Summary
Dynamisk vedhæftning af immunceller til karvæggen er en forudsætning for gut målsøgende. Her præsenterer vi en protokol til en funktionel i vitro assay for konsekvensanalyse af anti-integrin antistoffer, kemokiner eller andre faktorer på den dynamiske celle vedhæftning af menneskelige celler ved hjælp af addressin-belagt kapillærer.
Abstract
Gut homing af immunceller er vigtigt for patogenesen af inflammatoriske tarmsygdomme (IBD). Integra-afhængige celle vedhæftning til addressins er et afgørende skridt i denne proces og terapeutiske strategier forstyrrer vedhæftning har været med succes etableret. Anti-α4β7 integrin antistof, vedolizumab, der bruges til den kliniske behandling af Crohns sygdom (CD) og colitis ulcerosa (UC) og yderligere forbindelser er tilbøjelige til at følge.
Nærmere oplysninger om proceduren vedhæftning og handling mekanismer for anti-integrin antistoffer er stadig uklart i mange henseender på grund af den begrænsede tilgængelige teknik for den funktionelle forskning på dette område.
Her præsenterer vi en dynamisk friktionskoefficient assay for den funktionelle analyse af humane celle vedhæftning flow betingelser og virkningen af anti-integrin behandlingsformer i forbindelse med IBD. Det er baseret på perfusion af primære menneskelige celler gennem addressin-belagt ultratynde glas kapillærer med real-time mikroskopisk analyse. Analysen tilbyder en bred vifte af muligheder for forbedringer og ændringer og holder potentialer for mekanistisk opdagelser og translationel applikationer.
Introduction
Celle bevægelse er en stramt reguleret proces uundværlige for udvikling og funktion af multi-cellulære organismer, men er også involveret i patogenesen af en lang række sygdomme1. For nylig, den homing proces af immunceller fra blodet til de perifere væv har fået stigende opmærksomhed, da det bidrager til genbestilling og udvidelse af sygdomsfremkaldende celler i betændt væv i immunologisk medierede sygdomme2 ,3. Især har homing vist sig at have translationel relevans i inflammatoriske tarmsygdomme (IBD). Den terapeutiske anti-α4β7 integrin antistof vedolizumab forstyrrer gut homing har vist effekt i store kliniske forsøg4,5 og held har været anvendt i virkelige verden klinisk praksis6,7 , 8. yderligere forbindelser er tilbøjelige til at følge9,10. Ligeledes, den terapeutiske anti-α4-integrin antistof, natalizumab, bruges til behandling af multipel sklerose (MS)11.
Men vores funktionel forståelse af målsøgende processen i almindelighed og virkningsmekanisme af sådanne terapeutiske antistoffer i særdeleshed er stadig begrænset. Det er godt etableret, målsøgende består af flere trin, herunder celle tøjring og rullende med efterfølgende celle vedhæftning fører til fast anholdelse efterfulgt af trans endotel migration12,13. De ovennævnte antistoffer neutralisere integriner på cellens overflade forhindrer interaktion med addressins på endotelet i karvæggen. Dette menes at hæmme fast celle vedhæftning14,15. Endnu, vi kun begyndt at forstå differential relevansen af specifikke integriner for celle homing af særskilt celle subsets. Desuden virkningerne af anti-integrin antistoffer på forskellige celle subsets og dosis-respons foreninger er stort set ukendt, fører til masser af åbne spørgsmål inden for gut målsøgende og anti-friktion behandlingsformer i IBD.
Derfor er der desperat behov for praktiske værktøjer til at løse sådanne spørgsmål. Effekten af anti-integrin antistoffer på integrin-addressin interaktion er hidtil overvejende blevet evalueret af vurderingen bindende effekt/bindende hæmning med flowcytometri eller via statisk friktionskoefficient assays16,17 ,18,19,20, dermed med tilsyneladende forenkling og afvigelse fra den fysiologiske situation. Vi for nylig har etableret en dynamisk friktionskoefficient assay for at studere integrin-afhængige vedhæftning af menneskelige celler til addressins og virkningerne af anti-integrin antistoffer under shear stress2. Princippet om teknikken er tidligere blevet påvist med musen celler21,22. Her, det blev tilpasset og udviklet for at løse de ovennævnte translationel spørgsmål, åbning nye veje for bedre at forstå mekanismerne af behandling med anti-integrin antistoffer i vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De undersøgelser, der er beskrevet i de følgende afsnit er blevet udført efter godkendelse af den etiske komité af Friedrich-Alexander universitetet Erlangen-Nürnberg.
