Summary
Descriviamo un metodo per progettare un tessuto retinico composto di cellule epiteliali del pigmento retinico derivate da cellule staminali pluripotenti umane coltivate in cima membrane amniotiche umane e la sua preparazione per l'innesto in modelli animali.
Abstract
Diverse condizioni patologiche dell'occhio influenzano la funzionalità e/o la sopravvivenza dell'epitelio retinico del pigmento (RPE). Questi includono alcune forme di retinite pigmentosa (RP) e degenerazione maculare senile (AMD). Terapia cellulare è una delle più promettenti strategie terapeutiche proposte per curare queste malattie, con già incoraggianti risultati preliminari in esseri umani. Tuttavia, il metodo di preparazione dell'innesto ha un impatto significativo su suoi esiti funzionali in vivo. Infatti, le cellule RPE innestate come una sospensione cellulare sono meno funzionale le stesse cellule trapiantate come un tessuto retinico. Qui, descriviamo un metodo semplice e riproducibile per ingegnere RPE tessuto e la sua preparazione per un impianto in vivo . Cellule RPE derivate da cellule staminali pluripotenti umane sono seminate su un supporto biologico, la membrana amniotica umana (prosciutto). Rispetto ai ponteggi artificiale, questo supporto ha il vantaggio di avere una membrana dello scantinato che è vicino alla membrana di Bruch cui cellule RPE endogene sono fissate. Tuttavia, la sua manipolazione non è facile, e abbiamo sviluppato diverse strategie per la sua corretta coltivazione e preparazione per l'innesto in vivo.
Introduction
RPE è cruciale per la sopravvivenza e l'omeostasi dei fotorecettori con cui è strettamente associato1. Diverse condizioni patologiche alterano la funzionalità e/o sopravvivenza, comprese la RP e AMD.
RP è un gruppo di mutazioni monogeniche ereditarie che colpiscono le funzioni di fotorecettori, cellule RPE o entrambi di2,3. Si stima che le mutazioni che interessano specificamente RPE cellule rappresentano il 5% di RP2. AMD è un'altra condizione dove lo strato RPE è alterato, leader perdita di visione in definitiva a centrale. AMD è causato da complesse interazioni di fattori genetici e ambientali e colpisce gli anziani4,5,6. Secondo le proiezioni, AMD sarà una preoccupazione per 196 milioni di pazienti nel mondo da 20207. Per questi disturbi, non esiste alcuna cura efficace, e una delle strategie proposte è il trapianto di nuove cellule RPE per compensare i morti/non funzionale preesistente di cellule RPE8.
La modalità di formulazione del prodotto finale per essere innestato è essenziale per garantire i migliori risultati funzionali. Le cellule RPE iniettate come una sospensione cellulare, pur essendo un metodo di consegna, facile e semplice sollevano preoccupazioni per quanto riguarda la loro sopravvivenza, integrazione e funzionalità9,10,11,12 , 13. gli scienziati ora stanno sviluppando più complesse formulazioni di consegnare ingegnerizzato tessuto retinico9,13,14,15,16. In questo contesto, abbiamo sviluppato un metodo originale per generare in vitro tessuto RPE che poteva essere utilizzato per il trapianto9.
Banche di cellule RPE derivate da cellule staminali embrionali umane (ES) sono utilizzate nel presente protocollo. Comunque, alternativa RPE cellula banche da fonti differenti delle cellule (cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo, cellule RPE primarie, ecc.) e differenziato con un metodo diverso sono adatti anche per questo protocollo. Esso comprende differenziazione diretto protocolli mediante citochine e/o piccole molecole17,18,19,20,21,22.
Per essere trapiantati, il tessuto ingegnerizzato dovrebbe essere preparato su un ponteggio. Negli ultimi anni, diversi ponteggi sono stati sviluppati basandosi su un polimero o su una matrice di origine biologica13,23,24. Qui, il substrato biologico utilizzato è il prosciutto, ma altri substrati, come membrane Bruch denudate, potrebbero essere attuate. Il metodo qui descritto ha il vantaggio di usando un'impalcatura biologica che è più rilevante per l'ambiente nativo di RPE.
