST1 vektor kan også bli inkludert.- Individuelt vaksinere 50 mL av selektiv LB medier med en prøve av hver A. tumefaciens stamme vokst i trinn 2.1 og ruge over natten på 28 ° C i en risting inkubator på 200 rpm.
- Individuelt overføre 50 mL kulturer fra trinn 2.1.1-1000 mL selektiv LB medier (og 50 μg/mL, kanamycin, 50 μg/mL streptomycin 100 μg/mL) og ruge over natten på 28 ° C i en risting inkubator på 200 rpm.
- Individuelt pellets A. tumefaciens med sentrifugering (4000 x g), fra flytende kulturer generert i trinn 2.1.2 (kast nedbryting).
- Individuelt resuspend pellets fra trinn 2.1.3 i 50 mL av nylagde MMA buffer (MMA Buffer: 10 mM 2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid, pH 5.6 (KOH), 10 mM MgCl2, 150 μM 3'5 '-dimethoxy-4'-acetophenone) og Inkuber ved romtemperatur i mørket 1t.
- Kombinere riktige volumet av hver A. tumefaciens MMA suspensjon (generert i trinn 2.1.4) å produsere en siste OD600 av minst 0,2 for hver stamme i et 10 L total siste volum.
- Legge til ekstra MMA buffer av kombinerte suspensjon generert i trinn 2.1.5 til et endelig antall 1 L (bruk umiddelbart i trinn 3).
Merk: Det anbefales å forberede en ekstra 2 L infiltrasjon hjuloppheng vedlikehold væskenivået under infiltrasjon prosessen. - Forberede 1 L 10 x styrke MMA buffer.
3. Utfør vakuum infiltrasjon
Merk: Se figur 2 for en beskrivelse av vakuum infiltrasjon apparater. Bruk 5-uke-gamle N. benthamiana planter i 9 cm x 9 cm Potter fortsetter trinnene. Frøplanter bør sådd i F1 kompost (f.eks fra Levington) og vokst i 2 uker før de overføres til personlige Potter som inneholder F2 kompost. Planter bør dyrkes i drivhus ved 25 ° C, med 16 timer per dag lys (bruk supplerende belysning når kreves), vann daglig, maksimal tettheten av 100 planter/m2.
- Overføre 1 L infiltrasjon hjuloppheng generert i trinn 2 og 1 L 10 x styrke MMA buffer infiltrasjon badekaret, etterfulgt av en ekstra 8 L vann.
- Fjerne avtakbar vingene av skreddersydde anlegg holderen, sett 4 anlegg (5-uke-gamle planter se ovenfor note), og koble vingene. Invertere holderen og plasser på infiltrasjon badekaret for å senke blader i infiltrasjon suspensjon.
Merk: Sikre suspensjon nivået når overflaten av innehaveren av anlegget. Heve nivået med tillegg av ekstra infiltrasjon suspensjon hvis nødvendig. - Overføre infiltrasjon badekaret med submerged planter til infiltrasjon chamber og lukke døren. Kontroller i luftinntaket ventilen er stengt på infiltrator. Aktivere vakuumpumpe og åpne inline ventilen til vakuum reservoaret etterfulgt av vakuum luftinntaket ventilen på infiltrasjon kammeret.
- Når trykket i infiltrasjon kammeret har redusert med 880 mbar, slå vakuum luftinntaket ventilen, og åpne i luftinntaket ventilen. Når infiltrasjon kammeret har returnert til lufttrykk, åpne døren og fjern infiltrasjon badekaret.
- Heve plante abonnenten til plantene er ikke lenger neddykket i infiltrasjon suspensjon, deretter forsiktig shake holderen slik at overskytende suspensjon å kjøre av bladene tilbake i infiltrasjon badekaret.
- Returnere abonnenten til stående, fjerne avtakbar vingene og fjerne planter.
- Gjenta trinn 3.1.1 til 3.1.5 til ønsket antall planter har blitt infiltrert.
- Autoclave brukte infiltrasjon suspensjon før deponering.
- Autoclave infiltrasjon bad før gjenbruk i etterfølgende eksperimenter.
- Sterilisere interiøret infiltrasjon kammeret ved rengjøring med 70% etanol og la luften tørr før gjenbruk i etterfølgende eksperimenter.