1. forberedelse af kapillærer
- Tilslut rektangulære kapillærer til gummi slange ved at strække slangen på den ene side med en lille saks og forsigtigt indsætte kapillær (ca 0,5 cm) i røret. Forsegle forbindelsen mellem kapillær og tube med plast paraffin film.
- Coat kapillær med 20 µL addressin (rekombinant Fc chimera; 5 µg/mL addressin, fx MAdCAM-1, i coatingbuffer (150 mM NaCl + 1 mM HEPES)) eller den passende isotype kontrol løsning ved hjælp af en p20 pipette (væske vil suge sig ind i kapillar). Derefter forsegle den side ikke forbundet til rør med plast paraffin film og Inkuber i mindst 1 time ved 37 ° C. Brug en kapillær fyldt kun med coatingbuffer eller med passende isotype kontrol som negativ kontrol.
- Fjerne plastik paraffin film fra spidsen af kapillar, tømmer belægningen ved at lade den flydende blød ud af kapillar på et papir håndklæde og blok kapillærer i mindst 1 time med 20 µL blokerende løsning (1 x PBS med 5% BSA) ved 37 ° C. Seal den åbne side af kapillar med plast paraffin film. Fjern ikke den blokerende løsning, før du fortsætter til mikroskopi.
2. celle Isolation, behandling og forberedelse til mikroskopi
Bemærk: Disse trin kan udføres under inkubation perioder nødvendige for kapillær forberedelse.
- Indsamle 18 mL af antikoaguleret fuldt humant blod med en aseptisk blod samling fra den kubiske vene af frivilligt arbejde personer (fx IBD patienter og raske kontrolpersoner) efter informeret skriftligt samtykke efter reglerne i lokalt etisk udvalg.
Bemærk: Dette trin skal kun udføres af uddannede og erfarne medicinsk personale efter nationale og lokale bestemmelser. - Fylde blodet ind i en 50 mL tube og fortyndes op til et volumen paa 35 mL med 1 x PBS. Derefter underlag blod-PBS blandingen med 10 mL af tæthed gradient medium.
- Udføre tæthed gradient centrifugering i 15 min. ved 800 x g og 24 ° C uden bremse til separate celler.
- Indsamle perifert blod mononukleære celler (PBMC) ved sugning hvid cellelag lige på toppen af tæthed gradient medium lag (klart midterste lag). Overføre PBMC i en frisk 50 mL tube, fylde op til 50 mL med 1 x PBS og centrifugeres i 10 min. ved 300 x g og 10 ° C.
- Supernatanten, celle resuspenderes i 10 mL 1 x PBS og efterfølgende tælle celle tal, fx ved hjælp af en Neubauer celle tælle kammer.
- Valgfrit: For at studere vedhæftning af granulocytter udføre følgende procedure. Ellers gå videre med trin 2,7 eller 2.8.
- Indsamle granulocyt lag (nederste lag efter tæthed gradient centrifugering indeholder også erytrocytter). Resuspend celler i 40 mL 1 x PBS. Derefter tilsættes 8 mL 6% Dextran i 1 x PBS, blandes forsigtigt og lad celler sediment i 30 min. ved stuetemperatur.
Bemærk: Erytrocytter vil synke til bunden af røret, mens granulocytter vil bo i suspension. - Efter 30 min, indsamle supernatanten, overføres til en frisk 50 mL tube, og der centrifugeres i 6 min. ved 300 x g og 4 ° C. Supernatanten og lyse de resterende erytrocytter ved tilsætning af 5 mL 0,2% NaCl i ddH2O. Incubate i 1 minut.
- Der tilsættes 5 mL 1,4% NaCl i ddH2O og Inkuber i et minut. Stop det hypotonic lysis ved at tilføje 20 mL 1 x PBS og centrifugeres i 6 min. ved 300 x g og 4 ° C.
- Celle resuspenderes i 10 mL 1 x PBS. Derefter tælle celle tal ved hjælp af en Neubauer celle tælle kammer.
