Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Engineering Transplantation-egnet retinale Pigment epitelvæv stammer fra menneskelige embryonale stamceller

Published: September 6, 2018 doi: 10.3791/58216
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 4, 5, 1,2
1U861, I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), 2U861, I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Université Evry Val-d'Essonne (UEVE), 3I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Centre pour L’Etude des Cellules Souches (CECS), 4Banque de tissus humain, Hôpital Saint Louis, Assistance Publique - Hôpitaux de Paris (AP-HP), 5Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, F-75012

Summary

Vi beskriver en metode til at ingeniør en retinal væv består af retinale pigment epitel celler, der stammer fra humane pluripotente stamceller kulturperler oven på menneskelige fostervand membraner og dens forberedelse til podning i dyremodeller.

Abstract

Flere patologiske tilstande i øjet påvirke funktionaliteten og/eller overlevelsen af den retinale pigment epitel (ÅV). Disse omfatter nogle former for retinitis pigmentosa (RP) og aldersbetinget makuladegeneration (AMD). Celleterapi er en af de mest lovende terapeutisk strategier foreslås at helbrede disse sygdomme med allerede opmuntrende foreløbige resultater i mennesker. Metode til forberedelse af graften har imidlertid en betydelig indvirkning på dets funktionelle resultater in vivo. ÅV celler podet som en cellesuspension er faktisk mindre funktionel end de samme celler transplanteret som en retinal væv. Heri beskrives en simpel og reproducerbar metode til ingeniør ÅV væv og dens forberedelse til en i vivo implantation. ÅV celler, der stammer fra humane pluripotente stamceller udsås på et biologisk støtte, den menneskelige fostervand membran (skinke). Sammenlignet med kunstige stilladser, har denne støtte fordelen at have en basalmembran, der er tæt på Bruchs membran hvor endogene ÅV celler er knyttet. Men dens manipulation er ikke let, og vi udviklet flere strategier til sin rette dyrkning og forberedelse til podning in vivo.

Introduction

ÅV er afgørende for overlevelse og homeostase af fotoreceptorer, som det er tæt forbundet1. Flere patologiske betingelser ændre dens funktionalitet og/eller overlevelse, herunder RP og AMD.

RP er en gruppe af arvelige monogene mutationer, der påvirker funktioner af fotoreceptorer eller ÅV celler eller begge2,3. Det anslås, at mutationer, der påvirker specifikt ÅV celler udgør 5% af RP2. AMD er en anden tilstand, hvor laget ÅV er ændret, førende i sidste ende til centrale synstab. AMD er forårsaget af det komplekse samspil af genetiske og miljømæssige faktorer og påvirker ældre4,5,6. Ifølge fremskrivninger, vil AMD være en bekymring for 196 millioner patienter på verdensplan af 20207. For disse lidelser, ingen effektiv kur eksisterer, og en af de foreslåede strategier er transplantation af nye ÅV celler for at kompensere for døde/nonfunctional forudbestående ÅV celler8.

Tilstanden af formuleringen af det endelige produkt til at blive podet er afgørende for at sikre de bedste funktionelle resultater. ÅV celler injiceres som en cellesuspension, selvom det er en nem og enkel metode til levering, giver anledning til bekymring med hensyn til deres overlevelse, integration og funktionalitet9,10,11,12 , 13. forskere er nu ved at udvikle mere komplicerede formuleringer at levere manipuleret retinale væv9,13,14,15,16. I denne sammenhæng udviklet vi en original metode til at generere i vitro ÅV væv, der kunne bruges til transplantation9.

ÅV cellebanker stammer fra menneskelige embryonale stamceller (ES) er brugt i denne protokol. Dog alternativ ÅV celle banker fra forskellige kilder (human-induceret pluripotente stamceller, primære ÅV celler, etc.) og differentieret med en anden metode egner sig også til denne protokol. Det omfatter styret differentiering protokoller ved hjælp af cytokiner og/eller små molekyler17,18,19,20,21,22.

