Summary
Dinámica adhesión de células inmunes a la pared del vaso es un prerrequisito para autoguiado hacia el blanco gut. Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo funcional en vitro para el análisis del impacto de los anticuerpos anti-integrina, quimioquinas u otros factores de la adherencia de la célula dinámica de células humanas mediante capilares histórico cubierto.
Abstract
Gut autoguiado hacia el blanco de las células inmunes es importante para la patogenia de las enfermedades inflamatorias intestinales (EII). La adhesión celular dependiente de la integrina a addressins es un paso crucial en este proceso y estrategias terapéuticas interfiere con la adherencia se han establecido con éxito. Anticuerpo integrina α4β7 anti, vedolizumab, se utiliza para el tratamiento clínico de la enfermedad de Crohn (EC) y colitis ulcerosa (Cu) y otros compuestos son propensos a seguir.
Los detalles de la adhesión y los mecanismos de acción de los anticuerpos anti-integrina aún no están claros en muchos aspectos debido a las limitadas técnicas disponibles para la investigación funcional en este campo.
Aquí, presentamos un ensayo de adherencia dinámico para el análisis funcional de la adherencia de la célula humana bajo condiciones de flujo y el impacto de las terapias anti-integrina en el contexto de la EII. Se basa en la perfusión de las células primarias humanas a través de Capillares de vidrio ultrafina histórico cubierto con análisis microscópico en tiempo real. El ensayo ofrece una variedad de oportunidades de mejoras y modificaciones y tiene potencial para descubrimientos mecanicistas y aplicaciones traslacionales.
Introduction
Movimiento de la célula es un proceso estrechamente regulado indispensable para el desarrollo y función de organismos multicelulares, pero está también implicado en la patogenesia de una multitud de enfermedades1. Recientemente, el proceso de autodirección de las células inmunes de la sangre a los tejidos periféricos ha ganado cada vez más atención, ya que contribuye a la reposición y expansión de células patógenas en los tejidos inflamados en enfermedades inmunológico2 ,3. En particular, homing ha demostrado tener relevancia traslacional en las enfermedades inflamatorias intestinales (EII). La terapéutica anti-α4β7 integrina anticuerpo vedolizumab interferir con homing gut ha demostrado eficacia en ensayos clínicos grandes4,5 y se ha utilizado con éxito en la práctica clínica del mundo real6,7 , 8. compuestos adicionales están probables que siga9,10. Del mismo modo, el anticuerpo integrina de terapéutica anti-α4, natalizumab, se utiliza para el tratamiento de la esclerosis múltiple (EM)11.
Sin embargo, nuestro entendimiento funcional del proceso autoguiados hacia el blanco en general y el mecanismo de acción de estos anticuerpos terapéuticos en particular es todavía limitada. Está bien establecido que homing consiste en varios pasos, incluyendo la inmovilización de células y que rueda con adherencia posterior de la célula hacia la detención firme seguido por trans migración endotelial12,13. Los mencionados anticuerpos neutralizan las integrinas en la superficie celular impidiendo la interacción con addressins en el endotelio de la pared del vaso. Esto se piensa para impedir firme célula adherencia14,15. Sin embargo, sólo estamos empezando a comprender la relevancia diferencial de integrinas específicas para autoguiado hacia el blanco celular de subconjuntos distintos de la célula. Además, los efectos de los anticuerpos anti-integrina en diferentes subconjuntos de células y asociaciones de dosis-respuesta son en gran parte desconocidas a un montón de preguntas abiertas en el campo de terapias autoguiados hacia el blanco y la adherencia intestinal en la EII.
Por lo tanto, se necesitan desesperadamente herramientas prácticas para abordar estas cuestiones. El efecto de los anticuerpos anti-integrina en interacción integrina-histórico predominante hasta ahora ha sido evaluado mediante la evaluación de la inhibición de la eficacia/obligatorio vinculante con citometría de flujo o a través de la adherencia estática ensayos16,17 ,18,19,20, así con aparente simplificación y desviación de la situación fisiológica. Recientemente establecimos un ensayo de adherencia dinámica para estudiar la adhesión dependiente de integrinas de las células humanas a addressins y los efectos de los anticuerpos anti-integrina bajo tensión de esquileo2. El principio de la técnica anterior se ha demostrado con células de ratón21,22. Aquí, fue adaptado y desarrollado para responder las preguntas mencionadas traslacionales, apertura nuevas avenidas para mejor comprender los mecanismos de la terapia con anticuerpos anti-integrina en vivo.
