Summary
Dinamica adesione delle cellule immuni alla parete del vaso è un prerequisito per homing gut. Qui, presentiamo un protocollo per un'analisi funzionale in vitro per l'analisi dell'impatto degli anticorpi anti-integrina, chemochine o altri fattori sull'adesione di dinamica delle cellule delle cellule umane utilizzando capillari α4β7 rivestite.
Abstract
Gut homing delle cellule del sistema immunitario è importante per la patogenesi delle malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD). Adesione di integrina-dipendente delle cellule di addressins è un passo fondamentale in questo processo e interferire con l'adesione di strategie terapeutiche sono state stabilite con successo. L'anticorpo di anti-α4β7 integrina, vedolizumab, è utilizzato per il trattamento clinico del morbo di Crohn (CD) e colite ulcerosa (UC) e altri composti sono propensi a seguire.
I dettagli della procedura di adesione e i meccanismi di azione degli anticorpi anti-integrina sono ancora poco chiari per quanto riguarda molti a causa delle limitate tecniche disponibili per la ricerca funzionale in questo campo.
Qui, presentiamo un saggio di adesione dinamico per l'analisi funzionale di adesione delle cellule umane in condizioni di flusso e l'impatto delle terapie anti-integrina nel contesto di IBD. Si basa sull'aspersione di cellule umane primarie attraverso capillari di vetro ultrasottile α4β7 rivestite con l'analisi al microscopio in tempo reale. Il saggio offre una varietà di opportunità per modifiche e perfezionamenti e detiene potenzialità per applicazioni traslazionale e meccanicistici scoperte.
Introduction
Movimento delle cellule è un processo strettamente regolato indispensabile per lo sviluppo e la funzione degli organismi pluricellulari, ma inoltre è implicata nella patogenesi di una moltitudine di malattie1. Recentemente, il processo di homing delle cellule immuni dal flusso sanguigno ai tessuti periferici ha guadagnato l'attenzione aumentante, poiché contribuisce al rifornimento e all'espansione delle cellule patogene in tessuti infiammati in malattie immunologicamente mediate2 ,3. In particolare, l'homing ha dimostrato di avere rilevanza traslazionale in malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD). Il terapeutico anti-α4β7 integrina anticorpo vedolizumab interferire con homing gut ha indicato l'efficacia in studi clinici di grandi4,5 ed è stato utilizzato con successo nel mondo reale pratica clinica6,7 , 8. ulteriori composti sono propensi a seguire9,10. Allo stesso modo, l'anticorpo di integrina terapeutico anti-α4, natalizumab, è utilizzato per il trattamento della sclerosi multipla (MS)11.
Tuttavia, la nostra comprensione funzionale del processo di homing in generale e il meccanismo di azione di tali anticorpi terapeutici in particolare è ancora limitato. È assodato che homing è costituito da diversi passaggi tra cui cella tethering e rotolamento con adesione successiva delle cellule che conduce all'arresto costante seguita da trans migrazione endoteliale12,13. I suddetti anticorpi neutralizzano le integrine sulla superficie delle cellule impedendo l'interazione con addressins sull'endotelio della parete del vaso. Questo è pensato per impedire cella ferma adesione14,15. Eppure, stiamo solo cominciando a capire la rilevanza differenziale delle integrine specifiche per homing delle cellule dei sottogruppi distinti delle cellule. Inoltre, gli effetti degli anticorpi anti-integrina su diversi sottoinsiemi del cellulare e associazioni di dose-risposta sono in gran parte sconosciute che conduce a un sacco di domande aperte nel campo delle terapie di homing e anti-adesione di intestino in IBD.
Pertanto, strumenti utili per affrontare tali questioni sono disperatamente necessari. L'effetto degli anticorpi anti-integrina sull'interazione integrina α4β7 finora è stata valutata principalmente valutando l'inibizione di efficacia/associazione associazione con citometria a flusso o tramite adesione statica saggi16,17 ,19,18,20, così con apparente semplificazione e deviazione dalla situazione fisiologica. Recentemente abbiamo stabilito un'analisi di adesione dinamico per studiare l'adesione integrine-dipendente delle cellule umane per addressins e gli effetti degli anticorpi anti-integrina sotto sollecitazione di taglio2. Il principio della tecnica è stato dimostrato in precedenza con mouse cellule21,22. Qui, si era adattato e sviluppato per affrontare le questioni di cui sopra traslazionale, apertura nuovi viali per meglio comprendere i meccanismi della terapia con anticorpi anti-integrina in vivo.