- Fjerne avtakbar vingene av skreddersydde anlegg holderen, sett 4 anlegg (5-uke-gamle planter se ovenfor note), og koble vingene. Invertere holderen og plasser på infiltrasjon badekaret for å senke blader i infiltrasjon suspensjon.
4. vokse infiltrere planter
- Ordne infiltrere planter fra trinn 3 på en maksimal tetthet av 100 planter/m2 i drivhus.
- Vokse i 5 dager ved 25 ° C og 16 timer per dag lys (bruk supplerende belysning når nødvendig), og vann daglig.
5. harvest infiltrere bladene
- Etter 5 dager med vekst, høste bladene.
- Autoclave avfall plantemateriale, Potter og jord før deponering.
6. Tørk bladene høstes
Merk: Nøyaktig lyophilization prosedyren beskrevet nedenfor, avhenger av innholdet av tilgjengelige lyophilization apparater tilgjengelig.
- Lyophilize høstes bladene til tørr.
- Plass høstet bladene i et 2 mm tykt polypropylen bag. Frys bladene høstes ved lagring i-80 ° C fryser i 30 min.
- Perforere posen med mange små hull med en nål. Legg den bagged frosne bladene i sentrale kammeret av lyophilizer. Kontroller alle kolbe vedlegg kraner er lukket og deretter slå på lyophilizer. Sikre kondensatoren når minst-50 ° C og trykket reduseres til minst 0,15 mbar, og deretter la over natten.
- Slå av lyophilizer og ventilere vakuum ved å åpne et kolbe vedlegg trykk. Fjern tørkede blader fra sentrale kammeret, og videre til trinn 7.
7. Trykk løsemiddelekstraksjon
Merk: Fortsetter trinnene refererer til bruk av en kommersielt tilgjengelig PSE instrument (se Tabell for materiale). Se produsentens litteratur for mer detaljert informasjon om operasjonen. Instrumentet utfører 4 utdrag parallelt.
- Slipe av tørkede blader til et kurs pulver via en praktisk metode (f.eks for de fleste triterpene forbindelser rundt bruker en domestic food prosessor eller manuelt knuse bladene mens innenfor en bag).
Merk: Sliping med en morter under flytende nitrogen er vanligvis ikke nødvendig.- Bland blad pulver med kvartssand (0,3 \u2012 0,9 mm, 20% etter volum) i en egnet beholder; Dette fungerer som en dispergerings og forbedrer effektiviteten til utpakkingen.
- Forberede 4 utvinning celler (120 mL) for fylling. For dette, invertere utvinning cellene og sett inn glass fiber filteret, etterfulgt av metall frit og holde plugg. Returnere utvinning cellene i vertikal posisjon og legge et 1 cm dype lag av kvartssand (0,3 \u2012 0,9 mm).
- Fylle utvinning cellene.
- Fyll utvinning cellene med forberedt blad pulver generert i 7.1 opptrappe påfyllingsstreken. Hvis nødvendig, forsiktig komprimere pulveret under denne prosessen å lette tillegg av en større mengde avkortet utvinning.
- Legge til et lite lag med kvartssand (0,3 \u2012 0,9 mm) til toppen pakket pulver og topp cellulose filteret.
- Sett inn pakket utvinning cellene i PSE apparatet og kjøre metoden ønsket. Bruk følgende innstillinger og materiale; Løsemiddel: 100% ethyl acetate; temperatur: 100 ° C, Press: 130 bar. Kjøre 3 sykluser som følger: syklus 1: 0 min hold tid, syklus 2 og 3: 5 min hold tid, ender med 2 min løsemiddel flush, og 12 min nitrogen gass flush.
Merk: Det anbefales å først optimalisere metoden utvinning på en liten skala. Følgende metode er imidlertid ofte nok for de fleste oksidert triterpene aglycones. Brennevin fra hver utvinning celle kan kombineres i samme eksterne samling fartøyet ved å angi avfall linjen som utvinning mål, i stedet for standard personlige samling linjene. Vær oppmerksom på mengden løsemiddelet brukes er avhengig av pakking av utvinning cellene og innstilt temperatur og trykk. Metoden ovenfor vanligvis genererer ca 800 mL utvinning brennevin for 4 parallelle utdrag. - Gjenta trinn 7.2 til 7.3.3-feilrettingsprogram til alle blad pulver er behandlet.