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Protocol
Los estudios descritos en las secciones siguientes se han realizado según aprobación de la Comisión de ética de la Universidad Friedrich-Alexander Erlangen-Nuremberg.
1. preparación de capilares
- Conectar tubos capilares rectangulares para el tubo de goma estirando el tubo por un lado con unas tijeras pequeñas y cuidadosamente insertar el capilar (aproximadamente 0,5 cm) en el tubo. Sellar la conexión entre tubo y tubo con película de plástico de la parafina.
- Capa del tubo capilar con 20 μl de la solución de control de isotipo correspondiente utilizando una pipeta de p20 o histórico (recombinante Fc quimera; histórico, por ejemplo, MAdCAM-1, en tampón de recubrimiento (NaCl 150 mM + 1 mM HEPES) de 5 μg/mL) (líquido empapará sí mismo en el capilar). Luego, sellar el lado no conectado a la tubería con la película de parafina plástica e incubar durante al menos 1 h a 37 ° C. Utilizar un capilar llenado sólo con el tampón de recubrimiento o con el control de isotipo correspondiente como control negativo.
- Quitar la película de parafina plástica desde la punta del tubo capilar, vaciar la capa dejando el remojo líquido fuera del capilar sobre un papel toalla y bloquear los capilares durante al menos 1 hora con 20 μl de bloquear la solución (1 x PBS con 5% BSA) a 37 ° C. Sellar el lado abierto del tubo capilar con película de plástico de la parafina. No retire la solución de bloqueo antes de proceder a la microscopía.
2. célula de aislamiento, tratamiento y preparación para microscopía
Nota: Estos pasos pueden realizarse durante la incubación períodos necesarios para la preparación capilares.
- Recoge 18 mL de sangre completa anticoagulada con una colección de sangre aséptica de la vena cubital del voluntariado de las personas (p. ej., pacientes de EII o controles sanos) después de consentimiento informado conforme a las normas del local Comité de ética.
Nota: Este paso debe realizarse sólo por personal médico entrenado y experimentado según regulaciones nacionales o locales. - Llenar la sangre en un tubo de 50 mL y diluir a un volumen de 35 mL con PBS 1 x. Luego la arpillera de la mezcla de sangre-PBS con 10 mL de medio de gradiente de densidad.
- Realizar la centrifugación gradiente de densidad por 15 min a 800 x g y 24 ° C sin freno para separar las células.
- Recoger las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) aspirando la capa de célula blanca de la derecha en la parte superior de la capa media gradiente de densidad (capa clara media). Transferencia de PBMCs en un nuevo tubo 50 mL, completar hasta 50 mL 1 x PBS y centrifugar 10 min a 300 x g y 10 ° C.
- Eliminar el sobrenadante, Resuspender el precipitado de células en 10 mL de 1 x PBS y posteriormente contar el número de células, por ejemplo, utilizando una celda de Neubauer recuento de cámara.
- Opcional: Para estudiar la adherencia de los granulocitos realice el siguiente procedimiento. De lo contrario, continúe con el paso 2.7 o 2.8.
- Reunir la granulocitos capa (más después de la centrifugación de gradiente de densidad que también contiene los eritrocitos). Resuspender las células en 40 mL de PBS 1 x. Luego añada 8 mL de 6% dextrán en PBS 1 x, mezcle suavemente y deje sedimento células durante 30 min a temperatura ambiente.
Nota: Los eritrocitos se hundirán hasta el fondo del tubo, mientras que los granulocitos permanecerá en suspensión. - Después de 30 minutos, recoger el sobrenadante, transferir a un tubo de fresca 50 mL y centrifugar durante 6 min a 300 x g a 4 ° C. Deseche el sobrenadante y lisar los eritrocitos restantes añadiendo 5 mL de 0.2% NaCl en el ddH2O. Incubar durante 1 minuto.
- Añadir 5 mL de 1,4% NaCl en ddH2O e incube durante otro minuto. Detener la lisis hipotónica añadiendo 20 mL de 1 x PBS y centrifugar durante 6 min a 300 x g a 4 ° C.