Cellule RPE di derivati da cellule ES umane sono coltivate per almeno 4 settimane al fine di essere completamente organizzato come un monostrato di ciottoli. In tale fase, l'epitelio ottenuta è funzionale e polarizzato9. Infine, come questo tessuto rughe facilmente, è incorporato in uno strato sottile di un vettore di idrogel per dargli più rigidità ed elasticità e per proteggerlo durante la procedura di iniezione. Questo prodotto è quindi conservato a 4 ° C fino ad innesto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutto il materiale umano utilizzato in questo protocollo sono stato utilizzato in conformità con i regolamenti dell'Unione europea. La linea cellulare umana di ES utilizzata in questo studio è stata derivata da un unico embrione. La coppia che aveva donato l'embrione è stato pienamente informata e hanno dato il loro consenso per una donazione anonima. Una linea cellulare di uso clinico umana ES è stata derivata da questo embrione, incassata, qualificata e adeguatamente documentata da Roslin cellule (UK). Prosciutti sono ottenuti in condizioni di sterilità durante un taglio cesareo in madri che hanno firmato un consenso informato per la donazione di placenta secondo le linee guida di ospedale (APHP, Hôpital Saint Louis).
1. preparazione di terreni di coltura e reagenti
-
Preparazione del terreno di coltura delle cellule RPE
- Per preparare il terreno di coltura delle cellule RPE, aggiungere 4% siero sostituto (20 mL per un volume finale di 500 mL), 1.000 x diluito 2-mercaptoetanolo (500 µ l per un volume finale di 500 mL) e soluzione di 1% Eagle′s mezzo minimo essenziale (MEM) gli aminoacidi non essenziali (5 mL per un finale volume di 500 mL) di (DMEM) medio alto glucosio dell'Aquila di Dulbecco modificato (475 mL per un volume finale di 500 mL).
-
Preparazione del mezzo di trasporto/conservazione
- Per preparare il mezzo di trasporto/conservazione, aggiungere 1% di penicillina-streptomicina (5 mL per un volume finale di 500 mL) di CO2-mezzo indipendente (495 mL per un volume finale di 500 mL) e tenerlo a 4 ° C.
-
Risospensione dell'enzima termolisina
- Preparazione di una soluzione madre di termolisina
- Per preparare una soluzione stock di termolisina, scongelare la polvere di termolisina, che è stata conservata a-20 ° C, a temperatura ambiente.
- Come l'attività enzimatica può essere variabile da lotto a lotto, calcolare questa attività basata sul certificato di analisi fornito con la polvere di termolisina del batch da utilizzare. Dividere le "attività della proteasi neutra calcolato = ANPC" (indicato nel certificato di analisi) di 181 (che è il peso molecolare di tirosina). Il risultato ottenuto corrisponde all'attività enzimatica totale della dotazione termolisina polvere (U/fiala).
- Preparare una soluzione di riserva a 200 U/mL aggiungendo il volume d'acqua corrisponde all'attività enzimatica totale (U/fiala) diviso per 200 (U/mL).
- Sciogliere l'enzima pipettando l'acqua che è stato aggiunto su e giù. Vortice la soluzione per 30 s e verificare se la polvere completamente è stato sospeso. Pipettaggio più può essere richiesto per una completa dissoluzione.
- Aliquota della soluzione di riserva e conservare a-20 ° C.
- Preparazione di una soluzione di lavoro di termolisina
Nota: La soluzione di termolisina deve essere preparata il giorno del trattamento prosciutto.- Scongelare le aliquote stock di termolisina a 200 U/mL conservati a-20 ° C. Diluire la soluzione madre di 200x in tampone fosfato salino (PBS) al fine di ottenere un'attività enzimatica finale di 1 U/mL. Preparare 40 mL per trattare le patch di prosciutto 1 – 4.
- Filtrare la soluzione di termolisina attraverso un prima del filtro di 0,2 µm di utilizzare.