For at være transplanteret, bør manipuleret væv være forberedt på et stillads. I de sidste par år, blev forskellige stilladser udviklet baseret på en polymer eller en matrix af biologisk oprindelse13,23,24. Her, den biologiske substrat anvendes er skinken, men andre substrater, som blottet Bruch membraner, kunne gennemføres. Den metode beskrevet heri har fordelen ved at bruge en biologisk stillads, der er mere relevant for ÅV indfødte miljø.

Humane ES celle-afledte ÅV celler er kulturperler i mindst 4 uger for at være fuldt organiseret som en brostensbelagte éncellelag. På tidspunkt epitel opnået er funktionelle og polariseret9. Endelig, da dette væv rynker nemt, det er indlejret i et tyndt lag af hydrogel transportør til at give det mere stivhed og elasticitet og beskytte det under proceduren injektion. Dette produkt er derefter opbevares ved 4 ° C indtil podning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle menneskelige materialer i denne protokol blev brugt i henhold til EU 's bestemmelser. Den menneskelige ES cellelinie anvendes i denne undersøgelse stammer fra en unik Foster. De par, der havde skænket embryo var fuldt informeret og gav deres samtykke til en anonym donation. En klinisk-grade menneskelige ES cellelinje var stammer fra dette Foster, krænges, kvalificeret og behørigt dokumenteret ved Roslin celler (UK). Skinker blev indkøbt under sterile forhold under en kejsersnit hos mødre, der har underskrevet en informeret samtykke til moderkagen donation efter hospitalet retningslinjer (APHP, Hôpital Saint Louis).

1. forberedelse af dyrkningsmedier og reagenser

  1. Forberedelse af ÅV cellekulturmedium
    1. For at forberede ÅV cellekulturmedium, tilsættes 4% serum erstatning (20 mL til en endelige mængden af 500 mL), 1.000 x fortyndet 2-mercaptoethanol (500 µL til en endelige mængden af 500 mL) og 1% Eagle′s minimum afgørende medium (MEM) ikke-essentielle aminosyrer løsning (5 mL for en endelig volumen af 500 mL) til Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) høje glukose (475 mL for en endelige mængden af 500 mL).
  2. Forberedelse af transport/bevarelse medium
    1. For at forberede transport/bevarelse medium, tilsættes 1% af penicillin-streptomycin (5 mL for en endelige mængden af 500 mL) til CO2-uafhængige medie (495 mL for en endelige mængden af 500 mL) og holde det ved 4 ° C.
  3. Ophvirvling af thermolysin enzymet
    1. Forberedelse af en stamopløsning af thermolysin
      1. For at forberede en stamopløsning af thermolysin, tø thermolysin pulver, der blev gemt ved-20 ° C, stuetemperatur.
      2. Da den enzymatiske aktivitet kan være variabel fra batch til batch, beregne denne aktivitet baseret på analysecertifikatet forsynet med thermolysin pulver af batch skal anvendes. Opdele den "aktivitet Neutral Protease beregnet = ANPC" (angivet i certifikatet analyse) af 181 (som er tyrosins molekylvægt). Resultatet svarer til den samlede enzymatisk aktivitet af den medfølgende thermolysin pulver (U/vial).
      3. Forbered en stamopløsning på 200 U/mL ved at tilføje vandmængde svarende til den samlede enzymatisk aktivitet (U/vial) divideret med 200 (U/mL).
      4. Opløses af enzymet ved pipettering det vand, der blev tilføjet op og ned. Vortex løsning til 30 s og markere om pulveret er helt suspenderet. Flere pipettering kan være nødvendige for en fuld opløsning.
      5. Alikvot stamopløsningen, og opbevar den ved-20 ° C.
    2. Forberedelse af en arbejdsgruppe løsning af thermolysin
      Bemærk: Thermolysin løsning skal være forberedt på dagen for skinke behandling.
      1. Optø de bestand delprøver af thermolysin på 200 U/mL opbevares ved-20 ° C. Fortynd stamopløsning 200 x i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) for at opnå en endelig enzymatisk aktivitet af 1 U/mL. Forberede 40 mL til behandling 1 – 4 skinke patches.
      2. Filtrer thermolysin løsning gennem en 0,2 µm filter før brug.
  4. Ophvirvling af gelatine
    1. Forberedelse af 20% gelatine løsning og blok
      Bemærk: 20% gelatine løsning og blok kan være forberedt op til 1 uge før brug.
      1. Varm CO2-uafhængige medie til 42 ° C i et vandbad i 30 min (maks. 1 h). I en 50 mL tube, Tilføj gelatine til 40 mL. 10 g varmede CO2-uafhængige medie og vortex løsningen.
      2. Opløses gelatine i 30 – 60 min på 42 ° C. Vortex hver 10 min at homogenisere løsningen.
      3. Når løsningen er homogene, tilsættes 4 mL den 20% gelatine til fire 6 cm kultur retter. Undgå boblerne. Tilføje en plastik paraffin film for at beskytte retterne, og tillade løsning at størkne ved 4 ° C.
    2. Forberedelse af 8% gelatine løsning
      Bemærk: 8% gelatine løsning kan være tilberedes dagen før brug og opbevares ved 4 ° C.
      1. Varm CO2-uafhængige medie til 42 ° C i 30 min (maks. 1 h). I en 50 mL tube, tilføje 4 g af gelatine til 46 mL varmede CO2-uafhængige medie og vortex løsningen.
      2. Opløses gelatine i 30 – 60 min på 42 ° C. Tilføje en plastik paraffin film for at beskytte røret og holde det i et vandbad ved 37 ° C, hvis den skal bruges samme dag, eller gemme det ved 4 ° C, hvis den skal bruges senere.