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Protocol
Gli studi descritti nelle sezioni seguenti sono stati eseguiti secondo l'approvazione del comitato etico dell'Università Friedrich-Alexander Erlangen-Norimberga.
1. preparazione dei capillari
- Collegare rettangolari capillari al tubo di gomma che allunga il tubo su un lato con piccole forbici e attentamente inserendo il capillare (circa 0.5 cm) nel tubo. Sigillare il collegamento tra tubo con pellicola di plastica paraffina e capillare.
- Cappotto del capillare con 20 µ l di MADCAM1 (ricombinante Fc chimera; 5 µ g/mL α4β7, ad es. MAdCAM-1, in tampone di rivestimento (NaCl 150 mM + 1 mM HEPES)) o la soluzione di controllo di isotipo appropriato utilizzando una pipetta p20 (fluido stesso si immergeranno nel capillare). Quindi, il lato non collegato al tubo con la pellicola di plastica paraffina ed incubare per almeno 1 h a 37 ° C. Utilizzare un capillare riempito solo con il tampone di rivestimento o con il controllo di isotipo appropriato come controllo negativo.
- Rimuovere la pellicola di plastica paraffina dalla punta del capillare, svuotare il rivestimento lasciando il liquido soak fuori il capillare su un capillari di asciugamano e blocco di carta per almeno 1 h con 20 µ l di blocco soluzione (1x PBS con 5% BSA) a 37 ° C. Sigillare il lato aperto del capillare con pellicola di plastica paraffina. Non rimuovere la soluzione bloccante prima di procedere alla microscopia.
2. cella di isolamento, trattamento e preparazione per microscopia
Nota: Questa procedura può essere eseguita durante l'incubazione periodi necessari per la preparazione capillare.
- Raccogliere 18 mL di sangue intero umano anticoagulated con un prelievo di sangue asettica impostato dalla vena cubitale del volontariato persone (per esempio, pazienti affetti da IBD e/o controlli sani) dopo consenso informato scritto secondo le regolazioni del locale Comitato etico.
Nota: Questa operazione deve essere eseguita solo da personale medico qualificato ed esperto secondo le normative nazionali e/o locale. - Riempire il sangue in una provetta da 50 mL e diluire fino ad un volume di 35 mL con PBS 1X. Quindi sottoposto la miscela di sangue-PBS con 10 mL di terreno di gradienti di densità.
- Eseguire la centrifugazione in gradiente di densità per 15 min a 800 x g e 24 ° C, senza freno per separare le cellule.
- Raccogliere le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) aspirando lo strato delle cellule bianche proprio sopra lo strato medio gradiente di densità (strato trasparente centrale). Trasferire PBMCs in una provetta di fresca 50 mL, riempire fino a 50 mL con 1x PBS e centrifugare per 10 minuti a 300 x g e 10 ° C.
- Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di 1X PBS successivamente contare i numeri di cellulare, per esempio, utilizzando una cella Neubauer camera di conteggio.
- Facoltativo: Per studiare l'adesione dei granulociti eseguire la procedura seguente. In caso contrario, procedere con il passaggio 2.7 o 2,8.
- Raccogliere lo strato del granulocyte (livello più basso dopo centrifugazione in gradiente di densità contenente anche eritrociti). Risospendere le cellule in 40 mL di PBS 1X. Quindi aggiungere 8 mL di 6% destrano in PBS 1X, mescolare delicatamente e lasciare il sedimento di celle a temperatura ambiente per 30 minuti.
Nota: Gli eritrociti affonderanno alla parte inferiore del tubo, mentre i granulociti rimarrà in sospensione. - Dopo 30 min, raccogliere il surnatante, trasferire in un tubo fresco da 50 mL e centrifugare per 6 min a 300 x g e a 4 ° C. Scartare il surnatante e lisare gli eritrociti rimanenti aggiungendo 5 mL di 0,2% NaCl in ddH2O. Incubare per 1 min.
- Aggiungere 5 mL di 1,4% NaCl in ddH2O e incubare per un altro minuto. Fermare la Lisi ipotonica aggiungendo 20 mL di 1X PBS e centrifugare per 6 min a 300 x g e 4 ° C.
- Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di 1X PBS. Quindi, contare i numeri di cellulare utilizzando una cella Neubauer camera di conteggio.
- Raccogliere lo strato del granulocyte (livello più basso dopo centrifugazione in gradiente di densità contenente anche eritrociti). Risospendere le cellule in 40 mL di PBS 1X. Quindi aggiungere 8 mL di 6% destrano in PBS 1X, mescolare delicatamente e lasciare il sedimento di celle a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Facoltativo: Per studiare l'adesione dei sottoinsiemi PBMC, purificare diversi tipi di cellule o sottoinsiemi (ad es., CD4+ e CD8+ T cellule o CD19+ B cellule) utilizzando microsfere secondo il protocollo del produttore o di fluorescenza-attivato cella ordinamento (FACS). In caso contrario, procedere con il passaggio 2.8.
- Centrifugare la sospensione cellulare per 10 min a 300 x g e 10 ° C. Scartare il surnatante e macchia le cellule con cellulare tracciante (ad es., CFSE) secondo le istruzioni del produttore.
- Successivamente, centrifugare le cellule per 10 min a 300 x ge scartare il surnatante. Risospendere in 1X PBS, determinare il numero di cell e centrifugare nuovamente per 10 min a 300 x g.
- Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare macchiato in quantità adeguata del buffer di adesione (1 mM MgCl2 + 1 mM HEPES + 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2) per ottenere una sospensione di 1,5 x 106 cellule/mL. Quindi, aggiungere la quantità appropriata di 100mm MnCl2 per ottenere una concentrazione finale di 1 mM.
Nota: Queste cellule sono ora pronte per microscopia. - Opzionale: Curare le cellule con citochine, neutralizzando gli anticorpi o altri composti. In caso contrario, procedere al passaggio 3.
- Omettere il passaggio 2.10 e risospendere il pellet cellulare macchiato dal passaggio 2.9 nel medium RPMI (con 10% FBS e 1% penicillina/streptomicina) per ottenere una concentrazione di 1.5 x 106 cellule/mL.
- Pipettare 1 mL di questa sospensione cellulare in altrettanti pozzetti di una piastra di 48-bene come ci sono le condizioni per essere analizzati. Sempre preparare un pozzetto con cellule non trattate per essere irrorato attraverso un capillare non patinata come controllo negativo e un pozzetto con cellule non trattate per essere irrorato attraverso un capillare α4β7 rivestite come controllo positivo.
- Per il trattamento con anticorpi anti-integrina, aggiungere la quantità appropriata di anticorpo (ad esempio, 10 µ g/mL vedolizumab) alla sospensione di cellule. Incubare per 1 h a 37 ° C. Per il trattamento con citochine, aggiungere la quantità appropriata di citochina ricombinante (ad esempio, 10 ng/mL CXCL10) alla sospensione di cellule. Incubare per 5 min a 37 ° C.
- Dopo l'incubazione, è necessario raccogliere le cellule di risospendere le cellule più volte utilizzando una pipetta p1000. Trasferire le cellule in una provetta da 2 mL, risciacquare bene con 1 mL di PBS 1X e aggiungere alla provetta 2 mL. Determinare il numero di cellulare.
Nota: L'incubazione di popolazioni di cellule aderenti (ad es., monociti) potrebbe richiedere ulteriori misure (ad es., il trattamento con tripsina) per staccare le cellule dalla piastra.
- Centrifugare le cellule per 10 min a 300 x g e a 10 ° C. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in quantità adeguata di buffer di adesione per ottenere una sospensione di 1,5 x 106 cellule/mL. Quindi, aggiungere la quantità appropriata di 100mm MnCl2 per ottenere una concentrazione finale di 1 mM. Quando il pretrattamento con chemochine non aggiungere MnCl2 alla sospensione di cellule. Queste cellule sono ora pronte per microscopia.
Nota: Il volume minimo utilizzato per il dosaggio dipende dalla pompa e la tubazione utilizzata. In questo studio, utilizzando la pompa peristaltica e la tubatura specificato nella Tabella materiali, era richiesto un volume minimo di 400 µ l. Se desiderata e applicabile (a seconda del tipo di cella e rendimento), la concentrazione di cellule in sospensione può essere aumentata per misurare più alta adesione in un breve periodo di tempo. - Possibili modifiche: analisi di adesione dinamica competitiva
- Eseguire i passaggi di cui sopra con popolazioni differenti delle cellule per essere confrontate tra loro (ad es., regolamentazione e cellule T effettrici isolate attraverso l'isolamento di biglie magnetiche seguendo le istruzioni del produttore secondo il punto 2.7).
