Summary
Dynamische Adhäsion von Immunzellen, die Gefäßwand ist eine Voraussetzung für Darm-Homing. Hier präsentieren wir ein Protokoll für einen funktionellen in Vitro Assay für die Impact-Analyse der Antikörper Anti-Integrin, Chemokine oder andere Faktoren auf die dynamische Zelladhäsion von menschlichen Zellen mit Bearbeit-beschichteten Kapillaren.
Abstract
Darm-Homing von Immunzellen ist wichtig für die Pathogenese der entzündlichen Darmerkrankungen (IBD). Integrin-abhängige Zelladhäsion, Addressins ist ein entscheidender Schritt in diesem Prozess und therapeutische Strategien stören Adhäsion haben erfolgreich etabliert. Der Anti-α4β7 Integrin Antikörper, Vedolizumab, dient der klinischen Behandlung von Morbus Crohn (CD) und Colitis ulcerosa (UC) und weitere Verbindungen sind wahrscheinlich folgen.
Die Einzelheiten des Verfahrens Adhäsion und Wirkungsmechanismen von Anti-Integrin-Antikörper sind in vielerlei Hinsicht aufgrund der begrenzten verfügbaren Techniken für die funktionelle Forschung in diesem Bereich noch unklar.
Hier präsentieren wir Ihnen eine dynamische Adhäsion-Assay für die funktionelle Analyse der menschlichen Zelle Adhäsion unter Strömungsverhältnisse und die Auswirkungen der Anti-Integrin-Therapien im Rahmen der IBD. Es basiert auf die Perfusion der primären humanen Zellen durch Bearbeit-beschichtete ultradünnen Glaskapillaren mit mikroskopischen Analysen in Echtzeit. Der Test bietet eine Vielzahl von Möglichkeiten für Verbesserungen und Modifikationen und Potenziale für die mechanistischen Entdeckungen und Translationale Anwendungen hält.
Introduction
Zelle Bewegung ist ein streng regulierten Prozess unverzichtbar für die Entwicklung und Funktion der mehrzelligen Organismen, sondern ist auch in der Pathogenese zahlreicher Erkrankungen1verwickelt. Homing Prozess der Immunzellen aus dem Blutstrom zu den peripheren Geweben hat vor kurzem, zunehmende Aufmerksamkeit gewonnen, da sie Nachschub und Ausbau der pathogene Zellen in entzündetem Gewebe bei immunologisch vermittelten Erkrankungen2 fördert ,3. Referenzfahrt ist insbesondere nachweislich, translationale Relevanz bei entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) zu haben. Die therapeutische Anti-α4β7 Integrin Antikörper Vedolizumab Darm referenzieren stören hat Wirksamkeit gezeigt, in großen klinischen Studien4,5 und erfolgreich eingesetzt in der klinischen Praxis6,7 , 8. weitere Verbindungen sind wahrscheinlich9,10folgen. Ebenso ist der therapeutische Anti-α4-Integrin-Antikörper, Natalizumab, zur Behandlung von Multipler Sklerose (MS)11verwendet.
Unsere funktionalen Verständnis des homing-Prozesses im allgemeinen und der Mechanismus der Wirkung solcher therapeutischer Antikörper ist insbesondere jedoch nach wie vor begrenzt. Es ist allgemein bekannt, dass Homing aus mehreren Schritten besteht, einschließlich der Zelle tethering und Walzen mit nachfolgenden Zelladhäsion, zur festen Festnahme gefolgt von Trans endotheliale Migration12,13. Die oben genannten Antikörper neutralisieren Integrine auf der Zelloberfläche, die Interaktion mit Addressins auf das Endothel der Gefäßwand zu verhindern. Dies ist gedacht, um feste Zelle Adhäsion14,15behindern. Allerdings sind wir erst am Anfang zu verstehen, die differenzierte Relevanz der spezifischen Integrine für Zelle Homing von eindeutigen Zelle Teilmengen. Darüber hinaus die Auswirkungen der Anti-Integrin-Antikörper auf verschiedenen Zelle Teilmengen und Dosis-Wirkungs-Verbände sind weitgehend unbekannt, was zu viele offene Fragen auf dem Gebiet der Darm homing und Anti-Adhäsion Therapien in IBD.
Praktische Tools für solche Fragen sind daher dringend erforderlich. Die Wirkung von Anti-Integrin-Antikörper auf Integrin-Bearbeit Interaktion ist bisher überwiegend ausgewertet worden, durch die Beurteilung verbindliche Wirksamkeit/Bindung Hemmung mit Durchflusszytometrie oder durch statische Haftung Assays16,17 ,18,19,20, also mit scheinbaren Vereinfachung und Abweichung von der physiologischen Situation. Wir hat kürzlich einen dynamischen Adhäsion-Assay Integrin-abhängige Adhäsion von menschlichen Zellen, Addressins und die Auswirkungen der Anti-Integrin-Antikörpern unter Scherbelastung2studieren. Das Prinzip der Technik wurde früher mit Maus Zellen21,22nachgewiesen. Hier wurde es angepasst und entwickelt, um die oben genannten translatorische Fragen, Eröffnung neuartige Wege zum besseren Verständnis der Mechanismen der Therapie mit Anti-Integrin Antikörper in Vivo.
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Protocol
In den folgenden Abschnitten beschriebenen Studien wurden nach Genehmigung der Ethikkommission der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg durchgeführt.
1. Vorbereitung der Kapillaren
- Verbinden Sie rechteckige Kapillaren mit den Gummischlauch durch Dehnung des Schlauchs auf der einen Seite mit einer kleinen Schere und sorgfältig Einfügen der Kapillare (ca. 0,5 cm) in die Röhre. Die Verbindung zwischen Kapillare und Schlauch mit Kunststoff Paraffin Film zu versiegeln.
- Beschichten die Kapillare mit 20 µL Bearbeit (rekombinante Fc Chimäre; 5 µg/mL Bearbeit, z.B. MAdCAM-1, in Beschichtung Puffer (150 mM NaCl + 1 mM HEPES)) oder die entsprechenden Isotype-Control-Lösung mit einer Pipette p20 (Flüssigkeit saugt sich in der Kapillare). Dann, die Seite nicht auf das Rohr mit dem Kunststoff Paraffin-Film verbunden verschließen und mindestens 1 h bei 37 ° c inkubieren Verwendung einer Kapillare gefüllt nur mit der Beschichtung-Puffer oder mit dem entsprechenden Isotype-Steuerelement als Negativkontrolle.
- Entfernen Sie den Kunststoff Paraffin-Film von der Spitze der Kapillare, Entleeren Sie die Beschichtung zu, indem man die Flüssigkeit Tränken aus der Kapillare auf ein Papier Handtuch und Block Kapillaren für mindestens 1 h mit 20 µL Lösung (1 X PBS mit 5 % BSA) bei 37 ° c zu blockieren Versiegeln Sie die offene Seite der Kapillare mit Kunststoff Paraffin Film. Entfernen Sie nicht die blockierende Lösung vor der Mikroskopie.
2. Handy-Isolation, Behandlung und Vorbereitung für die Mikroskopie
Hinweis: Diese Schritte können während der Inkubation Perioden notwendig für die Kapillare Vorbereitung durchgeführt werden.
- Sammeln Sie 18 mL Antikoagulanzien volles menschliches Blut mit einer aseptischen Blutentnahme vom cubital Ader der Freiwilligenarbeit Personen (z. B. IBD Patienten und gesunden Kontrollpersonen) nach informierte Zustimmung gemäß den Vorschriften der örtlichen Ethik-Kommission.
Hinweis: Dieser Schritt sollte nur von geschulten und erfahrenen medizinischen Personal gemäß den nationalen und/oder lokalen Vorschriften durchgeführt werden. - Füllen Sie das Blut in ein 50 mL-Tube und auf ein Volumen von 35 mL mit 1 X PBS verdünnen. Dann Unterlage die Blut-PBS-Mischung mit 10 mL der Dichte-Gradienten-Medium.
- Führen Sie Dichte-Gradienten-Zentrifugierung für 15 min bei 800 X g und 24 ° C ohne Bremse, Zellen zu trennen.
- Sammeln Sie die peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) durch Absaugen der weißen Zellschicht rechts oben auf die Dichte mittlere Verlaufsebene (klare mittlere Schicht). Übertragen Sie PBMCs in einem frischen 50 mL-Tube, füllen Sie bis zu 50 mL mit 1 X PBS und Zentrifuge für 10 min bei 300 x g und 10 ° C.
- Den überstand verwerfen, Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL 1 X PBS und anschließend zählen Zellzahlen, z. B. durch die Verwendung einer Neubauer Zelle zählen Kammer.
- Optional: Zur Untersuchung der Haftung der Granulozyten führen die folgenden Schritte. Fahren Sie andernfalls mit Schritt 2.7 oder 2.8.
- Die Granulozyten-Schicht (unterste Schicht nach der Dichte Steigung Zentrifugierung, enthält auch die Erythrozyten) zu sammeln. Zellen in 40 mL 1 X PBS aufzuwirbeln. Fügen Sie dann 8 mL 6 % Dextran in 1 X PBS, vorsichtig mischen und lassen Zellen Sediment für 30 min bei Raumtemperatur.
Hinweis: Die Erythrozyten sinkt auf den Boden des Rohres, während die Granulozyten werden in der Schwebe bleiben. - Nach 30 min. Überstands sammeln, übertragen in eine frische 50 mL-Tube und Zentrifuge für 6 min bei 300 x g und 4 ° C. Den überstand verwerfen und lösen Sie die verbleibenden Erythrozyten durch Zugabe von 5 mL 0,2 % NaCl in DdH2O. Inkubation für 1 min.
- Geben Sie 5 mL 1,4 % NaCl in DdH2O und eine weitere Minute inkubieren. Stoppen Sie die hypotone Lyse durch Zugabe von 20 mL 1 X PBS und Zentrifuge für 6 min bei 300 X g und 4 ° C.
- Die Zelle Pellet in 10 mL 1 X PBS aufzuwirbeln. Dann zählen Sie Zellzahlen mithilfe einer Neubauer Zelle zählen Kammer.
- Die Granulozyten-Schicht (unterste Schicht nach der Dichte Steigung Zentrifugierung, enthält auch die Erythrozyten) zu sammeln. Zellen in 40 mL 1 X PBS aufzuwirbeln. Fügen Sie dann 8 mL 6 % Dextran in 1 X PBS, vorsichtig mischen und lassen Zellen Sediment für 30 min bei Raumtemperatur.
- Optional: Um das Anhaften von PBMC Teilmengen zu studieren, zu reinigen, verschiedene Zelltypen oder Teilmengen (z. B. CD4+ und CD8+ T Zellen oder CD19+ B Zellen) mit Microbeads laut Protokoll des Herstellers oder durch Fluoreszenz-aktivierte cell sorting (FACS). Fahren Sie andernfalls mit Schritt 2,8.
- Zentrifugieren der Zellsuspension für 10 min bei 300 x g und 10 ° C. Verwerfen Sie den überstand und beflecken Sie Zellen mit Cell tracking Farbstoff (z. B. CFSE) entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
- Anschließend die Zellen für 10 min bei 300 X gZentrifugieren und überstand verwerfen. In 1 X PBS aufzuwirbeln Sie, bestimmen Sie die Anzahl von Zellen und Zentrifuge wieder für 10 min bei 300 X g.
- Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der gefärbten Zelle Pellet in die entsprechende Menge an Haftung Puffer (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) um eine Suspension von 1,5 x 106 Zellen/mL zu erhalten. Fügen Sie dann den entsprechenden Betrag von 100 mM MnCl2 , eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
Hinweis: Diese Zellen sind nun bereit für die Mikroskopie. - Optional: Behandlung von Zellen mit Zytokine, Antikörper oder andere Verbindungen zu neutralisieren. Fahren Sie andernfalls mit Schritt 3.
- Überspringen Sie Schritt 2.10 und Aufschwemmen der gefärbten Zelle Pellet aus Schritt 2,9 in RPMI Medium (mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin), eine Konzentration von 1,5 x 106 Zellen/mL zu erhalten.
- Pipette 1 mL dieser Zellsuspension in möglichst viele Vertiefungen einer 48-Well-Platte, da gibt es Bedingungen analysiert werden. Bereiten Sie immer einen Brunnen mit unbehandelten Zellen durch eine unbeschichtete Kapillare als Negativkontrolle durchblutet werden und einen Brunnen mit unbehandelten Zellen durch eine Kapillare Bearbeit beschichtet als Positivkontrolle durchblutet werden.
- Für die Behandlung mit Anti-Integrin-Antikörpern die entsprechende Menge des Antikörpers (z.B. 10 µg/mL Vedolizumab) hinzufügen der Zellsuspension. 1 h bei 37 ° c inkubieren Fügen Sie für die Behandlung mit Zytokinen die entsprechende Menge an rekombinanten Zytokine (z. B. 10 ng/mL CXCL10 hinzu), die Zellsuspension. 5 min bei 37 ° c inkubieren
- Ernten Sie nach der Inkubation Zellen durch resuspending Zellen mehrmals mit Hilfe einer Pipette p1000. Übertragen Sie Zellen in einer 2 mL-Tube, mit 1 mL 1 X PBS wieder gut spülen Sie ab und fügen Sie der 2 mL Tube hinzu. Bestimmen Sie die Anzahl von Zellen.
Hinweis: Inkubation von adhärente Zell-Populationen (z. B. Monozyten) erfordern zusätzliche Maßnahmen (z. B.., Behandlung mit Trypsin), Zellen von der Platte zu lösen.
- Zentrifuge Zellen für 10 min bei 300 X g bei 10 ° C. Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in die entsprechende Menge an Haftung Puffer, eine Suspension von 1,5 x 106 Zellen/mL zu erhalten. Fügen Sie dann den entsprechenden Betrag von 100 mM MnCl2 , eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten. Bei Vorbehandlung mit Chemokine keine hinzu MnCl2 der Zellsuspension. Diese Zellen sind nun bereit für die Mikroskopie.
Hinweis: Das Mindestvolumen für den Assay verwendet ist abhängig von der Pumpe und Schlauch verwendet. In dieser Studie, die mit Hilfe der peristaltischen Pumpe und den Schlauch in die Tabelle der Materialienangegeben war ein Mindestvolumen von 400 µL erforderlich. Wenn gewünscht und (je nach Zelltyp und Ertrag) Anwendung, kann die Zellkonzentration in der Suspension erhöht werden, um höhere Haftung in kürzerer Zeit zu messen. - Mögliche Änderung: wettbewerbsfähige dynamische Adhäsion Assay
- Führen Sie die oben genannten Schritte mit verschiedenen Zell-Populationen (z. B. regulatorische und T-Effektorzellen isoliert durch magnetische Wulst Isolierung nach Anweisungen des Herstellers entsprechend Schritt 2.7) miteinander verglichen werden.
- Färben Sie jedes Volk mit einem anderen Farbstoff (z. B. CFSE und FarRed), wie beschrieben 2,8-2,9, Zell-Populationen während Mikroskopie unterscheiden zu können.
- Verwerfen Sie den überstand und Aufschwemmen Sie der gefärbten Zelle Pellets in die entsprechende Menge an Haftung Puffer (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) um eine Suspension von 1,5 x 106 Zellen/mL zu erhalten.
- Mischen Sie gleiche Volumina von Zellsuspensionen (z. B. 500 µL der regulatorischen T-Zellen) und 500 µL T-Effektorzellen zu einem Finale gemischt Zellkonzentration von 1,5 x 106 Zellen/mL. Fügen Sie dann den entsprechenden Betrag von 100 mM MnCl2 , eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten. Solcher Suspensionen können anschließend für Wettbewerbsanalyse der Klebevorgang durch verschiedene Zell-Populationen durch die gleichen Kapillare Vorrichtung verwendet werden.
3. live Cell Imaging der dynamischen Adhäsion
- Schalten Sie das Mikroskop und wählen Sie den entsprechenden Filter oder laser-tracking-Dye(s) (z. B. 488 nm Laser für CFSE-), eine geeignete Ziel (z. B. 40 X) und eine Übernahme-Modus ermöglicht Zeit verfallen Bildgebung Zelle zu begeistern.
- Entfernen Sie den Kunststoff Paraffin-Film von der Spitze der Kapillare und verbinden Sie die Kapillare mit einem kurzen Stück Schlauch (ca. 5 cm Länge) durch Dehnung des Schlauchs auf der einen Seite mit einer kleinen Schere und sorgfältig Einfügen der Kapillare (ca. 0,5 cm) in die Röhre. Die Verbindung zwischen Kapillare und Schlauch mit dem Kunststoff Paraffin-Film zu versiegeln.
- Montieren Sie die Kapillare auf einem Tablett Fixierung (z.B. Deckel von einer 6-Well-Platte mit einem rechteckigen Ausschnitt etwas kürzer als die Länge der Kapillare) und platzieren Sie die feste Kapillare auf dem Tablett-Halter des Mikroskops, so dass die Kapillare im Fokus und bereit ist für die Mikroskopie.
- Stecken Sie den Gummischlauch in die entsprechende Kerbe der peristaltischen Pumpe und stecken Sie das Ende nicht an der Kapillare in das entsprechende Probenröhrchen, enthält die Zellsuspension angefügt. Stecken Sie den kurzen Schlauch auf der anderen Seite der Kapillare in ein 15 mL-Tube, Flow-through zu sammeln.
- Lassen Sie die Schläuche füllen mit einem Durchsatz von 500 µL pro Minute bis die Zellsuspension fast die Kapillare erreicht. Dann lassen Sie die Kapillare Füllung mit einer Durchflussmenge von 100 µL/min.
Hinweis: Eine schnelle Füllung der Kapillare sorgt für eine gleichmäßige Verteilung der Zellsuspension innerhalb der Kapillare. - Wenn die Kapillare mit der Zellsuspension gefüllt ist, einstellen Sie Durchfluss bis 10 µL/min.
Hinweis: Diese Flussraten können variieren, wenn Kapillaren eine andere Größe oder andere Schlauchpumpen verwendet werden. In dieser Studie wurde die Durchflussmenge von 10 µL/min für die Pumpe und Kapillaren zu in Vivo Blutfluss zu imitieren optimiert. - Zeitraffer-Aufnahmen der Zellen langsam durch die Kapillare entlang der Bearbeit-Beschichtung auf der Innenseite Wand alle 2 s für eine Gesamtmenge von 3 min.
Hinweis: Intervalle und Gesamtzeit variieren je nach Zelltyp und Frage angegangen werden. - Vor dem Ablegen der Kapillare, die ganze Kapillare Bildschirm durch das Okular des Mikroskops um sicherzustellen, dass der Abschnitt auf dem Video gezeigt Vertreter ist. Wenn nötig, machen Sie eine zweite Aufnahme.
- Den Schlauch von der Pumpe frei und lassen Sie die restliche Flüssigkeit laufen zurück in der 2-mL-Tube, dann trennen Sie die Kapillare und Schlauch aus der Fixierung und fahren Sie mit der nächsten Kapillare.
4. Bewertung und Zellzählung
- Öffnen Sie die Zeitraffer-Sequenz mit der entsprechenden Software und exportieren Sie die ersten drei Bilder ("Anfang") und die letzten drei Bilder ("Ende") als TIFF-Dateien.
- Offen die drei "Anfang" Bilder in ImageJ, konvertieren, 32-Bit ("Bild | Typ | 32-Bit ") und Bilder zu verschmelzen (' Bild | Farbe | Kanäle verbinden; Ordnen Sie die Farben rot, grün und blau zu den verschiedenen Bildern) zu. Zusammengesetztes Bild in RGB umwandeln (' Bild | Type-RGB') und speichern als TIFF-Datei. Wiederholen Sie mit dem "Ende"-Bilder.
Hinweis: Zuerst aufgeteilt In wettbewerbsfähigen dynamischen Adhäsion Assays mit Zellen mit verschiedenen Farben gefärbt, die Kanäle der Bilder, um die Adhäsion der unterschiedlichen Zellpopulationen separat zu analysieren. - Zählen Sie die weißen Zellen sichtbar im "Anfang" und "Ende" Composite und subtrahieren Sie die Zahl der weißen Blutkörperchen in den "Anfang" von der weißen Blutkörperchen in das "Ende".
Hinweis: Der Unterschied entspricht der Anzahl der neu Einhaltung im Zeitintervall von 3 min-Zellen. In das zusammengesetzte Bild sind Zellen, die verschoben in die spezifische Farbe, die den jeweiligen Frame zugewiesen wurde, da sie an einer anderen Stelle im vorhergehenden und folgenden Frame lokalisieren, sichtbar. Für Zellen, die Anhänger, die roten, grünen und blauen Signale in der gleichen Stelle Überlappung zu weiß. - Um die Ergebnisse besser zu visualisieren, kompilieren Sie ein Video von den Zeitraffer-Sequenzen, z. B. mit ImageJ.
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Representative Results
Die vorgestellte Methode in diesem Manuskript zielt darauf ab, die in Vivo -Prozess der menschlichen Zelle Adhäsion an der endothelialen Wand so nah wie möglich an funktionell simulieren bewerten Zelladhäsion und die Rolle der störende Antikörper. Daher sind ultradünne Kapillaren mit Addressins beschichtet und mit Gewebekulturen beschriftete menschliche Zellen mit einer Perfusion Pumpe durchströmt. Mit live Cell imaging das Anhaften von menschlichen Zellen, die Addressins kann in Echtzeit (Abbildung 1) beobachtet werden.
Diese Methode eignet sich besonders, die Mechanismen der Anti-Adhäsion Therapien in IBD aufzuklären. Wie in Abbildung 2Agezeigt, führt Durchblutung der Kapillaren mit ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1 und Isotype Fc Chimäre mit menschlichen PBMCs beschichtet zu markierten Adhäsion, wenn eines der drei Addressins vorhanden ist. Im Gegensatz dazu ist Haftung auf Isotype-beschichteten Kapillaren minimal. Hemmung der Integrin-Bearbeit Interaktionen mit neutralisierende Antikörper in der Regel führt zu eine deutliche Abnahme der dynamischen Adhäsion, die fehlt, wenn Kontrolle Antikörper Isotype (repräsentativ dargestellt in Abbildung 2 b, gebündelt hinzugefügt werden quantitative Daten in Abbildung 2).
Ebenso kann die Auswirkungen von Chemokinen auf Integrin-Affinität Modulation in diesem System von Vorinkubation mit solche Peptide in Vitrountersucht werden. Dargestellt durch repräsentative Daten in Abbildung 3, Behandlung von CD4+ menschlichen T-Zellen mit CCL2 oder CXCL10 führt zu erhöhte Adhäsion zu MAdCAM-1 im Vergleich zu unbehandelten menschlichen Zellen.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Workflows. Vorbereitung der Bearbeit beschichtet ultradünne Kapillaren und Gewebekulturen beschriftete menschliche Zellen (links) wird gefolgt von Perfusion der Zellen durch die Kapillare mit einer peristaltischen Pumpe (Mitte) und Zeitraffer-Mikroskopie (rechts). Mit freundlicher Genehmigung von Referenz23geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: dynamische Haftung des menschlichen peripheren Blut MONONUKLEÄRE Zellen (PBMCs) von Kontrolle Spendern zu verschiedenen Addressins. (A) Anzahl der neu Einhaltung PBMCs zu Kapillaren beschichtet mit bestimmten Addressins oder Fc Isotype Kontrolle (n = 6). (B) repräsentative Bilder der dynamischen Adhäsion im ICAM-1-beschichteten Kapillaren durchblutet mit unbehandelten (NT) PBMCs oder Zellen inkubiert mit 10 µg/mL Anti-CD18 Antikörper oder 10 µg/mL IgG Isotype Kontrolle. Beginn: Fusionierte die ersten drei Bilder der Sequenz 3 min; Ende: Zusammengeführten letzten drei Bilder der Sequenz 3 min; anhaftende Zellen dargestellt sind weiß. Ihre Zahl sowie die Differenz (d. h. neu anhaftende Zellen) sind angegeben. Maßstabsleiste = 100 µm. (C) Auswirkungen der Anti-Integrin-Antikörper (verwendet in einer Konzentration von 10 µg/mL) auf dynamische Adhäsion. Links: Nummer der neu anhaftende Zellen, die Kapillaren beschichtet mit ICAM-1 und durchblutet mit unbehandelt, Anti-CD18-behandelt oder IgG Isotype Kontrolle-behandelten Zellen; Mitte: Nummer der neu anhaftende Zellen, die Kapillaren beschichtet mit VCAM-1 und durchblutet mit unbehandelt, Natalizumab behandelt oder IgG Isotype Kontrolle-behandelten Zellen; Rechts: Nummer der neu anhaftende Zellen, die Kapillaren mit MAdCAM-1 beschichtet und mit durchblutet unbehandelt, Vedolizumab behandelt oder IgG Isotype Kontrolle-behandelten Zellen (n = 5 – 6). Balken mit Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Statistische Tests wurden mit One-Way ANOVA gefolgt von Newman-Keuls mehrere Vergleichstest (* p < 0,05; ** p < 0,01). Mit freundlicher Genehmigung von Referenz23geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Chemokin-vermittelten dynamischen Haftung des menschlichen CD4+ T-Zellen zu MAdCAM-1. Bilder aus einer repräsentativen dynamische Adhäsion assay in MAdCAM-1-beschichteten Kapillaren durchblutet mit unbehandelten (NT) CD4+ T-Zellen oder Zellen inkubiert mit 10 ng/mL rhCXCL10 oder mit 100 ng/mL rhCCL2. Beginn: Fusionierte die ersten drei Bilder der Sequenz 3 min; Ende: Zusammengeführten letzten drei Bilder der Sequenz 3 min; anhaftende Zellen dargestellt sind weiß. Ihre Zahl sowie die Differenz (d. h. neu anhaftende Zellen) sind angegeben. Maßstabsleiste = 100 µm. Vorinkubation mit Chemokine führt zu erhöhten dynamischen Adhäsion, vermutlich durch Integrin-Affinität Modulation. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
SupplementaryVideos: Filme von drei Minuten Bildsequenzen aus MAdCAM-1 beschichteten Kapillaren durchblutet mit Gewebekulturen beschrifteten PBMCs. (A) Kapillare mit unbehandelten Zellen durchblutet. (B) Kapillare durchströmt mit Zellen mit 10 µg/mL Vedolizumab behandelt. (C) Kapillare durchströmt mit Zellen behandelt mit 10 µg/mL menschliche IgG Isotype Kontrolle. Handy-Durchfluss von unten nach oben, neu anhaftende Zellen durch weiße Pfeile gekennzeichnet sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
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Discussion
Das obige Protokoll beschreibt eine nützliche Technik, um dynamische Haftung der menschlichen Immunzellen zur endothelialen Liganden zu studieren. Durch Variation der beschichteten Liganden PERFUNDIERTEN Zelltypen oder Teilmengen, die Inkubation mit zusätzlichen Reize oder verschiedene neutralisierende Antikörper, es hat fast unbegrenzte Einsatzmöglichkeiten. Daher können solche dynamischen Adhäsion Assays nützlich sein, sowohl grundlegende Fragen der Grundlagenforschung sowie translational Abfragen, die helfen könnten, zu entwickeln und Optimierung der klinischen Therapie mit Medikamenten stören den Klebevorgang.
Das Dienstprogramm des Assays zu untersuchen, die Auswirkungen der Anti-Adhäsion Therapien wurde kürzlich nachgewiesen. Darüber hinaus weisen unterschiedliche Zellpopulationen Ausdruck verschiedene Arten und Mengen an Integrine konsistente dynamische Adhäsion zu den jeweiligen Addressins unterstützen die Gültigkeit der Assay-23.
Im großen und ganzen der Abschluss des Protokolls muss etwa 6 Stunden Arbeit und Fortgeschrittene technische Herausforderungen. Sobald die Beschichtung der Kapillare begonnen hat, ist ein kritisches Thema, um Dehydrierung zu vermeiden. Dies erfordert genaue Abdichtung während der inkubationsschritte und sorgfältigen Umgang mit den Kapillaren, beim Austausch von Lösungen. Darüber hinaus erfordert die Einleitung des Prozesses Perfusion Vorsicht. Durch das Totvolumen der Schläuche ist es nicht möglich, das ganze Rohr mit der endgültigen Perfusion Durchfluss zu füllen. Auf der anderen Seite birgt Ändern der Volumenstrom nach dem Spülen der Kapillare mit high-Speed die Gefahr der Fluss Unterbrechung führt zu die Möglichkeit, statische Haftung begrenzen die Gültigkeit in Bezug auf dynamische Adhäsion. Daher ist eine rechtzeitige Umstellung auf die endgültige Fördermenge wichtig. Die endgültige Durchflussmenge sollte abhängig von der verwendeten Pumpe, Schlauch und Kapillare Größe gewählt werden. Um menschliche Blutfluss in hohe endothelial Venolen als bürgernah wie möglich, einen Volumenstrom von 0,1 bis 5 zu imitieren ist mm/s24,25empfohlen.
Die Schwierigkeit des Assays kann deutlich erhöhen, wenn Änderungen angewendet werden. Beispielsweise erfordern anspruchsvolle Polarisation oder Reinigung Strategien26Analyse der spezifischen T-Zell-Subsets. Auch, einschließlich der homing Schritte der Anbindehaltung, Roll- und Zelle Aktivierung12 in das Experiment wird weiter erhöhen die Schwierigkeit, da es möglicherweise erforderlich, eine Kombination von Liganden an der Innenseite der Kapillaren oder (vor-) Behandlung zu beschichten die durchblutet Zellpopulation mit Chemo oder Zytokine selektin-abhängige Rollen und Chemokin-induzierte Zelle Aktivierung und Integrin Affinität Modulation27zu berücksichtigen. Diese kann jedoch besonders interessante Fragen für die zukünftige Forschung, zumal der vorgestellte Technik erlaubt es, funktional eine ausgefeilte Interaktion von verschiedenen Molekülen mit menschlichen Zellen und Liganden anzugehen. Wie bereits erwähnt, kann konkurrierend Analyse dynamischer Haftung mehrere unterschiedlich gefärbten Zellpopulationen in der gleichen Kapillare eine weitere Ebene der Komplexität hinzufügen. Darüber hinaus wurde auch nachgewiesen, dass Endothelzellen in fluidische Systeme statt rekombinante Liganden28verwendet werden können.
Obwohl es eine funktionelle Assay ist, wird die Technik durch die Verringerung der Komplex in Vivo -Netzwerke, um eine ausgewählte Gruppe von beteiligten Moleküle in-vitro-begrenzt. Dies bedeutet, dass die Auswirkungen von unbekannten oder unerwarteten zusätzlichen Faktoren übersehen oder nicht ausreichend berücksichtigt werden könnten. Dies ist jedoch ein häufiges Problem in der Humanforschung, weil ethische Überlegungen oft mechanistischen in Vivo Untersuchungen29verbieten.
Zusammengenommen, präsentiert dieses Protokoll einen funktionelle Assay für die Analyse von Integrin-abhängige dynamische Adhäsion und Anti-Integrin Therapien bei entzündlichen Darmerkrankungen. Während das Grundprinzip ist recht geradlinig und nicht allzu schwer zu führen, es kann verschönert werden und in mehrfacher Hinsicht geändert und hat das Potenzial, Anti-Adhäsion Therapie bei IBD translatorische Fragen.
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Disclosures
M.F.N. diente als Berater für Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda und Boehringer. M.F.N. und S.Z. seitens Forschungsförderung der Takeda und Roche.
Acknowledgments
Die Forschung von CN, IA, MFN und SZ wurde unterstützt durch das interdisziplinäre Zentrum für klinische Forschung (IZKF) und der ELAN-Programm der Universität Erlangen-Nürnberg, der Else Kröner-Fresenius-Stiftung, der Fritz-Bender-Stiftung, die deutsche Morbus Crohn und Ulcerosa Foundation (DCCV), die klinische Forschung Gruppe CEDER von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG), das DFG-Thema-Programm auf Mikrobiota, Emerging-Feld-Initiative und die DFG Collaborative Research Centers 643, 796 und 1181.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48-well plate | Sarstedt | 833,923 | |
| Adhesion buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2 | |||
| Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA | |||
| Bovine Serum albumin (BSA) | Applichem | A1391,0100 | |
| CaCl2 | Merck | 2382 | |
| Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0.20 mm x 2.00 mm ID, 50 mm length | CM Scientific | 3520-050 | |
| CCL-2, human | Immunotools | 11343384 | |
| CD4-Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFischer Scientific | C34554 | |
| Centrifuge (Rotixa 50 RS) | Hettrich | ||
| Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES | |||
| Confocal Microscope (TCS SP8) | Leica | ||
| CXCL-10, human | Immunotools | 11343884 | |
| Dextran 500 | Roth | 9219.3 | |
| EDTA KE/9 mL Monovette | Sarstedt | ||
| Falcons (50 mL) | Sarstedt | 62,547,004 | |
| Fc chimera isotype control | R&D Systems | 110-HG | |
| Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) | Baoding Shenchen Precision Pump Company | ||
| HEPES | VWR | J848-100ML | |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFischer Scientific | 31154 | |
| Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 720-IC-050 | |
| LS-Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MgCl2 | Roth | ||
| MnCl2 | Roth | ||
| mouse IgG isotype control | Miltenyi Biotec | 130-106-545 | |
| Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 6056-MC | |
| NaCl | Roth | 3957.3 | |
| Natalizumab | Biogen | ||
| Neubauer Counting chamber | Roth | T729.1 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-601000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182-10 | w/o Mg and Ca |
| Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) | VWR | 52858-000 | |
| purified anti-human CD18 | Biolegend | 302102 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco Life Technologies | 61870-010 | |
| Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02 mm ID, 406.4 mm length | Ismatec | SC0059 | |
| Serological Pipetts | Sarstedt | 861,254,025 | |
| Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
| Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera | Biolegend | 553706 | |
| Vedolizumab (Entyvio) | Takeda |
References
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