- Resuspender el precipitado de células en 10 mL de 1 x PBS. Entonces, contar números de celular mediante el uso de una celda de Neubauer recuento de cámara.
- Reunir la granulocitos capa (más después de la centrifugación de gradiente de densidad que también contiene los eritrocitos). Resuspender las células en 40 mL de PBS 1 x. Luego añada 8 mL de 6% dextrán en PBS 1 x, mezcle suavemente y deje sedimento células durante 30 min a temperatura ambiente.
- Opcional: Para estudiar la adhesión de subconjuntos PBMC, purifica los diferentes tipos de células o subconjuntos (por ejemplo, CD4+ y CD8+ T células o CD19+ B células) usando microesferas según protocolo del fabricante o por fluorescencia activada la célula clasificación (FACS). De lo contrario, continúe con el paso de 2.8.
- Centrifugar la suspensión celular por 10 min a 300 x g y 10 ° C. Deseche el sobrenadante y las células con la célula de seguimiento de tinte (por ejemplo, CFSE) según las instrucciones del fabricante de la mancha.
- Posteriormente, centrifugar las células durante 10 min a 300 x gy descartar el sobrenadante. Resuspender en 1 x PBS, determinar el número de células y centrifugar nuevamente por 10 minutos a 300 x g.
- Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado de células teñidas en la cantidad adecuada de amortiguación de adherencia (NaCl 150 mM + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) para obtener una suspensión de 1.5 x 106 células/mL. Luego, añada la cantidad apropiada de MnCl2 para obtener una concentración final de 1 mM de 100 mM.
Nota: Estas células están ahora listas para microscopía. - Opcional: Tratar las células con citoquinas, neutralización de anticuerpos u otros compuestos. De lo contrario, continúe con el paso 3.
- Omita paso 2.10 y resuspender el precipitado de células teñidas de paso 2.9 en Medio RPMI (con 10% FBS y 1% penicilina/estreptomicina) para obtener una concentración de 1.5 x 106 células/mL.
- Tomar con pipeta 1 mL de esta suspensión celular en tantos pocillos de una placa de 48 pozos existen condiciones para ser analizados. Siempre preparar bien con las células no tratadas para ser perfundidos a través de un tubo capilar sin recubrimiento como control negativo y un pozo con las células no tratadas para ser perfundidos a través de un tubo capilar recubierto de histórico como control positivo.
- Para el tratamiento con anticuerpos anti-integrina, añadir la cantidad adecuada de anticuerpos (p. ej., 10 μg/mL vedolizumab) a la suspensión de células. Incubar durante 1 h a 37 ° C. Para el tratamiento con citoquinas, añadir la cantidad apropiada de citoquinas recombinantes (por ejemplo, 10 ng/mL CXCL10) a la suspensión de células. Incubar por 5 min a 37 ° C.
- Después de la incubación, cosechar células resuspender las células varias veces utilizando una pipeta p1000. Transferencia de células en un tubo de 2 mL, enjuagar bien otra vez con 1 mL de PBS 1 x y agregar al tubo 2 mL. Determinar el número de celular.
Nota: Incubación de poblaciones de células adherentes (por ejemplo, monocitos) podría requerir medidas adicionales (por ej., tratamiento con tripsina) para separar las células de la placa.
- Células de centrifugar 10 min a 300 x g a 10 ° C. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en la cantidad adecuada de amortiguación de adherencia para obtener una suspensión de 1.5 x 106 células/mL. Luego, añada la cantidad apropiada de MnCl2 para obtener una concentración final de 1 mM de 100 mM. Cuando el pretratamiento con quimiocinas no agregue MnCl2 a la suspensión de células. Estas células están ahora preparadas para microscopía.
Nota: El volumen mínimo utilizado para el análisis depende de la bomba y la tubería utilizada. En este estudio, utilizando la bomba peristáltica y la tubería especificado en la Tabla de materiales, se requiere un volumen mínimo de 400 μl. Si deseado y aplicables (dependiendo del tipo de la célula y producción), se puede aumentar la concentración de células en la suspensión para medir adherencia mayor en un período corto de tiempo. - Potencial modificación: ensayo de adhesión dinámica competitiva
- Realice los pasos mencionados con diferentes poblaciones celulares para ser comparado con otros (por ejemplo, reglamentación y células efectoras T aisladas mediante aislamiento de grano magnético siguiendo las instrucciones del fabricante según paso 2.7).