2. Thermolysin behandling af menneskelige fostervand membraner

  1. Menneskelige fostervand membran vask
    1. Har skinke leveres som små stykker (ca 30 mm x 30 mm) fast i en nylon stillads, enten allerede ved 4 ° C i PBS eller frosne. Hvis frosne, tø membraner ved 37 ° C i en inkubator i 30 min.
    2. Vaske membraner:
      1. Placer 1 – 4 membraner i en 250 mL flaske indeholder 80 mL PBS. Bruge så mange flasker som krævet.
      2. Ryst hver flaske i en plade shaker med høj hastighed i 5 min, så kassér PBS. Der tilsættes 80 mL PBS og Gentag.
  2. Thermolysin behandling
    1. Der tilsættes 40 mL brugsopløsning af thermolysin (1 U/mL) per flaske, der indeholder membraner (1 – 4 membraner pr. flasker; op til 3 flasker ad gangen).
    2. Ryst flasker i 5 min på 450 rpm og derefter vortex dem for 30 s. Gentag 1 x.
    3. Kassér thermolysin løsningen og tilføje 80 mL PBS.
    4. Ryst flasker i 5 min på 450 rpm. Kassér PBS og tilføje 80 mL PBS. Gentag 3 x.

3. fiksering af menneskelige fostervand membraner på en kultur indsætte

  1. Brug lange steril pincet, (der kan nå bunden af flasken) til at fjerne skinker én efter én, og overføre hver skinke til en 10 cm kultur parabol som indeholder 10 mL PBS.
  2. I en ny 10 cm kultur parabol som indeholder 10 mL PBS, skal du placere en af membranerne med nylon vender nedad. Frigøre to af de fire klip, der bruges til at lave membran til nylon.
  3. Indsæt den mindre ring af kultur indsætte mellem nylon og membranen.
  4. Sørg for, at membranen dækker den mindre ring helt. Klip den anden del af kultur-Indsæt oven på membranen. Basalmembranen af skinken står inde i kultur-Indsæt. Fjern de sidste to klip.
  5. Snit, med steril saks, overskud af membran uden for kultur Indsæt om nødvendigt. Brug af pincet, overføre membranen fast i kultur-Indsæt til en 12-godt plade, tilføje PBS, og gemme pladen i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
  6. Gentag disse operationer (fra trin 3.2 til 3,5) med andre membraner.

