Summary
Nós descrevemos um método para engenheiro um retina tecido composto de células epiteliais de pigmento retinal derivadas de células-tronco pluripotentes humanas cultivadas em cima de membrana amniótica humana e sua preparação para enxertia em modelos animais.
Abstract
Diversas condições patológicas do olho afetam a funcionalidade e/ou a sobrevivência do epithelium retinal do pigment (RPE). Estes incluem algumas formas de retinite pigmentosa (RP) e degeneração macular relacionada à idade (DMRI). Terapia celular é uma das estratégias mais promissoras terapêuticas propostas para curar estas doenças, com já incentivando os resultados preliminares em seres humanos. No entanto, o método de preparação do enxerto tem um impacto significativo em seus resultados funcionais em vivo. Com efeito, as células RPE enxertadas como uma suspensão de células são menos funcionais do que as mesmas células transplantadas como um tecido da retina. Aqui, descrevemos um método simples e reprodutível para engenheiro RPE tecido e sua preparação para a implantação na vivo . As células RPE derivadas de células-tronco pluripotentes humanas são semeadas sobre um suporte biológico, a membrana amniótica humana (presunto). Comparado aos andaimes artificiais, este apoio tem a vantagem de ter uma membrana basal que é perto da membrana de Bruch, onde as células RPE endógenas estão conectadas. No entanto, sua manipulação não é fácil, e desenvolvemos várias estratégias para seu cultivo adequado e preparação para enxertia em vivo.
Introduction
RPE é crucial para a sobrevivência e a homeostase dos FOTORRECEPTORES com o qual é fortemente associado1. Diversas condições patológicas alteram a sua funcionalidade e/ou sobrevivência, incluindo RP e AMD.
RP é um grupo de mutações herdadas de monogénicas que afetam as funções de fotorreceptores, células RPE ou ambos os2,3. Estima-se que as mutações que afetam especificamente o RPE células conta para 5% da RP2. AMD é outra condição onde a camada RPE é alterada, perda de visão, em última análise, a central principal. AMD é causada pelas complexas interações de fatores genéticos e ambientais e afeta os idosos4,5,6. De acordo com projeções, a AMD vai ser uma preocupação para os pacientes 196 milhões em todo o mundo por 20207. Para estes distúrbios, não existe nenhuma cura eficaz e uma das estratégias propostas é o transplante de células RPE novos para compensar mortos/não-funcionais preexistente RPE células8.
O modo de formulação do produto final a ser enxertado é essencial para garantir os melhores resultados funcionais. As células RPE injetadas como uma suspensão de células, apesar de ser um método fácil e simples de entrega, aumentar as preocupações em relação a sua sobrevivência, integração e funcionalidade9,10,11,12 , 13. cientistas desenvolvem-se mais complexas formulações para entregar engenharia tecido retinal9,13,14,15,16. Neste contexto, desenvolvemos um método original para gerar em vitro tecido RPE que poderia ser usado para transplante9.
Os bancos de células RPE derivados de células-tronco embrionárias humanas (ES) são usados no presente protocolo. No entanto, a alternativa RPE celular bancos de fontes diferentes células (células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem, as células RPE primárias, etc.) e diferenciados com um método diferente também são adequados para este protocolo. Diferenciação dirigida inclui protocolos usando citocinas e/ou pequenas moléculas17,18,19,20,21,22.
Para ser transplantado, o tecido projetado deve ser preparado em um andaime. Nos últimos anos, andaimes diferentes foram desenvolvidos com base em um polímero ou em uma matriz de origem biológica13,23,24. Aqui, o substrato biológico utilizado é o presunto, mas outros substratos, como membranas de Bruch desnudas, poderiam ser implementados. O método aqui descrito tem a vantagem de usar um andaime biológico que é mais relevante para o ambiente nativo de RPE.
ES derivado de células RPE as células humanas são cultivadas pelo menos 4 semanas para ser totalmente organizado como uma monocamada de paralelepípedos. Nessa fase, o epitélio obtido é funcional e polarizada9. Finalmente, como este tecido enruga facilmente, ele é incorporado em uma camada fina de uma operadora de hidrogel para dar mais rigidez e elasticidade e para protegê-lo durante o procedimento de injeção. Este produto é então armazenado em 4 ° C até enxertia.
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Protocol
Todos os materiais humanos utilizados neste protocolo foram utilizados em conformidade com os regulamentos da União Europeia. A linha de celular humana ES utilizada neste estudo foi derivada de um único embrião. O casal que tinha doado o embrião estava plenamente informado e deu seu consentimento para uma doação anônima. Uma linha celular do ES humana grau clínico foi derivada este embrião, bancada, qualificada e devidamente documentada por Roslin células (Reino Unido). Presuntos foram adquiridos em condições estéreis durante uma cesariana em mães que assinaram um consentimento para a doação de placenta de acordo com diretrizes do hospital (PHP, Hôpital Saint Louis).
1. preparação de reagentes e meios de cultura
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Preparação do meio de cultura de células RPE
- Para preparar o meio de cultura de células RPE, adicionar substituto 4% de soro (20 mL para um volume final de 500 mL), 1.000 x diluído 2-mercaptoetanol (500 µ l para um volume final de 500 mL) e solução de não aminoácidos essenciais em meio essencial mínimo (MEM) 1% Eagle′s (5 mL para um final volume de 500 mL) com glicose alta do médio (DMEM) da águia modificados de Dulbecco (475 mL para um volume final de 500 mL).
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Preparação do meio de transporte/conservação
- Para preparar o meio de transporte/conservação, adicione 1% de penicilina-estreptomicina (5 mL para um volume final de 500 mL) para CO2-médio independente (495 mL para um volume final de 500 mL) e mantê-lo em 4 ° C.
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Ressuspensão da enzima thermolysin
- Preparação de uma solução stock de thermolysin
- Para preparar uma solução stock de thermolysin, descongele o pó de thermolysin, que foi armazenado a-20 ° C, à temperatura ambiente.
- Como a atividade enzimática pode ser variável de lote para lote, calcule essa atividade com base no certificado de análise fornecida com o pó de thermolysin do lote a ser usado. Dividir a "atividade Protease neutro calculado = ANPC" (indicado no certificado de análise) por 181 (que é o peso molecular da tirosina). O resultado obtido corresponde a atividade enzimática total do thermolysin fornecido em pó (U/frasco).
- Prepare uma solução stock de 200 U/mL, adicionando o volume de água correspondente à atividade enzimática total (U/frasco) dividido por 200 (U/mL).
- Dissolva a enzima pipetando água que foi adicionada para cima e para baixo. Vórtice da solução por 30 s e verificar se o pó completamente foi suspenso. Pipetagem mais pode ser exigido para uma dissolução completa.
- Alíquota da solução estoque e armazená-lo a-20 ° C.
- Preparação de uma solução de trabalho de thermolysin
Nota: A solução de thermolysin deve ser preparada no dia do tratamento presunto.- Descongelar as alíquotas estoque de thermolysin a 200 U/mL armazenado a-20 ° C. Dilua a solução-mãe de 200x em tampão fosfato salino (PBS) a fim de obter uma final atividade enzimática de 1 U/mL. Prepare-se 40 mL para tratar manchas de presunto 1 – 4.
- Filtre a solução de thermolysin através de um antes do filtro de 0,2 µm de usar.
- Preparação de uma solução stock de thermolysin
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Ressuspensão de gelatina
- Preparação da solução de gelatina de 20% e bloco
Nota: A solução de gelatina de 20% e o bloco podem ser preparados até 1 semana antes da utilização.- Aquecer o CO2-médio independente a 42 ° C em banho-maria por 30 min (até 1 h). Em um tubo de 50 mL, adicionar 10 g de gelatina para 40 mL de aquecido CO2-médio independente e vortex a solução.
- Dissolver a gelatina por 30 a 60 min a 42 ° C. Vórtice cada 10min para homogeneizar a solução.
- Uma vez que a solução é homogênea, adicione 4 mL de solução a 20% de gelatina para quatro pratos de cultura de 6 cm. Evite bolhas. Adicionar um filme plástico de parafina para proteger os pratos e permitir que a solução solidificar a 4 ° C.
- Preparação da solução de gelatina de 8%
Nota: A solução de gelatina de 8% pode ser preparada no dia antes do uso e armazenada a 4 ° C.- Aquecer o CO2-médio independente a 42 ° C por 30 min (até 1 h). Em um tubo de 50 mL, adicionar 4 g de gelatina para 46 mL de aquecido CO2-médio independente e vortex a solução.
- Dissolver a gelatina por 30 a 60 min a 42 ° C. Adicionar um filme plástico de parafina para proteger o tubo e mantê-lo em banho-maria a 37 ° C, se é para ser usado no mesmo dia, ou armazená-lo em 4 ° C, se é para ser usado mais tarde.
- Preparação da solução de gelatina de 20% e bloco
2. Thermolysin tratamento de membrana amniótica humana
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Lavagem de membrana amniótica
- Tenho presuntos fornecidos como pedaços pequenos (aproximadamente 30 x 30 mm) fixo em um andaime de nylon, ou já a 4 ° C, em PBS ou congelados. Se fornecido congelado, descongelar as membranas a 37 ° C numa incubadora por 30 min.
- Lave as membranas:
- Coloque 1 – 4 membranas em uma garrafa de 250 mL contendo 80 mL de PBS. Use tantas garrafas conforme necessário.
- Agite cada garrafa em um agitador de placa em alta velocidade por 5 min, em seguida, descartar a PBS. Adicione 80 mL de PBS e repetição.
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Tratamento Thermolysin
- Adicionar 40 mL da solução de trabalho de thermolysin (1 U/mL) por garrafa que contém as membranas (1 – 4 membranas por garrafas; até 3 garrafas de cada vez).
- Agitar os frascos durante 5 min à 450 rpm e, em seguida, vórtice por 30 s. Repita 1 x.
- Descartar a solução de thermolysin e adicionar 80 mL de PBS.
- Agite os frascos por 5 min a 450 rpm. Descartar a PBS e adicionar 80 mL de PBS. Repita 3x.
3. fixação de membrana amniótica humana por uma inserção de cultura
- Use pinça longa estéril (que pode atingir o fundo da garrafa) para remover os presuntos, um por um e transferir cada presunto para um prato de cultura 10 cm contendo 10 mL de PBS.
- Uma placa de cultura nova 10 cm contendo 10 mL de PBS, lugar de membranas com o nylon voltado para baixo. Separe dois dos quatro clips que são usados para fixar a membrana de nylon.
- Introduza o anel menor da inserção da cultura entre o nylon e a membrana.
- Certifique-se que a membrana cobre completamente o anel menor. Clip-a segunda parte da inserção da cultura em cima da membrana. A membrana basal do presunto é enfrentar a inserção da cultura interna. Separe os dois últimos clipes.
- Corte, com tesoura estéril, o excesso de membrana exterior a inserção de cultura, se necessário. Usando fórceps, transferir a membrana fixa na inserção da cultura para uma placa de 12, adicionar PBS e armazenar a placa em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO2.
- Repita estas operações (da etapa 3.2 a 3.5) com as outras membranas.
4. descongelar e propagação das células do epitélio Retinal do pigmento na membrana amniótica humana
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Descongelamento das células do epitélio retinal do pigmento
- O banco de células RPE é congelado a 1 milhão de células por frasco criogênico em nitrogênio líquido. Descongelar como muitos frascos criogênicos como necessário (350.000 células são semeadas por membrana).
- Prepare um tubo de 15 mL contendo 3 mL do meio RPE por frasco criogênico. Uma vez que o frasco é descongelado, transferi as células para cada tubo. Repita esta operação para os outros frascos.
- Homogeneizar (pipeta para cima e para baixo algumas vezes para Ressuspender as células em meio de RPE) e levar 10 µ l da solução celular e transferi-lo para um tubo de 1,5 mL. Adicione 10 µ l de trypan azul. Lugar de 15 µ l desta solução em uma câmara de contagem, então contar o número de células viáveis (não coloridos em azul) sob um microscópio com um objetivo X 4. Repita esta operação para os outros frascos.
- Entretanto, centrifugar os tubos de 15 mL em 110 x g durante 5 min. descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 700.000 células/mL.
-
Semeadura de células do epitélio retinal do pigmento em membrana amniótica humana
- Remova a placa de 12 poços contendo as membranas da incubadora.
- Aspire a PBS. Adicione 500 µ l de suspensão de célula preparada na etapa 4.1.4 no centro da inserção da cultura. Adicione 1 mL de meio RPE fora a inserção de cultura (no interior do poço). Repita para as outras membranas.
- Coloque a placa de 12 poços contendo as membranas na incubadora.
5. manutenção de culturas de células de epitélio Retinal do pigmento na membrana amniótica humana
- Renovar o meio 2 x por semana, geralmente às segundas e sextas, até pelo menos dia 30 da cultura.
- Aspire o meio dentro e fora da inserção da cultura de cada poço e renová-lo com meio fresco (1ml fora a inserção da cultura e 500 µ l de dentro). Coloque a placa na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2.
6. preparação do Patch do epitélio Retinal do pigmento para transplante
Nota: A partir de dia 30, da cultura, o tecido está pronto para transplante.
- Quente a solução de 8% de gelatina em banho-maria a 37 ° C por 30 min. Encha a câmara interna da vibratome com frio CO2-médio independente (a 4 ° C).
-
Coloque o bloco de 20% de gelatina para o vibratome.
- Leve o prato de cultura de 6cm que contém o bloco de 20% de gelatina na geladeira. Usando um bisturi, corte um bloco de 5 cm x 5 cm. Cole a parte superior do bloco para o apoio com cola de cianoacrilato ou seu equivalente.
- Coloque uma lâmina nova no vibratome.
- Ajuste o nível do bloco até que esteja no mesmo nível da lâmina de barbear.
- Encher a banheira em torno do apoio com frescos de CO2-médio independente a 4 ° C. Corte o bloco com a vibratome usando uma velocidade média até que o bloco é cortado uniformemente, levando a uma superfície lisa. Defina a posição 0.
- Aspire o meio em torno do bloco de gelatina até que esteja completamente seco e depois levar o prato de 12-poços de cultura contendo os tecidos da incubadora a 37 ° C.
- Usando a pinça, abra cuidadosamente a inserção da cultura em cima do bloco de gelatina. Corte, com a tesoura, todas as partes das membranas que não contêm células (fora do ringue onde células não foram cultivadas). Aspire o inteiro médio residual.
- Adicione 1 mL da solução de 8% de gelatina líquida a 37 ° C, a fim de cobrir as membranas. Remova cuidadosamente o excesso. Espere 5 – 8 min para permitir que a gelatina solidificar.
- Adicionar novo CO2-médio independente (a 4 ° C) para o banho até que a membrana é coberta.
- Corte, com o vibratome em uma posição de-100 µm, com uma velocidade média, permanecendo ciente de como o bloco se comporta. No final da seção, tenha cuidado para manter a orientação do tecido.
- Com um bisturi, corte um canto para identificar a orientação da seção.
- Recolher a membrana incorporada em gelatina com uma espátula e coloque-o em uma placa de 6 preenchida com o meio de conservação a 4 ° C, até enxertia aos olhos do destinatário.
- Na época do transplante, ajuste o tamanho do implante para o tamanho do olho destinatário sob um microscópio cirúrgico (1-3 para ratos, 10 a 15 mm2 para primatas não-humanos).
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Representative Results
Presuntos contêm uma camada epitelial que deve ser removida antes da semeadura de células RPE. Um tratamento enzimático da membrana é executado com o thermolysin sob agitação. Em ordem para não perder a polaridade da membrana (o epitélio é de um lado), é fixado num suporte de composição que pode ser diferente dependendo do provedor (figura 1A). Verificar a aderência da membrana de seu apoio a este passo e adicionar clips, se necessário. Aquando da fixação na inserção da cultura, trabalhar com cuidado para evitar fazer furos na membrana e manter sua polaridade com a membrana basal, virada para cima (figura 1B). Quando as células são semeadas em membranas, eles poderiam escapar esses buracos e diminui a concentração de final de célula. A presença de buracos pode ser visualizada sob um microscópio ou adicionando PBS a inserção de cultura interna e verificando se o PBS está vazando. Qualquer membrana com furos deve ser descartada.
Após a fixação na inserção da cultura, a presença de células residuais em um microscópio de contraste de fase é avaliada (figuras 1 e 1 D). Classicamente, algumas células mortas poderiam permanecer na superfície da membrana, mas essas células serão eliminadas quando o meio de cultura é alterado (Figura 1). As fibras da membrana porão podem ser vistas em uma maior ampliação (Figura 1) se não há células permanecem. Se isso não for o caso, poderá ser ajustado o tempo de incubação com thermolysin.
Nos dias seguintes a semeadura das células RPE, verificar se as células aderem. Dependendo o microscópio usado, pode ser difícil ver claramente as células durante as primeiras semanas, mas se as células não aderirem, células serão vistas flutuando em meio de cultura celular. Uma vez que o epitélio é formado e começa a amadurecer, torna-se mais fácil de vê-lo sob um microscópio (figuras 2A, 2Be 2C). Em três semanas, as células formam um epitélio monocamada completa típico de RPE (organização de paralelepípedos). Após 4 semanas, o epitélio é suficientemente maduro para a sua preparação para a implantação (Figura 2D). No entanto, ele poderia ser mantido em cultura por mais semanas por razões logísticas.
A preparação da prótese para implante é descrita na Figura 3. Mediante a aposição da membrana para o bloco de 20% de gelatina, Aspire todo o meio de cultura de células em excesso. Esta etapa é importante, como qualquer meio restante poderia impede a aderência da gelatina de 8% para o RPE e a membrana. Com efeito, o Médio irá formar uma película de líquido entre as camadas de gelatina.
A gelatina usada para a incorporação do implante pode ser de uma força variável, dependendo do seu índice de Bloom (ou seja, um teste de controle de qualidade, realizada e fornecidos pelos fornecedores, que avalia a força de gel a uma temperatura padronizada e concentração). Se a gelatina usada não é suficientemente rígida e vela durante a enxertia, a referência usado gelatina deve ser alterada para outro, com uma força maior. A concentração de gelatina também poderia ser alterada, com base na experimentação, para ajustar sua força e elasticidade.
Figura 1: inserir imagens representativas do presunto antes e após o tratamento thermolysin e fixação em uma cultura. (A) imagem representativa de uma membrana de um banco de tecidos. (B) imagem representativa de uma membrana fixada em uma inserção de cultura. (C) a imagem representativa de uma membrana tratada com thermolysin em uma baixa ampliação. (D) a imagem representativa de uma membrana tratada com thermolysin em uma alta ampliação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: imagens representativas do presunto em cima de semeadura as células RPE. (A) imagem representativa da membrana antes da semeadura. (B e C) imagens representativas de células RPE nas membranas em 3 semanas após a semeadura. A membrana pode não ser completamente planar como visto no painel C. Barra de escala = 100 µm (C), 20 µm para a ampliação. (D) imagem representativa das células RPE numa membrana em 30 dias após a semeadura, correspondente ao tempo de incorporá-los em gelatina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: esquema descrevendo as etapas sequenciais para a inclusão do tecido retinal engenharia contendo a camada de células RPE o presunto dentro de um filme de gelatina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nós descrevemos um método para a cultura de células RPE sobre um andaime biológico e sua preparação para implantação em modelos animais. Uma das etapas críticas do protocolo é a manutenção da orientação do presunto por todo o procedimento até sua inclusão em gelatina. Com efeito, é removido o epitélio nativo da membrana e sua membrana basal torna-se exposto9. As células RPE possuem ser semeado em cima desta membrana basal. Após a preparação para a incorporação de gelatina, é crucial trabalhar com todos os produtos à temperatura definida. Com efeito, gelatina tem a propriedade a ser rígido a 4 ° C e líquido no corpo temperatura (37 ° C)9. Se a temperatura não for respeitada, a gelatina pode solidificar ou liquefazer em uma etapa onde este efeito não é desejado.
Vários andaimes biológicos têm sido propostas, como a membrana de25 ou presuntos26 do Descemet. Em particular, presuntos, de uma cesariana,27, se demonstrou para ser bem tolerado no espaço subretinal, causando inflamação limitada e reduzindo a neovascularização coroide26. A membrana suporta com sucesso a cultura humana RPE células9,28. Além disso, estas membranas têm também uma longa história em clínicas29, tornando-os bons candidatos para um andaime para terapia com células RPE. Outros suportes biológicos podem ser facilmente implementados com este protocolo. Andaimes sintéticos baseados em polímero já são rígidas e podem não precisar de uma gelatina incorporação antes da implantação13,30,31,32,33. Outros sistemas para implantação foram recentemente desenvolvidos pela entrega subretinal do olho humano de uma monocamada RPE hESC derivados em um andaime do poliéster rígido34 ou em um substrato parylene sintético projetado para imitar a membrana de Bruch35 . Mesmo que estas estratégias são promissoras, acreditamos que andaimes biológicas podem fornecer a melhor plataforma para a engenharia de tecidos RPE.
Neste protocolo, as células RPE semeadas foram derivadas de células ES humanas, usando um método de diferenciação espontânea. No entanto, diferentes tipos de células RPE poderiam ser usados, também diferenciados de células-tronco pluripotentes induzidas humana ou de células RPE primárias obtidas a partir de cadáveres ou mesmo um RPE célula linha19,36,37,, 38. Além disso, se usando células-tronco pluripotentes, vários protocolos foram desenvolvidos nos últimos anos para obter células RPE com base em uma diferenciação espontânea ou com pequenas moléculas para guiar a diferenciação18,22. Células RPE obtidas a partir desses protocolos diferentes de diferenciação poderiam também ser usadas com este método para engenharia de tecidos.
Um limite desse método é a estabilidade do tecido incorporado a 4 ° C. Como ele está incluído em gelatina apenas antes da expedição para o local da cirurgia, tem que ser mantida nesta temperatura até a enxertia. Nesse contexto, a cirurgia deve ser realizada em 48 h.
Esse método pode ser facilmente transferido para a clínica. O tecido RPE incorporado em gelatina é conservado a 4 ° C no CO2-médio independente. Este meio poderia ser substituído, se necessário, com outros já aprovados pela Food and Drug Administration (FDA) para a conservação de córneas obtidas post mortem, e que são utilizados para transplantes em humanos. Temos demonstrado com sucesso a eficiência desta estratégia para transplante em um estudo de prova de conceito em modelos de roedores9, e atualmente está validando a abordagem cirúrgica em primatas não-humanos antes de implementá-lo para um ensaio clínico para tratar pacientes com formas específicas de RP que afectam o RPE.
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Disclosures
Olivier Goureau é o inventor na pendente patentes relacionadas com a geração de células da retina a partir células-tronco pluripotentes humanas. Os outros autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer Jérôme Larghero e Valérie Vanneaux (Hôpital Saint Louis, Paris, França) para a sua entrada durante a instauração do método descrito aqui.
Este trabalho foi apoiado por concessões do ANR [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], o Fondation pour la Recherche Médicale [programa de Bio-Engenharia - DBS20140930777] e do LABEX REVIVE [ANR-10-LABX-73] Olivier Goureau e Christelle Monville. Era apoiado por NeurATRIS, uma infra-estrutura de pesquisa translacional (Investissements d'Avenir) para biotherapies em Neurociências [ANR-11-INBS-0011] e INGESTEM, a infra-estrutura nacional (Investissements d'Avenir) engenharia para pluripotentes e células-tronco diferenciadas [ANR-11-INBS-000] para Christelle Monville. Karim Ben M'Barek foi apoiado por bolsas de Stempole DIM e LABEX REVIVE [ANR-10-LABX-73]. -Tronco faz parte do Instituto de doenças raras, apoiada pela Association Française contre les miopatias (AFM) Biotherapies-Téléton.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile biosafety cabinet | TechGen International | Not applicable | |
| Liquid waste disposal system for aspiration | Vacuubrand | BVC 21 | |
| CO2-controlled +37 °C cell incubator | Thermo Electron Corporation | BVC 21 NT | |
| 200 µL pipette: P200 | Gilson | F144565 | |
| 1 mL pipette: P1000 | Gilson | F144566 | |
| Pipet aid | Drummond | 75001 | |
| +4 °C refrigerator | Liebherr | Not applicable | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fine scissors | WPI | 501758 | |
| Forceps (x2) | WPI | 555227F | |
| Water bath | Grant subaqua pro | SUB6 | |
| Precision balance | Sartorius | CP225D | |
| Centrifuge | Eppendorff | 5804 | |
| Microscope | Olympus | SC30 | |
| Horizontal Rocking Shaker | IKA-WERKE | IKA MTS 214D | |
| Vortex | VWR | LAB DANCER S40 | |
| Disposable Scalpel | WPI | 500351 | |
| plastic paraffin film | VWR | PM992 | |
| 0.200 µm single use syringe filter | SARTORIUS | 16532 | |
| Syringe without needle 50 mL | Dutscher | 50012 | |
| Bottles 250 mL | Dutscher | 28024 | |
| 15 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352097 | |
| 50 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352098 | |
| culture insert | Scaffdex | C00001N | |
| 60 mm cell culture disches: B6 | Dutscher | 353004 | |
| 12 well cell culture plate | Corning | 3512 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3506 | |
| Razor blades | Ted Pella, Inc | 121-9 | |
| Cyanoacrylate glue | Castorama | 3178040670105 | |
| PBS 1x (500 mL) | Sigma | D8537 | |
| Thermolysine | Roche | 5339880001 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965-026 | |
| KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) | Invitrogen | 12618-013 | |
| MEM-NEAA (100x) | Invitrogen | 11140-035 | |
| b-mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| CO2-independent medium | GIBCO | 18045-054 | |
| Gelatin | MERCK | 104078 | |
| human amniotic membrane | Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) | Not applicable |
References
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