- Indsamle granulocyt lag (nederste lag efter tæthed gradient centrifugering indeholder også erytrocytter). Resuspend celler i 40 mL 1 x PBS. Derefter tilsættes 8 mL 6% Dextran i 1 x PBS, blandes forsigtigt og lad celler sediment i 30 min. ved stuetemperatur.
- Valgfrit: For at studere vedhæftning af PBMC delmængder, rense forskellige celletyper eller delgrupper (fx CD4+ og CD8+ T celler eller CD19+ B celler) ved hjælp af microbeads efter producentens protokol eller ved fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS). Ellers gå videre med trin 2.8.
- Centrifugeres cellesuspension til 10 min på 300 x g og 10 ° C. Supernatanten og plette celler med celle tracking farvestof (f.eks. CFSE) ifølge producentens anvisninger.
- Derefter centrifugeres celler i 10 minutter ved 300 x g, og kassér supernatanten. Resuspend i 1 x PBS, bestemme celle nummer og centrifugeres igen i 10 minutter ved 300 x g.
- Supernatanten og resuspenderes farves celle i den passende mængde vedhæftning buffer (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) for at opnå en suspension af 1.5 x 106 celler/mL. Derefter tilføje den passende mængde på 100 mM frihedsbevægelse2 at få en endelig koncentration på 1 mM.
Bemærk: Disse celler er nu klar til mikroskopi. - Valgfrit: Behandling af celler med cytokiner, neutraliserende antistoffer eller andre stoffer. Ellers gå videre med trin 3.
- Udelad trin 2.10 og resuspenderes farves celle fra trin 2.9 i RPMI medium (med 10% FBS og 1% Penicillin/Streptomycin) at opnå en koncentration af 1.5 x 106 celler/mL.
- Der afpipetteres 1 mL af denne cellesuspension i så mange huller i en 48-godt pladen som der er betingelser, der skal analyseres. Altid forberede et godt med ubehandlede celler til at være perfunderet via en ubestrøget kapillar som negativ kontrol og et godt med ubehandlede celler til at være perfunderet via en addressin-belagt kapillar som positiv kontrol.
- Behandling med anti-integrin antistoffer, skal du tilføje den passende mængde antistof (f.eks, 10 µg/mL vedolizumab) til cellesuspension. Inkuber i 1 time ved 37 ° C. Behandling med cytokiner, skal du tilføje den passende mængde af rekombinant cytokin (f.eks. 10 ng/mL CXCL10) til cellesuspension. Inkuber i 5 min. ved 37 ° C.
- Høste celler af resuspending celler flere gange ved hjælp af en p1000 pipette efter inkubationen. Overfør celler i et 2 mL tube, skyl godt igen med 1 mL PBS, 1 x og tilføje til 2 mL tube. Bestemme celle nummer.
Bemærk: Inkubation af vedhængende cellepopulationer (fx monocytter) kan kræve yderligere foranstaltninger (fx., behandling med trypsin) Adskil celler fra pladen.
- Centrifuge celler i 10 minutter ved 300 x g ved 10 ° C. Supernatanten og resuspenderes celle i den passende mængde vedhæftning buffer til at opnå en suspension af 1.5 x 106 celler/mL. Derefter tilføje den passende mængde på 100 mM frihedsbevægelse2 at få en endelig koncentration på 1 mM. Når forbehandling med kemokiner Tilføj ikke frihedsbevægelse2 til cellesuspension. Disse celler er nu klar til mikroskopi.
Bemærk: Den mindstemængde, der er anvendt til analysen er afhængige af pumpe og slanger, der anvendes. I denne undersøgelse, ved hjælp af den peristaltiske pumpe og slange angivet i Tabel af materialer, var en mindstemængde af 400 µL påkrævet. Hvis ønskede og gældende (afhængigt af celletype og udbytte), øges koncentrationen af celler i suspension for at måle højere friktion i en kortere periode. - Mulige modifikation: konkurrencedygtige dynamisk friktionskoefficient assay
- Ovennævnte fremgangsmåde med forskellige cellepopulationer skal sammenlignes med hinanden (fx, regulerende og effektor T celler isoleret gennem magnetisk bead isolation efter producentens instruktioner pr. trin 2.7).
- Pletten hver befolkning med en anden farve (f.eks. CFSE og FarRed), som beskrevet i trin 2,8-2,9 at differentiere cellepopulationer under mikroskopi.
- Supernatanten og resuspend farves celle pellets i den passende mængde vedhæftning buffer (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) for at opnå en suspension af 1.5 x 106 celler/mL.
- Bland lige mængder af celle suspensioner (f.eks. 500 µL af regulerende T-celler) og 500 µL af effektor T celler til at opnå en endelig blandet celle koncentration af 1.5 x 106 celler/mL. Derefter tilføje den passende mængde på 100 mM frihedsbevægelse2 at få en endelig koncentration på 1 mM. Sådanne suspenderinger kan efterfølgende bruges til konkurrencedygtige analyse af adhæsion proces af perfusing forskellige cellepopulationer gennem den samme kapillar.
3. levende celle Imaging dynamisk friktionskoefficient
- Tænde mikroskopet og vælg det ønskede filter eller laser for at ophidse cellen tracking dye(s) (f.eks. 488 nm laser til CFSE), et passende mål (f.eks. 40 X) og en erhvervelse mode gør det muligt tid bortfalder billeddannelse.
- Fjerne plastik paraffin film fra spidsen af kapillær og forbinde kapillar med et kort stykke af slanger (ca. 5 cm i længden) af strækker sig slangen på den ene side med en lille saks og forsigtigt indsætte kapillær (ca 0,5 cm) ind i røret. Forsegle forbindelsen mellem kapillær og tube med plast paraffin film.
- Montere kapillar på en fiksering bakke (f.eks. låget fra en 6-godt plade med en rektangulær cut-out lidt kortere end længden af kapillar) og placere den faste kapillær på bakken indehaveren af mikroskopet, således at kapillar er i fokus og klar til mikroskopi.
- Indsæt gummi slange i den tilsvarende hak i den peristaltiske pumpe og Placer ende ikke tilknyttet kapillar ind i ifølge prøve rør indeholdende cellesuspension. Indsæt den korte rør på anden siden af kapillar i en 15 mL tube at indsamle gennemstrømning.
- Lad slangen fyld med en gennemstrømningshastighed på 500 µL pr. minut indtil cellesuspension næsten når kapillar. Så lad den kapillære fyld med en gennemstrømningshastighed på 100 µL/min.
Bemærk: En hurtig påfyldning af kapillar sikrer en regelmæssig fordeling af cellesuspension inde kapillar. - Når kapillar er fyldt med cellesuspension, justere strømningshastighed til 10 µL/min.
Bemærk: Disse strømningshastigheder kan variere, når kapillærer af en anden størrelse eller forskellige peristaltiske pumper bruges. I denne undersøgelse, var væskehastighed på 10 µL/min. optimeret til pumpe og kapillærer til at efterligne i vivo blodgennemstrømning. - Fange time-lapse billeder af celler bevæger sig langsomt gennem kapillar langs addressin-belagt inde i væggen hver 2 s for et samlet beløb på 3 min.
Bemærk: Intervaller og totaltid kan variere afhængigt af celletype og spørgsmål behandles. - Skærmen hele kapillær gennem øjet brik i mikroskop for at sikre, at afsnittet vist på video er repræsentant før kassering af kapillar. Hvis det er nødvendigt, gøre en anden optagelse.
- Gratis slangen fra pumpen og lade de resterende væske løbe tilbage til 2 mL tube, derefter frakoble kapillær og slangen fra bakken fiksering og fortsætte med den næste kapillær.
4. evaluering og celle optælling
- Åbn time-lapse sekvensen med passende software og eksportere de første tre billeder ("begyndelsen") og de sidste tre billeder ("ende") som Tiff-filer.
- Åbn de tre "Begynder" billeder i ImageJ, konvertere til 32 bit («billede | Type | 32 bit') og flette billeder (' billede | Farve | Flette kanaler; Tildel farver rød, grøn og blå til de forskellige billeder). Konvertere sammensatte billede i RGB (' billede | Type-RGB') og gemme som Tiff-fil. Gentag med den "Ende" billeder.
Bemærk: I konkurrencedygtige dynamisk friktionskoefficient farvet assays med celler med forskellige farver, først opdele kanaler af billeder til at analysere vedhæftning af de forskellige cellepopulationer separat. - Tæller de hvide celler synlige i "Start" og "Slutning" composite og fratræk antallet af hvide blodlegemer i "Begyndelsen" fra de hvide blodlegemer i "Ende".
Bemærk: De forskel repræsenterer antallet af nyligt vedhængende celler i 3 min gang interval. I det sammensatte billede er celler, der flyttede synlige i den specifikke farve, der er tildelt til den respektive ramme da de lokalisere i et andet sted i den foregående og efterfølgende ramme. Celler, der er tilhænger, de røde, grønne og blå signaler i den samme spot overlap til hvid. - For at bedre visualisere resultaterne, udarbejde en video fra time-lapse sekvenser, fx ved hjælp af ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden fremlægges i dette manuskript har til formål at simulere i vivo proces af humane celle vedhæftning til i endothelial væggen så tæt som muligt til funktionelt vurdere celle vedhæftning og rollen som interfererende antistoffer. Derfor, ultratynde kapillærer er belagt med addressins og perfunderet med fluorescently mærket menneskelige celler af interesse ved hjælp af en perfusion pumpe. Ved hjælp af levende celle imaging vedhæftning af menneskelige celler til at addressins kan ses i realtid (figur 1).
Denne metode er særligt velegnet til at belyse mekanismerne i anti-friktion behandlingsformer i IBD. Som vist i figur 2A, fører perfusion af kapillærer belagt med ICAM-1 og VCAM-1, MAdCAM-1 Isotype Fc chimera med menneskelige PBMC til markant friktion, når en af de tre addressins er til stede. Derimod er vedhæftning til isotype-belagt kapillærer minimal. Hæmning af Integra-addressin interaktioner ved hjælp af neutraliserende antistoffer typisk fører til et markant fald dynamisk friktionskoefficient, der er fraværende, når isotype kontrol antistoffer er tilføjet (repræsentativt illustreret i figur 2B, samlet kvantitative data i figur 2 c).
Ligeledes, effekten af kemokiner på integrin-affinitet modulation kan undersøges i dette system af præ-inkubation med disse peptider in vitro. Som det fremgår af repræsentative data i figur 3, behandling af CD4+ humane T celler med enten CCL2 eller CXCL10 fører til øget friktion til MAdCAM-1 i forhold til ubehandlede humane celler.
Figur 1: skematisk gengivelse af arbejdsprocessen. Forberedelse af addressin belagt ultratynde kapillærer og fluorescently mærket menneskelige celler (til venstre) er efterfulgt af perfusion af celler gennem kapillar ved hjælp af en peristaltisk pumpe (i midten) og time-lapse mikroskopi (til højre). Modificeret med tilladelse fra reference23. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: dynamisk vedhæftning af humant perifert blod mononukleære celler (PBMC) fra kontrol donorer til forskellige addressins. (A) antallet af nyligt vedhængende PBMC til kapillærer belagt med specifikke addressins eller med Fc Isotype kontrol (n = 6). (B) repræsentative billeder af dynamiske friktion i ICAM-1 belagt kapillærer perfunderet med ubehandlet (NT) PBMC eller cellerne inkuberes med 10 µg/mL anti-CD18 antistof eller 10 µg/mL IgG isotypen kontrol. Begyndelsen: Fusionerede tre første billeder af 3 min sekvens; Slutningen: Flettede sidste tre billeder af 3 min sekvens; vedhængende celler er afbildet hvid. Deres numre samt forskellen (dvs., nyligt vedhængende celler) er angivet. Skalalinjen = 100 µm. (C) virkningen af anti-integrin antistoffer (hver brugt i en koncentration på 10 µg/mL) på dynamisk vedhæftning. Venstre: Antal af nyligt vedhængende celler til kapillærer belagt med ICAM-1 og perfunderet med ubehandlet, anti-CD18-behandlet eller IgG isotypen kontrol-behandlede celler; Midten: Antal af nyligt vedhængende celler til kapillærer belagt med VCAM-1 og perfunderet med ubehandlet, behandlet med natalizumab eller IgG isotypen kontrol-behandlede celler; Højre: Antal af nyligt vedhængende celler til kapillærer belagt med MAdCAM-1 og perfunderet med ubehandlet, vedolizumab-behandlet eller IgG isotypen kontrol-behandlede celler (n = 5-6). Angiver middel med standard fejl af middelværdien (SEM). Statistiske test blev udført med en-vejs ANOVA efterfulgt af Newman-Keuls flere sammenligning test (* p < 0,05; ** p < 0,01). Modificeret med tilladelse fra reference23. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Chemokine-medieret dynamisk vedhæftning af menneskelige CD4+ T-celler til MAdCAM-1. Billeder fra en repræsentativ dynamiske friktion assay i MAdCAM-1-belagt kapillærer perfunderet med ubehandlet (NT) CD4+ T celler eller celler inkuberes med 10 ng/mL rhCXCL10 eller med 100 ng/mL rhCCL2. Begyndelsen: Fusionerede tre første billeder af 3 min sekvens; Slutningen: Flettede sidste tre billeder af 3 min sekvens; vedhængende celler er afbildet hvid. Deres numre samt forskellen (dvs., nyligt vedhængende celler) er angivet. Skalalinjen = 100 µm. Preincubation med kemokiner fører til øget dynamiske friktion, formentlig på grund af integrin-affinitet graduering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
SupplementaryVideos: film fra tre minutter billedsekvenser fra MAdCAM-1 belagt kapillærer perfunderet med fluorescently mærket PBMC. (A) kapillær perfunderet med ubehandlede celler. (B) kapillær perfunderet med celler behandles med 10 µg/mL vedolizumab. (C) kapillær perfunderet med celler behandles med 10 µg/mL humant IgG isotypen kontrol. Celle flow fra bund til top, nyligt vedhængende celler er markeret med hvide pile. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ovennævnte protokol beskriver en nyttig teknik til at studere dynamisk vedhæftning af menneskelige immunceller til endotel ligander. Gennem variation af de coatede ligander, perfunderet celletyper eller delgrupper, inkubation med yderligere stimuli eller forskellige neutraliserende antistoffer, det har næsten ubegrænset potentielle anvendelsesmuligheder. Sådanne dynamiske friktion assays kan derfor nyttigt at besvare begge grundlæggende spørgsmål af grundlæggende forskning samt translationel forespørgsler, der kan bidrage til at udvikle og optimere klinisk behandling med stoffer forstyrrer vedhæftning proces.
Nytten af analysen til at undersøge virkningerne af kliniske anti-friktion behandlingsformer er for nylig blevet påvist. Forskellige cellepopulationer udtrykker forskellige typer og mængder af integriner viser desuden, ensartede niveauer af dynamiske vedhæftning til de respektive addressins, støtte til gyldigheden af assay23.
På hele gennemførelsen af protokollen har brug for omkring 6 timer af arbejde og præsenterer mellemliggende tekniske udfordringer. Når overfladebehandling af kapillar har startet, er et kritisk spørgsmål at undgå dehydrering. Dette kræver nøjagtig forsegling under inkubation trin og omhyggelig håndtering af kapillærerne, når de udveksler løsninger. Desuden nødvendiggør indledningen af perfusion proces nogle forsigtighed. På grund af døde mængden af slangen er det ikke muligt at fylde hele slangen med den endelige perfusion strømningshastighed. På den anden side medfører ændrer strømningshastigheden efter skylning kapillær med høj hastighed risiko for flow afbrydelse fører til muligheden for statisk friktionskoefficient begrænse gyldighed med hensyn til dynamisk vedhæftning. En rettidig Skift til den endelige strømningshastighed er derfor afgørende. Den endelige strømningshastighed skal vælges afhængig af pumpe, slanger og kapillær størrelse anvendes. For at efterligne menneskelige blodgennemstrømningen i høj endotel venules som nøje som muligt, en mængde strøm af 0,1-5 anbefales mm/s24,25.
Vanskeligheden ved analysen kan markant øge, når ændringer anvendes. For eksempel kræver analyse af specifikke T celle subsets muligvis krævende polarisering eller rensning strategier26. Også, herunder tethering, rullende og celle aktivering12 homing trinene i eksperimentet vil stige yderligere besvær, da det kan blive nødvendigt at belægge en kombination af ligander til indersiden af kapillærer eller (forud) behandle den perfunderet celle befolkning med kemo- eller cytokiner redegøre for selectin-afhængige rullende og chemokine-induceret celle aktivering og integrin affinitet graduering27. Disse kan imidlertid være særdeles interessant spørgsmål for den fremtidige forskning, især som præsenteres teknikken tillader at funktionelt løse sådan en sofistikeret samspillet mellem forskellige molekyler med humane celler og ligander. Som nævnt ovenfor, kan konkurrencedygtige analyse dynamisk vedhæftning af flere forskelligt farvede cellepopulationer i samme kapillar tilføje en anden grad af kompleksitet. Derudover er det også blevet påvist, at endotelceller kan bruges i fluidic systemer i stedet for rekombinante ligander28.
Selv om det er en funktionel analyse, er teknikken begrænset af reduktion af komplekse i vivo netværk til et udvalgt sæt af involveret molekyler i vitro. Det betyder, at virkningerne af ukendt eller uventet yderligere faktorer kan være overset eller ikke tilstrækkeligt overvejet. Dette er imidlertid et hyppigt problem i menneskelige forskning, fordi etiske overvejelser ofte forbyde mekanistiske i vivo undersøgelser29.
Tilsammen præsenterer denne protokol en funktionel analyse til analyse af integrin-afhængige dynamisk vedhæftning og anti-integrin behandlingsformer i inflammatoriske tarmsygdomme. Mens det grundlæggende princip er ganske ligetil og ikke for vanskelige at udføre, det kan blive forskønnet og ændret i flere henseender og har potentiale til at besvare translationel spørgsmål vedrørende anti-friktion terapi i IBD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.F.N. har fungeret som rådgiver for Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda og Boehringer. M.F.N. og sz modtaget forskningsstøtte fra Takeda og Roche.
Acknowledgments
Forskning i KN, IA, MFN og SZ blev støttet af interdisciplinære Center for klinisk forskning (IZKF) og ELAN program af University Erlangen-Nürnberg, anden Kröner-Fresenius-Stiftung, Fritz-Bender-Stiftung, tysk Crohns og Colitis Foundation (DCCV), den kliniske forskning gruppe CEDER af tysk forskning Rådet (DFG), programmet DFG emne på mikrobiota, det nye felt initiativ og den DFG Collaborative Research Centre 643, 796 og 1181.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48-well plate | Sarstedt | 833,923 | |
| Adhesion buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2 | |||
| Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA | |||
| Bovine Serum albumin (BSA) | Applichem | A1391,0100 | |
| CaCl2 | Merck | 2382 | |
| Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0.20 mm x 2.00 mm ID, 50 mm length | CM Scientific | 3520-050 | |
| CCL-2, human | Immunotools | 11343384 | |
| CD4-Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFischer Scientific | C34554 | |
| Centrifuge (Rotixa 50 RS) | Hettrich | ||
| Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES | |||
| Confocal Microscope (TCS SP8) | Leica | ||
| CXCL-10, human | Immunotools | 11343884 | |
| Dextran 500 | Roth | 9219.3 | |
| EDTA KE/9 mL Monovette | Sarstedt | ||
| Falcons (50 mL) | Sarstedt | 62,547,004 | |
| Fc chimera isotype control | R&D Systems | 110-HG | |
| Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) | Baoding Shenchen Precision Pump Company | ||
| HEPES | VWR | J848-100ML | |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFischer Scientific | 31154 | |
| Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 720-IC-050 | |
| LS-Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MgCl2 | Roth | ||
| MnCl2 | Roth | ||
| mouse IgG isotype control | Miltenyi Biotec | 130-106-545 | |
| Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 6056-MC | |
| NaCl | Roth | 3957.3 | |
| Natalizumab | Biogen | ||
| Neubauer Counting chamber | Roth | T729.1 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-601000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182-10 | w/o Mg and Ca |
| Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) | VWR | 52858-000 | |
| purified anti-human CD18 | Biolegend | 302102 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco Life Technologies | 61870-010 | |
| Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02 mm ID, 406.4 mm length | Ismatec | SC0059 | |
| Serological Pipetts | Sarstedt | 861,254,025 | |
| Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
| Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera | Biolegend | 553706 | |
| Vedolizumab (Entyvio) | Takeda |
References
- von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-Cell Function and Migration - Two Sides of the Same Coin. New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).
- Zundler, S., et al. The α4β1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In Vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
- Binder, M. -T., et al. Similar inhibition of dynamic adhesion of lymphocytes from IBD patients to MAdCAM-1 by vedolizumab and etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. , in press (2018).
- Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 699-710 (2013).
- Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 711-721 (2013).
- Baumgart, D. C., Bokemeyer, B., Drabik, A., Stallmach, A., Schreiber, S. Vedolizumab Germany Consortium Vedolizumab induction therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice--a nationwide consecutive German cohort study. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 43 (10), 1090-1102 (2016).
- Kopylov, U., et al. Efficacy and Safety of Vedolizumab for Induction of Remission in Inflammatory Bowel Disease-the Israeli Real-World Experience. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 404-408 (2017).
- Amiot, A., et al. Effectiveness and Safety of Vedolizumab Induction Therapy for Patients With Inflammatory Bowel Disease. Clinical Gastroenterology and Hepatology: The Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association. 14 (11), 1593-1601 (2016).
- Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), London, England. 309-318 (2014).
- Vermeire, S., et al. Anti-MAdCAM antibody (PF-00547659) for ulcerative colitis (TURANDOT): a phase 2 randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 390 (10090), London, England. 135-144 (2017).
- Miller, D. H., et al. A Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis. New England Journal of Medicine. 348 (1), 15-23 (2003).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Ley, K., Rivera-Nieves, J., Sandborn, W. J., Shattil, S. Integrin-based therapeutics: biological basis, clinical use and new drugs. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (3), 173-183 (2016).
- Wyant, T., Yang, L., Fedyk, E. In vitro assessment of the effects of vedolizumab binding on peripheral blood lymphocytes. mAbs. 5 (6), 842-850 (2013).
- Fischer, A., et al. Differential effects of α4β7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Wyant, T., Estevam, J., Yang, L., Rosario, M. Development and validation of receptor occupancy pharmacodynamic assays used in the clinical development of the monoclonal antibody vedolizumab. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 90 (2), 168-176 (2016).
- Tidswell, M., et al. Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1. Journal of Immunology. 159 (3), Baltimore, Md. 1497-1505 (1997).
- Soler, D., Chapman, T., Yang, L. -L., Wyant, T., Egan, R., Fedyk, E. R. The Binding Specificity and Selective Antagonism of Vedolizumab, an Anti-α4β7 Integrin Therapeutic Antibody in Development for Inflammatory Bowel Diseases. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 330 (3), 864-875 (2009).
- Parikh, A., et al. Vedolizumab for the treatment of active ulcerative colitis: a randomized controlled phase 2 dose-ranging study. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (8), 1470-1479 (2012).
- Wendt, E., White, G. E., Ferry, H., Huhn, M., Greaves, D. R., Keshav, S. Glucocorticoids Suppress CCR9-Mediated Chemotaxis, Calcium Flux, and Adhesion to MAdCAM-1 in Human T Cells. The Journal of Immunology. 196 (9), 3910-3919 (2016).
- Nussbaum, C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes leukocyte rolling by mobilizing endothelial P-selectin. Nature Communications. 6, (2015).
- Pruenster, M., et al. Extracellular MRP8/14 is a regulator of β2 integrin-dependent neutrophil slow rolling and adhesion. Nature Communications. 6, (2015).
- Binder, M. -T., et al. Similar Inhibition of Dynamic Adhesion of Lymphocytes From IBD Patients to MAdCAM-1 by Vedolizumab and Etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (6), 1237-1250 (2018).
- Wang, L., et al. Vessel Sampling and Blood Flow Velocity Distribution With Vessel Diameter for Characterizing the Human Bulbar Conjunctival Microvasculature. Eye & Contact Lens. 42 (2), 135-140 (2016).
- House, S. D., Johnson, P. C. Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation. The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).
- Zundler, S., Neurath, M. F. Pathogenic T cell subsets in allergic and chronic inflammatory bowel disorders. Immunological Reviews. 278 (1), 263-276 (2017).
- Zundler, S., Becker, E., Weidinger, C., Siegmund, B. Anti-Adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease-Molecular and Clinical Aspects. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
- Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).
- Zundler, S., et al. Blockade of αEβ7 integrin suppresses accumulation of CD8(+) and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo. Gut. 66 (11), 1936-1948 (2017).