4. optøning og såning af retinale Pigment epitel celler på menneskelige fostervand membraner

  1. Optøning af retinale pigment epitel celler
    1. ÅV celle bank er frosset på 1 million celler pr. kryogene hætteglas i flydende kvælstof. Tø så mange kryogene hætteglas som kræves (350.000 cellerne udsås pr. membran).
    2. Forberede en 15 mL tube indeholder 3 mL af ÅV medium pr. kryogene hætteglas. Når hætteglasset er optøet, overføre cellerne til hver tube. Gentag denne handling for de andre hætteglas.
    3. Homogeniseres (pipetteres op og ned et par gange til resuspend celler i ÅV medium) og tage 10 µL af opløsningen celle og overføre det til en 1,5 mL tube. Tilsæt 10 µL af trypan blå. Sted 15 µL af denne løsning i en optælling kammer, så tælle antallet af levedygtige celler (ikke farvet i blå) under et mikroskop med en 4 X mål. Gentag denne handling for de andre hætteglas.
    4. I mellemtiden, centrifugeres 15 mL rør på 110 x g i 5 min. Fjern supernatanten og resuspend celler på 700.000 celler/mL.
  2. Såning af retinale pigment epitel celler til menneskelig fostervand membraner
    1. Fjern 12-godt pladen som indeholder membraner fra rugemaskinen.
    2. Opsug PBS. Tilsættes 500 µL af cellesuspension forberedt i trin 4.1.4 i midten af kultur-Indsæt. Der tilsættes 1 mL af ÅV medium uden for kultur-Indsæt (indvendig hul). Gentag for de andre membraner.
    3. Sted 12-godt pladen som indeholder membraner i rugemaskinen.

5. vedligeholdelse af retinale Pigment epitel cellekulturer på menneskelige fostervand membraner

  1. Forny medium 2 x pr uge, normalt på mandag og fredag, indtil i hvert fald dag 30 af kultur.
  2. Opsug medium i og uden for kultur-Indsæt til hver brønd og forny det med friske medium (1 mL uden for kultur-Indsæt og 500 µL inde). Pladen anbringes i varmeskab ved 37 ° C og 5% CO2.

6. forberedelse af den retinale Pigment epitel Patch til Transplantation

Bemærk: Start på dag 30 i kulturen, er væv klar til transplantation.