- Preparazione di una soluzione madre di termolisina
-
Risospensione di gelatina
- Preparazione della soluzione di gelatina di 20% e blocco
Nota: Il 20% di soluzione di gelatina e il blocco può essere preparati fino a 1 settimana prima dell'uso.- Scaldare la CO2-mezzo indipendente a 42 ° C a bagnomaria per 30 min (fino a 1 h). In una provetta da 50 mL, aggiungere 10 g di gelatina a 40 mL di riscaldato CO2-mezzo indipendente e vortice la soluzione.
- Sciogliere la gelatina per 30 – 60 min a 42 ° C. Vortice ogni 10 min per omogeneizzare la soluzione.
- Una volta che la soluzione è omogenea, aggiungere 4 mL di soluzione 20% gelatina a quattro piastre di coltura di 6 cm. Evitare le bolle. Aggiungere una pellicola di plastica paraffina per proteggere i piatti e lasciare che la soluzione a solidificare a 4 ° C.
- Preparazione della soluzione di gelatina di 8%
Nota: La soluzione di gelatina 8% può essere preparata il giorno prima dell'uso e conservata a 4 ° C.- Scaldare la CO2-mezzo indipendente a 42 ° C per 30 min (fino a 1 h). In una provetta da 50 mL, aggiungere 4 g di gelatina di 46 mL di riscaldato CO2-mezzo indipendente e vortice la soluzione.
- Sciogliere la gelatina per 30 – 60 min a 42 ° C. Aggiungere un film di plastica paraffina per proteggere il tubo e tenerlo a bagno d'acqua a 37 ° C se deve essere utilizzato lo stesso giorno, o conservarlo a 4 ° C se deve essere usato più tardi.
- Preparazione della soluzione di gelatina di 20% e blocco
2. termolisina trattamento delle membrane amniotiche umane
-
Lavare la membrana amniotica umana
- Sono prosciutti forniti come piccoli pezzi (circa 30 mm x 30 mm) fissati in un'impalcatura di nylon, sia già a 4 ° C in PBS o congelati. Se forniti congelati, scongelare le membrane a 37 ° C in un incubatore per 30 min.
- Lavare le membrane:
- Posto 1 – 4 membrane in un flacone da 250 mL contenente 80 mL di PBS. Utilizzare come molte bottiglie come richiesto.
- Agitare ogni bottiglia in un agitatore per piastre ad alta velocità per 5 min, poi scarta il PBS. Aggiungere 80 mL di PBS e ripetere.
-
Trattamento di termolisina
- Aggiungere 40 mL di soluzione di lavoro di termolisina (1 U/mL) al flacone contenente le membrane (1 – 4 membrane per bottiglie; fino a 3 bottiglie alla volta).
- Agitare le bottiglie per 5 min a 450 giri/min e poi vortice li per 30 s. Ripetere 1 x.
- Scartare la soluzione di termolisina e aggiungere 80 mL di PBS.
- Agitare le bottiglie per 5 min a 450 giri/min. Scartare il PBS e aggiungere 80 mL di PBS. Ripetere 3 volte.
3. fissazione delle membrane amniotiche umane su un inserto di cultura
- Utilizzare pinze lunghe sterili (che possono raggiungere il fondo della bottiglia) per rimuovere i prosciutti uno per uno e trasferire ogni prosciutto a una piastra di coltura di 10cm contenente 10 mL di PBS.
- In una nuova piastra di coltura 10cm contenente 10 mL di PBS, posizionare una delle membrane con il nylon rivolto verso il basso. Scollegare due dei quattro ganci che sono utilizzati per fissare la membrana di nylon.
- Inserire l'anello più piccolo dell'inserto cultura tra il nylon e la membrana.
- Assicurarsi che la membrana copre l'anello più piccolo completamente. La seconda parte dell'inserto cultura sopra la membrana di clip. La membrana dello scantinato del prosciutto è rivolto verso l'alto all'interno dell'inserto di cultura. Staccare le ultime due clip.
- Taglio, con forbici sterili, l'eccesso di membrana fuori l'inserto di cultura se necessario. Usando il forcipe, trasferire la membrana fissa nell'inserto cultura ad una piastra 12-pozzetti, aggiungere PBS e memorizzare la piastra in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2.