- La mancha cada población con un tinte diferente (por ejemplo, CFSE y FarRed) como se describe en pasos 2.8-2.9 para ser capaces de diferenciar poblaciones celulares en microscopia.
- Desechar el sobrenadante y resuspender los pellets de células teñidas en la cantidad adecuada de amortiguación de adherencia (150 mM NaCl 1 mM HEPES 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) para obtener una suspensión de 1.5 x 106 células/mL.
- Mezclar volúmenes iguales de las suspensiones de la célula (por ejemplo, 500 μl de células de T reguladoras) y 500 μl de células efectoras T obtener un final mezcla concentración celular de 1.5 x 106 células/mL. Luego, añada la cantidad apropiada de MnCl2 para obtener una concentración final de 1 mM de 100 mM. Tales suspensiones pueden utilizarse posteriormente para el análisis de la competencia del proceso de adhesión por perfundiendo diferentes poblaciones celulares a través de los capilares mismo.
3. proyección de imagen de células de adhesión dinámico en vivo
- Encienda el microscopio y seleccione el filtro apropiado o con láser para excitar a la célula de seguimiento de dye(s) (p. ej., 488 nm láser de CFSE), un objetivo apropiado (por ejemplo, 40 X) y una adquisición modo propicio tiempo lapso la proyección de imagen.
- Retire la película de parafina plástico de la punta del tubo capilar y conecte el tubo capilar con un pedazo corto de tubería (aproximadamente 5 cm de longitud) por estirar el tubo por un lado con pequeñas tijeras y con cuidado introducir el capilar (aproximadamente 0,5 cm) en el tubo. Sellar la conexión entre el capilar y el tubo con la película plástica de la parafina.
- Monte el tubo capilar en una bandeja de fijación (por ejemplo, la tapa de una placa de 6 pozos con un recorte rectangular ligeramente más corto que la longitud del tubo capilar) y colocar el capilar fijo en el soporte de la bandeja del microscopio, para que el capilar está en foco y listo para microscopía.
- Inserte el tubo de goma en la ranura correspondiente de la bomba peristáltica y coloque el extremo no conectado al tubo capilar al tubo de muestra según que contiene la suspensión de células. Inserte el tubo corto al otro lado del tubo capilar en un tubo de 15 mL para recoger a través de flujo.
- Dejar el relleno de la tubería con un caudal de 500 microlitros por minuto hasta que la suspensión de células casi llega a los capilares. Que el relleno capilar con un caudal de 100 μl/min.
Nota: Un rápido llenado del tubo capilar garantiza una distribución regular de la suspensión de células dentro del tubo capilar. - Cuando el tubo capilar se llena con la suspensión de células, ajustar flujo a 10 μl/min.
Nota: Estas tasas de flujo pueden variar cuando se utilizan tubos capilares de diferente tamaño o diferentes bombas peristálticas. En este estudio, la tasa de flujo de 10 μl/min se ha optimizado para que la bomba y tubos capilares para imitar el flujo de sangre en vivo . - Capturar imágenes de Time-lapse de las células moviéndose lentamente a través de los capilares a lo largo del histórico cubierto dentro de la pared cada 2 s durante un total de 3 minutos.
Nota: Intervalos y el tiempo total pueden variar dependiendo del tipo celular y pregunta a tratarse. - Antes de descartar el tubo capilar, de la pantalla el capilar todo a través del ocular del microscopio para asegurarse de que la sección que se muestra en el video es representante. Si es necesario, hacer una segunda grabación.
- Libre de la tubería de la bomba y deje que el líquido restante correr hacia atrás en el tubo de 2 mL, luego desconecte el tubo capilar y los tubos de la bandeja de fijación y continúe con el siguiente tubo capilar.
4. evaluación y recuento celular
- Abra la secuencia Time-lapse con software apropiado y exportar las primeras tres imágenes ("principio") y las tres últimas imágenes ("End") como archivos Tiff.