- Konsentrere seg den kombinerte utvinning sprit tørrhet, via roterende fordampning under vakuum. Sjekk for den forventede avgangen (dvs., mørk grønn slurry).
Merk: Fremgangsmåten kan variere avhengig av hvilke opp på tilgjengelige roterende fordamperen. Alltid bruke vernebriller når roterende fordampning, og sjekk glass for skade før utsette vakuum forhold.- Slå på chiller gjenvinne, og at varme overføring væske avkjøles til minst 5 ° C. Slå på vannbad, og Still inn temperaturen til 35 ° C.
- Overføre utvinning brennevin til en fordampning kolbe (ikke fyller mer enn halve volumet av kolbe). Konsentrere brennevin batch-wise (i til samme kolbe) hvis det totale volumet overskrider dette. Fest fylt fordampning kolbe til damp-kanalen på roterende fordamperen (sikkert med felles clip).
- Justere kolbe heis posisjon og vinkel, slik som å senke bunnen tredje av fordampning kolbe i vannbad på en ca 45 ° vinkel. Starte kolbe spinning med en hastighet som begynner å spre utvinning brennevin opp veggene i flasken.
- Kontroller ventil kranen er stengt og redusere trykket (med kontrolleren til vakuumpumpe) til et moderat drypp er observert mellom kondensatoren og mottaker kolbe.
Merk: Tillat ikke utvinning brennevin å koke. Hvis dette skjer redusere styrken av vakuum å bringe destillasjon under kontroll. - Overvåke og justere vakuum styrke og spinn hastigheten som passer til alle løsemiddelet er fordampet.
8. grunnleggende ionebytte harpiks behandling for fjerning av Chlorophylls
Merk: Antallene sitert i fremgangsmåten antar en original arbeider omfanget av 100 \u2012 150 planter. Trinn 8 passer ikke for produkter som inneholder karboksylsyre grupper eller funksjonelle grupper som ville være hydrolyzed under grunnleggende forhold som estere.
- Oppløse det rå ekstrakt generert i trinn 7 i en minimal mengde etanol.
- Legge til 50 mL av grunnleggende ionebytte harpiks perler (se Tabell of Materials) til utgangen trinn 7.1.1 og riste ved romtemperatur for 30 min.
Merk: Ikke erstatning riste for bruk av stirring apparater. Magnetisk eller mekaniske overhead røring kan kompromittere integriteten av harpiks perler. Egnet agitasjon kan også enkelt oppnås ved langsomme rotasjon av reaksjon kolbe på en roterende fordamperen med vakuum satt med lufttrykk eller frakoblet. - Legge til en ekstra 50 mL av grunnleggende ionebytte harpiks perler enhver 30 min før reaksjonen har gått til ferdigstillelse; grunnleggende ionebytte harpiks perlene endres fra rosa grønn i fargen, og flytende fase endres fra grønn til oransje eller en skummel brun farge avhengig av skalaen.
- Hvis du er i tvil om at reaksjonen har gått til ferdigstillelse, smake på 0,5 mL av væsken. Filtrere utvalget gjennom en liten kolonne av kiselgur og observere fargen på filtratet; reaksjonen er vanligvis fullført innen 1,5 timer.
- Filtrere reaksjonsblandingen gjennom en kort kolonne av kiselgur.
- Utføre dette via vakuum filtrering, eller via en glass flash kromatografi kolonne bruke hånden belger for å bruke press. Hvis filtrering rate bremser, forstyrre toppen av kiselgur puten med gripende stang. Samle filtratet.
- Skyll samlet harpikser perler med etanol, etterfulgt av 1:1 etanol: Heksan, og til slutt Heksan. Bruk et skyll volum tilstrekkelig til å resuspend perler på kolonnen kiselgur.
- Kombiner filtratet fra trinn 8.4 og skyller fra trinn 8.5, og konsentrere seg å dryness av roterende fordampning under vakuum.
9. første grov fraksjoneres
Merk: Følgende metode er vanligvis passende for typiske oksidert triterpene aglycones, og sysselsetter et automatisert flash kromatografi instrument. Se produsentens litteratur for mer informasjon om operasjonen.
- Adsorberes råolje produktet generert i trinn 8 til flash klasse silica gel (pore størrelse: 60 Å, partikkelstørrelse: 35 \u2012 75 μm) skal flash kromatografi patron via tørr lasting metodikk.
- Oppløse råolje produktet generert i trinn 8 i en minimal mengde egnet organisk løsemiddel. Sikre komplett oppløsning.
Merk: Diklormetan med tillegg av noen dråper av metanol er vanligvis et passende valg løsemiddel. - Skru av toppen av 100 g forhåndsutfylte flash kromatografi patron (se Tabell for materiale) og fjerne sette å avsløre hodet tørr lasteplassen. Bruk hodet plassen for å måle riktig volumet med silica gel for tørr lasting.
- Overføre målt volumet med silica gel for tørr lasting løsningen av råolje produkt, og deretter fjerner løsemiddelet av roterende fordampning under vakuum.
Merk: Silica gel skal returnere til en fri flyt pulver. Mot slutten av fordampning prosess forsiktig skrape kan være nødvendig å frigjøre silica gel fra siden av fordampning kolbe. - Equilibrate 100 g flash kromatografi kassetten på 100 mL/min med minst 5 kolonnen mengder 100% Heksan, men ideelt til kassetten innholdet er fullt og jevnt fuktet.
- Overføre forberedt tørr lasting silica gel generert i trinn 9.1.3-patchen til tørr hodet lasteplassen equilibrated 100 g flash kromatografi standardkassetten, ved å helle. Suspensjon i Heksan og en bredt mouthed pipette kan brukes å hjelpe overføring av eventuelle gjenværende tørr lasting silica gel.
- Våt overførte tørr lasting silica gel seng med 100% Heksan å fjerne luft fra tørr lasting tanken.
- Kjør følgende kromatografi metode: løsemiddel [A]: Heksan, løsemiddel [B]: ethyl acetate, Flow rate: 100 mL/min, gradering: 0% [B] 100% [B] over 3000 mL, samling: samle alle, brøkdel størrelse: 250 mL.
- Analysere fraksjoner av tynt lag kromatografi (TLC)8 eller gass kromatografi-massespektrometri (GC-MS)8og konsentrasjon til tørrhet fraction(s) som inneholder sammensatte interesse via roterende fordampning under vakuum.
- Oppløse råolje produktet generert i trinn 8 i en minimal mengde egnet organisk løsemiddel. Sikre komplett oppløsning.
- Utføre nedstrøms fint rensing til ønsket nivå med renhet er nådd.
Merk: Nedstrøms fint rensing er helt sammensatte spesifikke og det er ikke mulig å gi standardisert trinn (se drøftingen).
Representative Results
Typisk isolert gir er avhengig av enzymet/enzym kombinasjonen under etterforskning, kjemiske stabiliteten i det mål sammensatt og hvordan utfordrende en renselsesprosess var. Vi har tidligere rapportert isolert avkastning av β-amyrin derivater fra våre kombinasjon biosyntesen eksperimenter mellom 0,12 3.87 mg per gram tørr N. benthamiana blad pulver. Disse forbindelsene varierte mye i nivået av oksidasjon, og inkludert unaturlig kombinasjoner av enzymer (Figur 3)8. Denne protokollen brukes rutinemessig i vårt laboratorium for å produsere ti eller hundre milligram renset produkt for strukturelle karakterisering av NMR spektroskopi og nedstrøms funksjonelle analyser. Vi har også vist preparative nytten av denne plattformen ved å produsere 0,8 g triterpene stillaset β-amyrin på renhet av mer enn 98%. Dette eksperimentet brukes 459 planter, og representerer en isolert avkastning på 3,3 mg per gram tørr N. benthamiana blad pulver8.
Figur 1: skjematisk Sammendrag. Skjematisk fremstilling av prosessen utnytter forbigående uttrykk for biosyntetiske enzymer i N. benthamiana blad å avlede endogene forsyninger av 2,3-oxidosqualene mot skytevåpen produksjon av nye høy verdi triterpene produkter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: vakuum infiltrator bygging og prosessen en) Skreddersydd anlegget holder en vinge frittliggende. b) Bespoke anlegget holder vinger festet. c) inversjon og neddykking planter. d) innsetting av infiltrasjon badekaret. e) infiltrasjon badekar på plass innenfor infiltrasjon kammeret. f) komplett vakuum infiltrator: (1) vakuum pumpe (2) tilkobling fra vakuumpumpe til vakuum reservoaret (3) vakuum reservoaret Avstengningsventil (4) tilkobling mellom vakuum reservoaret og i infiltrasjon kammer (5) trykkmåleren (6) luftinntaket ventilen (7) Infiltrasjon kammer (8) vakuum reservoaret. g) representant går fra én plante infiltrert med et uttrykk konstruere for grønne fluorescerende protein (GFP) etter fem dager etter infiltrasjon vekst. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: tidligere rapportert representant resultater for skytevåpen produksjon av β-amyrin derivater bruker denne protokollen8. Denne tabellen er bestilt av isolerte avkastning. Kolonnene er betinget formatert med farge indikasjon på relative verdi. Rød = høy, grønn = lav (skjønt mellomliggende gul). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Høy-lakkeringsverksteder vakuum infiltrasjon kan denne protokollen skal brukes rutinemessig i vårt laboratorium for skytevåpen produksjon av triterpene forbindelser av interesse for ulike nedstrøms programmer. Vakuum infiltrasjon apparatet beskrevet her er lett replikert. Tillegg av vakuum reservoaret er tilrådelig å redusere tiden det tar å trekke de nødvendige vakuumet, men det er mulig å bare gjenbruke uforandret vakuum ovn som infiltrasjon kammeret. Beskytte vakuumpumpe via tillegg av en egnet kondensator er teoretisk fornuftig, men i vårt laboratorium har vi fant dette å være unødvendig.
Infiltrasjon dekning er kompromittert hvis bladene ikke er fullstendig nedsenket i infiltrasjon suspensjon. Dette problemet er minimert ved å sikre at nivået av suspensjon når overflaten av innehaveren av anlegget, og at innehaveren av anlegget er trangt for infiltrasjon bad. Notat fra figur 2 at overflaten av anlegget holderen er innfelt i for infiltrasjon bading i stedet. Dette oppnås ved paneler på midten kantene av holderen som utgjør Forankringspunktet med toppen av infiltrasjon badekaret. Infiltrasjon suspensjon krever periodiske sammentellingene å opprettholde suspensjon. Dette er best oppnås ved tillegg av overflødig infiltrasjon suspensjon å hindre gradvis reduksjon av OD600 i løpet av en stor batch-wise infiltrasjon. Men i våre hender synes substitusjon for vann ikke å ha en merkbar effekt på forventet avkastning på en preparative skala, selv om dette ikke er quantitively undersøkt. Hvor mange planter kan infiltrated fra en gruppe med infiltrasjon suspensjon er fortsatt et åpent spørsmål. Vi infiltrere rutinemessig mellom 100 og 200 planter med en enkelt satsvis infiltrasjon hjuloppheng. Dessuten, er det normalt at noen jord lekke inn i infiltrasjon suspensjon i løpet av infiltrasjon prosessen. Dette har ikke blitt funnet for å ha en merkbar effekt på infiltrasjon effekt.
Under innhøstingen det er tilrådelig (men ikke kritisk) å høste bare bladene som ble infiltrert (noen blader vil ha vokst etter infiltrasjon). Selektiv harvest hindrer fortynning med uproduktive vev, som ellers ville øke andelen endogene urenheter i forhold til sammensatt interesse. Dette har en nominell effekt på brukervennlighet nedstrøms rensing og øker omfanget av disse prosessene. Når du bruker tHMGR for å øke forløper forsyning, er en necrosed fenotypen ofte observert for å utvikle over etter infiltrasjon vekstperioden. Dette er normalt og faktisk aids selektiv harvest og nedstrøms tørkeprosessen. Tørket blad pulver kan vanligvis lagres i lukket beholder på et kjølig, tørt og mørkt sted, men perfekt i en desiccator under vakuum. Dette avhenger stabiliteten i sammensatt av interesserte. Forsiktig hvis velger lagre i-80 ° C fryser. At tørrfisk bladene er i en vanntett beholder og fjerning fra lagring, tillater denne beholderen til varm til romtemperatur før åpningen. Gjør det vil resultere i rewetting av bladene, hindre behandling av ned-stream.
Post-Harvest trinnene i denne protokollen tilbys veiledende, og for å hjelpe de forskerne som kan ha begrenset praktisk kjemi erfaring. De kan erstattes for mange andre naturlige produktet utvinning/rensing teknikker. Som beskrevet i innledningen, PSE har mange fordeler, men hovedstaden bekostning av kommersielt tilgjengelig PSE apparater kan være uoverkommelige og det er ikke avgjørende. Grunnleggende ionebytte harpiks behandling er en meget praktisk metode for å erstatte tradisjonelle forsåpning etterfulgt av væske og væske partisjonering. Men er det ikke egnet for produkter som inneholder karboksylsyre grupper eller funksjonelle grupper som ville være hydrolyzed under grunnleggende forhold, for eksempel estere. Disse produktene kan forventes å bli beholdt på grunnleggende ionebytte harpiks. Det er imidlertid mulig å utnytte dette for en fangst og slipp prosedyre (ikke dokumentert her). Der tradisjonell forsåpning ville være passende, fungerer grunnleggende ionebytte harpiks behandling som et praktisk alternativ. Kromatografi metoden beskrevet i trinn 9, har blitt funnet for å være generalizable for forbindelser beskrevet i Figur 3. Forbindelser av økt polaritet kan imidlertid kreve 100% ethyl acetate elueringsrør lengre. Med trinn 9.2, nedstrøms fint rensing er helt sammensatte spesifikk, og er også avhengig av skala. Gjentatte runder med mindre flash kromatografi optimalisert hellinger, er vanligvis tilstrekkelig for å oppnå en renhet passer for NMR analyse. På større skalaer er krystallisering ofte et praktisk alternativ. I vanskelige saker, kan skytevåpen eller semi preparative høyytelses flytende kromatografi (HPLC) være ansatt avhengig av ønsket antall av isolerte sammensatte. Eksempler på nedstrøms rensing prosesser for en rekke representant forbindelser kan finnes andre steder8.
Gjeldende protokollen, som presenteres her, brukes rutinemessig i vårt laboratorium, og har bevist nytte. Det er imidlertid fortsatt betydelige muligheter for mer optimalisering av uttrykk-plattformen. Arbeidet pågår i vårt laboratorium å undersøke hvordan ytterligere veien engineering og differensial kontroll av protein uttrykk kan forbedre triterpene produksjon, mens formidling toksisitet for verten cellene. Det er også mulig å undersøke manipulering av intracellulær transport systemer20,21, og retning av enzymer til forskjellige mobilnettet rom22,23, veier som kan forbedre effektiviteten av flere oksidasjon hendelser. Potensielle fordeler for å endre underliggende morfologi av viktige organeller kan også utforskes. For eksempel har overuttrykte Arabidopsis thaliana HMGR membran domenet blitt observert for å indusere hypertrofi av det endoplasmatiske retikulum planter24; et viktig område for CYP450 aktivitet. Denne protokollen er ideelt for produksjon av mg til gram skala mengder triterpene produkter, og kan brukes i en forskning til forbindelser for nedstrøms studie (f.eks systematisk utforskningen av struktur-aktivitet relasjoner og Foreløpige undersøkelser i til Farmakodynamiske og farmakokinetiske egenskapene til føre forbindelser klinisk rundt). Men plattformen er lineært og pålitelig skalerbare ved å øke antall planter brukt og praktisk bruk av forbigående uttrykk via agroinfiltration har vist på industriell skala for produksjon av farmasøytiske proteiner 14, dermed er det potensial for denne plattformen utvides for kommersiell produksjon av høy verdi triterpenes. Alternativt er det også mulig å forestille seg produksjon av stabile transformants bærer den endelige ønske multigene biosyntetiske sti, tillater masse dyrking og fortsatte "oppdrett" av transgene N. benthamiana stammer produserer forskjellige komponenter av handelsverdi.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en Norwich forskning Park Studentship (JR), gi felles Engineering og Physical Sciences Research Council/Biotechnological og Biological Sciences Research Council BBSRC-finansierte forskningssenter for OpenPlant syntetisk biologi (BB / L014130/1) (M.J.S., AO); en John Innes sentrum kunnskapsutveksling og kommersialisering gi (BB/KEC1740/1) (bb); og BBSRC Institutt strategiske program Grant "Molekyler fra naturen" (BB/P012523/1) og John Innes Foundation (Ao). Vi vil gjerne takke George Lomonossoff for å gi pEAQ vektorer og Andrew Davis for fotografering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GC-MS instrument | any | n/a | |
| Thermocycler suitable for performing PCR reactions | any | n/a | |
| Gel electrophoresis apparatus | any | n/a | |
| Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
| Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L) | any | n/a | |
| Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/> 15000 rpm) | any | n/a | |
| Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
| Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
| Standing incubator | any | n/a | |
| Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L) | any | n/a | |
| Centrifuge bottles (1 L) | any | n/a | |
| Vacuum infiltration apparatus | bespoke | n/a | |
| 9 x 9 cm plant pots | any | n/a | |
| Freeze drying apparatus (=/> 8 litre condenser capacity) | any | n/a | |
| Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument) | Buchi | SpeedExtractor E-914 | |
| Rotary evaporator apparatus | any | n/a | |
| Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L) | any | n/a | |
| Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L) | any | n/a | |
| Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L) | any | n/a | |
| Spatulas (assorted sizes) | any | n/a | |
| Analytical balance (5 figures) | any | n/a | |
| Balance (2 figures) | any | n/a | |
| Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L) | any | n/a | |
| A -80 freezer | any | n/a | |
| Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument | Biotage | ISO-1EW | |
| Safety glasses | any | n/a | |
| Lab coat | any | n/a | |
| Autoclave | any | n/a | |
| Consumables | |||
| Micropipette tips (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
| Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL) | any | n/a | |
| Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL) | any | n/a | |
| Disposable Transfer pipettes (size 2 mL) | any | n/a | |
| Petri dishes (Size: 100 mL) | any | n/a | |
| Biotage® SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges | Biotage | FSK0-1107-0100 | |
| HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps | any | n/a | |
| Disposable purple nitrile gloves | any | n/a | |
| Top filter for E-914, cellulose | Buchi | 51249 | |
| Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber | Buchi | 11055932 | |
| Reagents | |||
| Quartz sand, 0.3 - 0.9 mm | Buchi | 37689 | |
| Celite 545 (diatomaceous earth) | Simga-Alrich | 22140-1KG-F | |
| Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm) | Merck | 1.09385.5000 | |
| 2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid | Melford | B2002 | |
| MgCl2 | Simga-Alrich | 208337-100G | |
| KOH | Simga-Alrich | 60377-1KG | |
| 3’5’-dimethoxy-4’-acetophenone (acetosyringone) | Simga-Alrich | D134406-1G | |
| Rifampicin | Alfa Aesar | J60836 | |
| Kanamycin sulfate | Gibco | 11815-032 | |
| Streptomycin | Simga-Alrich | S6501-100G | |
| Gentamycin | MP biomedicals | 190057 | |
| Agarose LE gel | Melford | MB1203 | |
| LB broth Millar | Simga-Alrich | L3522-250G | |
| Agar | Simga-Alrich | A5306-250G | |
| NaCl | Simga-Alrich | S5886-500G | |
| KCl | Simga-Alrich | P9541-500G | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Alrich | M2773-500G | |
| Glucose | Sigma-Alrich | G7021-100G | |
| Ambersep® 900 hydroxide (basic ion exchange resin) | Sigma-Alrich | 06476-1KG | |
| Hexane | Fisher | H/0406/PB17 | |
| Ethyl acetate | Fisher | E/0900/PB17 | |
| Dichloromethane | Fisher | D/1852/PB17 | |
| Methanol | Fisher | M/4056/PB17 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Alrich | E7637-1G | |
| Ethanol | VWR | 20821-330 | |
| Milli-Q water | any | n/a | |
| Levington F1 Compost | any | n/a | |
| Levington F2 Compost | any | n/a | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit). | Qiagen | 27104 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | Supplier New England Biolabs Ltd | C2987I | |
| pEAQ-HT-DEST1 vector | Lomonossoff laboratory John Innes Center | n/a | |
| pDONR207 | Thermo-Fisher | pDONR207 | |
| A. tumefaciens LBA4404 | Thermo-Fisher | 18313015 | |
| GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11791020 | |
| GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11789020 | |
| GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX | Promega UK Ltd | M7822 | |
| PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE | New England Biolabs Ltd | M0530S | |
| dNTP SET 100mm | Thermo-Fisher | 10297018 | |
| RNEASY PLANT MINI KIT | Qiagen Ltd | 74904 | |
| RQ1 RNASE-FREE DNASE | Promega UK Ltd | M6101 | |
| Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System | Fisher | 10308632 | |
| Trytone | Sigma-Alrich | T7293-250G | |
| Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | n/a |
References
- Thimmappa, R., et al. Triterpene biosynthesis in plants. Annual Review of Plant Biology. 65, 225-257 (2014).
- Seki, H., Tamura, K., Muranaka, T. P450s and UGTs: Key players in the structural diversity of triterpenoid saponins. Plant Cell Physiology. 56 (8), 1463-1471 (2015).
- Roy, A., Saraf, S. Limonoids: overview of significant bioactive triterpenes distributed in plants kingdom. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 29 (2), 191-201 (2006).
- Kamble, S. M., Goyal, S. N., Patil, C. R. Multifunctional pentacyclic triterpenoids as adjuvants in cancer chemotherapy: a review. RSC Advances. 4 (63), 33370-33382 (2014).
- Liby, K. T., Sporn, M. B. Synthetic oleanane triterpenoids: multifunctional drugs with a broad range of applications for prevention and treatment of chronic disease. Pharmacological Reviews. 64 (4), 972-1003 (2012).
- Yadav, V. R., et al. Targeting inflammatory pathways by triterpenoids for prevention and treatment of cancer. Toxins. 2 (10), 2428-2466 (2010).
- Christensen, L. P. Ginsenosides chemistry, biosynthesis, analysis, and potential health effects. Advances in Food and Nutrition Research. 55, 1-99 (2009).
- Reed, J., et al. A translational synthetic biology platform for rapid access to gram-scale quantities of novel drug-like molecules. Metabolic Engineering. 42, 185-193 (2017).
- Andersen-Ranberg, J., et al. Expanding the landscape of diterpene structural diversity through stereochemically controlled combinatorial biosynthesis. Angewandte Chemie International Edition. 55 (6), 2142-2146 (2016).
- Peyret, H., Lomonossoff, G. P. The pEAQ vector series: the easy and quick way to produce recombinant proteins in plants. Plant Molecular Biology. 83, 51-58 (2013).
- Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants. Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).
- Sainsbury, F., Lomonossoff, G. P. Extremely high-level and rapid transient protein production in plants without the use of viral replication. Plant Physiology. 148 (3), 1212-1218 (2008).
- Voinnet, O., et al. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. The Plant Journal. 33 (5), 949-956 (2003).
- Holtz, B. R., et al. Commercial-scale biotherapeutics manufacturing facility for plant-made pharmaceuticals. Plant Biotechnology Journal. 13 (8), 1180-1190 (2015).
- Bucar, F., Wubea, A., Schmidb, M. Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds. Natural Product Reports. 30, 525-545 (2003).
- Kaufmann, B., Christen, P. Recent extraction techniques for natural products: microwave-assisted extraction and pressurised solvent extraction. Phytochemical Analysis. 13 (2), 105-113 (2002).
- Larsen, E., Christensen, L. P. Simple saponification method for the quantitative determination of carotenoids in green vegetables. Journal of Archaeological and Food Chemistry. 53 (17), 6598-6602 (2005).
- Sainsbury, F., et al. Using a virus-derived system to manipulate plant natural product biosynthetic pathways. Methods Enzymology. , 185-202 (2012).
- Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA Cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research. 10, 1788-1795 (2000).
- Ting, H., et al. SNARE-RNAi results in higher terpene emission from ectopically expressed caryophyllene synthase in Nicotiana benthamiana. Molecular Plant. 8, 454-466 (2015).
- Wang, B., et al. Transient production of artemisininin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua. Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).
- Nielsen, A. Z., et al. Redirecting photosynthetic reducing power toward bioactive natural product synthesis. ACS Synthetic Biology. 2, 308-315 (2013).
- Dong, L., et al. Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments. New Phytologist. 209, 679-690 (2016).
- Ferrero, S., et al. Proliferation and morphogenesis of the endoplasmic reticulum driven by the membrane domain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A reductase in plant cells. Plant Physiology. 168, 899-914 (2015).