  1. Varm 8% gelatine løsning i et vandbad ved 37 ° C i 30 min. fyld den interne afdeling af vibratome med kolde CO2-uafhængige medie (ved 4 ° C).
  2. Placere 20% gelatine blok i vibratome.
    1. Tage 6 cm kultur parabol indeholdende blok af 20% gelatine fra køleskabet. Ved hjælp af en skalpel, klip et 5 cm x 5 cm blok. Indsæt den øverste side af blok at støtte med ren lim eller tilsvarende.
    2. Placere en ny klinge i vibratome.
    3. Justere niveauet af blokken, indtil det er på det samme niveau af barberblad.
    4. Fyld bad omkring støtte med friske CO2-uafhængige medie ved 4 ° C. Skære blokken med vibratome ved hjælp af en medium hastighed, indtil blokken er skåret ensartet, fører til en glat overflade. Indstil position 0.
    5. Opsug medium rundt om blokken af gelatine, indtil det er helt tørt, og derefter tage 12-godt kultur pladen indeholdende væv fra inkubator ved 37 ° C.
    6. Brug af pincet, omhyggeligt åbne kultur Indsæt på toppen af gelatine blok. Skære med saks, alle dele af membraner, der ikke indeholder celler (uden for den ring, hvor celler ikke blev kulturperler). Opsug den hel resterende medium.
    7. Der tilsættes 1 mL af den flydende 8% gelatine løsning ved 37 ° C for at dække membraner. Forsigtigt fjerne overskydende. Vente 5-8 min til at tillade gelatine til at størkne.
    8. Tilføj frisk CO2-uafhængige medie (ved 4 ° C) til bad indtil membranen er dækket.
    9. Snit, med vibratome på en position af-100 µm, med en medium hastighed, resterende klar over hvordan blokken opfører. I slutningen af afsnittet, være omhyggelig med at bevare retningen af væv.
    10. Med en skalpel, skåret et hjørne for at identificere papirretning i afsnittet.
    11. Indsamle membranen indlejret i gelatine med en spatel og placere den i en 6-godt tallerken fyldt med bevarelse medium ved 4 ° C, indtil podning det ind i modtagerens øjet.
    12. På tidspunktet for transplantation, justere størrelsen på implantatet til størrelsen af den modtagende øje under en kirurgisk mikroskop (1-3 for rotter, 10-15 mm2 til ikke-menneskelige primater).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Skinker indeholder en epitel lag, der bør fjernes før såning af ÅV celler. En enzymatisk behandling af membranen er udført med thermolysin under omrystning. I orden ikke at ikke miste polariteten af membranen (epitel er på den ene side), det er fastsat på et bærestof, hvilken sammensætning kunne være forskellige, afhængigt af udbyderen (figur 1A). Kontrollere vedhæftning af membran til sin støtte på dette trin og tilføje klip, hvis nødvendigt. På tidspunktet for fiksering i kultur-Indsæt arbejde omhyggeligt for at undgå at lave huller i membranen og holde sin polaritet med basalmembranen opad (figur 1B). Når cellerne udsås på membraner, de kunne flygte fra disse huller og den endelige celle koncentration vil blive reduceret. Tilstedeværelsen af huller kunne visualiseres under et mikroskop eller ved at tilføje PBS inde kultur-Indsæt og kontrol, hvis PBS er utæt. Enhver membran med huller skal kasseres.

Efter fiksering på kultur-Indsæt er tilstedeværelsen af resterende celler i et fasekontrast mikroskop evaluerede (tal 1 c og 1 D). Klassisk, et par døde celler kunne forblive på overfladen af membranen, men disse celler vil blive fjernet, når substratet er ændret (figur 1 c). Fibrene af basalmembranen kunne ses på en højere forstørrelse (fig. 1 d), hvis ingen celler forbliver. Hvis det ikke er tilfældet, kan timingen af inkubationen med thermolysin justeres.

I dagene efter såning af ÅV celler, tjekke hvis cellerne overholde. Afhængigt af mikroskop bruges, det kunne være svært at se klart cellerne i de første par uger, men hvis cellerne ikke overholder, celler vil blive set flyder rundt i cellekulturmedium. Når epitel dannes og begynder at modnes, bliver det nemmere at se det under et mikroskop (tal 2A, 2Bog 2 C). På 3 uger danner cellerne en komplet éncellelag epitel typisk af ÅV (brostensbelagte organisation). Efter 4 uger er epitel tilstrækkeligt modne for sin forberedelse til implantation (figur 2D). Det kunne dog holdes i kultur i flere uger af logistiske årsager.

Forberedelse af graften til implantation er beskrevet i figur 3. Ved anbringelse af membran til 20% gelatine blok, Aspirér alle de overskydende cellekulturmedium. Dette trin er vigtigt, som enhver resterende medium kunne udelukke vedhæftning af 8% gelatine til ÅV og membranen. Faktisk vil mellemlangt danne en film af væske mellem lag af gelatine.

Gelatine bruges til integrering af implantatet kunne være en varierende styrke, afhængigt af dens blomstre indeks (dvs.en kvalitetskontrol test, udført og leveret af leverandører, der evaluerer styrken af en gel ved en standardiseret temperatur og koncentration). Hvis gelatine bruges ikke er stiv nok og disaggregates under podning, bør referencen brugte gelatine ændres til en anden med en højere styrke. Koncentrationen af gelatine kan også ændres, baseret på eksperimenter, at justere dens styrke og elasticitet.