- Abrir las tres imágenes de "Principio" en ImageJ, convertir a 32 bits ('imagen | Tipo | 32 bits ') y fotos (' imagen | Color | Combinar canales; asignar los colores rojos, verdes y azules a las imágenes diferentes). Convertir imagen en RGB (' imagen | Type-RGB') y guardarlo como archivo Tiff. Repita con las imágenes de "Fin".
Nota: En los ensayos de adhesión dinámica competitiva con células teñidas con diferentes colores, primero dividir los canales de las imágenes para analizar la adhesión de las diferentes poblaciones celulares por separado. - Contar las células blancas visibles en la imagen compuesta de "Inicio" y "Final" y restar el número de células blancas en el "principio" de las células blanco en el "fin".
Nota: La diferencia representa el número de recién adheridas las células en el intervalo de tiempo de 3 minutos. En la imagen compuesta, las células que son visibles en el color específico que fue asignado a la respectiva estructura ya que localiza en otro lugar en el marco anterior y siguiente. Para células adherentes, las señales rojas, verdes y azules en la misma superposición punto blanco. - Para visualizar mejor los resultados, compilar un vídeo de las secuencias de lapso de tiempo, por ejemplo, utilizar ImageJ.
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Representative Results
El método presentado en este manuscrito pretende simular el proceso en vivo de adhesión de células humanas a la pared endotelial lo más cerca posible a funcionalmente evaluar adhesión celular y el papel de los anticuerpos que interfieren. Por lo tanto, capilares ultrafinos son recubiertos con addressins y perfundidos con fluorescencia etiquetadas células humanas de interés utilizando una bomba de perfusión. Utilizando células vivas, la adhesión de las células humanas a la addressins la proyección de imagen se puede observar en tiempo real (figura 1).
Este método es particularmente adecuado para dilucidar los mecanismos de las terapias anti-adherencia en la EII. Como se muestra en la figura 2A, la perfusión de los capilares con ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1 y Isotype Fc quimera con PBMCs humanos conduce a adherencia marcada, cuando uno de los tres addressins está presente. En cambio, la adhesión a los capilares recubiertos de isotipo es mínima. Inhibición de la interacción integrina-histórico mediante anticuerpos neutralizantes por lo general conduce a una disminución marcada de adhesión dinámico que está ausente, cuando anticuerpos control de isotipo se agregan (representativo ilustrado en figura 2B, agrupados datos cuantitativos en figura 2).
Del mismo modo, se puede investigar el impacto de quimiocinas en la modulación de la afinidad de la integrina en este sistema por preincubación con tales péptidos in vitro. Como se muestra por datos representativos en la figura 3, tratamiento de CD4+ las células de T humanas con CCL2 o CXCL10 conduce a mayor adhesión MAdCAM-1 en comparación con las células humanas no tratadas.
Figura 1: representación esquemática del flujo de trabajo. Preparación de histórico recubrimiento ultrafinos capilares y fluorescencia etiquetadas células humanas (izquierda) seguido de perfusión de las células a través del tubo capilar usando una bomba peristáltica (medio) y Time-lapse microscopia (derecha). Modificado con permiso de la referencia23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: dinámica adhesión de periférico humano la sangre las células mononucleares (PBMCs) de donantes del control a addressins diferentes. (A) número de adherirse recientemente PBMCs a tubos capilares recubiertos con addressins específicos o con control de isotipo de Fc (n = 6). (B) imágenes representativas de adhesión dinámico en tubos capilares de ICAM-1 cubierta inundada con PBMCs (NT) no tratadas o las células se incubaron con 10 μg/mL de anticuerpo anti-CD18 o 10 μg/mL de IgG control de isotipo. Principio: Se fusionaron tres primeras imágenes de la secuencia de 3 minutos; Final: Combina tres imágenes de la secuencia de 3 minutos; las células adherentes son representadas blanco. Se indica sus números, así como la diferencia (es decir, las células recién adherido). Barra de escala = 100 μm. (C) impacto de los anticuerpos anti-integrina (cada uno se utiliza en una concentración de 10 μg/mL) sobre adhesión