- Ripetere queste operazioni (dal punto 3.2-3.5) con le altre membrane.
4. lo scongelamento e la semina delle cellule dell'epitelio retinico del pigmento sulle membrane amniotiche umane
-
Lo scongelamento delle cellule dell'epitelio retinico del pigmento
- La banca di cellule RPE è congelata a 1 milione cellule per flaconcino criogenico in azoto liquido. Scongelare i flaconcini criogenici come molti come richiesto (350.000 celle sono seminate a membrana).
- Preparare una provetta da 15 mL contenente 3 mL di terreno RPE per flaconcino criogenico. Una volta che il flaconcino è scongelato, trasferire le cellule in ogni provetta. Ripetere questa operazione per le altre fiale.
- Omogeneizzare (pipetta su e giù un paio di volte per risospendere le cellule in medium RPE) e prendere 10 µ l della soluzione cella e trasferirlo in una provetta da 1,5 mL. Aggiungere 10 µ l di blu di trypan. Place 15 µ l di questa soluzione in una camera di conteggio, poi contare il numero di cellule vitali (non colorato in blu) sotto un microscopio con un obiettivo 4x. Ripetere questa operazione per le altre fiale.
- Nel frattempo, centrifugare le provette da 15 mL a 110 x g per 5 min, scartare il supernatante e risospendere le cellule a 700.000 cellule/mL.
-
Semina delle cellule dell'epitelio retinico del pigmento in membrane amniotiche umane
- Rimuovere la piastra 12-pozzetti contenenti le membrane dall'incubatrice.
- Aspirare il PBS. Aggiungere 500 µ l di sospensione cellulare preparata al punto 4.1.4 al centro dell'inserto cultura. Aggiungere 1 mL di mezzo RPE fuori l'inserto di cultura (all'interno del pozzo). Ripetere per le altre membrane.
- Posizionare la piastra 12-pozzetti contenenti le membrane nell'incubatrice.
5. il mantenimento di colture di cellule di epitelio retinico del pigmento sulle membrane amniotiche umane
- Rinnovare il mezzo 2 x alla settimana, solitamente il lunedì e il venerdì, almeno fino al giorno 30 della cultura.
- Aspirare il mezzo dentro e fuori l'inserto di cultura per ogni pozzetto e rinnovarlo con medium fresco (1 mL di fuori dell'inserto di cultura e 500 µ l all'interno). Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO2.
6. preparazione della Patch di epitelio retinico del pigmento per trapianto
Nota: A partire da giorno 30 della cultura, il tessuto è pronto per il trapianto.
- Caldo la soluzione 8% gelatina in un bagno di acqua a 37 ° C per 30 min. riempire la camera interna del vibratome con freddo CO2-mezzo indipendente (a 4 ° C).
-
Inserire il blocco di 20% gelatina del vibratome.
- Prendere il piatto di cultura di 6 cm contenente il blocco di gelatina di 20% dal frigo. Usando un bisturi, tagliare un blocco di 5 cm x 5 cm. Incollare il lato superiore del blocco al supporto con colla del cianoacrilato o suo equivalente.
- Inserire una nuova lama in del vibratome.
- Regolare il livello del blocco finché è allo stesso livello della lama di rasoio.
- Riempire il bagno intorno al supporto con fresco CO2-mezzo indipendente a 4 ° C. Tagliare il blocco con il vibratome usando una velocità media fino a quando il blocco viene tagliato in modo uniforme, portando ad una superficie liscia. Impostare la posizione 0.
- Aspirare il terreno intorno al blocco di gelatina fino a quando è completamente asciutto e poi prendere la piastra di coltura 12-pozzetti contenenti i tessuti da incubatore a 37 ° C.
- Usando il forcipe, aprire con cautela l'inserto di cultura sulla parte superiore del blocco di gelatina. Taglio, con le forbici, tutte le parti delle membrane che non contengono celle (fuori dal ring dove le cellule non sono state coltivate). Aspirare l'intero medio residuo.
- Aggiungere 1 mL di soluzione 8% gelatina liquida a 37 ° C al fine di coprire le membrane. Rimuovere delicatamente l'eccesso. Aspettare 5-8 minuti per consentire la gelatina a solidificare.
- Aggiungere fresco CO2-mezzo indipendente (a 4 ° C) per il bagno fino a quando la membrana è coperto.
- Taglio, con il vibratome in una posizione di-100 µm, con una velocità media, rimanendo consapevoli di come si comporta il blocco. Alla fine della sezione, fare attenzione a mantenere l'orientamento del tessuto.
- Con un bisturi, tagliare un angolo per identificare l'orientamento della sezione.
- Raccogliere la membrana incorporata in gelatina con una spatola e posizionarlo in una piastra a 6 pozzetti riempita con il mezzo di conservazione a 4 ° C, fino a quando l'innesto nell'occhio destinatario.
- Al momento del trapianto, regolare le dimensioni dell'impianto per la dimensione dell'occhio destinatario sotto un microscopio chirurgico (1 – 3 per i ratti, 10 – 15 mm2 per primati non umani).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prosciutti contengono uno strato epiteliale che deve essere rimossi prima della semina delle cellule RPE. Un trattamento enzimatico della membrana viene eseguito con la termolisina sotto agitazione. In ordine di non perdere la polarità della membrana (l'epitelio è su un lato), è fissato su un supporto quale composizione potrebbe essere diversa a seconda del provider (Figura 1A). L'adesione della membrana al suo sostegno in questa fase di verifica e se necessario, aggiungere clip. Al momento della fissazione dell'inserto di cultura, lavorare con cura per evitare di fare buchi nella membrana e mantenere la sua polarità con la membrana basale rivolto verso l'alto (Figura 1B). Quando le cellule sono seminate su membrane, potevano sfuggire da questi fori e la concentrazione di cella finale sarà ridotto. La presenza di fori poteva essere visualizzata al microscopio o mediante l'aggiunta di PBS all'interno dell'inserto di cultura e se PBS sta perdendo. Qualsiasi membrana con fori dovrebbe essere scartato.
Dopo la fissazione sull'inserto di cultura, la presenza di cellule residue in un microscopio a contrasto di fase è valutato (figure 1 e 1 D). Classicamente, poche cellule morte potevano rimanere sulla superficie della membrana, ma quelle cellule saranno eliminate quando viene modificato il terreno di coltura (Figura 1). Le fibre della membrana dello scantinato si vedeva a un ingrandimento superiore (Figura 1) se non rimangano cellule. Se questo non è il caso, i tempi di incubazione con termolisina potrebbero essere regolato.
Nei giorni seguenti la semina delle cellule RPE, verifica se le cellule aderiscono. A seconda del microscopio utilizzato, potrebbe essere difficile vedere chiaramente le cellule durante le prime settimane, ma se non aderiscono le cellule, le cellule saranno visibili galleggianti intorno nel medium di coltura delle cellule. Una volta che l'epitelio è formata e inizia a maturare, diventa più facile vederlo sotto un microscopio (figure 2A, 2Be 2C). A 3 settimane, le cellule formano un epitelio monostrato completo tipico di RPE (organizzazione di ciottoli). Dopo 4 settimane, l'epitelio è abbastanza maturo per la sua preparazione per l'impianto (Figura 2D). Tuttavia, potrebbero essere tenuta in coltura per più settimane per motivi logistici.
La preparazione dell'innesto per l'impianto è descritto nella Figura 3. All'apposizione della membrana per il blocco di 20% di gelatina, aspirare tutto il terreno di coltura cellulare in eccesso. Questo passaggio è importante, come qualsiasi mezzo rimanente potrebbe precludere l'adesione della gelatina 8% ai RPE e la membrana. Infatti, il medium formerà una pellicola di liquido tra gli strati di gelatina.
La gelatina utilizzata per l'incorporamento dell'impianto potrebbe essere di una forza variabile, a seconda del relativo indice di Bloom (cioè, un test di controllo qualità, eseguite e fornite dai fornitori, che restituisce la forza di un gel ad una temperatura standardizzata e concentrazione). Se la gelatina utilizzata non è sufficientemente rigida e Disaggrega durante l'innesto, il riferimento di gelatina usata deve essere modificato ad un altro con una maggiore resistenza. La concentrazione di gelatina potrebbe anche essere cambiata, basata sulla sperimentazione, per regolare la sua forza ed elasticità.
Figura 1: inserire immagini rappresentative del prosciutto prima e dopo il trattamento di termolisina e fissazione su una cultura. (A) immagine rappresentativa di una membrana fornita da una banca dei tessuti. (B) immagine rappresentativa di una membrana fissata su un inserto di cultura. (C) immagine rappresentativa di una membrana trattata con termolisina ad un ingrandimento basso. (D) l'immagine rappresentativa di una membrana trattata con termolisina a un forte ingrandimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: immagini rappresentative del prosciutto su semina le cellule RPE. (A) immagine rappresentativa della membrana prima della semina. (B e C) immagini rappresentative delle cellule RPE sulle membrane a 3 settimane post-semina. La membrana potrebbe non essere completamente planare come visto nel pannello C. Barra della scala = 100 µm (C), 20 µm per l'ingrandimento. (D) immagine rappresentativa delle cellule RPE su una membrana a 30 giorni post-semina, corrispondente al tempo di incorporarli in gelatina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: schema che descrive i passaggi sequenziali per l'inclusione del derivati dal tessuto retinico contenente lo strato di cellule RPE sul prosciutto all'interno di una pellicola di gelatina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Abbiamo descritto un metodo per la coltura di cellule RPE su un'impalcatura biologica e la sua preparazione per l'impianto in modelli animali. Una delle fasi critiche del protocollo è il mantenimento dell'orientamento del prosciutto lungo tutta la procedura fino alla sua inclusione in gelatina. Infatti, viene rimosso l'epitelio nativo della membrana e relativa membrana dello scantinato diventa esposto9. Le cellule RPE devono essere seminati in cima a questa membrana dello scantinato. Al momento di preparazione per l'incorporamento di gelatina, è fondamentale lavorare con tutti i prodotti alla temperatura definita. Infatti, la gelatina ha la proprietà di essere rigida a 4 ° C e liquido a corpo temperatura (37 ° C)9. Se la temperatura non viene rispettata, la gelatina potrebbe solidificare o liquefare un passo dove questo effetto non è desiderato.
Sono stati proposti diversi scaffold biologici, come membrane25 o prosciutti26 di Descemet. In particolare, prosciutti, da una sezione cesarean27, sono stati dimostrati per essere ben tollerato nello spazio subretinal, provocando infiammazione limitata e riducendo il neovascularization coroidico26. La membrana supporta correttamente la cultura dell'umano RPE cellule9,28. Inoltre, queste membrane hanno anche una lunga storia in cliniche29, che li rende buoni candidati per un'impalcatura per la terapia cellulare RPE. Altri supporti biologici potevano essere facilmente implementati con questo protocollo. Impalcature di sintesi basate sul polimero già sono rigide e potrebbero non essere necessario una gelatina incorporamento prima l'impianto13,30,31,32,33. Altri sistemi per l'impianto sono stati recentemente sviluppati per la consegna subretinal nell'occhio umano di un monostrato RPE hESC-derivati su un' impalcatura rigida di poliestere34 o su un substrato sintetico parylene progettata per imitare la membrana di Bruch35 . Anche se queste strategie sono promettenti, crediamo che scaffold biologici potrebbe fornire la migliore piattaforma per l'ingegneria tissutale RPE.
In questo protocollo, le cellule RPE teste di serie sono state derivate da cellule ES umane utilizzando un metodo di differenziazione spontanea. Tuttavia, potrebbero essere utilizzati diversi tipi di cellule RPE, sia differenziato da cellule staminali pluripotenti indotte umano o da cellule RPE primarie ottenute da cadaveri o anche da un RPE cella linea19,36,37, 38. Inoltre, se si utilizza cellule staminali pluripotenti, diversi protocolli sono stati sviluppati negli ultimi anni per ottenere cellule RPE basata su una differenziazione spontanea o con piccole molecole per guidare la differenziazione18,22. Cellule RPE ottenute da questi protocolli diversi di differenziazione potrebbero essere utilizzate anche con questo metodo per l'ingegneria tissutale.
Un limite di questo metodo è la stabilità del tessuto incorporato a 4 ° C. Come è incluso in gelatina appena prima della spedizione al sito chirurgia, deve essere mantenuta a questa temperatura fino a quando l'attecchimento. In tale contesto, la chirurgia deve essere eseguita entro 48 h.
Questo metodo potrebbe essere facilmente trasferito alla clinica. Il tessuto RPE incastonato in gelatina è conservato a 4 ° C in CO2-mezzo indipendente. Questo mezzo potrebbe essere sostituito, se necessario, con gli altri già approvati da la US Food and Drug Administration (FDA) per la conservazione delle cornee ottenuti post-mortem e che sono utilizzati per i trapianti in esseri umani. Abbiamo dimostrato con successo l'efficacia di questa strategia per trapianto in uno studio di proof-of-concept in modelli di roditori9, e noi stiamo attualmente convalida l'approccio chirurgico in primati non umani prima di implementarlo per una sperimentazione clinica per il trattamento di pazienti con specifiche forme di RP che interessano il RPE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Olivier Goureau è l'inventore su in attesa di brevetti relazionati alla generazione di cellule retiniche da cellule staminali pluripotenti umane. Gli altri autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare Jérôme Larghero e Valérie Vanneaux (Hôpital Saint Louis, Parigi, Francia) per il loro contributo durante la messa a punto del metodo descritto qui.
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da ANR [GPiPS: RFCS005-2010-ANR; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], la Fondation pour la Recherche Médicale [programma di Bio-ingegneria - DBS20140930777] e da LABEX REVIVE [ANR-10-LABX-73] Olivier Goureau e Christelle Monville. È stato sostenuto dal NeurATRIS, un'infrastruttura di ricerca traslazionale (Investissements d'Avenir) per bioterapie in neuroscienze [ANR-11-INBS-0011] e INGESTEM, l'infrastruttura nazionale (Investissements d'Avenir) Ingegneria per pluripotenti e cellule staminali differenziate [ANR-11-INBS-000] di Christelle Monville. Karim Ben M'Barek è stato sostenuto da borse di studio dal DIM Stempole e LABEX REVIVE [ANR-10-LABX-73]. Staminali sono parte dell'Istituto per le Malattie Rare supportato dall'Association Française contre les Myopathies (AFM) bioterapie-Téléthon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile biosafety cabinet | TechGen International | Not applicable | |
| Liquid waste disposal system for aspiration | Vacuubrand | BVC 21 | |
| CO2-controlled +37 °C cell incubator | Thermo Electron Corporation | BVC 21 NT | |
| 200 µL pipette: P200 | Gilson | F144565 | |
| 1 mL pipette: P1000 | Gilson | F144566 | |
| Pipet aid | Drummond | 75001 | |
| +4 °C refrigerator | Liebherr | Not applicable | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fine scissors | WPI | 501758 | |
| Forceps (x2) | WPI | 555227F | |
| Water bath | Grant subaqua pro | SUB6 | |
| Precision balance | Sartorius | CP225D | |
| Centrifuge | Eppendorff | 5804 | |
| Microscope | Olympus | SC30 | |
| Horizontal Rocking Shaker | IKA-WERKE | IKA MTS 214D | |
| Vortex | VWR | LAB DANCER S40 | |
| Disposable Scalpel | WPI | 500351 | |
| plastic paraffin film | VWR | PM992 | |
| 0.200 µm single use syringe filter | SARTORIUS | 16532 | |
| Syringe without needle 50 mL | Dutscher | 50012 | |
| Bottles 250 mL | Dutscher | 28024 | |
| 15 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352097 | |
| 50 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352098 | |
| culture insert | Scaffdex | C00001N | |
| 60 mm cell culture disches: B6 | Dutscher | 353004 | |
| 12 well cell culture plate | Corning | 3512 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3506 | |
| Razor blades | Ted Pella, Inc | 121-9 | |
| Cyanoacrylate glue | Castorama | 3178040670105 | |
| PBS 1x (500 mL) | Sigma | D8537 | |
| Thermolysine | Roche | 5339880001 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965-026 | |
| KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) | Invitrogen | 12618-013 | |
| MEM-NEAA (100x) | Invitrogen | 11140-035 | |
| b-mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| CO2-independent medium | GIBCO | 18045-054 | |
| Gelatin | MERCK | 104078 | |
| human amniotic membrane | Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) | Not applicable |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Gehrs, K. M., Anderson, D. H., Johnson, L. V., Hageman, G. S. Age-related macular degeneration--emerging pathogenetic and therapeutic concepts. Annals of Medicine. 38 (7), 450-471 (2006).
- Swaroop, A., Chew, E. Y., Rickman, C. B., Abecasis, G. R. Unraveling a multifactorial late-onset disease: from genetic susceptibility to disease mechanisms for age-related macular degeneration. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 19-43 (2009).
- Khandhadia, S., Cherry, J., Lotery, A. J.
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ben M'Barek, K., Regent, F., Monville, C. Use of human pluripotent stem cells to study and treat retinopathies. World Journal of Stem Cells. 7 (3), 596-604 (2015).
- Ben M'Barek, K., et al. Human ESC-derived retinal epithelial cell sheets potentiate rescue of photoreceptor cell loss in rats with retinal degeneration. Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Hsiung, J., Zhu, D., Hinton, D. R. Polarized human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cell monolayers have higher resistance to oxidative stress-induced cell death than nonpolarized cultures. Stem Cells Translational Medicine. 4 (1), 10-20 (2015).
- Diniz, B., et al. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (7), 5087-5096 (2013).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Thomas, B. B., et al. Survival and functionality of hESC-derived retinal pigment epithelium cells cultured as a monolayer on polymer substrates transplanted in RCS rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (6), 2877-2887 (2016).
- Borooah, S., et al. Using human induced pluripotent stem cells to treat retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 37, 163-181 (2013).
- Leach, L. L., Clegg, D. O. Concise review: Making stem cells retinal: Methods for deriving retinal pigment epithelium and implications for patients with ocular disease. Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells as a tool to model a form of Leber congenital amaurosis. Cellular Reprogramming. 15 (3), 233-246 (2013).
- Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS Cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
- Maruotti, J., et al. Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10950-10955 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Ilmarinen, T., et al. Ultrathin polyimide membrane as cell carrier for subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium. PloS One. 10 (11), e0143669 (2015).
- Thumann, G., Schraermeyer, U., Bartz-Schmidt, K. U., Heimann, K. Descemet's membrane as membranous support in RPE/IPE transplantation. Current Eye Research. 16 (12), 1236-1238 (1997).
- Kiilgaard, J. F., Scherfig, E., Prause, J. U., la Cour, M. Transplantation of amniotic membrane to the subretinal space in pigs. Stem Cells International. 2012, 716968 (2012).
- Capeans, C., et al. Amniotic membrane as support for human retinal pigment epithelium (RPE) cell growth. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (3), 271-277 (2003).
- Ohno-Matsui, K., et al. The effects of amniotic membrane on retinal pigment epithelial cell differentiation. Molecular Vision. 11, 1-10 (2005).
- Paolin, A., et al. Amniotic membranes in ophthalmology: long term data on transplantation outcomes. Cell and Tissue Banking. 17 (1), 51-58 (2016).
- Hu, Y., et al. A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer. Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).
- Pennington, B. O., Clegg, D. O. Pluripotent stem cell-based therapies in combination with substrate for the treatment of age-related macular degeneration. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: The Official Journal of the Association. 32 (5), 261-271 (2016).
- Song, M. J., Bharti, K. Looking into the future: Using induced pluripotent stem cells to build two and three dimensional ocular tissue for cell therapy and disease modeling. Brain Research. 1638 (Pt A), 2-14 (2016).
- Ramsden, C. M., et al. Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future). Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
- Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
- Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C.
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