Figure 1
Figur 1: repræsentative billeder af skinken før og efter thermolysin behandling og fiksering på en kultur indsætte. (A) repræsentativt billede af en membran, der leveres af en vævsbank. (B) repræsentativt billede af en membran, fast på en kultur indsætte. (C) repræsentativt billede af en membran, der er behandlet med thermolysin på en lav forstørrelse. (D) repræsentativt billede af en membran, der er behandlet med thermolysin på en høj forstørrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentative billeder af skinke ved såning ÅV celler. (A) repræsentativt billede af membran før såning. ()B og C) repræsentative billeder af ÅV celler på membraner på 3 uger efter såning. Membranen kan ikke være helt plane, som set i panelet C. Skalalinjen = 100 µm (C), 20 µm for forstørrelse. (D) repræsentativt billede af ÅV celler på en membran på 30 dage efter såning, svarende til tidspunktet for at integrere dem i gelatine. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: ordningen beskriver de sekventielle trin for inddragelse af de manipuleret retinale væv indeholdende ÅV cellelag på skinke inde en gelatine film. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi beskrevet en metode for kulturen af ÅV celler på et biologisk stillads og dens forberedelse til implantation i dyremodeller. En af de afgørende trin i protokollen er vedligeholdelse af orientering af skinke hele proceduren frem til dets optagelse i gelatine. De indfødte epitel af membranen er fjernet, og dens basalmembranen bliver eksponeret9. ÅV celler skal være seedet oven på denne basalmembranen. Ved forberedelsen af gelatine indlejring, er det afgørende at arbejde med alle produkter på de definerede temperatur. Faktisk, gelatine har egenskaben at blive stiv ved 4 ° C og flydende krop temperatur (37 ° C)9. Hvis temperaturen ikke er overholdt, kunne gelatine størkne eller liquefy på et trin, hvor denne effekt ikke ønskes.

Flere biologiske stilladser har været foreslået som Descemets membraner25 eller skinke26. Især var skinke, fra et kejsersnit27, vist sig for at være veltolereret i subretinal plads, forårsager begrænset betændelse og reducere choroidal neovascularization26. Membranen understøtter med succes kultur af human ÅV celler9,28. Desuden, disse membraner har også en lang historie i klinikker29, at gøre dem gode kandidater til en stillads til ÅV celleterapi. Andre biologiske understøtter kunne gennemføres let med denne protokol. Syntetisk stilladser baseret på polymer er allerede stive og muligvis ikke en gelatine indlejring før implantation13,30,31,32,33. Andre systemer til implantation er for nylig udviklet til subretinal levering i det menneskelige øje af en menneskelige stamceller-afledt ÅV éncellelag, på en stiv polyester stillads34 eller på en syntetisk parylene substrat designet til at efterligne Bruchs membran35 . Selv om disse strategier er lovende, mener vi, at biologiske stilladser kan levere den bedste platform for ÅV vævsmanipulering.

I denne protokol, var seedede ÅV cellerne stammer fra humane ES-celler ved hjælp af en spontan differentiering metode. Men forskellige typer af ÅV celler kunne bruges, enten differentieret fra menneskelige inducerede pluripotente stamceller eller primære ÅV celler fremstillet af kadavere eller endda fra en ÅV celle linje19,36,37, 38. Desuden, hvis du bruger pluripotente stamceller, flere protokoller blev udviklet i de seneste år at opnå ÅV celler baseret på en spontan differentiering eller ved hjælp af små molekyler til at guide differentiering18,22. ÅV celler fremstillet af disse forskellige differentiering protokoller kan også bruges med denne metode for vævsmanipulering.

En grænse for denne metode er stabiliteten i den indlejrede væv ved 4 ° C. Som det er medtaget i gelatine lige før afsendelse til webstedet kirurgi, har det fastholdes ved denne temperatur, indtil engraftment. I forbindelse bør operationer udføres inden for 48 timer.