- Macchia di ogni popolazione con un colorante diverso (ad es., CFSE e Fichera) come descritto nei passaggi 2.8 – 2,9 per essere in grado di distinguere le popolazioni delle cellule durante la microscopia.
- Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare macchiato in quantità adeguata del buffer di adesione (1 mM MgCl2 + 1 mM HEPES + 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2) per ottenere una sospensione di 1,5 x 106 cellule/mL.
- Volumi uguali di sospensioni di cellule (ad es., 500 µ l di cellule T regolatorie) e 500 µ l di cellule T effettrici di mescolare per ottenere un finale misto della concentrazione cellulare di 1.5 x 106 cellule/mL. Quindi, aggiungere la quantità appropriata di 100mm MnCl2 per ottenere una concentrazione finale di 1 mM. Tali sospensioni possono essere utilizzati successivamente per analisi competitiva del processo di adesione irrorando popolazioni differenti delle cellule attraverso la capillare stesso.
3. live Cell Imaging di aderenza dinamica
- Accendere il microscopio e selezionare il filtro appropriato o laser per eccitare la cellula di rilevamento dye(s) (ad es., 488 laser di nanometro per CFSE), un obiettivo appropriato (ad es., 40 X) e un imaging di intervallo di acquisizione modalità abilitazione tempo.
- Rimuovere la pellicola di plastica paraffina dalla punta del capillare e collegare il capillare con un breve pezzo di tubo (circa 5 cm di lunghezza) che allunga il tubo su un lato con piccole forbici e attentamente inserendo il capillare (circa 0,5 cm) nel tubo. Sigillare il collegamento tra il tubo con la pellicola di plastica paraffina e capillare.
- Montare il capillare su un vassoio di fissazione (ad es., coperchio da una piastra a 6 pozzetti con un cut-out rettangolare leggermente più corto rispetto alla lunghezza del capillare) e posizionare il capillare fisso sul titolare del vassoio del microscopio, in modo che il capillare è in stato attivo e pronto per microscopia.
- Inserire il tubo di gomma nella corrispondente tacca della pompa peristaltica e posizionare l'estremità non collegato alla capillare nella provetta del campione secondo contenente la sospensione cellulare. Inserire il tubo corto sul lato opposto del capillare in una provetta da 15 mL per raccogliere flusso continuo.
- Lasciate che il riempimento della tubazione con una portata di 500 µ l al minuto fino a quando la sospensione cellulare raggiunge quasi il capillare. Poi lasciare che il riempimento capillare con una portata di 100 µ l/min.
Nota: Un rapido riempimento del capillare assicura una distribuzione regolare della sospensione delle cellule all'interno del capillare. - Quando il capillare è riempito con una sospensione cellulare, regolare la portata a 10 µ l/min.
Nota: Queste portate possono variare, quando vengono utilizzati i capillari di dimensioni diverse o diverse pompe peristaltiche. In questo studio, il tasso di flusso di 10 µ l/min è stato ottimizzato per la pompa e capillari per simulare il flusso sanguigno in vivo . - Catturare immagini time-lapse delle cellule si muove lentamente attraverso il capillare lungo la α4β7 rivestite all'interno muro ogni 2 s per un totale di 3 min.
Nota: Gli intervalli e il tempo totale può variare a seconda del tipo di cella e questione da affrontare. - Prima di gettare il capillare, schermo intero capillare attraverso l'oculare del microscopio per assicurarsi che la sezione mostrata nel video è rappresentante. Se necessario, effettuare una seconda registrazione.
- Liberate il tubo dalla pompa e lasciate che il liquido rimanente correre indietro nella provetta 2 mL, poi scollegare la tubazione e capillare dal vassoio di fissazione e continuare con il successivo capillare.
4. valutazione e conta cellulare
- Aprire la sequenza di time-lapse con il software appropriato ed esportare le prime tre immagini ("inizio") e le ultime tre immagini ("fine") come file Tiff.
- Aperte le tre immagini "Beginning" in ImageJ, convertire a 32 bit ('immagine | Tipo | 32 bit') e unire immagini (' immagine | Colore | Unire i canali; assegnare i colori rossi, verdi e blu per le differenti immagini). Convertire immagine composita in RGB (' immagine | Type-RGB') e salvare come file Tiff. Ripetere l'operazione con le immagini di "Fine".