dinámico. Izquierda: Número de nuevos células adherentes a tubos capilares recubiertos con ICAM-1 y perfundidos con no tratados, tratados con anti-CD18 o IgG células tratadas con control de isotipo; Medio: Número de nuevos células adherentes a tubos capilares recubiertos con VCAM-1 y perfundidos con no tratados, tratados con natalizumab o IgG células tratadas con control de isotipo; Derecha: Número de nuevos células adherentes a tubos capilares recubiertos con MAdCAM-1 y perfundidos con no tratados, tratados con vedolizumab o células tratadas con control de isotipo de IgG (n = 5-6). Las barras indican los medios con el error estándar de la media (SEM). Prueba estadística se realizó con ANOVA de una vía seguido de prueba de comparación múltiple de Newman-Keuls (* p < 0.05; ** p < 0.01). Modificado con permiso de la referencia23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Chemokine medió adhesión dinámico de CD4 humano+ T células MAdCAM-1. Imágenes de una adhesión dinámica representante ensayo en tubos capilares MAdCAM-1-cubierta inundados con no tratados (NT) CD4+ T células o células incuban con 10 ng/mL rhCXCL10 o con 100 ng/mL rhCCL2. Principio: Se fusionaron tres primeras imágenes de la secuencia de 3 minutos; Final: Combina tres imágenes de la secuencia de 3 minutos; las células adherentes son representadas blanco. Se indica sus números, así como la diferencia (es decir, las células recién adherido). Barra de escala = 100 μm. preincubación con quimiocinas conduce a mayor adherencia dinámica, probablemente debido a la modulación de la afinidad de la integrina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
SupplementaryVideos: películas de tres minutos de secuencias de imágenes de MAdCAM-1 recubrimiento capilares perfundidos con fluorescencia etiquetadas PBMCs. (A) capilares perfundidos con las células no tratadas. (B) capilares perfundidos con las células tratan con 10 μg/mL vedolizumab. (C) capilares perfundidos con las células tratan con 10 μg/mL IgG isotipo control humano. La célula de flujo de abajo hacia arriba, nuevamente las células adherentes están indicadas por flechas blancas. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El protocolo de arriba describe una técnica útil para estudiar la dinámica adhesión de células inmunes humanas a ligandos endoteliales. A través de la variación de los ligandos revestidos, tipos de la célula inundada o subconjuntos, incubación con estímulos adicionales o diferentes anticuerpos neutralizantes, tiene casi ilimitadas aplicaciones potenciales. Por lo tanto, estos ensayos de adhesión dinámica pueden ser útiles para responder a dos preguntas fundamentales de investigación básica y traslacionales consultas que podrían ayudar a desarrollar y optimizar la terapia clínica con las drogas que interfiere con el proceso de adhesión.
Recientemente se ha demostrado la utilidad de la prueba para investigar los efectos de tratamientos clínicos de anti-adherencia. Por otra parte, diferentes poblaciones celulares expresan diferentes tipos y cantidades de las integrinas muestran niveles constantes de adhesión dinámico a los respectivos addressins, apoyando la validez del ensayo23.
En general, la realización del protocolo necesita cerca de 6 horas de trabajo y presenta desafíos técnicos intermedios. Una vez comenzado el recubrimiento del tubo capilar, es una cuestión crítica para evitar la deshidratación. Esto requiere sellado precisa durante los pasos de incubación y manejo cuidadoso de los capilares, cuando el intercambio de soluciones. Además, la iniciación del proceso de perfusión requiere cierta precaución. Debido al volumen muerto de la tubería, no es factible para llenar el tubo entero con la tasa de flujo de final de la perfusión. Por otro lado, cambiando la velocidad de flujo después del lavado capilar con alta velocidad conlleva el riesgo de interrupción de flujo conduce a la posibilidad de adherencia estática limitación de la validez en cuanto a adherencia dinámica. Por lo tanto, un interruptor de tiempo para el caudal final es esencial. La tasa de flujo final debe elegirse depende del tamaño de la bomba, la tubería y el tubo capilar utilizado. Para imitar el flujo de la sangre humana en los altos venules endoteliales como cerca como posible, un caudal de 0.1 a 5 mm/s se recomienda24,25.
La dificultad del análisis puede aumentar notablemente, cuando se aplican modificaciones. Por ejemplo, análisis de subconjuntos de células T específicas puede ser necesario exigir estrategias de polarización o purificación26. También, incluyendo los pasos recalados de tethering, balanceo y célula activación12 en el experimento aumentará aún más la dificultad, ya que puede que sea necesario cubrir una combinación de ligandos en el interior de los capilares o (pre-tratamiento) el inundada la población celular con quimioterapia o con citocinas para tener en cuenta para el balanceo de la selectina-dependiente y celular inducida por chemokine activación y integrin afinidad modulación27. Sin embargo, podrían ser particularmente interesantes preguntas para investigaciones futuras, especialmente como la técnica presentada permite tratar funcionalmente una interacción tan sofisticada de diferentes moléculas con células humanas y ligandos. Como se mencionó anteriormente, adhesión dinámico competitivo análisis de varias poblaciones de células diferentemente teñidos en el mismo capilar puede añadir otro nivel de complejidad. Por otra parte, también se ha demostrado que las células endoteliales pueden utilizarse en sistemas fluídicos en vez de ligandos recombinante28.
Aunque es un análisis funcional, la técnica está limitada por la reducción de redes complejas en vivo a un conjunto seleccionado de las moléculas involucradas en vitro. Esto significa que los efectos de otros factores desconocidos o inesperados podrían pasarse por alto o no suficientemente considerados. Sin embargo, se trata de un problema frecuente en la investigación humana, debido a consideraciones éticas prohíben a menudo mecanicista en vivo investigaciones29.
Tomados en conjunto, este protocolo presenta un análisis funcional para el análisis de terapias de adherencia y anti-integrina dinámicos dependiente de la integrina en enfermedades inflamatorias del intestino. Mientras que el principio básico es bastante sencillo y no demasiado difícil de realizar, puede ser embellecido y modificado en varios saludos y tiene el potencial para responder a preguntas de traslación con respecto a la terapia anti-adherencia en la EII.
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Disclosures
N.M.F. ha servido como asesor para Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda y Boehringer. N.M.F. y S.Z. recibieron apoyo a la investigación de Takeda y Roche.
Acknowledgments
La investigación de CN, IA, SZ y NMF fue apoyada por el centro interdisciplinario de investigación clínica (IZKF) y el programa ELAN de la Universidad de Erlangen-Nuremberg, Else Kröner-Fresenius-Stiftung, la Fritz-Bender-Stiftung, de Crohn alemán y Colitis Foundation (DCCV), la investigación clínica grupo CEDER el Consejo alemán de investigaciones (DFG), el programa de tema DFG en la Microbiota, la iniciativa de campo emergente y la DFG colaboración investigación centros 643, 796 y 1181.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48-well plate | Sarstedt | 833,923 | |
| Adhesion buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2 | |||
| Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA | |||
| Bovine Serum albumin (BSA) | Applichem | A1391,0100 | |
| CaCl2 | Merck | 2382 | |
| Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0.20 mm x 2.00 mm ID, 50 mm length | CM Scientific | 3520-050 | |
| CCL-2, human | Immunotools | 11343384 | |
| CD4-Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFischer Scientific | C34554 | |
| Centrifuge (Rotixa 50 RS) | Hettrich | ||
| Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES | |||
| Confocal Microscope (TCS SP8) | Leica | ||
| CXCL-10, human | Immunotools | 11343884 | |
| Dextran 500 | Roth | 9219.3 | |
| EDTA KE/9 mL Monovette | Sarstedt | ||
| Falcons (50 mL) | Sarstedt | 62,547,004 | |
| Fc chimera isotype control | R&D Systems | 110-HG | |
| Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) | Baoding Shenchen Precision Pump Company | ||
| HEPES | VWR | J848-100ML | |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFischer Scientific | 31154 | |
| Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 720-IC-050 | |
| LS-Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MgCl2 | Roth | ||
| MnCl2 | Roth | ||
| mouse IgG isotype control | Miltenyi Biotec | 130-106-545 | |
| Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 6056-MC | |
| NaCl | Roth | 3957.3 | |
| Natalizumab | Biogen | ||
| Neubauer Counting chamber | Roth | T729.1 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-601000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182-10 | w/o Mg and Ca |
| Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) | VWR | 52858-000 | |
| purified anti-human CD18 | Biolegend | 302102 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco Life Technologies | 61870-010 | |
| Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02 mm ID, 406.4 mm length | Ismatec | SC0059 | |
| Serological Pipetts | Sarstedt | 861,254,025 | |
| Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
| Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera | Biolegend | 553706 | |
| Vedolizumab (Entyvio) | Takeda |
References
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