Denne metode kan overføres let til klinikken. ÅV væv indlejret i gelatine er bevaret ved 4 ° C i CO2-uafhængige medie. Dette medium kunne erstattes, hvis det er nødvendigt, med andre allerede godkendt af US Food and Drug Administration (FDA) til bevarelse af hornhinder opnået post mortem og som anvendes til transplantationscentre i mennesker. Vi med succes demonstreret effektiviteten af denne strategi for transplantation i en proof of concept undersøgelse gnavere modeller9, og vi i øjeblikket validering af kirurgisk tilgang i ikke-menneskelige primater før du implementerer den i et klinisk forsøg til behandling af patienter med specifikke former for RP påvirker ÅV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Olivier Goureau er opfinderen på ventende patenter relateret til generation af retinale celler fra humane pluripotente stamceller. Andre forfattere har intet at videregive.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Jérôme Larghero og Valérie Vanneaux (Hôpital Saint Louis, Paris, Frankrig) for deres bidrag under oprettelsen af metoden beskrevet her.

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra ANR [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], Fondation pour la Recherche Médicale [Bio-engineering program - DBS20140930777] og fra LABEX genoplive [ANR-10-LABX-73] til Olivier Goureau og Christelle Monville. Det blev støttet af NeurATRIS, en translationel forskningsinfrastruktur (Investissements d'Avenir) til biotherapies i neurovidenskab [ANR-11-INBS-0011] og INGESTEM, den nationale infrastruktur (Investissements d'Avenir) engineering for pluripotente og differentierede stamceller [ANR-11-INBS-000] til Christelle Monville. Karim Ben M'Barek blev støttet af stipendier fra DIM Stempole og LABEX genoplive [ANR-10-LABX-73]. -Stammen er en del af det Biotherapies Institut for sjældne sygdomme støtte fra Association Française contre les myopatier (AFM)-Téléthon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile biosafety cabinet TechGen International Not applicable
Liquid waste disposal system for aspiration Vacuubrand BVC 21
CO2-controlled +37 °C cell incubator Thermo Electron Corporation BVC 21 NT
200 µL pipette: P200 Gilson F144565
1 mL pipette: P1000 Gilson F144566
Pipet aid Drummond 75001
+4 °C refrigerator Liebherr Not applicable
Vibratome Leica VT1000S
Fine scissors WPI 501758
Forceps (x2) WPI 555227F
Water bath Grant subaqua pro SUB6
Precision balance Sartorius CP225D
Centrifuge Eppendorff 5804
Microscope Olympus SC30
Horizontal Rocking Shaker IKA-WERKE IKA MTS 214D
Vortex VWR LAB DANCER S40
Disposable Scalpel WPI 500351
plastic paraffin film VWR PM992
0.200 µm single use syringe filter SARTORIUS 16532
Syringe without needle 50 mL Dutscher 50012
Bottles 250 mL Dutscher 28024
15 mL sterile Falcon tubes Dutscher 352097
50 mL sterile Falcon tubes Dutscher 352098
culture insert Scaffdex C00001N
60 mm cell culture disches: B6 Dutscher 353004
12 well cell culture plate Corning 3512
6-well culture plates Corning 3506
Razor blades Ted Pella, Inc 121-9
Cyanoacrylate glue Castorama 3178040670105
PBS 1x (500 mL) Sigma D8537
Thermolysine Roche 5339880001
DMEM, high glucose, GlutaMAX Invitrogen 61965-026
KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) Invitrogen 12618-013
MEM-NEAA (100x) Invitrogen 11140-035
b-mercaptoethanol (50 mM) Invitrogen 31350-010
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140122
CO2-independent medium GIBCO 18045-054
Gelatin MERCK 104078
human amniotic membrane Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) Not applicable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
  3. Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
  4. Gehrs, K. M., Anderson, D. H., Johnson, L. V., Hageman, G. S. Age-related macular degeneration--emerging pathogenetic and therapeutic concepts. Annals of Medicine. 38 (7), 450-471 (2006).
  5. Swaroop, A., Chew, E. Y., Rickman, C. B., Abecasis, G. R. Unraveling a multifactorial late-onset disease: from genetic susceptibility to disease mechanisms for age-related macular degeneration. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 19-43 (2009).
  6. Khandhadia, S., Cherry, J., Lotery, A. J. Age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 724, 15-36 (2012).
  7. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
  8. Ben M'Barek, K., Regent, F., Monville, C. Use of human pluripotent stem cells to study and treat retinopathies. World Journal of Stem Cells. 7 (3), 596-604 (2015).
  9. Ben M'Barek, K., et al. Human ESC-derived retinal epithelial cell sheets potentiate rescue of photoreceptor cell loss in rats with retinal degeneration. Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).