Nota: Nell'analisi di adesione dinamica competitiva con le cellule colorate con colori diversi, in primo luogo dividere i canali delle immagini per analizzare separatamente adesione delle popolazioni differenti delle cellule. - Contare le celle bianche visibili nel composito "Inizio" e "Fine" e sottrarre il numero di globuli bianchi nel «Principio» da cellule bianche alla "fine".
Nota: La differenza rappresenta il numero di nuovi aderenti cellule nell'intervallo di tempo di 3 min. Nell'immagine composita, cellule che spostato sono visibili nel colore specifico che è stato assegnato al rispettivo telaio poiché essi localizzare in un altro posto nel frame precedente e seguente. Per le celle che sono aderenti, i segnali rossi, verde e blu nel stesso posto si sovrappongono al bianco. - Per visualizzare meglio i risultati, è necessario compilare un video dalle sequenze di time-lapse, per esempio, usando ImageJ.
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Representative Results
Il metodo presentato in questo manoscritto ha lo scopo di simulare il processo di in vivo di adesione delle cellule umane per la parete endoteliale quanto più possibile a funzionalmente valuta adesione delle cellule e il ruolo degli anticorpi interferenti. Di conseguenza, ultrasottili capillari sono rivestiti con addressins e irrorati con le cellule umane fluorescente contrassegnate di interesse utilizzando una pompa di perfusione. Utilizzando cellule vive l'adesione delle cellule umane per la addressins di imaging può essere osservato in tempo reale (Figura 1).
Questo metodo è particolarmente adatto per delucidare i meccanismi delle terapie di anti-adesione in IBD. Come mostrato nella Figura 2A, perfusione dei capillari rivestito con ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1 e Isotype Fc chimera con PBMCs umano conduce ad adesione profonda, quando è presente uno dei tre addressins. Al contrario, adesione ai capillari rivestite su isotype è minima. Inibizione di integrina α4β7 interazioni usando anticorpi neutralizzanti in genere conduce ad una profonda diminuzione di aderenza dinamica che è assente, quando gli anticorpi isotipo controllo vengono aggiunti (rappresentativo illustrata in Figura 2B, in pool dati quantitativi in Figura 2).
Allo stesso modo, l'impatto delle chemochine sulla modulazione di integrina-affinità possa essere studiato in questo sistema di pre-incubazione con tali peptidi in vitro. Come emerge dai dati rappresentativi in Figura 3, trattamento di CD4+ cellule T umane con CCL2 o CXCL10 conduce ad una maggiore adesione al MAdCAM-1 rispetto a cellule umane non trattate.
Figura 1: rappresentazione schematica del flusso di lavoro. Preparazione di α4β7 rivestito ultrasottili capillari e cellule umane fluorescente contrassegnate (a sinistra) è seguito da perfusione delle cellule attraverso la capillare utilizzando una pompa peristaltica (al centro) e time-lapse microscopia (a destra). Per volta con il permesso di riferimento23. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: dinamica adesione del periferico umano cellule mononucleari (PBMCs) da donatori di controllo per diverse addressins del sangue. (A) numero di recente aderendo PBMCs capillari rivestito addressins specifici o con Fc isotipo controllo (n = 6). (B) immagini rappresentative di dinamica adesione ICAM-1 rivestito capillari irrorati con PBMCs (NT) non trattati o cellule incubate con 10 µ g/mL di un anticorpo anti-CD18 o controllo di isotipo IgG µ g/mL 10. Inizio: Fuse prime tre immagini della sequenza 3 min; Fine: Fuse ultimi tre immagini della sequenza 3 min; le cellule aderenti sono raffigurate bianco. È indicata i loro numeri, nonché la differenza (cioè, appena aderente celle). Barra della scala = 100 µm. (C) impatto di anticorpi anti-integrina (ciascuno utilizzato ad una concentrazione di 10 µ g/mL) sull'adesione dinamico. A sinistra: Numero di appena aderente cellule capillari rivestiti con ICAM-1 ed irrorato con non trattata, trattata anti-CD18 o IgG isotipo cellule trattate con controllo; Medio: Numero di appena le cellule aderenti a capillari ricoperti di VCAM-1 e irrorati con non trattata, trattati con il natalizumab o IgG isotipo cellule trattate con controllo; A destra: Numero di appena le cellule aderenti a capillari rivestiti con MAdCAM-1 ed irrorato con non trattata, trattata vedolizumab o cellule trattate con controllo dell'isotipo di IgG (n = 5 – 6). Le barre indicano mezzi con errore standard della media (SEM). Statistica test è stato eseguito con One-way ANOVA seguita da test di confronto più Newman-Keuls (* p < 0.05; * * p < 0.01). Per volta con il permesso di riferimento23. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Chemokine-mediata dinamico adesione di CD4 umana+ T cellule MAdCAM-1. Analisi di immagini da un'adesione dinamica rappresentanza in MAdCAM-1-coated capillari irrorati con non trattati (NT) CD4+ T cellule o cellule incubate con 10 ng/mL rhCXCL10 o con 100 ng/mL rhCCL2. Inizio: Fuse prime tre immagini della sequenza 3 min; Fine: Fuse ultimi tre immagini della sequenza 3 min; le cellule aderenti sono raffigurate bianco. È indicata i loro numeri, nonché la differenza (cioè, appena aderente celle). Barra della scala = 100 µm. preincubazione con chemochine conduce ad adesione aumentata dinamica, presumibilmente a causa della modulazione di integrina-affinità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
SupplementaryVideos: film da tre minuti di sequenze di immagini da MAdCAM-1 rivestito capillari irrorati con fluorescente contrassegnati PBMCs. (A) capillari irrorati con cellule non trattate. (B) capillari irrorati con cellule trattate con 10 µ g/mL vedolizumab. (C) capillari irrorati con cellule trattate con 10 controllo di isotipo IgG umano di µ g/mL. Cella di flusso dal basso verso l'alto, appena le cellule aderenti sono indicate da frecce bianche. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il protocollo di cui sopra descrive una tecnica utile per studiare la dinamica adesione delle cellule immuni umane a ligandi endoteliali. Attraverso la variazione di ligandi rivestiti, tipi cellulari irrorato o sottoinsiemi, incubazione con stimoli ulteriori o diversi anticorpi neutralizzanti, ha quasi illimitato di potenziali applicazioni. Pertanto, tali dosaggi di adesione dinamica possono essere utile per rispondere a entrambe le domande fondamentali della ricerca di base, nonché query traslazionale che potrebbe contribuire a sviluppare e ottimizzare la terapia clinica con farmaci che interferiscono con il processo di adesione.
Recentemente è stata dimostrata l'utilità del dosaggio per studiare gli effetti della clinica delle terapie anti-adesione. Inoltre, popolazioni differenti delle cellule che esprimono diversi tipi e quantità di integrine mostrano livelli consistenti di adesione dinamico per i rispettivi addressins, sostenere la validità del test23.
Nel complesso, il completamento del protocollo ha bisogno di circa 6 ore di lavoro e presenta sfide tecniche intermedie. Una volta avviato il rivestimento del vaso capillare, un problema critico è per evitare la disidratazione. Ciò richiede accurata tenuta durante le fasi di incubazione e un'attenta gestione dei capillari, quando lo scambio di soluzioni. Inoltre, l'avvio del processo di perfusione rende necessaria una certa cautela. A causa del volume morto del tubo, non è fattibile per riempire il tubo intero con il tasso di flusso di perfusione finale. D'altra parte, variare la velocità di flusso dopo aver sciacquato il capillare con l'alta velocità comporta il rischio di interruzione del flusso che porta alla possibilità di adesione statica limitando la validità in materia di adesione dinamico. Pertanto, un interruttore tempestivo alla portata del finale è essenziale. La portata finale dovrebbe essere scelto dipende dalla dimensione pompa, tubi e capillare usata. Per simulare il flusso di sangue umano in alti venules endothelial come vicino possibile, un flusso di volume di 0,1 a 5 mm/s è consigliato24,25.
La difficoltà del dosaggio può aumentare notevolmente, quando le modifiche vengono applicate. Ad esempio, analisi dei sottoinsiemi a cellula T specifici potrebbero richiedere più esigenti di polarizzazione o purificazione strategie26. Inoltre, inclusi i passaggi homing di tethering, rotolamento e cella attivazione12 l'esperimento aumenterà ulteriormente la difficoltà, poiché esso potrebbe essere necessario rivestire una combinazione di ligandi all'interno dei capillari o delizia (pre-) la irrorati popolazione cellulare con chemio - o citochine in conto selectina-dipendente di rotolamento e chemochine-indotta delle cellule attivazione e integrina affinità modulazione27. Tuttavia, questi potrebbero essere particolarmente interessanti domande per la ricerca futura, tanto più che la tecnica presentata permette di indirizzare in modo funzionale una sofisticata interazione di molecole diverse con cellule umane e ligandi. Come accennato in precedenza, adesione competitivo analisi dinamica delle diverse popolazioni di cellule diversamente macchiato nel capillare stesso può aggiungere un ulteriore livello di complessità. Inoltre, è anche stato dimostrato che le cellule endoteliali possono essere utilizzate nei sistemi fluidi invece di ligandi ricombinanti28.
Anche se è un'analisi funzionale, la tecnica è limitata dalla riduzione delle reti complesse in vivo per un insieme selezionato di molecole coinvolte in vitro. Ciò significa che gli effetti di altri fattori sconosciuti o imprevisti potrebbero essere trascurati o non sufficientemente considerati. Tuttavia, questo è un problema frequente nella ricerca umana, perché le considerazioni etiche non voglia spesso meccanicistico in vivo le indagini29.
Presi insieme, questo protocollo presenta un'analisi funzionale per l'analisi delle terapie di adesione e anti-integrina dinamiche integrina-dipendente nelle malattie intestinali infiammatorie. Mentre il principio di base è abbastanza straight-forward e non troppo difficile da eseguire, esso può essere abbellita e modificato sotto vari aspetti e ha il potenziale per rispondere alle domande traslazionale sulla terapia di anti-adesione in IBD.
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Disclosures
M.F.N. ha servito come consulente per Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda e Boehringer. M.F.N. e S.Z. ha ricevuto il sostegno alla ricerca da Takeda e Roche.
Acknowledgments
La ricerca di CN, IA, MFN e SZ è stata sostenuta dal centro interdisciplinare per ricerca clinica (IZKF) e il programma ELAN dell'Università di Erlangen-Norimberga, l'altro Kröner-Fresenius-Stiftung, Fritz-Bender-Stiftung di Crohn tedesco e Colite Foundation (DCCV), la clinica ricerca gruppo CEDER di Consiglio di ricerca tedesca (DFG), il programma di argomento DFG sul Microbiota, l'iniziativa di campo emergente ed il DFG Collaborative Research centri 643, 796 e 1181.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48-well plate | Sarstedt | 833,923 | |
| Adhesion buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2 | |||
| Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA | |||
| Bovine Serum albumin (BSA) | Applichem | A1391,0100 | |
| CaCl2 | Merck | 2382 | |
| Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0.20 mm x 2.00 mm ID, 50 mm length | CM Scientific | 3520-050 | |
| CCL-2, human | Immunotools | 11343384 | |
| CD4-Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFischer Scientific | C34554 | |
| Centrifuge (Rotixa 50 RS) | Hettrich | ||
| Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES | |||
| Confocal Microscope (TCS SP8) | Leica | ||
| CXCL-10, human | Immunotools | 11343884 | |
| Dextran 500 | Roth | 9219.3 | |
| EDTA KE/9 mL Monovette | Sarstedt | ||
| Falcons (50 mL) | Sarstedt | 62,547,004 | |
| Fc chimera isotype control | R&D Systems | 110-HG | |
| Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) | Baoding Shenchen Precision Pump Company | ||
| HEPES | VWR | J848-100ML | |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFischer Scientific | 31154 | |
| Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 720-IC-050 | |
| LS-Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MgCl2 | Roth | ||
| MnCl2 | Roth | ||
| mouse IgG isotype control | Miltenyi Biotec | 130-106-545 | |
| Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 6056-MC | |
| NaCl | Roth | 3957.3 | |
| Natalizumab | Biogen | ||
| Neubauer Counting chamber | Roth | T729.1 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-601000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182-10 | w/o Mg and Ca |
| Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) | VWR | 52858-000 | |
| purified anti-human CD18 | Biolegend | 302102 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco Life Technologies | 61870-010 | |
| Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02 mm ID, 406.4 mm length | Ismatec | SC0059 | |
| Serological Pipetts | Sarstedt | 861,254,025 | |
| Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
| Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera | Biolegend | 553706 | |
| Vedolizumab (Entyvio) | Takeda |
References
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