  10. Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
  11. Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
  12. Hsiung, J., Zhu, D., Hinton, D. R. Polarized human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cell monolayers have higher resistance to oxidative stress-induced cell death than nonpolarized cultures. Stem Cells Translational Medicine. 4 (1), 10-20 (2015).
  13. Diniz, B., et al. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (7), 5087-5096 (2013).
  14. Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
  15. Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
  16. Thomas, B. B., et al. Survival and functionality of hESC-derived retinal pigment epithelium cells cultured as a monolayer on polymer substrates transplanted in RCS rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (6), 2877-2887 (2016).
  17. Borooah, S., et al. Using human induced pluripotent stem cells to treat retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 37, 163-181 (2013).
  18. Leach, L. L., Clegg, D. O. Concise review: Making stem cells retinal: Methods for deriving retinal pigment epithelium and implications for patients with ocular disease. Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).
  19. Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8518-8523 (2014).
  20. Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells as a tool to model a form of Leber congenital amaurosis. Cellular Reprogramming. 15 (3), 233-246 (2013).
  21. Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS Cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
  22. Maruotti, J., et al. Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10950-10955 (2015).
  23. Stanzel, B. V., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
  24. Ilmarinen, T., et al. Ultrathin polyimide membrane as cell carrier for subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium. PloS One. 10 (11), e0143669 (2015).
  25. Thumann, G., Schraermeyer, U., Bartz-Schmidt, K. U., Heimann, K. Descemet's membrane as membranous support in RPE/IPE transplantation. Current Eye Research. 16 (12), 1236-1238 (1997).
  26. Kiilgaard, J. F., Scherfig, E., Prause, J. U., la Cour, M. Transplantation of amniotic membrane to the subretinal space in pigs. Stem Cells International. 2012, 716968 (2012).
  27. Capeans, C., et al. Amniotic membrane as support for human retinal pigment epithelium (RPE) cell growth. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (3), 271-277 (2003).
  28. Ohno-Matsui, K., et al. The effects of amniotic membrane on retinal pigment epithelial cell differentiation. Molecular Vision. 11, 1-10 (2005).
  29. Paolin, A., et al. Amniotic membranes in ophthalmology: long term data on transplantation outcomes. Cell and Tissue Banking. 17 (1), 51-58 (2016).
  30. Hu, Y., et al. A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer. Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).
  31. Pennington, B. O., Clegg, D. O. Pluripotent stem cell-based therapies in combination with substrate for the treatment of age-related macular degeneration. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: The Official Journal of the Association. 32 (5), 261-271 (2016).
  32. Song, M. J., Bharti, K. Looking into the future: Using induced pluripotent stem cells to build two and three dimensional ocular tissue for cell therapy and disease modeling. Brain Research. 1638 (Pt A), 2-14 (2016).
  33. Ramsden, C. M., et al. Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future). Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).
  34. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
  35. Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
  36. Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Transplantation of the RPE in AMD. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (5), 516-554 (2007).
  37. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
  38. Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).

Tags

Udviklingsmæssige biologi sag 139 pluripotente stamceller celler differentiering celleterapi retinale pigment epitel retinal dystrophies aldersrelateret makuladegeneration
Engineering Transplantation-egnet retinale Pigment epitelvæv stammer fra menneskelige embryonale stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ben M'Barek, K., Habeler, W.,… More

Ben M'Barek, K., Habeler, W., Plancheron, A., Jarraya, M., Goureau, O., Monville, C. Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (139), e58216, doi:10.3791/58216 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter